参麦注射液的化学成分的制备及其在治疗心脑血管疾病中的应用的制作方法

专利名称：：参麦注射液的化学成分的制备及其在治疗心脑血管疾病中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种应用于治疗心脑血管疾病的中药注射剂的新化合物和活性化学成分的制备方法及在治疗心血管疾病方面和质量控制方面的应用。
背景技术：
：参麦注射液(又称"参麦水针剂"，以下简称"参麦针")是古方"生脉散"的衍变方，由红参和麦冬两种中药材经现代工艺提取加工而成，用于治疗气阴两虚型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症，为国家中药保护品种，系基本急救药品。参麦针已有20余年的临床应用，但是其中的活性成分一直不是很清楚，目前的参麦针的质量标准只规定了人参(红参)里的三个人参皂甙Rbt、Rg,和Re的含量测定，而对处方中的另一味药材麦冬的有效成分根本没有体现，这对于药品生产中对麦冬部分的质量控制是非常不利的，从而对参麦注射液的质量控制也是相当不利的。同时，市场上存在的大量的含麦冬中药制剂，比如生脉胶囊、益心口服液、心通口服液等，长期以来也一直缺乏对麦冬部分的有效质控方法，含麦冬中药制剂的质控方法也是有待解决的问题。
发明内容本发明的目的是通过对参麦针的麦冬原液所含化学成分及其在抑制心肌细胞凋亡、促进血管内皮细胞一氧化氮(NO)释放、促进心肌细胞增殖和抑制2，2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐(简称AAPH)引起的氧化等药理活性测试的研究，确定其中用于治疗心脑血管疾病的有效成分，此研究可以用于拓展参麦针产品的质量控制指标以保证这个复方药物在生产中的质量，及参麦针的二次开发以提高心脑血管疾病的治疗效果。本发明主要将参麦针的麦冬原液经大孔树脂吸附，以水和含乙醇水溶液洗脱，再经硅胶柱、反向硅胶柱(RP—18)、葡聚糖凝胶柱等层析分离，高效液相分离和结晶升华等方法得到9个化合物，分别为I(2-莰醇)、iH2-莰醇葡萄糖苷)、111(2-莰醇-0-芹糖(1-6)葡萄糖苷)、IV(2,5-莰二醇)、V(甲基麦冬二氢高异黄酮B)、VI(羟基甲基麦冬二氢高异黄酮B)、VEa(2P-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A)、VIIb(2ci-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A)、VD1(川麦冬皂苷A,Ophiopoj即oninA)。研究表明，这9个化合物分别或同时具有抑制心肌细胞凋亡、增加血管内皮细胞一氧化氮(NO)释放、促进心肌细胞增殖和抑制AAPH引起的氧化等功效。本发明公开了上述9个活性化合物的制备方法，其中化合物VI、VHa和VEb经鉴定为全新化合物，化合物i和iv为首次从浙麦冬中分离得到，化合物n、III、V和VI的制备方法与文献报道不同(化合物结构和化学名如下)。本发明还公开了一种新的参麦注射液的质量控制方法。包括如下内容对新化合物VI、Vfla和VIIb以及活性化合物V、Vi以及以及人参皂苷Rb,进行定量控制，在一定的色谱条件下测试参麦注射液液相图谱，要求每lral含Rb,不得少于80Pg/ml，含V不得少于1.5pg/ml，含VI不得少于0.8吗/ml，含VHa不得少于O.7)_ig/ml，含VHb不得少于O.7pg/ml，含Vffl不得少于5pg/ml。所述的一定的色谱条件，包括如下因素色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(包括AgilentZorbaxC18)。流动相A为50腿ol/L的KH2P0,溶液，B为80%的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例0—5min，25%;5—50min，25%—64%;50—65min，64%;65—75rain，64%—85%;75—90min，85%。检测波长为203nm。流速lml/min。柱温为40。C。应用本发明，我们将上述6个质控指标(新化合物VI、VEa和VIIb以及活性化合物V、Vffl以及以及人参皂苷Rb,)的含量要求作为产品出厂检验的检验质控标准，将参麦注射液的新检测技术成功应用于参麦注射液的生产检验质量控制，由于新增加麦冬心血管活性有效成份作为质控指标，与传统质控技术比较，所得参麦注射液产品质量更为稳定可靠，初步解决了传统参麦注射液生产中对麦冬部分的质量控制不利的局面。应用本发明的化合物VI、VIIa和Vllb，对于含麦冬中药制剂以及其他含VI、vna和viib的中药制剂的产品质量标准完善和产品质量提高也是显而易见的。图i、化合物i、n、vi和vni对血管内皮细胞促进No释放的作用图2、化合物i、n和m对aaph引起的氧化作用的抑制效果图3、Rb,对照品液相图谱图4、V对照品液相图谱图5、VI对照品液相图谱图6、VHa对照品液相图谱图7、vnb对照品液相图谱图s、vm对照品液相图谱图9、供试液(参麦注射液)液相图谱图10、缺麦冬方参麦注射液液相图谱具体实施例方式1.化合物I一VOI的制备方法(1)试剂和分离材料分离所用溶剂(乙醇、石油醚、氯仿、丙酮、甲醇、乙酸乙酯)为分析纯溶剂，制备型的高效液相所用溶剂乙腈为色谱纯，水为自制二次重蒸水，其他分离用水为蒸馏水。200-300目柱层析硅胶和薄层层析用硅胶H，青岛海洋化工集团有限公司高效薄层硅胶板HSGF254，山东省烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂，烟台0DS反相硅胶(RP-18):绿百草科技发展有限公司，北京大孔树脂D-1400型大孔树脂，扬州制药厂，扬州葡聚糖凝胶S印hadexLH-20，PharmaciaBiotechAB，瑞典乌普萨拉制备型高效液相仪VarianHPLC系统(Pr印Star-SD-1泵，UV-Vis320紫外检测器)(2)化合物I一WI的制备方法a)10公斤的浙麦冬药材按照参麦注射液中的麦冬提取生产工艺，将麦冬投入回流锅内，加三倍量90%乙醇。