专利名称：缀合的凝血因子viii的制作方法
技术领域：
本发明涉及缀合形式的凝血因子VIII。
背景技术：
因子VIII (FVIII)是必不可少的凝血因子，也被称为抗血友病因子(AHF)。对人类而言，因子VIII由F8基因编码。在该基因上的缺陷会导致血友病A，这是一种众所周知的隐性X染色体连锁的凝血异常，影响着大约1/5000的男性。X染色体连锁的F8基因编码来自26个外显子的具有2351个氨基酸的多肽，该多肽在被切割了信号肽之后形成具有2332个氨基酸的成熟FVIII分子(Wang et al. Int.J. Pharmaceutics, 259:1-15 (2003))。已经发现FVIII被合成并通过肝脏的血管细胞、血管小球细胞(glomerular cells)、管状内皮细胞(tubular endothelium cells)和窦内皮细·胞(sinusoidal cells)释放到血液中,但是人体内FVIII的初始释放位点在哪里仍然存在很大争议。FVIII分子由六个蛋白结构域组成；NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。成熟的分子含有许多翻译后修饰，包括N-连接和O-连接的糖基化，磺基化以及二硫键的形成。FVIII总共含有23个半胱氨酸残基，其中16个半胱氨酸残基在蛋白质的A和C结构域中形成了 8个二硫键(McMullen et al. Protein Science, 4:740-746 (1995))。由于蛋白质的翻译后修饰，基于糖基化的水平和类型，它的循环分子量(circulation molecular weight)能够多达330kDa。FVIII也会经历蛋白水解过程，从而使得血液循环中的种类是由重链(A1-A2-B)和轻链(A3-C1-C2)组成的异二聚体。当FVIII被分泌进入血液循环时，它以非共价的形式与血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vffF)结合。两个分子的结合涉及FVIII的轻链的 A3 和 C2 结构域(Lacroix-Desmazes et al. Blood, 112:240-249 (2008))。与 vWF 的结合增加了 FVIII的稳定性和循环半衰期(circulatinghalf-life)。虽然与vWF的结合能够增加FVIII的循环半衰期，它的天然半衰期仅为15-19小时。因子VIII是参与内源性凝血途径必不可少的辅因子。在凝血级联反应中它的作用是作为“成核模板”，以使得FX酶复合物的组分在活化的血小板的表面以正确的空间方向有机排布(Shen et al. Blood, 111:1240-1247(2008))。FVIII 首先由凝血酶(因子 II a)或者FXa活化，然后它以FVIIIa的形式从vWF解离。然后，FVIIIa在血管损伤的位置与活化的血小板结合，并通过A2和A3介导的相互作用与FIXa结合。当血小板表面存在Ca2+离子时，FIXa与FVIII的结合使得FIXa的蛋白水解活性增加了大约200000倍。然后，该复合物将FX活化为FXa。然后因子Xa和它的辅因子因子Va活化更多的凝血酶。凝血酶转而将纤维蛋白原切割为纤维蛋白，然后纤维蛋白聚合并交联(利用因子XIII)成为纤维蛋白血块。由于不再受vWF的保护，在过程中活化的FVIII被蛋白水解而失活(最主要是通过活化的蛋白质C和因子IXa)并迅速从血流中被清除。蛋白质聚乙二醇化方法已由PolyTherics有限公司开发,并被称为TheraPEG ,在该产品中，通过蛋白质中的一对半胱氨酸残基的还原型二硫键，PEG聚合物与目的蛋白相连接(WO 2005/007197)。这一技术已被用于制备无因子FIXa污染的因子IX的聚乙二醇化变体(WO 2009/130602)。然而，对于使用同样的技术制备聚乙二醇化的FVIII而言，则被认为是重要的或者非常规的。从活性角度来看，FVIII与FIX存在某些关键的区别，这就意味着这种蛋白质和生物相容性聚合物的缀合并不是一个简单的步骤。例如，FIXa是一种丝氨酸蛋白酶，而FVIII则没有酶活性。一旦活化，FIX仅需要与它的辅因子形成结合，而FVIII则需要参与凝血级联反应。而且，FVIII是辅因子，且能够形成“模板”，其它凝血因子(包括FIXa)组装在该“模板”上从而增强它们的催化活性。为了发挥FVIII的功能，它必须能够与FX、FXa、FIXa和磷脂相结合。而且，为了使FVIII在血液循环中稳定，它必须能够与血管性血友病因子结合。因此，由于实现分子间相互作用的FVIII所有的结构域中都有二硫化物存在，该蛋白的半胱氨酸残基上的二硫化物进行聚乙二醇化就会在空间上阻碍这些相互作用。因而，因子FVIII的聚乙二醇化存在一些不同于FIX的独特的和不同的挑战。使用TheraPEG 技术对FIX进行聚乙二醇化获得成功的事实，对于使用同样的方法能否成功制备聚乙二醇化的FVIII而言并没有指导意义，因为FVIII是结构和功能上都不相同的蛋白质。已经发现，通过将FVIII和一种或多种生物相容性聚合物缀合可以增强因子VIIK本文中称为FVIII)的操作性。增强的操作性能也包括制备高纯度FVIII缀合物的能力。
发明内容
