一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺的制作方法

专利名称：一种乙型肝炎疫苗及其制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗乙型肝炎病毒(HBV)的乙型肝炎疫苗，其包括完全的HBV表面抗原，该表面抗原由preS抗原和S抗原组成,一种复合HBV抗原疫苗，该复合HBV抗原疫苗 除该完全的表面抗原外还进一步包括一种HBV核心抗原，及其制备方法。
背景技术：
HBV感染导致急性和慢性肝炎。大部分HBV感染者在一到两个月后能够从病毒感染中完全康复，但是有约10%的HBV感染者会成为慢性肝炎患者。根据感染年龄的不同，转为慢性感染的比例随感染年龄的增大而显著下降，两个月以下的新生儿超过95%，五岁的儿童则为25%。HBV慢性感染导致罹患肝硬化和肝癌的风险上升。HBV表面抗原(HBsAg)可从HBV慢性感染患者的血液中检出，但是抗HBsAg抗体并不一定随免疫耐受性的发展而获得。因此，治愈HBV慢性感染的最终目的是在血清中诱发抗HBsAg抗体，并将HBV从血液和肝脏中去除。本发明揭露的治疗疫苗适用于HBV慢性感染的治疗，因为其破坏了免疫耐受性并诱发对HBV的免疫应答，从而从血液中去除HBV抗原。针对HBV慢性感染的治疗疫苗应当满足下列条件必须能够破坏免疫耐受性并诱发对HBV的免疫应答，引起强的体液和细胞介导免疫力以消除慢性病毒感染。在感染了 HBV后，当多克隆免疫应答被诱发时，感染可以被消除。但是，当弱寡克隆免疫应答被诱发时，感染会演变成慢性感染。这一发现指出治疗疫苗必须含有能提供诱发多克隆免疫应答所需的多种表位的抗原。HBV的包膜抗原基因由preS(preSl和preS2)区及S区组成。在转录后，通过对三种起始密码子各自进行交替翻译，合成三种包膜蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)。L蛋白由约400个氨基酸组成,视HBV亚型不同,包括preSl域，preS2域及S域,翻译起始从其中的preSl AUG密码子开始。M蛋白由约281个氨基酸组成,包括preS2域及S域,翻译起始从其中的preS2开始。S蛋白由约226个氨基酸组成，仅包括S域，并组成病毒粒子中最丰富的部分。这些包膜蛋白的S域被植入类脂膜，并根据三种不同大小的包膜蛋白的比例，组成22nm到42nm的粒子和棒状形态。M蛋白和L蛋白含有的preSl域和preS2域高度免疫原并有助于在单独S蛋白不能免疫原的特定同类系小鼠身上诱发S蛋白特异性抗体。如上所述，有鉴于整套的包膜抗原特定表位和作为高免疫原粒子形态的HBV抗原非常重要，因此本发明的目的在于开发一种含有完整的PreS蛋白和S蛋白的乙型肝炎疫苗。具体地，动物实验和人体实验都表明含有preS抗原和S抗原的疫苗比只含有S抗原的疫苗能够诱发更强的免疫应答和远为快速的响应。也就是说，与只含有S抗原的疫苗相比，同时含有preS抗原和S抗原的疫苗更免疫原并诱发快速的免疫应答，从而表明L蛋白可用于作为治疗慢性乙型肝炎感染的治疗疫苗。但是，市售的大多数乙型肝炎疫苗只含有S蛋白。这可归结于见于慢性HBV患者的粒子形态的L蛋白仍未成功从真核细胞表达系统如啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)或多形汉森酵母菌(Hansenulapolymorpha)表达。进一步的，曾有人尝试将preS抗原(具体地，preS2)的一部分和S抗原在真核细胞如啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)或多形汉森酵母菌(HansenulapoIymorpha)中联合表达,但是,得到的产品并未发现有足够的免疫原性。此外，也曾有人尝试生产将preS基因单独表达以制成单独的preS抗原，然后与S抗原混合而得的HBV抗原。但是，得到的preS抗原的线性可溶形态 并不十分免疫原。因此，与preS抗原和S抗原以粒子形态被联合表达,且preS抗原位于粒子的外表面的完全表面抗原相比较，改进免疫原性的尝试并不成功。综上所述,为改进免疫原性，preS抗原和S抗原必须被同时表达,且preS抗原必须位于由S抗原组成的粒子的外表面。近来，赛真(Scigen)在以色列开发出一种乙型肝炎疫苗，并且他们声称含有完全表面抗原即PreS抗原和S抗原。

发明内容
技术难点本发明的发明人成功地开发了一种能产生粒子形态的含有preS抗原和S抗原的HBV包膜抗原的CHO细胞系。他们发现，当完整的乙型肝炎病毒的包膜基因被引入到一特定的载体时，三种类型的表面蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)都被观察到在HBV慢性患者的血液中以粒子形态表达。使用这种抗原，一种包括重组完全表面抗原的强效乙型肝炎疫苗被开发出来。进一步的，其被发现对在一种在血液中产生HBV抗原，但没有任何可检出量的HBV特异抗体的转基因小鼠身上诱发强免疫应答非常有效。技术方案本发明的目的在于提供一种乙型肝炎疫苗，其包括完全表面抗原，该抗原由三种类型的粒子形态的表面蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)组成。优选的，本发明的目的在于提供包括一种完全的HBV表面抗原的该疫苗，其中L蛋白，M蛋白和S蛋白被从一个表达载体联合表达,该表达载体包括完整的将乙型肝炎病毒的preSl抗原，preS2抗原和S抗原编码的包膜基因，且得到的preS抗原位于这些抗原构成的粒子的外表面。本发明的又一目的在于提供一种制备一种强效的乙型肝炎疫苗的方法。本发明的又一目的在于提供一种能表达全部三种类型的表面蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)的重组表达载体。本发明的又一目的在于提供一种用该重组表达载体改造的细胞。本发明的又一目的在于提供一种以乙型肝炎疫苗的形式适用于治疗HBV慢性感染的免疫疗法。本发明的又一目的在于提供一种复合HBV抗原疫苗以提高体液和细胞介导免疫力，通过向该疫苗中加入一种重组HBV核心抗原和/或佐剂制备。