加热80-90。C连续回流2次，每次2小时，制备得到麦冬原液；经4(TC减压浓縮后，用大孔树脂柱层析分离，以水、10%、20%、40%、60%、80%及95%乙醇梯度洗脱，获得麦冬原液的水、10%、20%、40%、60%、80%及95%乙醇的洗脱部分；b)a步骤中获得的95。/。乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，依次用石油醚、氯仿、梯度从1:0至l:l的氯仿一丙酮、梯度从50:1至l:l的氯仿一甲醇为展开剂洗脱至无色；比例为10:1氯仿一丙酮洗脱部分用硅胶柱层析进一步分离，以比例为2:l石油醚一乙酸乙酯作为展开剂，用薄层硅胶层析板检测，合并相同和相似组分，获得化合物VI、VIIa及Vnb混合物为主的富集部分，其中Rf值0.44为化合物VI，Rf值0.37为VIIa及Wb的混合物，再用葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱纯化，以氯仿为展开液可获得vi和vn，后者为一对差向异构体，用制备型的高效液相制备可得到单体化合物VIIa及VEb，制备液相为Pr印Star系统，1.2x25cm的merckODS填充柱，流动相A为水，B为乙腈；B的比例为30%—60%，0—30分钟;比例为50:1的氯仿一丙酮洗脱部分继续用硅胶柱层析分离，以比例为5:1的石油醚一乙酸乙酯的为展开剂，可获得化合物V，其Rt二0.4;比例为50:1的氯仿一甲醇洗脱部分用硅胶柱层析在25:1的氯仿甲醇为展开剂条件下进一步纯化，用薄层硅胶层析板检测，合并相同和相似组分，可获得化合物I富集部分，其R产0.54，再经升华可得化合物I。c)a步骤中的80%乙醇洗脱部分用硅胶柱分离，用梯度从50:1至1:1的氯仿_甲醇为展开剂洗脱；其中10:1的氯仿一甲醇洗脱部分再用硅胶柱层析，采用展开剂为5:1:0.1的氯仿一甲醇一水分离，用薄层硅胶层析板检测，合并相同和相似组分，获得化合物II富集部分，其R,二0.49，再用RP-18反相硅胶柱纯化，用2:1的乙醇-水作为分配溶液冲洗可以获得单体化合物II。d)a步骤中获得的40。/。乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，用梯度从20:1至l:l的氯仿一甲醇为展开剂洗脱。5:1的氯仿一甲醇洗脱部分进一步用硅胶柱层析分离，展开剂采用的是4:1:0.1的氯仿一甲醇一水，可得到化合物VI，其Rf=0.21;其剩余部分经RP-18反相硅胶柱分离纯化，用4:1的甲醇-水作为分配溶液可分别获得化合物m和IV，其R,值分别为0.31和0.14。其中，化合物VI、Wa和VHb被鉴定为新化合物，化合物I和IV为首次从浙麦冬中分离得到，化合物II、III、V和環的制备方法与文献报道不同。关于化合物n、m、V和VEI的制备方法，有文献报道(金田宣，等.YAKUGAKUZASSHI(药学杂志)，1983，103(11):1133-1139)，中国产麦冬20kg用100L甲醇回流，除去甲醇后加水使之悬浮，分别用乙醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取；乙醚部分用硅胶柱层析分离，以正己垸、苯一正己烷(1:1)、苯、正己烷一乙醚(5:1)、苯一乙醚(10:1)、氯仿冲洗；正己烷一乙醚(5:1)冲下部分析出结晶V;正丁醇提取部位经硅胶柱层析，以氯仿一甲醇(7:1)、氯仿一甲醇—水(100:10:1)、乙酸乙酯一甲醇一水(200:15:1)为展开剂梯度冲洗，分别得到单体化合物II和III。另有文献报道(戴好富，等.植物学报，2001，43(1):97-100)，10公斤川麦冬用95%乙醇提取，浓縮提取液除去乙醇后，加水溶解(悬浮)，经大孔树脂D-101柱层析分离，用水和甲醇冲洗，甲醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，以氯仿一甲醇一水(4:1:0.l)为展开剂，分得8个馏分；第二个馏分经硅胶柱(氯仿一甲醇一水，8:1:0.09)和反相硅胶柱(RP_18，甲醇一水，6:4—7:3梯度)层析分离，得到单体化合物VDI。3)理化数据i)测试仪器和条件熔点Fisher-Johns熔点仪旋光Perkin-Elmer-341旋光仪红外Nicolet-Magna-750-FTIR红外光谱仪电喷雾质谱(ESI-MS):LCQ-Deca质谱仪电子轰击质谱(EI-MS):MAT-95质谱仪核磁共振Bruker-AV-500和Bruker-300核磁共振仪ii)化合物I(2-莰醇，54mg，得率0.00054%):白色结晶(甲醇)，熔点208°C，旋光["]2D°=-38°(c=5，EtOH)，分子式UH180，分子重154;ESI-MS155([M+H]+)，153([M—H]—);'H丽R(CDCl:,,300MHz，《)0.81(6H，s，Me-8和Me-9)，0.83(3H，s，Me-10),0.95(1H，必，/二13.3，3.6Hz，Hax—3)，1.58(1H，t，月.6Hz,H-4),3.94(1H，械/二10.0,3.7，2.0Hz，H-2);1:5C丽R(pyridine—d，125MHz，5):13.35(C—10)，18.48(C—8)，19.46(C—9)，26.79(C-6)，28.03(C—5)，36,84(C-3)，44.82(C-4)，47