根据本发明的第一方面，提供了通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIII缀合的生物相容性聚合物。生物相容性聚合物可选自由聚乙二醇(PEG)、聚磷脂酰胆碱(PC)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚环氧乙烷(PEO)、聚氧乙烯醇(polyoxyethylated polyol)、聚烯 IKpolyolefinic alcohol)、聚轻烧基丙烯酸甲酯(polyhydroxyalkylmethacrylate)、多糖、聚α _轻基酸、聚乙烯醇、聚磷腈(polyphosphosphasphazene)、聚 N-丙烯酰吗啉、聚烯烃氧化物聚合物(polyalkyene oxidepolymers)、聚马来酸、聚DL-丙氨酸、羧甲基纤维素、右旋糖酐、淀粉或淀粉衍生物、透明质酸甲壳素(hyaluronic acid chitin)、聚甲基丙烯酸酯、聚唾液酸(PSA)、聚轻基羧酸钠(polyhydroxy alkanoates)、聚氨基酸以及它们的组合组成的组中。所述生物相容性聚合物可以具有线性或分支状结构。在另一种实施方式中，所述生物相容性聚合物为蛋白质，选自但不限于由FVII、·白蛋白、转铁蛋白、免疫球蛋白(包括单克隆抗体)、抗体片段如单结构域抗体、\、VH、Fab、F(ab，)2、Fab’、Fab3、scFv、di-scFv、sdAb、Fe 以及它们的组合组成的组中。如果需要，每个FVIII分子可以通过一个或多个半胱氨酸残基与一种或多种生物相容性聚合物缀合。游离的半胱氨酸残基是还原胱氨酸二硫键的产物。本发明的生物相容性聚合物可以通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键与FVIII缀合。所述缀合可以是通过将FVIII中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫残基桥接的连接基团的方式。因而，二硫键可以是天然二硫键或者是重组引入的二硫键。PEG分子可以具有任何适当的分子量，例如5-100kDa，10_500kDa。适当地为5-30kDa或者10-30kDa。某些适当的分子量包括10、20或者30kDa。适当地，FVIII缀合物的生物相容性聚合物部分可以与两个半胱氨酸残基结合，从而在FVIII中形成二硫键。这样，含有PEG的连接物桥接了所述二硫键。WO 2005/007197、WO 2009/047500 和 WO 2010/010324 描述了这种缀合过程。在本发明的一种实施方式中，可以根据图2中所示的方案将生物相容性聚合物与FVIII缀合。在图2中，显示了生物相容性聚合物和连接基团之间的基团R1，所述连接基团跨越(spanning) 了 FVIII分子上二硫键的硫原子。Rl代表取代基团，所述取代基团可以是直接的键(direct bond)、亚烷基(优选C1,亚烧基)或可任选取代的芳基或杂芳基(heteroaryl groups);其中所述芳基包括苯基、苯甲酰基和萘基；其中适当的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑(oxazole)、咕嗪、喃唳和嘌呤；其中与聚合物的连接可为通过水解不稳定的键的方式的连接或通过稳定的键的连接。在可任选取代的芳基或者杂芳基上存在的具体取代基包括例如选自-CN、-NO2,-C02R、-C0H、-CH20H、-COR、-OR、-0C0R、-OCO2R, -SR、-S0R、-SO2R, -NHC0R、-NRC0R、_NHC02R、-NR’ C02R、-NO、-ΝΗ0Η、-NR’ OH、-C=N-NHCOR, -C=N-NRj COR、-N+R3, -N+H3, -N+HR2, -N+H2R,卤素例如氟或氯、-C = CR、-C=CR2和13C=CHR中的一种或多种相同或不同的取代基，其中每个R或R’独立地代表氢原子或者烷基(优选C1J或者芳基(优选苯基)。特别优选地存在吸电子取代基。在一种实施方式中，Rl中可任选取代的芳基或杂芳基包括被酰胺基(NHCO)取代的芳基或杂芳基，所述酰胺基将Rl单元与生物相容性聚合物连接。因此，在FVIII半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团可以含有3-碳桥。在一种实施方式中,在FVIII半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团是(CH2) 2CHC(0)-。在本发明的一种实施方式中，生物相容性聚合物如上所述的进行缀合，其中包括与生物相容性聚合物相缀合的FVIII的组合物具有以下结构
权利要求
1.一种生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIII缀合。
2.根据权利要求I所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键与FVIII缀合。
3.根据权利要求2所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物通过连接基团与FVIII缀合，所述连接基团桥接在FVIII中形成二硫键的两个半胱氨酸残基的硫残基。