图I为一种表达了一种重组完全表面抗原(S蛋白,M蛋白，L蛋白)的载体的不意图。图2为一张提纯的该重组完全表面抗原(S蛋白，M蛋白，L蛋白)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)的照片。图3为一张用N-糖苷酶处理的提纯的该重组完全表面抗原的蛋白质印迹(Western blot)的照片。
图4为一张提纯的该重组完全表面抗原的电子显微镜照片。图5为一张提纯的该重组核心抗原(core Ag)的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blot)的照片。图6为一张提纯的该重组核心抗原的电子显微镜照片。图7为根据本发明的包括完全表面抗原的该乙型肝炎疫苗和已知疫苗的抗体滴度的比较。图8为根据本发明的包括完全表面抗原的该乙型肝炎疫苗和已知疫苗的半数有效剂量(ED5tl)的比较。图9为根据本发明的该复合抗原疫苗在正常小鼠身上诱发的体液免疫应答。图10为根据本发明的该复合抗原疫苗在正常小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答。图11为一张胶体金合成物附着preS的电子显微镜照片。图12为胶体金合成物在正常小鼠身上诱发的体液免疫应答。图13为胶体金合成物在正常小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答。图14为根据本发明的该治疗疫苗在正常小鼠身上诱发的体液免疫应答。图15为根据本发明的该治疗疫苗在正常小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答。图16为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的体液免疫应答。图17为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答的酶联免疫斑点法分析(ELISPOT assay)结果。图18为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)结果。图19为该治疗疫苗使在血液中表面抗原(病毒样粒子)减少。图20为该治疗疫苗使病毒基因表达减少和干扰素Y (IFN- Y )表达增加。图21为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的体液免疫应答。图22为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答的酶联免疫斑点法分析(ELISPOT assay)结果。图23为根据本发明的该治疗疫苗在转基因小鼠身上诱发的细胞介导免疫应答的酶联免疫吸附剂测定(ELISA)结果。图24为根据本发明的该治疗疫苗使在血液中表面抗原(病毒样粒子)减少。最佳实施方式
在一个实施例中，本发明提供了一种乙型肝炎疫苗，其包括一种由粒子形态的L蛋白，M蛋白和S蛋白组成的重组完全表面抗原。乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)由三种相关的包膜蛋白组成，这些包膜蛋白通过交替使用三种翻译起始密码子和一种共同的终止密码子合成。HBsAg蛋白包括一种主要的226个氨基酸的多肽，其非糖基化(p24)和糖基化(gp27)形式被命名为S蛋白。中等大小的蛋白，M蛋白有额外的55个氨基酸在S域的N末端区，其被称为对应于gp33和gp36的preS2域。最大的L蛋白有额外的119个氨基酸(preSl域)在由S域和preS2域组成的M蛋白的N末端区，其根据糖基化被命名为p39和gp42。在天然的包膜HBsAg粒子中，L蛋白，M蛋白和S蛋白的S域通过分子间二硫键互相共价连接形成病毒粒子。分别对S域，preS2域和preSl域的免疫应答的相对重要性目前只被认识到一部分。但是，据报道对preS抗原的免疫应答能提高S抗原的免疫原性(ref. Milich DR et atScience 228 :1195-1199,1985 ；Milich DR et al JImmunol 23 :511-523,1986 ;Milich DR et al Proc Natl. Acad Sci USA 85:1610-1614,1988)。进一步的，也有报道抗 preS 抗原的抗体阻碍了乙型肝炎病毒对肝细胞的附着，内吞作用，和可能的膜嵌入(Neurath AR etal. Nature 315 :154-156，1985 ;Neurath AR et al. Vaccine 4 :35_37，1986 ;Gerlich WHet al. Vaccine 8 :S63_S68，1990)。因此，含有preS抗原和S抗原的第三代乙型肝炎疫苗比只含有S抗原的疫苗能更有效地诱发免疫应答。根据本发明，一种包括一种重组HBV完全表面抗原的乙型肝炎疫苗可以被制备，其包括的该重组HBV完全表面抗原含有从一个表达载体表达的S蛋白，M蛋白和L蛋白，且由preSl和preS2组成的preS抗原位于由S抗原联结形成的粒子的外表面。本发明的包括该抗原的该疫苗可用作为一种治疗疫苗，因其与只含有S抗原的疫苗或含有混合形式的分别表达的S抗原和preS抗原的疫苗比较，诱发了远为强烈的免疫应答。在已知的乙型肝炎疫苗中，第二代乙型肝炎疫苗仅含有S抗原，而第三代乙型肝炎疫苗并不含有全部三种表面抗原，却含有一部分preS抗原和S抗原或含有仅仅检出量的preS抗原，尽管据推测其应都含有preS抗原和S抗原。这可归结于preS部分在提纯过程中的损失。因此，制得的表面抗原可能不具有一种完全表面抗原的免疫原性，或者preS抗原和S抗原被分别表达以混合形式呈现。于是，已知的乙型肝炎疫苗中制得的表面抗原可能不具有完全表面抗原的免疫原性，在完全表面抗原中preS抗原被与S抗原联合表达且位于由S抗原联结形成的粒子的外表面。如上所述，本发明提供了一种包括该完全表面抗原的重组乙型肝炎疫苗，其包括联合表达的在一实际水平的三种HBV表面蛋白以形成病毒样粒子，包括22nm和42nm的粒子和棒状形态。这一用词“完全表面抗原(L-HBsAg) ”指包括全部三种联合表达的HBV表面蛋白(S蛋白，M蛋白和L蛋白)的抗原,其中由preSl抗原和preS2抗原组成的preS抗原位于由S抗原联结形成的粒子的外表面。