.12(C-7)，49.23(C—1)，83.16(C—2).CanJChem，1979，57，733iii)化合物I1(2-莰醇葡萄糖苷，365mg,得率0.00365%):白色针状结晶(甲醇)，熔点125-127°C，旋光[ff]2^-8.6(c=0.3，MeOH)，分子式ClfiH2A，分子重316;ESI-MSUA):317([M+H]+)，315([M—H]一);'H丽R(pyridine-^,300MHz，》0.75(6H，s，Me—8禾隨e-9)，1.05(3H，s，Me—10)，4.51(1H，浙/二11.4，2.2Hz，H-2)，4.89(1H，《/二7.8Hz，H-l');"C丽R(pyridine—d，125MHz，5):14.3(C—10)，18,9(C—8)，19.9(C一9)，27.2(C—6):28.6(C—5)，38.1(C—3)，45.5(C—4)，48.8(C—7)，50.0(C—1)，86.2(C—2)，106.2(C-1')，75.6(C-2')，78.7(C-3')，71.9(C-4')，78.2(C—5')，63.1(C-6')。药学杂志(YakugakuZasshi)1983，103(11):1133iv)化合物III(2-莰醇-6^芹糖(1-6)葡萄糖苷，84mg，得率0.00084%):白色针状结晶(甲醇)，熔点183-185。C，旋光["]2。°=-53.4(c=0.44，MeOH)，分子式C21H36010，分子重448;IRv版腿cm—1:3400，2982，1054;ESI-MSU/z):449([M+H]+)，447([M—H]—)力NMR(pyridine—d，300MHz，5):5.86/2.3Hz)，4.85(夂/二7.7Hz，H-1')，4.77(《/=2.3Hz'H-1〃)，4.73(浙/二11.2，1.8Hz，H-2)，4.59("/=9.4Hz，Ha-5〃)，4.37(《/=9.4Hz，Hb-5〃)，1.04O,10-Me)0.81O,8-Me)，0,74(s，9-Me)1:,C應R(pyridine-d，125MHz，5):86.14(C-2)，49.89(C-1)，47.57(C-7)，45.33(C-4)，38.08(C-3)，28.54(C—5)，27.08(C—6)，19.81(C—8),18.89(C—9)，14.13(C—10)，106.16(C—1')，78.57(C-3')，77.83(C-5')，75.42(C—2')，71.84(C—4')，68.76(C-6'),111.06(C-1〃)，80.54(C—3〃)，77.17(C—2〃)，75.01(C—4〃)，65.63(C—5〃)。药学杂志(YakugakuZasshi)，1983，103(11):1133v)化合物IV(2，5-莰二醇，29mg，得率0.00029%):白色结晶(甲醇)，熔点255-257°C，旋光["K('=-16.12"(c=0.46，MeOH)，分子式d',HnA，分子重170.251;ESI-MS(/s/z):171([M+H]+)，193([M+Na]+).'H醒R(pyridine—4,300MHz):S0.92(3H，s，H—9orH-10)，1.21(3H，sH—9orH-IO)，1.42(3H，s，H-1),4.36(1H，br.s，H-3)，5.21(1H，bu，H-7);13CNMR(pyridine—d，125MHz,5):13.2(C—1)，50.4(C—2)，74.5(C-3),34.9(C-4)，53.1(C-5)，40.1(C—6)，82.5(C—7)，47.3(C-8)，20.0(C—9),21.2(C-10)。Phytochemistry，1983,22(3):774vi)化合物V(甲基麦冬二氢高异黄酮B，860mg，得率0.0086%):白色粉末，分子式C19H205，分子量328;EI-MS(/ff/z):328(M+,36)，310(M-H20)，207(4)，135(16),121(100).丽R(CDC13，500MHz，《)4.09(1H，J《/二12.0，7.0Hz，H-2)，4.31(1H,浙/二12.0，3.0Hz，H-2),2.72-3.08(1H，巡，H—3)，12.34(5—OH)，2.03(3H，&6-Me),2.08(3H，s，8-Me)，2.66(1H，姻/二10.0，10.OHz，H-9)，3.20(1H，"/二10.0Hz，H-9)，7.15(2H，《/二9.0Hz,H-2'andH-6')，6.87(2H，《/二9.0Hz,H-3'andH-5')，3.80(3H，■，7'-OMe);13C丽R(CDC13，125MHz,5):68.6(C-2，。，46.6(C-3，o)，198.3(C—4，s)，159.3(C—5，s)，102.6(C—6,s),160.4(C—7，s)，102.0(C-8,s)，31.8(C—9，zO，157.5(C—10，s),101.3(C-11,s)，8.0(6—Me,，7.6(8-Me，《)，129.8(C—1'，s)，129.8(C—2'，o)，113.8(C—3'，d，158.1(C—4''o)，113.8(C-5'，o)，129.8(C-6'，o),55.0(5'-0Me，^).vii)化合物VI(羟基甲基麦冬二氢高异黄酮B，620mg,得率0.0062%):白色针状结晶(丙酮)熔点159-160°C，分子式C19H2。0，分子重344;EI-MS:344[M]+(80)，326[M—H20]+，220(25)，208(84),207(62)，137(100)，121(5)，84(40)，77，56.