专利名称：用于治疗慢性肺病的三叶因子(tff)的制作方法
技术领域：
本发明提供一种在患有，例如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、吸烟者肺、囊胞性纤维症、支气管扩张症、细支气管炎、肺癌、肺炎、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)、社区获得性肺炎(CAP)、重度社区获得性肺炎(sCAP)或卡氏肺孢子虫的患者中，增强气道上皮修复和/或粘膜纤毛清除机制再生和/或气道上皮重塑正常化的方法，通过肺气道给药，给予该患者有效量的一种或多种促再生因子，优选TFF (三叶因子，Trefoil factor)成员和/或TFF 二聚体,更优选TFF3或TFF3 二聚体。
背景技术：
呼吸上皮被发现内衬于上、下呼吸道，它的作用是通过所谓的粘膜纤毛清除来滋润和保护气道。它还作为潜在的病原体和异物的屏障，预防由纤毛活动梯(下文所述)的作用所引起的感染。由于柱状上皮细胞的排列，呼吸上皮被认为是有纤毛的假复层柱状上皮；细胞核没有在同一平面上对齐，使其显得好像存在数层细胞。事实上，所有的细胞均与基底膜接触，因而是单层细胞；因此上皮被称为假 复层。杯状细胞位于柱状细胞之间，分泌粘液保持上皮的湿润，并捕捉通过气道移动的颗粒物。呼吸道的某些部分，如口咽，进行食物研磨吞咽。为了防止这些区域的呼吸上皮破损，它变成复层鳞状上皮，其更好地适应不断的蜕皮和磨损。口咽鳞状层与食道相连。呼吸上皮的纤毛协力摆动，将包含被捕获的异物粒子和细胞碎片、死细胞，像死肺泡巨噬细胞的分泌粘液向口咽方向移动。气道最窄的部分位于中央气道，此处咳嗽机制产生足够的气流速度，来增强具有足够剪切应力的湍流，使痰脱离气管/主支气管壁，咳痰或将痰吞入胃里，在胃里酸性PH值使异物和微生物失活。从小气道到中央气道的气道系统(其中咳嗽机制行之有效)被统称为纤毛活动梯，并起到两个功能:为肺泡清除远端呼吸道的细菌、异物和死细胞，以及防止粘液积聚在肺中，以确保正常的气体交换。因此，纤毛的功能是气道的宿主防御的重要部分。纤毛顶部的粘液层是两相的，具有浆液状的溶胶层，其中纤毛向上摆动，更中心的朝向气道管腔的是粘弹性或凝胶层。内衬于气道的上皮细胞参与保护气道粘膜不受主要损伤源的影响，所述损伤源包括吸入的有毒颗粒，如烟草烟雾、污染物、烟气以及像细菌和病毒的微生物。并进一步从外周和上部运输死肺泡细胞、细胞碎片至气管，这些除非被从肺泡区域清除，否则会释放其内含的蛋白酶，如弹性蛋白酶，破坏具有及处于晚期慢性阻塞性肺病和肺气肿的肺组织。内衬于气道的上皮通过相互依赖的功能提供抵御微生物和侵略性分子的有效屏障，其包括以下内容:粘液的机械清除；离子和水运输平衡；生化抗菌、抗氧化和抗蛋白酶功能；以及通过上皮细胞间连接的细胞屏障功能。所有这些功能对保护和保持气道上皮的完整性都很重要。任何传染或炎症相关的慢性疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、支气管扩张症和囊胞性纤维症后，气道上皮会很快受到干扰。气道上皮经常被吸入的有毒颗粒物，如烟草烟雾、污染物、烟气以及像细菌和病毒的微生物，以及来自更远的肺外周和上部、富含蛋白酶的死肺泡细胞和细胞碎片损伤。受到此类损伤后，包括上皮细胞修复、再生和重塑的创伤修复过程以特定的事件顺序启动:1、早期修复阶段的上皮屏障功能由相邻细胞的迁移组成。约24小时内，许多这些细胞进入细胞周期。2、第二修复阶段的特征是炎症过程、细胞增殖和分化发生，导致气道结构随着时间的细胞学和组织学变化，这一过程被称为气道重塑。在慢性阻塞性肺病(COPD )中，病情加重通常有几个原因，包括吸烟，暴露于香烟烟雾以及暴露于环境污染，特别是微粒污染物、病毒和细菌。这些情况是导致气道炎症的原因，其具有过量的炎症介质，以及由活化的上皮和炎症细胞释放的促炎细胞因子。气道表面上皮对损伤的正常反应包括一系列细胞活动，具有从表面上皮的完整性缺失，到仅上皮的局部脱落，或者甚至基底膜的完全剥蚀的整个范围。促再生因子增强上皮修复，涉及中央气道以及更重要的外周气道和肺泡的清除功能得到或未得到改善，其气道恢复治疗潜能特别包括痰的量变和质变，即通过抑制细胞转化为杯状细胞，保持粘性较小粘液的性能，减少粘液产生。这反过来会改善粘液流变学，浓粘液产生量较少，粘性较小的浆液产量较多。