在一优选实施例中，本发明提供了一种乙型肝炎疫苗，其在该完全表面抗原之外进一步包括一种HBV核心抗原。该HBV核心抗原的特征在于，其构成了病毒样粒子，显示了高免疫原性，并诱发了强细胞介导免疫力。因此，可以预见在该完全表面抗原外进一步包括该核心抗原的该疫苗诱发了强免疫应答，从而可被用为治疗疫苗，这被例3所证实。换言之，据发现，包括完全HBV表面抗原和核心抗原的该疫苗比只含有完全HBV表面抗原的疫苗更有效地诱发细胞介导免疫应答。于是，包括完全HBV表面抗原和核心抗原的该疫苗作为治疗疫苗更有益。稍后会详细描述到，进一步包括该HBV核心抗原的疫苗可通过混合该HBV核心抗原及通过本发明提供的方法制备的该完全HBV表面抗原而制得。在本发明的实施例中，根据本发明的仅包括该完全HBV表面抗原的该乙型肝炎疫苗被省略为单一抗原疫苗，根据本发明的包括该完全HBV表面抗原及该核心抗原的该乙型肝炎疫苗被省略为复合抗原疫苗。在又一实施例中，本发明提供了一种重组表达载体，其能有效地联合表达全部表面蛋白，这些表面蛋白构成了可见于HBV慢性患者的血液中的乙型肝炎病毒的HBV包膜蛋白。如上所述，本发明的最有效的乙型肝炎疫苗可通过从一个表达载体联合表达三种 表面蛋白，其中该重组表达载体包括HBV包膜基因，意即，一种编码了 pre-Sl区，pre-S2区和S区的完整的多核苷酸。优选的，碱基序列以完整的HBV包膜基因的形式存在，更优选的，以SEQ ID NO. I代表的HBV包膜基因。进一步的，作为制备根据本发明的该重组表达载体的一种载体，一种在韩国专利申请No. 10-2000-0043996 和 PCT/KR01/01285 中揭露的 pMSG载体(KCCM10202)可被优选采用。该pMSG载体含有一种β珠蛋白MAR互补序列，一种SV40病毒的启动子，及一种转录终止子，是一种能在动物细胞中有效表达外源基因的载体。该表达载体能在多种动物细胞中有效产生重组蛋白，并产生一种具有和野生型蛋白同样结构和功能的重组蛋白。该PMSG载体在韩国专利申请No. 10-2000-0043996中被详细描述，对其的揭露作为一个整体供本发明参考。在本发明的一个具体的实施例中，编码了该完全HBV表面抗原的该完整的包膜基因被注入该PMSG载体以确认L蛋白，M蛋白和S蛋白是否全部被表达(参见图2)。进一步的，据发现，制得的重组L蛋白，M蛋白和S蛋白形成病毒样粒子(参见图4)并提供了该表面抗原，preS抗原(preSl和preS2)及S抗原(参见实例I. I)在又一实施例中，本发明提供了一种用该表达载体引入的宿主细胞。该宿主细胞可优选为但不局限于动物细胞，更优选地，选自CHO (中国仓鼠卵巢)细胞，肝细胞，HEK (人胚肾)细胞或HLF (人胚肺成纤维细胞)，最优选为CHO细胞。在本发明的该优选实施例中，据发现，根据本发明的装载该完整HBV包膜基因的该表达载体被引入CHO细胞以大批量生产L蛋白，M蛋白及S蛋白(参见实例I. I及图2)。因此，通过根据本发明的该表达载体改造而制备的，能够联合表达L蛋白，M蛋白和S蛋白的该细胞系被命名为CHO DG44/L-HBsAg(J2. I)-GlOl，并于2006年12月28日被保藏于韩国生物科学与生物技术研究院(韩国典型菌种保藏中心，鱼隐洞，儒城区，大田广域市，韩国)，保藏编号KCTC 11058BP。在又一实施例中，本发明提供了一种制备包括该完全HBV表面抗原的该乙型肝炎疫苗的方法。如上所述，根据本发明的装载该完整HBV包膜基因的重组表达载体改造的该细胞系，联合表达了 L蛋白，M蛋白和S蛋白，被联合表达的该S抗原相互间共价联接形成粒子，被联合表达的preS抗原位于这些粒子的外表面，从而形成病毒样粒子。因此，在该细胞系中被表达的该完全HBV表面抗原被提纯以制备根据本发明的包括该完全HBV表面抗原的该乙型肝炎疫苗。具体地，根据本发明的制备该乙型肝炎疫苗的该方法包括以下步骤I.将一编码了乙型肝炎病毒preS抗原和S抗原的多核苷酸引入一表达载体；2.用步骤I的该表达载体改造一宿主细胞；及3.培养改造的该宿主细胞以恢复一重组HBV完全表面抗原(preS抗原和S抗原)。步骤I的该多核苷酸优选为乙型肝炎病毒(HBV)的一完整包膜基因的形式，更优选为一 HBV包膜基因和一含有多聚腺苷酸化位点的完整3' -UTR的编码区，最优选为有一具有碱基序列SEQ ID NO. I的多核苷酸。步骤I的该表达载体优选为一 pMSG载体(KCCM 10202)。该宿主细胞可优选为但不局限于一 CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。在该完全HBV表面抗原外进一步包括一 HBV核心抗原的该疫苗，可通过将用本发明提供的方法制备的该完全HBV表面抗原与通过已知技术的基因重组技术制备的该HBV核心抗原混合，而被容易地制备。具体地，包括步骤I到3的该乙型肝炎疫苗的制备方法进一步包括下述步骤4到6以制备包括该完全HBV表面抗原和HBV核心抗原4.将一编码了一 HBV核心蛋白的多核苷酸引入一表达载体；5.用步骤4中的该表达载体改造一宿主细胞；及6.培养该改造过的寄主细胞以恢复一重组HBV核心蛋白。步骤4中的表达载体可优选为但不局限于一 pBluescript载体,一 pGEX表达载体，一 pET表达载体，一 pIL20表达载体，一 pETlla表达载体，或其它类似载体。该表达载体可被引入原核或真核细胞。其优选的实例包括原核细胞如E. coli和B. subtilis，真核细胞如Saccharomycescerevisiae和Hansenula polymorpha,但不局限于此,其中最优选为E.coli ο在又一实施例中，本发明提供了一种包括一佐剂的乙型肝炎疫苗组合物。此处使用的“佐剂”指一种物质或补充物，其自身不能诱发特异的免疫力，但能激励免疫系统以提高对特定抗原的免疫应答。也就是说，含有抗原和佐剂的疫苗比只含有抗原的疫苗诱发了更强的免疫应答。在本发明中，铝化合物(硫酸铝，氢氧化铝，磷酸铝等)可用为佐剂。胶体金也可用为佐剂。具体地，本发明的发明人揭露了胶体金可被用为佐剂以显著地提高细胞介导免疫应答(韩国专利申请No. 10-2006-0057040)。