醒R(CDC13，500MHz，5):4.25(1H，浙/二12.0，7.0Hz，H—2)，4.42(1H,/二12.0，3.0Hz'H-2)，3.30—3.40(IH，/,H—3)，13.10(5—0H)，2.30(3H，&6—Me)，2.39(3H,s，8—Me)，2.95(IH，浙/二10.0，10.0Hz，H-9)，3.75(1H，d,/二10.0Hz，H-9)，7.10(IH，"/二8.2Hz,H-2')，6.58(IH，W/二8.2，2.4Hz，H-3'),6.78(1H，"/二2.4Hz，H—5')，3.80(3H，&7'-0Me);13C丽R(CDC1:,，125MHz，5):69.9(C-2，t)，45.4(C—3，》，198.4(C—4，5)，158.4(C—5，s)，102.5(C—6，s)，160.2(C-7,s)，104.5(C-8，s)，27.6(C-9，t)，157.7(C-10，s)，102.3(C—11，5)，8.8(6—Me,《)，8.5(8—Me，g)，118.2(C—1'，■)，132.1(C—2'，104.5(C—3'，o)，158.1(C—4'，s)，103.3(C—5'，0)，164.1(C—6'，s)，55.0(5'-0Me，。).ChemPharmBull,1980，28(5):1477viii)化合物VIIa(2"-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A，20mg，得率0.0002%):黄色无定形粉末，分子式C19Hl807，分子量358;EI-MS(%，/s/z):358[M]+(56),340[M-H20]+(16)，329(20)，181(35)，135(100);'HNMR(CDCl:,，500MHz,5):12.22(1H,s，5-OH)，6.70-6.65(3H，重叠信号，H-2'，H-3'andH-6')，5.94(2H,^H—7')，5.56(1H，br.《H-2)，3.41(1H，浙14.1，4.7Hz，H-9a)，3.11(1H，叫H—3)，2.71(1H，oW，/:14.1，10.7Hz，H—9b)，2.03(6H，&6-Meand8-Me);13C丽R(CDC1:,，125MHz)&96.3(C-2,t)，51.4(C—3，o),196.4(C—4，s)，159.1(C—5，￡■)，103.5(C—6，s),161.0(C_7，5)，102.9(C—8，s)，30.1(C—9，。，153.4(C—10，s)，102.4(C—11，》，7.7(6-Me，。)，7.2(8-Me,131.4(C-1',s)，109.6(C—2'，o)，108.6(C—3'，o),146.6(C—4'，108.7(C一5'，》，122.6(C-6',力，101.3，(7'-C，。.ix)化合物VIIb(2"-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A,18mg,得率0.00018%):黄色无定形粉末，分子式C,yH,A，分子量358;EI_MS0z//z):358[M]+(56)，340[M-H20]+(16)，329(20)，135(100)，121(12);'H-丽R(CDC13，500MHz,5):12.22(1H，s，5-OH),6.70-6.65(3H，重叠信号，H-2',H-3'和H-6')，5.94(2H，■，H-7')，5.50(1H'br.&H-2)，3.41(1H，浙/二14.1,4.7Hz，H-9a)，3.11(IH，a,H—3)，2.71(1H，^/，/二14.1，10.7Hz，H—9b)，2.03(6H's，6-Meand8—Me);l3C醒R(CDC13，125MHz，3):95.4(C—2'。，52.9(C—3，》，197.5(C-4，s)，159.1(C—5,》，103.8，(C-6，s)，161.5(C—7,5),102.9(C—8，5"),.34.6(C—9，t)，153.8(C-10,，102.0(C—11，5),7.9(6-Me，《)，7.2(8-Me,<7),132.3(C-1'，》，109.9(C—2'，d，108.6(C-3'，d，148.0(C一4'，s)，108.6(C-5',s)，122.2(C—6'，o),101.3(C—7'，.x)化合物VEl(川麦冬皂苷A,0phiopojaponinA，120mg，得率0.0012%):白色针晶(氯仿一甲醇，1:1),熔点230-232",旋光["]2D°=45.7°"=0.35，Me0H);ESI-MS(历/z):913([M+H]+).醒R(C5D5N，500MHz,。0.66(3H,"/二5.4Hz，Me-27)，0.95(3H，s，H-18)，1.07(3H，H-19),1.22(3H,《/=7.lHz，H—21)，1.78(3H，《/:6.6Hz，RhaH—6)，1.99(3H，■s,CH3C0),4.01(1H，t，/二6.9Hz,Xyl-H-2)，4.17(1H，重叠信号，Glc—H-2)，4.17(1H，重叠信号，Glc-H-3)，4.17(1H，重叠信号，XylH-3)，4.20(1H，重叠信号，RhaH-5)，4.25(1H，历，Rha-H-4)，4.72(1H，岛Rha-H-3)，4.90(IH，"/二7.2Hz，Glc—H—1)，5.02(1H,《/二7.7Hz,Xyl—H—1)，5.27(1H，岛H-6)，6.05(1H，"/二4.9Hz，Rha-H-2)，6.13(1H，br.