4.根据权利要求3所述的生物相容性聚合物，其中，所述连接基团通过基团R1和所述生物相容性聚合物缀合，R1是直接的键、C1,亚烷基、或者可任选取代的芳基或杂芳基。
5.根据权利要求4所述的生物相容性聚合物，其中，R1选自苯基、苯甲酰基、萘基、批啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶或嘌呤。
6.根据权利要求3-5中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIII的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团含有3-碳桥。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，在FVIII的半胱氨酸残基之间的原始二硫键的两个硫原子之间的连接基团是(CH2) 2CHC (O) _。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物与FVIII缀合，其中，缀合物具有如下结构
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的生物相容性聚合物，其中，所述生物相容性聚合物具有大约5-100kDa的分子量。
10.一种药物组合物，该药物组合物含有前述权利要求任意一项所述的生物相容性聚合物，所述生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIII缀合。
11.根据权利要求10所述的药物组合物，其中，所述药物组合物含有药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
12.根据权利要求10或11所述的药物组合物，所述药物组合物还含有其他药物活性剂。
13.根据权利要求10-12中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物适于肠外给药。
14.根据权利要求10-13中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物适于皮内注射、皮下注射、肌肉注射以及静脉输注或骨内输注。
15.根据权利要求10-14中任意一项所述的药物组合物，所述药物组合物以药水、悬浮液或乳液的形式存在。
16.根据权利要求10-15中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIII相t匕，FVIII缀合物具有更长的半衰期。
17.根据权利要求10-16中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIII相t匕，FVIII缀合物具有更高的AUC。
18.根据权利要求10-17中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIII相t匕，FVIII缀合物具有更高的生物利用率。
19.根据权利要求10-17中任意一项所述的药物组合物，其中，与未经修饰的FVIII相t匕，FVIII缀合物具有更低的免疫原性。
20.一种治疗凝血病或创伤的方法，该方法包括用权利要求10-19中任意一项所述的药物组合物对有需要的患者进行给药。
21.根据权利要求20所述的治疗方法，其中，所述凝血病是血友病A。
22.降低患有血友病A或创伤的哺乳动物的关节积血、出血、胃肠道出血和经血过多的风险的方法，该方法包括用权利要求12-21中任意一项所述的含有FVIII缀合物的药物组合物对有需要的患者进行给药。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述组合物通过皮下途径给药。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述组合物通过静脉途径给药。
25.根据权利要求22所述的方法，其中，每一至十四天用所述组合物进行给药一次。
26.生物相容性聚合物在治疗以FVIII功能丧失为特征的凝血病或治疗创伤中的用途，所述生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIII缀合。
27.—种制备以下生物相容性聚合物和FVIII的缀合物的方法，
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述缀合反应物具有以下分子式，
全文摘要
本发明提供了一种生物相容性聚合物，该生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基与FVIII缀合，适当地通过FVIII中还原的二硫键间的连接基与FVIII缀合，本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物含有这种缀合形式的FVIII。
文档编号A61K38/37GK102939108SQ201180021888
公开日2013年2月20日 申请日期2011年4月28日 优先权日2010年4月30日
发明者W·亨利 申请人:剑桥生物制药专利有限公司