专利名称：石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药，特别是一种石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，该石斛水提物具有雌激素样作用，可有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病。
背景技术：
兰科植物石斛(Dendrobium nobile Lindl.)，全年均可采收，采收后，除去杂质， 用开水略烫或烘软，再边搓边烘晒，至叶鞘搓净，干燥，即可。历代名家对其均有论述和研究，认为其性甘，微寒，归胃、肾经，益胃生津，滋阴清热。主治阴伤津亏，口感烦渴，食少干呕，病后虚热等。现代药理及临床研究表明石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖和提高免疫等作用，对恶性肿瘤的辅助治疗，以及慢性胃炎、糖尿病、慢性咽炎和久病体虚免疫功能低下等方面都有广泛的应用。但尚未有关于石斛雌激素样活性方面的研究报道。
发明内容
针对上述情况，本发明的目的就是提供一种石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，从而用于解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的用药问题。本发明解决的技术方案是，石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，该石斛水提物是，将石斛每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次池，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物，该石斛水提物即为有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)的药物，即石斛水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病(如妇女更年期综合症等)药物中的应用。本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，并经多次以上试验，均取得了相同或相近似的结果，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了石斛药用新用途，临床意义巨大。
图1为本发明石斛水提物对MCF-7增殖的影响(5 士s，n=6)示意图。图2为本发明石斛水提物对性未成熟小鼠子宫系数的影响& 士s，n=10)示意图。图3为本发明石斛水提物对ERE调控的报告基因瞬时表达结果&士s，n=3)示意图。图4为本发明石斛水提物对ERE调控的报告基因瞬时表达检测结果& 士s，n=3)示意图。
具体实施方式
CN 102526500 A
以下结合实施例和有关试验资料对本发明的具体情况作详细说明。本发明在具体实施中，所述的石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，该石斛水提物是由以下实施例给出实施例1该石斛水提物是，将石斛IOOg用其10倍重量的水IOOOg(即1000ml)煎煮2 次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物，连续反复三次，平均得率为
15.65%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例2该石斛水提物是，将石斛200g用其10倍重量的水2000g(即2000ml)煎煮2 次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物，连续反复三次，平均得率为
16.73%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。实施例3该石斛水提物是，将石斛300g用其10倍重量的水3000g(即3000ml)煎煮2 次，每次2h，合并两次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物，连续反复三次，平均得率为
17.23%，该水提物可制备雌激素类药物，用于治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病，如妇女更年期综合症药。根据上述方法按石斛和水的比例可以通过工业化生产制得任意量的石斛水提物， 用于制备雌激素类药物，有效解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的疾病(如妇女更年期综合症等)的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下采用细胞增殖实验、动物实验及报告基因技术对其进行了充分证明，其有关试验资料如下首先通过MCF-7细胞增殖实验(E-SCREEN)，发现石斛水提物能够显著促进MCF-7 细胞的增殖，说明其在体外具有雌激素样作用。其次通过小鼠子宫增重实验，证明石斛水提物能够显著增加性未成熟雌性小鼠的子宫系数，说明其在体内具有雌激素样作用。最后通过ERE调控的报告基因瞬时表达检测技术，进一步验证石斛水提物是通过与雌激素受体ER α和ER β的结合而发挥雌激素样作用。发明人已通过实验证明了本发明药物在制备雌激素类药物中的新用途。其主要实施方案如下一、实验材料与方法1.实验药物兰科植物石斛(Dendrobium nobiIe Lindl.)采收后，除去杂质，用开水略烫或烘软，再边搓边烘晒，至叶鞘搓净，干燥，即可。石斛以10倍量的水煎煮2次，每次池，水煎液减压干燥浓缩干燥得到石斛水提物。2.实验动物与细胞株及质粒昆明种小鼠，雌性，出生21天(刚断乳)，体重9 12g，购于河南省实验动物中心。人乳腺癌细胞(MCF-7)由中国军事医学科学院生物工程研究所提供。HEK293细胞株购于中国典型培养物保藏中心。β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，β-gal)对照质粒P β gal-Contro 1、重组报告基因pERE-TAL-luc由军事医学科学院生物工程研究所叶棋浓博士惠赠。重组人ER α (humanER α，hER α )表达载体pCXN2_hER α和重组人 ERβ (humanERβ，hERβ )表达载体pCXN2-hERβ由东京大学医学系&itoshi Inoue博士惠赠。3.主要试剂RPMI1640 培养基、小牛血清(Newborn Calf Serum, NCS)和脂质体 LipofectamineTM2000Reagent购自 Gibco hvitrogen 公司；胎牛血清、无酚红RPMI1640 培养基、17 β-雌二醇(17 β-estrogen，氏)、氨苄青霉素(Amp)、Tris碱和活性炭(Charcoal) 均购自Sigma公司；葡聚糖T-70(Dextran-70)购自上海化学试剂公司；己烯雌酚片(合肥久联制药)；邻-硝基苯-β -D-半乳吡喃糖苷(Ο-Nitrophenyl- β -D-galactopy ranoside, 0NPG)、EDTA, MTT 及 DMSO 为 Amresco 公司产品；Steady-GloR稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)、闪亮裂解缓冲液(Glo lysis Buffer)购自Promega公司；其余试剂均为国产分析纯。