《Rha-H-1)."'C-丽R(C5D5N，125MHz,，《)武元部分9.6(C-21)，17.2(C-18)，17.3(C—27)，19.5(C-19),21.0(C-ll)，28.9(C—24)，30.2(C-2)，30.5(C-25)，31.7(C—23)，32.1(C—7)，32.1(C-12),32.4(C—8)，32.5(C—15)，37.2(C—10)，37.6(C—1)，39.1(C-4),44.9(C—20)，45.2(C-13),50.4(C—9)，53.1(C—14),66.8(C—26)，78.4(C—3)，90.2(C—16)，90.2(C—17)，110.0(C—22)，121.9(C-6)，140.9(C-5);糖部分100.1(C—la)，77.1(C-2a),81.5(C-3a)，70.8(C一4a)，78.5(C-5a)，61.8(C—6a)，98.8(C—lb)，74.0(C-2b),70.5(C—3b)，74.2(C-4b)，69.4(C—5b)，18.6(C—6b)，21.0(CH3CO)，177.6(C)，105.8(C-lc)，75.0(C—2c),77.3(C-3c)，70.8(C—4c)，67.4(C—5c).植物学报，2001，43(1):972.生物活性测试2.1化合物抑制心肌细胞凋亡的测试细胞凋亡(Apoptosis)亦称程序性细胞死亡(Progra國edCellDeath),它不同于组织坏死或突发性细胞死亡，在机体生命活动中调控着细胞增殖与更新间的平衡，维持组织器官正常生理功能及细胞数量相对稳定(BrJCancer,1972，26，239)。现代的分子生物学和药理学研究表明，心肌细胞在各种刺激因子的诱导下存在凋亡现象，凋亡的心肌细胞参与了致病的过程，是心肌梗死、心力衰竭、心律失常、心肌病及病毒性心肌炎等多种心血管疾病发生与演变的细胞学基础(心脏杂志，2002，14(4)，347)。2.1.1测试原理:在大鼠心肌细胞中加入不同浓度的样品溶液，在缺血/再灌注(I/R)条件下诱导细胞凋亡，对比不加入样品的空白，评估样品对心肌细胞凋亡的保护作用。2.1.2实验方法:将6孔板和载玻片用90%的乙醇消毒，在每个孔里放置7.5><10''cell/mlH9c2(2-1)原代单层心肌细胞(1ml)和2mlDMEM(Dulbecco，sModifiedEagleMedium)培养液，生长1.5天，移除培养液，加2mlI/RMedia(可使细胞缺氧，模拟体外缺血的一种介质)和样品溶液，每组6个复孔，60分钟后移除培养液，再加入正常的2ml培养液(无色的DMEM)和样品溶液，30分钟后移除液体，用lmlPBS洗3次，加lml有机溶剂(甲醇一丙酮，1:1)固定细胞，将6孔板放置冰箱一20。CIO分钟，取出加lml甲醇使细胞渗透，再放入冰箱一2(TC10分钟，取出用lmlPBS洗涤3次，移出载波片，用吸墨纸吸干液体，用胶水将有细胞的载波片固定在标记好的载波片上，加一滴PBS到载波片上防止细胞干掉，将载波片放置密闭的玻璃容器10分钟使充分润湿，取出，吸干液体，均匀加20(VlHoechst染色剂于载玻片，将载玻片放置阴暗处10分钟，然后用PBS冲洗掉残余的染色剂，用吸墨纸吸干，加一滴抗褪色剂，用玻片封装，放置冰箱于4'C储存。然后用荧光显微镜(激发光波长352nm,发射光波长461nm)观察细胞凋亡情况。2.1.3实验结果如表1所示，化合物I和II在10到100^g/ml浓度时能明显抑制I/R导致的心肌细胞凋亡，且有浓度依赖效应；表2揭示化合物III在10到100Pg/ml能抑制由I/R引起的细胞凋亡，化合物IV在100w/ml时有抑制细胞凋亡的作用；表3表明化合物V和V111在50到100fig/ml时能抑制由I/R引起的细胞凋亡。表1、化合物I和II对缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡的抑制作用平均凋亡细胞数标准偏差T-检验KCtrl保护率Ctrl(DMSO)4.180.0057-—I/R(DMSO)11.760.00631.094E-12—I10Pg/ml7.010.00429.326E-0540.39%50Pg/ml6.310.00620.00746.34%100Hg/ml6.590.00630.00343.96%II10Pg/ml7.640.00511.681E-0535,03%50Pg/ml5.900.00630.02749.83%100Pg/ml5.040.00380.02557.14%"=6,Ctrh不加1/R媒介和药物的空白对照；I/R:模型对照组表2、化合物III和IV对缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡的抑制作用样品平均凋亡细胞数标准偏差T-检验K$Ctrl保护率Ctrl3.320.0021一_I/R10.180.0045_III10Pg/ml7.020.0044(:■■00231.04%50Hg/ml9.790.00350.0033.83%100Pg/ml6.740.00470.00133.79%IV10Hg/ml10.90.00430.010-7.07%50Pg/ml10.10.00610.0020.79%100Pg/ml8.50.00490.01616.50%/7=6,Ctrl-不加1/R媒介和药物的空白对照；I/R:模型对照组。表3、化合物V和W对缺血/再灌注引起的心肌细胞凋亡的抑制作用样品平均凋亡细胞数标准偏差T-检验Ctrl保护率Ctrl1.80.0025_—I/R11.70.0033——V50Pg/ml8.80.00210.00324.79%100lVml8.80.00520.01824.79%VI50Pg/ml9.80.00330.01216.24%100Pg/ml7.140.00410.Oil38.97%f6，Ctr卜不加1/R媒介和药物的空白对照；I/R:模型对照组。2.2、检测化合物激活内皮细胞一氧化氮合成酶(NOS)的活性科学研究发现，许多用于血管舒张的药物，如硝基化物、乙酰胆碱、缓激肽等都是通过作用于血管内皮细胞，使其释放出一氧化氮(NO)而使血管平滑肌松弛(Nature,1987,327，524)。