当根据本发明的该乙型肝炎疫苗被用于治疗慢性乙型肝炎时，就更需要其诱发细胞介导免疫应答的能力。据发现，含有胶体金作为佐剂的疫苗能更有效地诱发细胞介导免疫应答，从而可用为一更佳的治疗疫苗(参见实例5. 2 及图 13)。更优选的，胶体金可与明矾一起作为佐剂。明矾起到提高体液免疫力的作用。因此，当明矾和胶体金都被用作佐剂以制备治疗疫苗时，体液免疫力和细胞介导免疫力都可被有效地诱发。据发现，当使用明矾和胶体金作为佐剂时，根据本发明的该HBV复合抗原疫苗能更有效地诱发体液免疫力和细胞介导免疫力(参见实例6. 2和图15)。在又一实施例中，本发明提供了一种治疗性HBV疫苗。治疗疫苗适于慢性感染的治疗，因其破坏了免疫耐受性并诱发了针对感染的免疫应答以从感染状态恢复。这一功能可被一转基因动物模型所证实，该基因动物模型在血清中产生HBV包膜抗原但没有可检出量的抗HBV抗原抗体。根据本发明的该乙型肝炎疫苗诱发了强的细胞介导免疫应答及体液免疫应答。因此，本发明的该乙型肝炎疫苗适用于作为一种治疗疫苗。本发明的该乙型肝炎疫苗优选地含有佐剂。该佐剂可以为明矾，胶体金或两者。本发明的该疫苗组合物可含有药学上可接受的载体，并被制成通过多种途径给药供人用或兽用。给药途径的例子可包括口服，腹腔内，静脉，肌肉，皮下及皮内途径。该疫苗组合物优选被制成注射制剂。该注射制剂可使用水溶液如生理盐水或林格氏液，及非水溶液如植物油，高级脂肪酸脂(例如油酸乙酯)，及醇类(例如乙醇，苯甲醇，丙二醇或丙三醇)。进一步的，该注射制剂可含有一种药学上可接受的载体如一稳定剂以防止降解例如抗坏血酸，亚硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，丁基羟基茴香醚(BHA)，生育酚及乙二胺四乙酸(EDTA)，一种乳化剂，一种缓冲剂以调整pH，及一种抗菌保存剂(例如硝酸苯汞， 硫柳汞，苯扎氯铵，苯酚，甲酚和苯甲醇)。本发明的该组合物以药用有效剂量给药。这一用语“药用有效剂量”指一足以发挥该疫苗的效力的剂量，进一步的，一不致引起不良反应或严重或过度免疫应答的剂量。给药的准确浓度取决于被给药的抗原，且能被本领域内技术人员容易地确定，依据医学领域内公知的参数，包括患者年龄，体重，健康状况，性别和对药物的敏感度，给药途径，及给药方法，其可被一次或多次给药。在又一实施例中，本发明提供了一种使用该疫苗组合物治疗慢性乙型肝炎的方法。发明实例在下文中，本发明将以实例更详细地被描述。但是，这些实例只用于说明的目的，本发明并无意愿局限于这些实例。实例I乙型肝炎疫苗的制备I. I重组完全表面抗原(preS抗原和S抗原；L_HBsAg)的制备(I)-I 克隆聚合酶链反应(PCR)通过使用一种含有HBV基因组(HBV315，Korean Biochem.J. 17 =70-79,1984)的载体作为模板以扩大包膜基因(preSl-preS2-S)和一含有多聚腺苷酸化位点的完整的3' -UTR的编码区(SEQ ID NO. I)，然后引入一表达载体。此时，聚合酶链反应通过使用一种Pfu DNA聚合酶进行，且制备引物以扩大HBsAg和该完整的3' -UTR 的该编码区正向引物5-GGA AGA TCT CAA TCT CGG GAA-3 (SEQ ID NO. 2)，反向引物5-GGA AGA TCT CGA ATA GAA GGAAAG-3 (SEQ ID NO. 3)，BglII 识别顺序用下划线标注。获得一种约2. 75kbp的聚合酶链反应产物，该产物与一被BglII酶线性化的pMSG载体配位(参见进韩国专利申请No. 10-2000-0043996及PCT/KR01/01285)。制备的该载体(pMSG-L-HBsAg)在图I中被示意说明。CHO细胞被用该载体改造以提供转化株，并用蛋白质印迹法(Western blot)以确认完全表面抗原(L_HBsAg，SEQ ID NO. 4)的表达，接着为高水平表达掩蔽转化株。选择的该转化株被命名为CHO DG44/L-HBsAg(J2. 1)-G101，于2006年12月28日被保藏在韩国生物科学与生物技术研究院(韩国典型菌种保藏中心，鱼隐洞，儒城区，大田广域市，韩国)，保藏编号KCTC 11058BP。(I)-2悬浮培养建立细胞系选择的该细胞系(细胞数5X105)接种于一 T-175烧瓶。该细胞系在含有10%血清的培养基中培养，并使用O. 25%的胰岛素对附着的细胞进行处理。然后，1200转/分离心该细胞五分钟以去除残留的胰岛素。将该单一的细胞再次悬浮在无蛋白培养基中(HyQSFM4CH0,Hyclone)，以IOOml的工作容积接种于250ml转瓶中，并在80转/分及37°C下培养。该细胞以初始浓度5 X IO5细胞数/ml接种。当该细胞的浓度接近I. 5 X IO6细胞数/ml时，继续用同样的初始浓度继代培养。最后，获得适于悬浮培养的该细胞系。(2)培养细胞接种通过从主细胞库(MCB)继代培养制备。此时，无血清培养基(HyQSFM4CH0, Hyclone)被用做基础培养基，将该细胞在250ml转瓶中以5 X IO5细胞数/ml的浓度接种，并在80转/分及34°C下培养。三天后，在IL转瓶中继代培养该细胞以扩大细胞的数目。然后，将该细胞接种于一个7. 5L的生物反应器，并在pH7. 2，34°C，及80转/分的搅拌速度下培养。三天后，加入柠檬酸及HyQ LS1000，并将该细胞再培养三天。