已知肺部的几个促 再生因子包括防御蛋白如防御素，表面活性蛋白如SP-A、SP_B、SP-D，粘蛋白，slgA，乳铁蛋白，葡糖氨基葡聚糖，Clara细胞分泌蛋白(CCSP)，紧密连接蛋白如Z01、occludin、claudins以及肝细胞生长因子(HGF)。参与气道修复和再生的细胞和分子因子受到由上皮和间充质细胞释放的基质金属蛋白酶(MMP)、细胞因子和生长因子的调控。三叶因子家族蛋白特征在于40个氨基酸的三叶模体，其包含3个保守的二硫键。这3个链内二硫键形成了三叶模体(TFF结构域)。三叶模体是本领域已知的，例如Taupin and Podolsky, Nat Rev Mol Cell Bi0.4(9) 721-32，2003 ；Hoffmann et al., HistolHistopatholl6(I):319-34,2001 ;和 Thim, CellMol Life Sci53(11-12):888-903, 1997。在人类中，至今已鉴定了三种不同的三叶肽成员。TFFl或pS2在哺乳动物癌细胞系中作为雌激素诱导基因首次被检测到。在人胃中，它主要定位于胃粘膜的小凹细胞。TFF2(之前称为解痉多肽或SP)首次从猪胰腺中纯化出来，并在颈粘液细胞、深幽门腺和布鲁纳腺中表达。TFF3或肠三叶因子(ITF)是最后被鉴定的，主要在小肠和大肠杯状细胞中表达。三叶肽参与粘膜愈合过程，并在肿瘤疾病中异常高表达。大范围的人类肿瘤和胃肠道炎症性恶性肿瘤，包括消化性溃疡和结肠炎，克罗恩氏综合症，胰腺炎和胆道疾病都异常表达三叶肽。这些人类蛋白的同源基因已在其他动物，例如大鼠、小鼠和灵长类动物中被鉴定出来。TFF是在胃肠道黏膜中表达的稳定的分泌蛋白。它们的功能并不明确。三种三叶家族成员基因:三叶家族因子I (TFF1)、三叶家族因子II (TFF2)和三叶家族因子III (TFF3)被发现成簇分布于21号染色体上。发明概述 本发明的第一方面提供一种组合物，其包含有效量的一种或多种促再生因子，用作在患者肺部给药的药物，以增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。本发明的另一个方面涉及根据权利要求1至18的组合物的用途，通过在患者肺部给药，用于增强气道上皮修复和/或再生和/或抑制气道上皮重塑。本发明的另一个方面涉及包含有效量的一种或多种作为活性成分的促再生因子的组合物在制备药物中的用途，其在患者肺部给药，用于增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。本发明的再一个方面是提供一种组合物，其包含一种或多种作为活性成分的促再生因子，用作在患者肺部给药的药物，以增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。本发明的另一个方面涉及一种用于增强人类患者气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的方法，其包含对患者经肺部给药来给予有效量的一种或多种促再生因子。用在此处时，术语“药物在肺部沉积”和该主题的其他变化形式旨在描述通过气道进行肺部局部给药，而非全身给药，如图2中所示。为了本发明的“增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化”，其是指气道上皮内衬的修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的任何可检测到的改善，其方法描述如下。定义和缩略语氨基酸残基:氨基酸的一部分，其存在于多肽链中，其中该氨基酸通过肽(酰胺)键与其他氨基酸相连。此处所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式。然而，只要期望的功能性质被多肽保留，那么氨基酸包含每一种氨基酸，如L-氨基酸、D-氨基酸、α -氨基酸、β -氨基酸、Y-氨基酸、天然氨基酸及合成氨基酸等。进一步还包括天然的或已被修饰的合成氨基酸。ΝΗ2指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH指存在于多肽羧基末端的游离羧基。此处使用标准的氨基酸残基多肽缩写。应该指出的是，此处由通式代表的所有氨基酸残基序列从左到右均按常规的氨基末端到羧基末端的方向。