NO是一种脂溶性的气体小分子，由L-精氨酸在一氧化氮合成酶(NOS)作用下合成的，它在内皮细胞中生成，可以进入到平滑肌细胞，使血管扩张，还可影响血小板的运动。因此，N0可以预防和治疗冠心病和脑中风等心血管疾病，还可以防止其他细胞发生功能性障碍。2.2.1测试原理N0S是定量催化生成一氧化氮(NO)的功能酶，生成的NO具有舒张血管、抑制血管平滑肌细胞增殖等功能，在体内，N0以硝酸根(NO:,—)，亚硝酸根(N02—)和亚硝基硫醇(R-S-N=0)的形式存在，一氧化氮分析仪(NitricOxideAnalyzer)可以用三氯化钒一盐酸在9(TC时将上述NO物质定量还原成气相的N0，通过一个气相的化学发光(N0+臭氧)反应检测NO的量，可以检测细胞内总的NOS的活性。2.2.2测试方法将购买的人内皮细胞(HUVEC)放置于24孔板，加培养液(500)liLDMEMmedium+10%FBS+抗生素)培养过夜，吸尽培养液，另加入50(VL不加FBS的DMEM，每孔加入不同浓度的化合物样品(阳性对照物或空白)，每组6个复孔，培养4小时，然后于冰箱4。C储存，用NO分析仪(NOA^280)检测每个样品的NOS含量。表4、参麦针的化学成分对血管内皮细胞促进NO释放的作用样品浓度(Pg/ml)N0释放率(^M2)NO平均释放率标准偏差<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.2.3测试结果以麦冬促进NO释放最强的活性部位M2在100ng/ml的NO释放量(45nraol/mgK空白2nmol/mg，相当于10i^g/ml的硝酸甘油释放量的3倍)为阳性对照(100%),如表4和图1所示，化合物VI和WI有显著的促进NO释放的作用，在O.01^g/ml浓度时可以达到M2(100Pg/ml)的60%和50%左右的NO释放量；化合物I和II也有较强的促进NO释放的作用。2.3化合物对心肌细胞增殖的促进作用2.3.1测试原理在心肌细胞中加入不同浓度的样品溶液对比不加入样品的空白，评估样品对心肌细胞增殖的促进作用。2.3.2实验方法基本同2.1.2，区别在于实验过程中不加I/RMedia诱导细胞凋亡。2.3.3实验结果2.3.3.1Hoechst染色法测定增殖如表5所示，化合物W(Vila+Vllb1:1混合物)和WI在50和250^g/ml时能显著促进心肌细胞的增殖。_表5、化合物vn和vni对心肌细胞增殖的促进作用_<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.3.3.2MTT法测定心肌细胞增殖如表6所示，化合物VE(Vila+VHb1:1混合物)和WI在50和25(Vg/ml作用于正常的心肌细胞时，其吸光度A值明显高于对照组，说明化合物VII和VIfl能显著促进心肌细胞的增殖。_表6、化合物vn和vm对心肌细胞增殖的促进作用<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4化合物对AAPH导致的氧化的抑制作用低密度脂蛋白(LDL)是人体内血管中主要携带、运载胆固醇的脂蛋白，它能被体内的某些细胞产生的氧自由基氧化修饰，形成泡沫细胞，沉积于血管壁上，从而引发动脉粥状硬化等心血管疾病。抗氧化剂可以清除血管中的氧自由基，抑制LDL的过氧化，可以治疗和预防动脉粥状硬化等心血管疾病。(Arteriosclerosis,1987，1，9)2.4.1测试原理2，2-偶氮二(2-脒基丙烷)二盐酸盐^厶^可以将二氢若丹明123(Dihydrorhodamine123，dihydrochloridesalt,DHR)定量氧化为可发出绿色荧光的若丹明123(rhodamine123，Rh)，Rh的量可以用荧光酶标仪检测。DRHRh2.4.2测试方法在消毒的96孔板上加入3(V150(VMDHR、15^1不同浓度的样品溶液或阳性对照物水溶性维生素E(Trolox)，45pl甲醇，再将新配置的60pl的50mMAAPH于每孔(除空白外)、放置VersaMax荧光酶标仪运行90min(设定检测波长500nm).2.4.3实验结果如表7及图2所示，化合物III对AAPH诱导的氧化作用的抑制效果最为明显，且有浓度依赖效应；化合物I和II也有较强的抗氧化效果。表7、参麦针的化学成分对AAPH引起的氧化作用的抑制效果<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>AAPH:不加药物的模型组；Trolox:阳性对照组3化合物V-M的HPLC图谱及其在参麦注射液质量控制中的应用研究3.l.仪器与试药Agilent1100Series高效液相色谱仪，乙腈为色谱纯，甲醇为色谱纯，KH2P04为分析纯，水为重蒸水。人参皂苷R^对照品由中国药品生物制品检定所购买，麦冬化合物V，VI，VIla，VEb，VI标准品为自制，参麦注射液由正大青春宝药业有限公司提供，批号分别为0607031，0607032，0607041，0607042，0607051，0607052，0607061，0607062，0607071，0607072，共计10个扣匕号。3.2.色谱条件色谱柱AgilentZorbaxC18;流动相A为50mmol/L的1(1^04溶液，B为80%的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例:0—5min，25%;5—50min，25%—64%;50—65min，64%;65—75min，64%—85%;75—90min，85%。检测波长为203nm。流速lml/min。柱温为40。C。3.3.对照溶液和供试品溶液的制备3.3.l人参皂苷Rb,对照溶液精密称取人参皂苷Rh对照品适量，加甲醇制成每lml中含10(Vg的溶液，摇匀即得。