(2)提纯将从该生物反应器取出的该培养基离心以去除细胞残骸，并通过一 O. 45um的过滤器以去除杂质。被表达的该HBV表面抗原用平衡苯基-琼脂糖色谱，DEAE-琼脂糖色谱，及琼脂糖4FF色谱提纯。据发现，该提纯的完全表面抗原由S蛋白，M蛋白及L蛋白组成，并取决于糖基化由六种重组蛋白组成(图2)。图2A展示了提纯的该完全表面抗原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的结果，图2B展示了提纯的该完全表面抗原使用抗S抗体(通道I),抗preSl抗体(通道2)和抗preS2抗体(通道3)的蛋白质印迹(Western blot)的结果。使用N-糖苷酶F确认M蛋白的S区和preS2区的糖基化(图3)。进一步的，纯化的L-HBsAg通过电子显微镜观察被发现形成了病毒样粒子(图4)。I. 2重组核心抗原(HBcAg)的制备(I)克隆除了位于核心抗原c末端的精氨酸簇，氨基酸序列Nos. I到149被作为一重组蛋白(SEQ ID NO. 5)表达。编码该蛋白的核苷酸序列用SEQID NO. 6代表。聚合酶链反应使用一含有HBV基因组(HBV315)的载体作为模板以扩大对应的区域。该扩大的基因被注入一 pETlla载体(Novagen)的NdeI及BamHI限制位点以制备一 pETlla核心的表达载体。该核心基因的聚合酶链反应扩大使用正向引物5_CCC CAT ATG GACATT GAC CCG TA_3 (SEQID NO. 7)，反向引物5-CGC GGA TCC AACAAC AGT AGT TTC CGG-3 (SEQ ID NO. 8)。使用该pETlla核心表达载体改造E. coli BL21(DE3)。这一表达稳固，且高产克隆系被选择。(2)改造生产株的培养该生产株的最佳生产条件通过使用一 5L发酵桶确定。使用的培养基含有2%细菌用胰化胨，I %酵母提取物，2% NaCl，2%葡萄糖，I. 33% KH2PO47O. 4% (NH4)2HPO47O. 17%柠檬酸，O. 12% MgSO4,0. 01%盐酸硫胺，及O. 0371%氨苄西林。该生产株在37°C下被培养11小时，然后加入0.05mM/g细胞的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)。然后该细胞被IPTG诱导18个小时，并收成。(I)重组蛋白的提纯该细胞被收成后，使用一细胞裂解液(50mM Tris-Cl pH7. 6,150mMNaCl, 5mMEDTA, IOmM 2-巯基乙醇，0. 2mM PMSF)清洗三次。然后加入该细胞裂解液，使用超声处理分裂该细胞。使用离心法收集上清液，在65°C下培养30分钟。再使用离心法收集上清液，力口入30%的硫酸铵以析出核心抗原。离心之后，将沉淀物溶解在50mM Tris-CKpH 7.6)中，并通过一丁基琼脂糖凝胶柱以分离该纯核心抗原。该提纯的重组核心抗原被发现以粒子形态发生多聚合(图5)。图5A展示了该提纯的重组核心抗原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图5B展示了该提纯的重组核心抗原的蛋白质印迹的结果。在还原和非还原条件下多聚合被巩固。进一步的，通过电子显微镜观察，发现该提纯的重组核心抗原形成粒子(图6)。据发现，该提纯的重组核心抗原形成病毒样粒子，具有高免疫原性并诱发强细胞介导免疫力(在以下实例中)。实例2重组完全表面抗原(L-HBsAg)免疫原性的比较为确定本发明的重组完全表面抗原(L-HBsAg)是否具有高免疫原性并诱发强免疫应答，举行动物试验以和已知的第二代乙型肝炎疫苗比较。
2. I免疫原性的比较(I)目的比较由该重组L-HBsAg抗原诱发的抗体滴度和免疫应答。(2)材料和方法(a)实验动物6周大的雌性C57BL/6小鼠。(b)试验疫苗将根据实例1-1制备和提纯的该完全表面抗原(L-HBsAg)吸附到明矾上以制备一试验疫苗。作为一对照组，使用一多形汉森酵母菌制得的重组S抗原(Hepavax-Gene,Green Cross Co.),及在CHO细胞中制得的不含preS抗原的重组S抗原(重组乙型肝炎疫苗，Hualton,中国)。每份每抗原使用O. 5 μ g。(c)免疫组和免疫条件免疫组组I :多形汉森酵母菌制得的重组S抗原(Hepavax-Gene, Green CrossCo.)组2 :在CHO细胞中制得的重组S抗原(重组乙型肝炎疫苗，Hualton，中国)组3 :根据实例1-1制备和提纯的在CHO细胞中制得的重组L-HBsAg抗原给药方法每一试验疫苗通过肌肉注射给药三次，间隔两星期。(d)免疫应答的分析方法抗体滴度使用国际单位制(mIU/ml)测定,使用Diasorin试剂盒分析每种试验疫苗诱发的体液免疫应答。(3)结果据发现，与在已知疫苗中的该重组S抗原相比较，根据本发明的该重组L-HBsAg诱发了更强的体液免疫应答以显示出更高的抗体滴度(图7)。也就是说，该重组L-HBsAg被发现具有比已知的抗原更高的免疫原性。进一步的，与多形汉森酵母菌制得的该重组S抗原比较，该重组L-HBsAg被发现诱发了更快的免疫应答。2. 2半数有效剂量(ED50)的比较(I)目的通过ED50(有效剂量)，即抗原使50%的小鼠血清转化需要的最小量，比较根据实例1-1制备和提纯的该重组L-HBsAg抗原的免疫原性。(2)材料和方法(a)实验动物6周大的雌性C57BL/6小鼠。
(b)试验疫苗根据实例1-1制备和提纯的该完全表面抗原(L-HBsAg)被吸附到明矾上以制备一试验疫苗。一在酵母菌中制得的重组S抗原(重组乙型肝炎，康泰，中国)及在CHO细胞中制得的不含preS抗原的重组S抗原(重组乙型肝炎疫苗，Hualton，中国)作为一对照组使用。将各疫苗稀释以制备每份各含有O. 156 μ g, O. 312 μ g, O. 625 μ g, I. 25 μ g, 2.5 μ g, and 5 μ g抗原的疫苗。(c)免疫组和免疫条件免疫组每组被分为六个由10只小鼠组成的小组，每个小组使用稀释的各疫苗免疫。I.组I :在酵母菌中制得的重组S抗原(重组乙型肝炎疫苗，康泰，中国)(组1-1 给药 O. 156 μ g，组 1-2 :给药 O. 312 μ g，组 1-3 :给药 O. 625 μ g，组 1-4 :给药 I. 25 μ g，组