此外，应该指出的是，在氨基酸残基序列的开头或末尾的破折号表示与进一步的具有一个或多个氨基酸残基的序列相连的肽键，或与诸如NH2或乙酰基的氨基末端基团，或诸如COOH的羧基末端基团相连的共价键。修饰氨基酸:其中其任意基团被化学修饰的氨基酸。特别地，优选α-氨基酸的α-碳原子发生化学修饰的修饰氨基酸。多肽:短语多肽是指包含氨基酸残基的分子，其相邻的氨基酸残基之间不包含除酰胺键之外的连接。相应地，使用短语肽。药物在肺部沉积:用在此处时，术语“药物在肺部沉积”和该主题的其他变化形式旨在描述通过气道进行肺部局部给药，而非全身给药，如图2中所示。因此，肺部沉积或局部剂量递送指针对肺部疾病局部给药至肺。作为选择，全身剂量通常描述通过肺部给药，经肺泡区域吸收进入血液循环，治疗全身性紊乱，如糖尿病、偏头痛、骨质疏松症，以及激素调节。用在此处时，“气道上皮”、“呼吸上皮”和“肺上皮”是可以互换使用的。根据本发明，药学有效量或治疗有效量将被理解为足以诱导期望的生物学结果的量，即由合格医师来确定的有效剂量，他可以滴定剂量，以达到期望的反应。剂量的考虑因素将包括效价、生物利用度、期望的药代动力学/药效动力学情况，以及治疗条件，如体重、健康状况、年龄等患者相关的因素或医师已知的其他因素。
图LA)人TFF蛋白1-3序列比对。B)人TFF1、人TFF2、人TFF3、小鼠TFF1、小鼠TFF2、小鼠TFF3、 大鼠TFF1、大鼠TFF2和猪TFF2的蛋白序列比对。相同的残基被标记为“*”，保守取代的残基被标记为“:”，半保守取代被标记为”。图2.A)全身给药，B)肺部全局给药和C)肺部局部药物沉积之间的区别。发明详述本发明涉及通过任何适当的方法，包括，但并不限于，气管内、支气管内、支气管-肺泡或肺泡内给药，例如，经由吸入，将不管如何配制的包含有效量的一种或多种促再生因子的组合物，肺部给药于包括成人和儿童的人类患者，以增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。通过气管内、支气管内、肺泡内或支气管-肺泡给药给药有效量的一种或多种促再生因子对于减轻症状和/或治疗患有肺病，包括，但不限于哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、慢性支气管炎、囊胞性纤维症、支气管扩张、细支气管炎、肺癌、肺炎、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)、社区获得性肺炎(CAP)、重度社区获得性肺炎(sCAP)或卡氏肺孢子虫的患者特别有用。上皮修复、再生和重塑如上文所述，任何传染或炎症相关的慢性疾病，如哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、支气管扩张症和囊胞性纤维症后，气道上皮会很快受到干扰。气道上皮损伤后的重塑过程包括结构变化，如鳞状细胞和/或杯状细胞增生/转化(GCH/GCM)、粘液增生、粘膜下腺体肥大、皮下纤维化和增生以及气道平滑肌细胞肥大。这导致粘液分泌过多以及气道壁肥厚，造成典型的气流限制。气道上皮非纤毛浆液性的Clara细胞代表在人小气道中进行气道更新的主要祖细胞。在慢性阻塞性肺病和/或慢性支气管炎中，气道内衬被破坏。这意味着气道建模，发生杯状细胞转化，产生高粘性粘液，且对沉积在气道中的颗粒和死肺泡巨噬细胞的纤毛清除受损。如果没有这种纤毛清除机制，外周气道，即细支气管和肺泡会受到从死肺泡巨噬细胞释放的蛋白酶的蛋白降解。相比之下，从中央气道清除粘液仅依赖于咳痰，然而，当粘液变得高粘性时，中央气道的清除也会受阻。总之，如在COPD慢性肺病和囊胞性纤维症中所见的炎症损伤气道之后，随着病理性气道重塑，外周和中央清除机制均受到阻碍。在慢性气道疾病，如慢性阻塞性肺病(C0PD)、慢性支气管炎、囊胞性纤维症和哮喘中，上述气道重塑可能大大妨碍气道上皮的先天免疫和呼吸功能。气道上皮损伤修复和再生的体外(例如2-D细胞培养)和体内模型(例如小鼠中的人气道异种移植)允许进行所谓的细胞和分子相互作用因子，即促炎细胞因子、基质蛋白酶及其抑制剂，以及细胞间粘附分子的“时空”调控的研究。例如，2-D细胞培养已表明，在气道上皮再生过程中，首先且最重要的事件之一是细胞迁移和不增殖。例如，小鼠中的人气道异种移植已被用来研究损伤后气道上皮再生的细胞和分子机制的作用。气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的增强可以通过，例如，测量由气溶胶吸入，递送到更远端气道的粘液层上而沉积的不溶性放射性标记的标记物的清除率来确定。