3.3.2麦冬化合物V对照溶液精密称取麦冬化合物V标准品加甲醇制成每lml含5叱的溶液，摇匀即得。3.3.3麦冬化合物VI对照溶液精密称取麦冬化合物VI标准品加甲醇制成每lml含5Mg的溶液，摇匀即得。3.3.4麦冬化合物VEa对照溶液精密称取麦冬化合物VHa标准品加甲醇制成每lml含5pg的溶液，摇匀即得。3.3.5麦冬化合物Wb对照溶液精密称取麦冬化合物VEb标准品加甲醇制成每lml含5ng的溶液，摇匀即得。3.3.6麦冬化合物Vffl对照溶液精密称取麦冬化合物W1标准品加甲醇制成每lml含10pg的溶液，摇匀即得。3.3.7供试品溶液的制备取参麦注射液，作为供试品溶液。3.4.测定法分别精密吸取各对照品溶液和供试品溶液2(Vl，注入液相液谱仪(见图3—9)，按外标法以峰面积计算，即得。此方法可一次同时测定参麦注射液中的多个有效成分。3.5方法学考察3.5.1色谱条件的考察3.5.1.1色谱柱选择分别对Kromasil-C18(5^n，4.6X250mm)、依利特C18(5,Hypersil填料，4.6X250mm)、AgilentZorbaxC18(5^，4.6X250醒)三种十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱进行研究，AgilentZorbaxC18柱分离效果最好，它对20min—50min和50—60min间的峰群分离均较为理想。而Kromasil-C18柱对20min—50min间的峰群分离较为理想，但对50—60min间的峰群分离却差于AgilentZorbaxC18柱。依利特C18柱则对2个峰群分离均较差。3.5.1.2检测波长的选择取各标准品溶液于200—400nm波长范围进行紫外扫描，结果人参皂苷和麦冬化合物VDI标准品溶液在200nm附近有强吸收，麦冬化合物V，VI，Wa，VIIb标准品溶液在200nm、250和280nm附近均有强吸收。因此选定203nm为检测波长。3.5.1.3流动相的选择实验过程中选择了四组流动相(1)流动相A为水，B为乙腈，梯度洗脱程序如下B的比例0—35min，19%;35—50min，19%—50%;50—70min，50%—80%;70—80min，80%。(2)流动相A为水，B为乙腈，梯度洗脱程序如下B的比例0—35min，2%—35%;35—45min，35。/。—40%;45—60min，40。/。一55%;60—75min，55%—80%;75—100min，80%。(3)流动相A为50mmol/L的KH2PO,,溶液，B为80。/。的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例0—5rain，25%;5—45min，25%—69%;45—50min，69%;50—65min，69%—85Q/o;65—90min，85%。(4)流动相A为50腿ol/L的KH2P04溶液，B为80。/。的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例0—5min，25%;5—50min，25%—64%;50—65min，64%;65—75rain，64%—85%;75—90min，85%。研究结果表明，采用流动相体系(1)时，峰群集中在45min—70rain之间，比较密集，分离效果不好。采用流动相体系(2)时，各组峰群被拉宽到25min一75min之间，其中25min—60min之间的峰群分离得较好，但是60min—75min之间的峰群还是得不到有效分离。采用流动相体系(3)时，峰群在10rain—50min之间，各峰分离效果较好。对流动相体系(3)进行优化，采用条件(4)，峰群在10min—60rain之间，各峰分离效果较好。在流动相体系(4)下，人参皂苷Rbt麦冬化合物V，VI，VIIa，VHb，Wl色谱峰与相邻峰均达到基线分离，峰形对称，保留时间适宜，故以流动相体系(4)为最终条件。3.5.2空白试验为进一步考察实验设计的合理性，按参麦注射液处方工艺制成缺麦冬方参麦注射液，按样品测定方法进行测定，记录色谱图(见图10)，结果表明，在与麦冬化合物v，vi，Wa，wb，vni对照品相应的保留时间处无干扰峰出现，从而证明本方法是合理可行的。3.5.3标准曲线精密吸取上述对照品溶液，进不同量，按前述色谱条件测定。以峰面积Y为纵坐标，进样量(ng)为横坐标，绘制标准曲线(见表8:线性关系表)。各指标成分在测定质量浓度内，线性关系良好。表8:线性关系表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>3.5.4重复性试验取同一批参麦注射液样品，按上述条件重复进样6次，测定各组分的峰面积，计算各组分峰面积相对标准偏差RSD，结果RSD均〈1.5。/。，结果表明该方法重复性符合要求。结果见下表9。表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>取已知含量的样品6份，每份5ml，置10ml量瓶中，精密加入混合对照品溶液，用水稀释至刻度，摇匀，制得供试品溶液，同法测定，计算回收率，结果表明，该方法回收率较好，准确度较高，结果见下表IO。表10:加样回收率测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>3.5.6样品测定结果及含量限度确定依法测定正大青春宝药业有限公司生产的IO批样品，按正文方法操作，在上述色谱条件下，用外标法测定，结果见下表ll。表ll:样品含量测定结果<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>根据上述样品测定及研究结果，最终确定用色谱柱AgilentZorbaxC18;流动相A为50mmol/L的KH2P(V溶液，B为80。