1-5 :给药 2. 5 μ g,组 1-6 :给药 5 μ g)2.组2 :在CHO细胞中制得的重组S抗原，在实例2_1中用作对照组(重组乙型肝炎疫苗，Hualton，中国)(组2-1 :给药O. 156 μ g，组2-2 :给药O. 312 μ g，组2-3 :给药O. 625 μ g,组 2-4 :给药 I. 25 μ g,组 2-5 :给药 2. 5 μ g,组 2-6 :给药 5 μ g)3.组3 :根据实例1-1制备和提纯，在CHO细胞中制得的重组L-HBsAg抗原(组3-1 :给药 O. 156 μ g,组 3-2 :给药 O. 312 μ g,组 3-3 :给药 O. 625 μ g,组 3-4 :给药 I. 25g，组3-5 :给药 2. 5 μ g,组 3-6 :给药 5 μ g)给药方法每一试验疫苗通过一次腹腔内注射给药。(d)免疫应答的分析方法抗体滴度使用国际单位制(mIU/ml)测定,使用Diasorin试剂盒分析每种试验疫苗诱发的体液免疫应答。10mIU/ml的抗体滴度被定义为血清转化。在各组中，测定使50%的免疫小鼠发生血清转化所需抗原的量(ED50)。(3)结果与已知疫苗相比较，根据实例1-1制备和提纯的含有该重组L-HBsAg抗原的疫苗具有最低的ED50值。也就是说，与已知抗原相比较，根据本发明的该重组L-HBsAg被发现能有效诱发体液免疫应答(图8)。实例3乙型肝炎疫苗产生的免疫应答的比较3. I免疫实验条件和分析方法(I)目的为确认根据本发明制备的乙型肝炎疫苗的有效性，使用仅含有完全HBV表面抗原的疫苗(在下文中，提到时称“单一抗原疫苗”)或含有该完全表面抗原和核心抗原两者的疫苗(在下文中，提到时称“复合抗原疫苗”)对小鼠进行免疫，以分析诱发的免疫应答。(2)材料和方法(a)实验动物6周大的雌性C57BL/6小鼠。(b)试验疫苗将在实例I中制备和提纯的各该重组核心抗原和完全表面抗原吸附到明矾上以制备单一抗原疫苗。将吸附到明矾上的该重组核心抗原和完全表面抗原彼此混合以制备一复合抗原疫苗。每份每抗原使用O. 5 μ g。(c)免疫组和免疫条件免疫组I.组I :使用PBS (磷酸盐缓冲生理盐水)免疫的阴性对照组2.组2 :吸附到明矾上的重组完全表面抗原3.组3 :吸附到明矾上的重组核心抗原4.吸附到明矾上的重组完全表面抗原和重组核心抗原(复合抗原疫苗)
给药方法每一试验疫苗通过肌肉注射给药三次，间隔两星期。(d)免疫应答的分析方法I)体液免疫应答的分析将未免疫血清和免疫两周后的血清分开，使用ELISA分析在血清中产生的抗体以测定抗体滴度。首先，使用提纯的各抗原以IOOng/孔的浓度附着到96孔微孔板上，并使用牛血清白蛋白(1%)封闭I小时。清洗该微孔板。将连续稀释的血清加到每个孔，使在37°C下反应2小时。然后，加入抗鼠IgG-HRP作为第二抗体，在同样条件下反应I小时。清洗之后，加入一展开剂，在室温下反应20分钟。然后，使用一 ELISA检测仪在450nm测量OD值。抗体滴度被定义为OD值比阴性对照高三倍时的稀释倍数的倒数。2)细胞介导免疫应答的分析最终免疫后，取出所有小鼠的脾脏，分离并培养全部脾细胞。通过ELISPOT分析干扰素Y分泌脾细胞以确认细胞介导免疫应答。三级免疫后两周，将从每只小鼠身上取出的脾脏放入一细胞滤网，并挤入。然后，用一红细胞(RBC)裂解液将红细胞完全去除，分离脾细胞。分离得到的的脾细胞在完全培养基(在RPMI1640培养基中的IX谷氨酸盐和IX抗生素)中培养。为观察各抗原特异的免疫应答，向该培养基中以I μ g/ml的浓度加入该核心抗原和完全表面抗原，以激励抗原特异的免疫细胞。然后，使用，ELISPOT (BD Biosciences)分析干扰素Y分泌细胞的数目(细胞介导免疫应答指标)。3. 2体液免疫应答的效果与仅含有该重组完全表面抗原(L-HBsAg)的该单一抗原疫苗相比，在使用含有重组完全表面抗原(L-HBsAg)和重组核心抗原的复合疫苗给药的组中，抗乙型肝炎表面抗原(anti-HBs)的抗体被更快地诱发(图9)。在与该重组核心抗原混合的情况下，观察到有提高体液免疫应答的效果。但是，在最终免疫后，该单一抗原疫苗及复合抗原疫苗展示出同样的抗体滴度。3. 3细胞介导免疫应答的效果与仅含有该重组完全表面抗原(L-HBsAg)的该单一抗原疫苗或仅含有该重组核心抗原的该单一抗原疫苗相比较，在使用含有重组完全表面抗原(L-HBsAg)和重组核心抗原的复合疫苗给药的组中，观察到更高的细胞介导免疫应答(图10)。在与该重组核心抗原混合的情况下，细胞介导免疫应答被更有效地诱发。因此，该复合抗原疫苗优选为用作一诱发细胞介导免疫应答的治疗疫苗。实例4胶体金佐剂的制备4. I胶体金的制备
胶体金通过一弗朗士开发的基于朽1檬酸钠工艺的方法制备(Frens G,Controllednucleation for the regulation of the particle size in monodisperse goldsolutions. Nature Phys. Sci. 241 :20,1973)。将 0. 2g 氯化金(HAuC143H20)溶解在 IOml 蒸馏水中以制备一 2%金原液。搅拌加热IOOml蒸馏水，加入Iml的2%金原液至一 0. 02%的最终浓度，保持加热搅拌约五分钟。加入10%柠檬酸溶液至一 0. 032 0. 036%的最终浓度，保持加热搅拌5到10分钟。此时，该溶液的颜色最初为灰色，渐渐地变成紫色，I到3分钟后，变成红色。对该溶液进行水浴，然后冷却。然后，测量OD54tl和( _。胶体金的数目或浓度通过读取OD54tl值测量，为2到4。粒子尺寸或质量通过读取0D_值测量，为0. 55到0. 75。制得胶体金的粒子尺寸为约10到40nm。4. 2胶体金佐剂的制备将IOOmM—水碳酸钠(或其它缓冲剂)加入到制得的该胶体金溶液中，将该溶液 的PH滴定到7. 5。然后，当搅拌该胶体金溶液时，每Iml该溶液(含有200 μ g胶体金)加入20 μ g牛血清白蛋白(BSA)或10 μ g的preS抗原,在室温下继续搅拌15分钟。离心后，移除上清液，使用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS buffer)清洗沉淀物三次以去除游离的BSA或preS抗原。然后，将该沉淀物重悬浮在磷酸盐缓冲溶液中，并在4°C下保存。图I显示了一张附着PreS蛋白的胶体金合成物的电子显微镜照片(JEM1010，67. 0k)。通过测量在BSA或preS抗原吸附后离心获得的上清液中蛋白的量以确定蛋白吸附的量。实例5胶体金佐剂对诱发免疫应答的效果5. I免疫实验条件和分析方法(I)目的为确认胶体金合成物作为佐剂的效力，分析在免疫小鼠身上诱发的免