清除率随后可以通过闪烁扫描术来测量，监测肺部局部的气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的参数，如上皮细胞迁移、细胞增殖、细胞分化和细胞功能的变化。在本发明的一个优选实施方案中，给药一种或多种再生因子可减轻或预防如下文所述的哮喘、慢性阻塞性肺病(C0PD)、慢性支气管炎、囊胞性纤维症、支气管扩张症、细支气管炎、肺癌、肺炎、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)、社区获得性肺炎(CAP)、重度社区获得性肺炎(sCAP)或卡氏肺孢子虫中的任何病症。促再生因子根据本发明的促再生因子可以是任何因子，其增强上皮修复，使中央气道以及更重要的外周气道和肺泡的清除功能得到或未得到改善，其气道恢复治疗潜能特别包括痰的量变和质变，即通过抑制细胞转化为杯状细胞，保持粘性较小粘液的性能，减少粘液产生。这反过来会改善粘液流变学，浓粘液产生量较少，粘性较小的浆液产量较多。而且这样的治疗刺激纤毛细胞的生长和再生。综合考虑，这样的气道重塑过程将通过减少粘液粘性和改进的纤毛清除，改善清除机制，有效改善患者症状和肺功能。根据本发明的促再生因子包括，但不局限于，防御蛋白如防御素，表面活性蛋白如SP-A, SP-B, SP-D，粘蛋白，slgA，乳铁蛋白，葡糖氨基葡聚糖，Clara细胞分泌蛋白(CCSP)，紧密连接蛋白如Z01、occludin、claudins以及肝细胞生长因子(HGF)和三叶因子家族蛋白。根据本发明的其他促再生因子包括，但不限于，参与气道修复和再生的细胞和分子因子，其受到由上皮细胞和间质细胞释放的基质金属蛋白酶(MMP)、细胞因子和生长因子的调控。三叶家族此处提及的“TFF”、“TFF蛋白”、“三叶家族蛋白”或“TFF家族蛋白”是指包括TFFl、TFF2和TFF3的相关蛋白的组。在相同物种中，TFF蛋白具有至少约28%至45%的氨基酸同一性(参见图1A和B)。三叶家族的所有成员都包含在本发明中，其包括，但不限于SEQ IDN0.1的人三叶家族因子1、SEQ ID N0.2的人三叶家族因子2和SEQ ID N0.3的人三叶家族因子3。P-型三叶或 P-结构域[KRH] -X (2) -C-x- [FYPSTV] -χ (3，4) - [ST] -χ (3) _C_x (4) -C-C-[FYWH]是45个残基、富含半胱氨酸的区域，其中6个半胱氨酸通过3个二硫键以1_5、2-4,3-6的方式连接在一起， 即:
权利要求
1.种组合物，包含一种或多种促再生因子，用作药物以在终端肺单位(TLU)、肺泡间隔、肺间质和肺实质中增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。
2.据权利要求1的组合物，其中，有效量的一种或多种促再生因子通过气管内、支气管内、肺泡内或支气管-肺泡给药给予患者。
3.据前述任一项权利要求的组合物，其中，促再生因子是来自三叶家族因子(TFF)家族或其变体的肽或蛋白。
4.据前述任一项权利要求的组合物，其中，促再生因子是三叶家族因子(TFF)家族肽的二聚体。
5.据前述任一项权利要求的组合物，其中，促再生因子是三叶家族因子3(TFF3)或其变体。
6.据前述任一项权利要求的组合物，其中，促再生因子是三叶家族因子3(TFF3)的二聚体。
7.据前述任一项权利要求的组合物，其中，促再生因子是三叶家族因子3(TFF3) 二聚体的衍生物或类似物。
8.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者有慢性气道疾病。
9.据前述任一项权利要求的组合物，其中，慢性气道疾病选自由哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、囊胞性纤维症、支气管扩张症、细支气管炎、肺癌、肺炎、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)、社区获得性肺炎(CAP)、重度社区获得性肺炎(sCAP)和卡氏肺孢子虫组成的组。
10.据前述任一项权利要 求的组合物，其中，患者给予含有一种或多种促再生因子的雾状溶液或悬液。