/。的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例0—5min，25%;5—50min，25%—64%;50—65min，64%;65—75min，64%—85%;75—90min,85%。检测波长为203nm。流速lml/min。柱温为40。C。考虑到中药化学成分含量的不稳定性，并参照文献资料，暂定每lml参麦注射液含Rbi不得少于8(^g/ml，含V不得少于1.5^g/ml，含VI不得少于0.8pg/ml，含Wa不得少于O.7pg/ml，含VDb不得少于0.7pg/ml，含Vffl不得少于5pg/ml。权利要求1.一种具有如下结构式VI的化合物id="icf0001"file="S2007101874224C00011.gif"wi="72"he="28"top="5"left="5"img-content="drawing"img-format="tif"orientation="portrait"inline="no"/>VI羟基甲基麦冬二氢高异黄酮B。2、一种具有如下结构式Wa的化合物<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>vna:沙-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A3、一种具有如下结构式vnb的化合物VHb:2"-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A。4、权利要求l、2和3所述化合物的提取方法，其特征是a)、IO公斤的浙麦冬药材按照参麦注射液中的麦冬提取生产工艺，将麦冬投入回流锅内，加三倍量90%乙醇。加热80-9(TC连续回流2次，每次2小时，制备得到麦冬原液；经4(TC减压浓縮后，用大孔树脂柱层析分离，以水、10%、20%、40%、60%、80%及95%乙醇梯度洗脱，获得麦冬原液的水、10%、20%、40%、60%、80%及95%乙醇的洗脱部分；b)、a步骤中获得的95。/。乙醇洗脱部分用硅胶柱层析分离，依次用石油醚、氯仿、梯度从1:0至l:l的氯仿一丙酮、梯度从50:1至l:l的氯仿一甲醇为展开剂洗脱至无色；比例为10:1的氯仿一丙酮洗脱部分用硅胶柱层析进一步分离，以比例为2:1的石油醚一乙酸乙酯作为展开剂，用薄层硅胶层析板检测，合并相同和相似组分,获得化合物VLWa和Wb混合物为主的富集部分，其中Rf值0.44为化合物VI，Rf值0.37为Wa和VHb的混合物，再用葡聚糖凝胶S印hadexLH-20柱纯化，以氯仿为展开剂可获得vi和vn，后者为一对差向异构体，用制备型的高效液相制备可得到单体化合物VEa和VIIb，制备液相为Pr印Star系统，1.2x25cm的merck0DS填充柱，流动相A为水，B为乙腈；B的比例为30°%—60%，0—30分钟。5、权利要求1所述的化合物在制备促进血管内皮细胞一氧化氮释放的药物上的应用。6、权利要求2或3所述的化合物在制备促进心肌细胞增殖的药物上的应用。7、权利要求1、2或3所述的化合物单独或联合作为有效化合物群用于制备治疗与促进血管内皮细胞一氧化氮的释放和促进心肌细胞增殖药理模型密切相关的心脑血管类疾病的药物上的应用。8、权利要求l、2或3所述的化合物用于中药制剂质量控制中的应用。9、权利要求l、2或3所述的化合物用于含有VI、VHa和VIIb成份的中药制剂质量控制中的应用。10、权利要求l、2或3所述的化合物用于处方中含麦冬中药制剂质量控制中的应用。11、权利要求l、2或3所述的化合物用于参麦注射液的质量控制方法，其特征是对化合物VI、VIIa、Wb、简称V的活性化合物甲基麦冬二氢高异黄酮B、简称WI的活性化合物川麦冬皂苷A以及人参皂苷Rb,进行定量控制，在一定的色谱条件下测试供试液液相图谱，本品要求每lml含Rbt不得少于80l^g/ml，含V不得少于1.5Pg/ml，含VI不得少于0.8Pg/ml，含Wa不得少于0.7.Pg/ml，含VHb不得少于O.7Pg/ml，含VD1不得少于5Pg/ml。12、权利要求ll所述的一种参麦注射液的质量控制方法。所述的一定的色谱条件为，色谱柱AgilentZorbaxC18;流动相A为5O國ol/L的KH2PCU容液，B为80%的乙腈水溶液，梯度洗脱程序如下B的比例0—5min，25%;5—50min，25%—64%;50—65min，64%;65—75min，64%—85%;75—90min，85%;检测波长为203nra;流速lml/min;柱温为40。C。全文摘要本发明公开了参麦注射液中3个化合物羟基甲基麦冬二氢高异黄酮B(简称VI)、2β-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A(简称VIIa)和2α-羟基甲基麦冬二氢高异黄酮A(简称VIIb)及其制备方法。本发明还公开了一种参麦注射液的质量控制方法，对化合物VI、VIIa和VIIb和活性化合物甲基麦冬二氢高异黄酮B(简称V)、川麦冬皂苷A(简称VIII)以及人参皂苷Rb₁进行定量控制。研究表明，这些成分可能为参麦注射液治疗心脑血管疾病的主要活性物质。由于新增加了麦冬心血管活性有效成分作为质控指标，与传统质控技术比较，所得参麦注射液产品质量更为稳定可靠，基本解决了传统参麦注射液生产中对麦冬部分的质量控制不利的局面。文档编号C07D311/22GK101172971SQ20071018742公开日2008年5月7日申请日期2007年11月23日优先权日2007年7月5日发明者张善飞,文英强,朱大元,李云森,柯嘉敏,柴建国,箫耀龙,蒋福祥,许正宇,谭昌恒,黎豫杭申请人:正大青春宝药业有限公司