疫应答。(2)材料和方法(a)实验动物6周大的雌性C57BL/6小鼠。(b)试验疫苗将提纯的该重组核心抗原和完全表面抗原吸附到明矾上以制备一试验疫苗。每份每抗原使用0. 5 μ g。进一步的,将0. 5 μ g未吸附到明帆上的自由抗原与200 μ g胶体金合成物混合。(C)免疫组和免疫条件免疫组I.组I :使用PBS (磷酸盐缓冲生理盐水)免疫的阴性对照组2.组2 :吸附到明矾上的重组完全表面抗原和核心抗原免疫的组3.组3 :使用胶体金合成物和未吸附到明矾上的完全表面抗原和重组核心抗原的混合物免疫的组给药方法每一试验疫苗通过肌肉注射给药二次，间隔两星期。(d)免疫应答的分析方法I)体液免疫应答的分析如实例3所示，通过ELISA分析体液免疫应答。2)细胞介导免疫应答的分析二级免疫后两周内，从全部小鼠身上取出脾脏，分离并培养全部脾细胞以分析细胞介导免疫应答。从每一小鼠身上分离得到的的脾细胞放入一细胞滤网，并挤入。然后，用一红细胞(RBC)裂解液将红细胞完全去除，分离脾细胞。分离得到的的脾细胞在完全培养基(在RPMI1640培养基中的IX谷氨酸盐和IX抗生素)中培养。为观察各抗原特异的免疫应答，向该培养基中以1 μ g/ml的浓度加入该核心抗原和完全表面抗原，以激励抗原特异的免疫细胞。然后，使用一 ELISA试剂盒(BD Biosciences)分析细胞分泌的细胞因子(干扰素Y作为细胞介导免疫应答的指标)。5.2胶体金合成物作为佐剂的效力(1)体液免疫应答的效果在以疫苗抗原给药的组2和组3中，与该阴性对照组(组1)相比较，诱发了对每一抗原特异的抗乙型肝炎表面抗原的抗体及乙型肝炎核心抗体。但是在使用明矾作为佐剂(组2)的时，发现比使用胶体金合成物作为佐剂(组3)(图12)具有更高的抗体形成。明矾，如先前所知，是一种能够诱发强体液免疫应答的佐剂。在本发明中使用的该胶体金合成物也发被发现诱发体液免疫应答。但是，为比较两种佐剂作为供治疗疫苗使用的佐剂，需比较两种佐剂诱发的细胞介导免疫应答。(2)细胞介导免疫应答的效果为确认该胶体金合成物是否诱发了细胞介导免疫应答，在二级免疫后将每只小鼠的脾细胞分离，并使用ELISA分析对该核心抗原和表面抗原特异的该干扰素Y的生成。在使用明矾作为佐剂时(组2)，抗原特异的干扰素Y的生成比未免疫的该对照组提高了 2. 5倍。在使用胶体金合成物作为佐剂时，抗原特异的干扰素Y的生成比未免疫的该对照组大大提高(图13)，具体地，该表面抗原特异的细胞介导免疫应答比使用明矾提高了 4倍。也就是说，当该胶体金被作为佐剂使用时，针对乙型肝炎病毒抗原的细胞介导免疫应答被有效诱发以提高干扰素Y的生成以去除病毒。因此，该胶体金合成物能诱发强细胞介导免疫应答，从而在开发有效的治疗疫苗中可用作良好的佐剂。实例6治疗疫苗的优化6. 1免疫实验条件和分析方法(1)目的为使体液免疫应答和细胞介导免疫应答最大化，比较治疗疫苗的最佳组成。(2)材料和方法(a)实验动物6周大的雌性C57BL/6小鼠。(b)试验疫苗将提纯的该重组核心抗原和完全表面抗原吸附到明矾上。每份每抗原使用O. 5 μ g。进一步的，将O. 5 μ g吸附到明矾上的各抗原与200 μ g附着BSA的胶体金合成物混合，并进行免疫。(c)免疫组和免疫条件免疫组组1 :使用PBS (磷酸盐缓冲生理盐水)免疫的阴性对照组组2 :吸附到明矾上的重组完全表面抗原和核心抗原免疫的组组3 :使用胶体金合成物和吸附到明矾上的完全表面抗原和重组核心抗原的混合物免疫的组。
给药方法每一试验疫苗通过肌肉注射给药二次，间隔两星期。(d)免疫应答的分析方法
对试验疫苗诱发的体液免疫应答和细胞介导免疫应答的分析同实例3和实例5的描述。6. 2诱发的免疫应答的分析(I)体液免疫应答的效果在以疫苗抗原给药的组中(组2和组3)，与该阴性对照组(组I)相比较，诱发了抗原特异的抗体形成。在组2 (使用吸附到明矾的抗原免疫)和组3 (使用胶体金合成物和吸附到明矾的抗原的混合物免疫)之间抗体滴度没有显著差别(图14)。结果是，明矾和胶体金合成物被混合以用作佐剂，从而提高体液免疫应答。(2)细胞介导免疫应答的效果为确认该胶体金合成物是否诱发了细胞介导免疫应答，在二级免疫后将每只小鼠的脾细胞分离，并使用ELISA分析该干扰素Y的生成。在使用吸附到明矾上的该疫苗抗原免疫的组2中，抗原特异的干扰素Y的生成比该阴性对照组提高了两倍。在使用该疫苗抗原和胶体金合成物免疫的组3中，核心抗原特异的干扰素Y的生成提高了 2. 5倍，表面抗原特异的干扰素Y的生成提高了 4. 5倍(图
15)。因此，再次确认了明矾是一种能诱发强体液免疫应答的佐剂且该胶体金合成物是一种能诱发强细胞介导免疫应答的佐剂，如实例4所示。于是，使用吸附到明矾的疫苗和胶体金合成物的混合物进行免疫以实现对一种具有最优的体液免疫应答和细胞介导免疫应答的治疗疫苗的开发。实例7对转基因小鼠疫苗效力的确认(I)7. I免疫实验条件和分析方法(I)目的分析在正常小鼠身上确立的治疗疫苗组成对转基因小鼠(HBsAg/HLA-A2)的效力。(2)材料和方法(a)实验动物6 周大的雌性 HBsAg/HLA-A2 转基因小鼠(Loirat D et. al, HBsAg/HLA_A2transgenic mice a model for T cell tolerance to hepatitis B surface antigenin chronic hepatitis B virus infection International Immunology 15 :1125-1136,2003)。该小鼠模型连续表达HBV表面抗原(HBsAg)，并分泌由表面抗原组成的病毒样粒子进入血液。进一步的，该小鼠模型将该HBV表面抗原基因识别为自身基因，且不诱发对该基因的免疫应答，显示出免疫耐受力。也就是说，这是一为HBV慢性带原者的小鼠模型，其中针对HBV抗原的免疫应答太弱而不足于去除病毒抗原，且保持着慢性感染的状态。(b)疫苗抗原和佐剂该提纯的重组核心抗原和完全重组表面抗原被吸附到明矾上以用作一疫苗抗原。附着BSA的该胶体金合成物被用作治疗疫苗的佐剂。(C)免疫组和免疫条件免疫组组I :使用PBS (磷酸盐缓冲生理盐水)免疫的阴性对照组
组2 :吸附到明矾上的重组完全表面抗原和核心抗原免疫的组组3 :使用胶体金合成物和吸附到明矾上的完全表面抗原和重组核心抗原的混合物免疫的组。给药方法每一试验疫苗通过肌肉注射给药三次，间隔两星期。(d)血清中病毒样粒子的分析收集未免疫的血清和三级免疫后的血清，使用一 Genedia HBsAgELISA试剂盒