4.所用主要仪器普通手术器械；二氧化碳培养箱(REVCO)；倒置显微镜(NIKON ECLIPSE TS100)； KDC-160HR高速低温冷冻离心机(科大创新股份有限公司)；酶标仪(BI0-RAD 680)；纯水仪(Sartorius 611VF) ；90_3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)；ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)； AB204-N电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；IOcm培养皿、 96孔培养板、冻存管均为Corning公司生产；超净工作台(江苏苏净集团)；UV-7504PC型紫外-可见分光光度计(福州健洋科技仪器有限公司)；VeritasTM微板光度计(Turner BioSystems公司)；SK6200H型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；SHP-150型生化培养箱(上海精宏实验设备有限公司)。5.实验方法5. 1 MCF-7细胞增殖实验MCF-7细胞经无酚红含10%去激素血清的RPMI1640培养基培养2周后，选取对数生长期细胞，PBS洗两次，用0. 25 %胰蛋白酶消化后，加入无酚红含2 %去激素血清的 1^^11640培养基吹打均勻，以1\104个/!111的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为 200 μ L·培养24h待细胞贴壁后，换为含药培养液继续培养。37°C、5%C02培养7 后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml) 20 μ 1，37°C继续培养4h，小心吸净培养液，每孔加入150 μ 1DMS0， 震荡5 lOmin，使结晶物完全溶解。以DMSO调零，用酶标仪在490nm下测定各孔吸光度值 (A)，计算平均A值和增殖率(Proliferation Rate，RP)。实验平行重复三次。RP =实验组A值/空白组A值)4X 100%5.2小鼠子宫增重实验将小鼠按体重均衡和随机的原则分组。给药持续7天。空白对照组每日蒸馏水0. 2ml/10g灌胃；阳性对照组每日己烯雌酚悬浊液(0. 35mg/kg/d)灌胃；石斛水提物按临床用药的20倍量X提取率计算，配成相应浓度的混悬液，每日按O.anl/lOg灌胃。最后一次给药24h后，脱颈处死小鼠，立即摘取子宫称重，计算子宫系数(子宫湿重X (体重F1XlOO^ )。实验平行重复三次。结果与空白组相比，计算P值考察有无统计学意义。5. 3 ERE调控的报告基因瞬时表达检测5. 3.1细胞接种于转染前7 将处于对数生长期的HEK293细胞接种于M孔板，密度为16. OX IO4 个/0. 5ml/孔，且培养液为含10%去雌激素血清的无酚红RPMI1640培养液，分别设置空白对照孔、雌二醇孔及待测药物孔。5. 3. 2质粒的转染(1)7 后开始转染，小心吸出原培养基，加入400μ 1含10%去雌激素血清的无酚红RPMI1640培养基。(2)取 3 只 EP 管，ER α 管中加 500 μ 1 无酚红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2_hERa 质粒、8 μ IpERE-TAL-luc 质粒、8 μ Ip β gal-Control 质粒；ER β 管中加 500 μ 1 无酚红 RPMI1640 培养基、8 μ lpCXN2-hER β 质粒、8 μ lpERE-TAL-Iuc 质粒、8 μ 1 β gal-Control 质粒；脂质体管中加入1000 μ 1无酚红RPMI1640培养基和M μ 1脂质体。(3)倒转混勻脂质体管，室温放置5min，取500 μ 1分别加入ER α和ER β管，室温放置20min ；(4)倒转混勻ER α和ER β管，取80 μ IER α管中脂质体/DNA复合物分别加入M 孔板ER α实验孔，取80 μ IER β管中脂质体/DNA复合物分别加入M孔板ER β实验孔。前后摇勻，放入培养箱。(5) 6h后加入对照药物和检测药物。5. 3. 3 ERE调控的报告基因瞬时表达检测加药后Mh的细胞，吸去培养液，用ImlPBS洗一次，并移去PBS。按照Steady-GloR 稳定荧光素酶检测系统试剂盒(Steady-GloR Luciferase Assay Systerm)及闪亮裂解缓冲液(Glolysis Buffer)改良操作步骤操作，收集细胞裂解上清液，加入荧光素酶反应底物 (荧光素)，置于暗处，用VeritasTM微板光度计检测荧光强度。5. 3.4 β-gal 活性检测为了考察转染效率，对内参照β -gal活性进行了检测。(1)54μ 1β-巯基乙醇加入40ml Z-buffer中，混勻，取EP管，每管加1800 μ 1 ；(2)每管加20 μ 1裂解上清液；(3)每管加400 μ 1 0NPG，倒转混勻；(4)放置37°C温箱，至显黄色；(5)力卩 Na2CO3Iml 终止反应；(6)测 OD42tl 值；二、统计处理实验数据以S ±s表示，SPSS 13. 0进行单因素方差分析(One-Way AN0VA)统计处理。三、实验结果1.石斛水提物对MCF-7细胞增殖影响的实验结果结果显示，石斛水提物在0. 0001,0. 001,0. 01,0. lmg/ml时与空白组比对MCF-7细胞均有显著的促增殖作用(P < 0.05)，说明石斛水提物在体外具有雌激素样活性，见表1， 图1。
表1石斛水提物对MCF-7增殖的影响(；±s，n=6)
权利要求
1. 一种石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，该石斛水提物是将石斛每次用其 10倍重量的水煎煮2次，每次池，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物。
全文摘要
本发明涉及石斛水提物在制备雌激素类药物中的应用，可有效解决制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病，从而用于解决由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的用药问题，该石斛水提物是，将石斛每次用其10倍重量的水煎煮2次，每次2h，合并2次水煎液，减压浓缩干燥得到石斛水提物，该石斛水提物即为有效用于制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病的药物，即石斛水提物在制备治疗由于体内雌性激素分泌不足而引起的相关疾病药物中的应用，本发明水提物制备方法简单，稳定可靠，方便，成本低，其水提物有效用于制备雌激素类药物，开辟了石斛药用新用途。
文档编号A61P15/12GK102526500SQ20121006895
公开日2012年7月4日 申请日期2012年3月15日 优先权日2012年3月15日
发明者冯卫生, 刘朝妍, 王小兰, 蒋云, 郑晓珂 申请人:河南中医学院