11.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者给予雾状气溶胶或吸入性粉末形式的一种或多种促再生因子。
12.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者通过支气管肺泡灌洗给予含有一种或多种促再生因子的溶液。
13.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者通过盲探气管清洗给予含有一种或多种促再生因子的溶液。
14.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者给予聚乙二醇化、脂质体或纳米颗粒制备形式的一种或多种促再生因子。
15.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者在支气管镜检期间给予一种或多种促再生因子。
16.据前述任一项权利要求的组合物，其中，连同一种或多种促再生因子的给药一起，患者给予额外的药物，例如像吸入性肺部局部类固醇。
17.据权利要求16的组合物，其中，连同一种或多种促再生因子经吸入或经静脉注射的给药一起，额外的药物可以在促再生(即TFF类型的药物或其变体)之前、之中、之后施用，例如像吸入性肺部局部β -2受体激动剂或其他支气管扩张剂或吸入性类固醇。
18.据权利要求16的组合物，其中，额外的药物在治疗前、中、后全身给药，例如作为静脉注射抗炎药物、类固醇和或促生长因子。
19.据权利要求16的组合物，其中，额外的药物全身给药，例如作为静脉注射类固醇和或口服给药的促生长因子。
20.据前述任一项权利要求的组合物，其中，一种或多种促再生因子以每千克体重每天0.1微克至10毫克的量给予患者。
21.据前述任一项权利要求的组合物，其中，患者是哺乳动物。
22.据权利要求21的组合物，其中，哺乳动物是人。
23.据权利要求22的组合物，其中，人是年龄小于12岁的孩子。
24.据权利要求22的组合物，其中，人是年龄大于12岁的成年人。
25.据权利要求1至24的组合物的用途，通过在患者肺部给药，用于增强气道上皮修复和/或再生和/或抑制气道上皮重塑。
26.种组合物，包含有效量的一种或多种促再生因子，在患者中用作药物，用于在终端肺单位(TLU)、肺泡间隔、肺间质和肺实质中增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。
27.含有效量的一种或多种作为活性成分的促再生因子的组合物在制备用于增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的药物中的用途。
28.种组合物，包含一种或多种作为活性成分的促再生因子，在患者中用作药物，用于增强气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化。
29.种用于增强人类患者气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的方法，包含对患者给予有效 量的一种或多种促再生因子。
全文摘要
本发明提供用于提高或引发气道上皮修复和/或再生和/或气道上皮重塑正常化的方法，使用局部沉积一种或多种促再生因子，优选来自三叶家族因子(TFF)家族的肽或蛋白。促再生因子给予患者，用于治疗慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎、囊胞性纤维症、哮喘、支气管扩张症、细支气管炎、肺炎、呼吸机相关肺炎(VAP)、医院获得性肺炎(HAP)、社区获得性肺炎(CAP)、重度社区获得性肺炎(sCAP)和卡氏肺孢子虫，或给予经受肺部损伤的患者，该损伤使基于功能完善的纤毛的黏膜纤毛运输系统功能减弱，例如吸入有毒烟雾。本发明还提供治疗和/或预防或先发制人(preemptive)，例如基于预先确定的患者群体，像干预吸烟者，以提高正在进行的气道上皮修复和/或气道纤毛的再生，改善粘膜纤毛清除。促再生因子通过气管内、支气管内、肺泡内或支气管-肺泡给予。例如通过吸入气溶胶或以干粉配给和/或以支气管肺泡灌洗(BAL)给予有效量的制剂。
文档编号A61P11/00GK103096917SQ201180038244
公开日2013年5月8日 申请日期2011年6月3日 优先权日2010年6月4日
发明者谢勒·菲亚拉, 拉尔斯·赫斯莱特 申请人:三叶草私人有限公司