3.O (GREEN CROSS)分析由该表面抗原(HBsAg)组成的在血清中的病毒样粒子的量。(e)体液免疫应答的分析
收集未免疫的血清和三级免疫后的血清，用与实例4中描述的一致的方式分析抗原特异的抗体形成。进一步的，诱发抗体的亚型通过测量IgG2a和IgGl的比例来测定。(f)细胞介导免疫应答的分析按实例4中描述的方法分离并培养脾细胞，并通过ELISA和ELISPOT法分析作为细胞介导免疫应答指标的干扰素Y的诱发。(g)干扰素Y和表面抗原基因在肝脏中的表达的分析从小鼠肝脏中提取总RNA，使用RT-PCR方法对基因表达进行分析。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离总RNA,并使用下述引物和一步的RT-PCR试剂盒(Qiagen)分析表面抗原基因(SEQ ID NOs. 9 and 10)和干扰素Y基因(SEQ ID NOs. 11 and 12)的表达。^actin基因(SEQ ID NOs. 13and 14)的表达用于作为一阴性对照。S- (F) 5' -ATG GAG AGC ACA ACA TCA GG—3' (SEQ ID NO. 9)S-(R) 5' -TTA AAT GTA TAC CCT AAG-3' (SEQ ID NO. 10)INF-y (F) 5' -AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3' (SEQ ID NO. 11)INF-y (R) 5' -GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3' (SEQID NO. 12)β actin(F)5/ -TCC TGT GGC ATC CAT GAA AC-3' (SEQ ID NO. 13)β actin(R)5/ -CTT CGT GAA CGC CAC GTG C-3/ (SEQ ID NO. 14)7. 2胶体金合成物作为治疗疫苗的佐剂的效力(I)免疫耐受性的破坏该转基因小鼠模型将该HBV表面抗原识别为自身抗原而不诱发针对该抗原的免疫应答，显示出免疫耐受性。但是，当该小鼠模型使用该治疗疫苗给药时，对该表面抗原的该免疫耐受性被破坏以诱发体液免疫应答和细胞介导免疫应答。(a)体液免疫应答的诱发针对该表面抗原的抗体滴度通过使用该未免疫的血清和三级免疫后的血清测定。尽管抗原在血液中的高浓度得以在阴性对照(组I)中保持，但没有检测到针对该表面抗原的抗体。但是，在使用该疫苗抗原给药的组中(组2和组3)，对该表面抗原的免疫耐受性被破坏，且针对该表面抗原的抗体被生成。与使用吸附到明矾上的该疫苗抗原给药的组(组2)相比较，使用附着BSA的该胶体金合成物作为佐剂时(组3)，该诱发抗体的生成稍低(图
16)。但是，使用该胶体金合成物作为佐剂的组3中，IgG2a和IgGl的比例被发现比仅使用明矾的组2更高(图17)。因此，可见该胶体金合成物作为佐剂使免疫应答偏向Thl应答。(b)细胞介导免疫应答的诱发已知强细胞介导免疫应答对病毒去除很关键。因此，为确认该治疗疫苗是否破坏了免疫耐受性并诱发了该表面抗原特异的细胞介导免疫应答，将免疫后的脾细胞分离，通过ELISPOT和ELISA以比较作为细胞介导免疫应答指标的干扰素、的生成。在使用转基因小鼠的实验中，在使用该胶体金合成物作为佐剂的组3中诱发了更高的细胞介导免疫应答(图18中的A和B)，与实例5的结果相似。(2)血液中由表面抗原(HBsAg)组成的病毒样粒子的减少收集未免疫的血清和三级免疫的血清以分析血液中由表面抗原(HBsAg)组成的病毒样粒子的量。如前面所报道的，血液中病毒样粒子的量在阴性对照组中自然下降了约40%。但是，血液中病毒样粒子的量在使用该治疗疫苗免疫的组中显著下降。进一步的，在三级免疫后，与仅使用吸收到明矾上的该疫苗抗原免疫的组2相比较，在使用该疫苗抗原和胶体金合成物的混合物免疫的组3中检出了最少量的病毒样粒子(图19)。在仅使用吸收到明矾上的该疫苗抗原免疫的组2中，发现抗原的量暂时地下降，但是细胞介导免疫应答并未被诱发。因此，不能认为彻底去除了病毒。
(3)细胞介导免疫应答使肝脏中病毒基因表达的下降为从被感染的肝细胞中去除病毒，分泌干扰素Y并具有杀伤活性的免疫细胞必须移往肝脏以抑制病毒基因的转录并直接破坏被感染的细胞。因此，为确认在转基因小鼠的肝脏内抗原特异的细胞介导免疫应答是否真正被诱发，从该小鼠肝脏中提取总RNA，并通过RT-PCR方法分析干扰素Y的表达。发现干扰素Y的表达在对照组(组I)和组2中很低，但是发现干扰素Y的表达在组3中高出3至4倍(图20)。进一步的，为确认生成的干扰素Y是否抑制了病毒基因的表达，意即，在肝细胞中的HBV表面抗原基因，进行与前述相同的方法以比较表面抗原基因的表达。发现在仅使用吸附到明矾上的该抗原免疫的该对照组(组I)和组2中保持了表面抗原的高表达水平。相反，发现在组3中表面抗原的表达显著下降(图20)。因此，可见本发明的该治疗疫苗破坏了对乙型肝炎病毒抗原的免疫耐受性，并诱发了体液免疫应答和细胞介导免疫应答。具体地，发现作为佐剂的该胶体金诱发了强细胞介导免疫应答以抑制病毒基因在肝细胞中的表达并从血液中去除病毒样粒子。于是，这些实验表明本发明的含有作为佐剂的胶体金的该治疗疫苗破坏了免疫耐受性以诱发抗原特异的免疫应答，从而有利于治疗慢性感染。实例8对转基因小鼠疫苗效力的确认(2)8. I免疫实验条件和分析方法使用附着一部分HBV表面抗原，preS蛋白的胶体金合成物作为治疗疫苗的佐剂。实验动物，免疫组及分析方法与实例7中描述的一致。8. 2附着preS的胶体金合成物作为治疗疫苗的佐剂的效力(I)免疫耐受性的破坏在使用附着preS的胶体金合成物作为治疗疫苗的佐剂时，免疫耐受性被破坏以诱发体液免疫应答和细胞介导免疫应答，如在实例6中所示(使用附着BSA的胶体金合成物)。(a)体液免疫应答的诱发对该表面抗原的抗体滴度使用未免疫的血清和三级免疫后的血清测定。即使在阴性对照(组I)中血液中抗原的高浓度得以保持，却没有检测到针对该表面抗原的抗体。但是，在使用该疫苗抗原给药的组中(组2和组3)，针对该表面抗原的免疫耐受性被破坏，且产生针对该表面抗原的抗体。与使用吸附到明矾上的疫苗抗原给药的组(组2)相比较，在使用附着BSA的胶体金合成物作为佐剂时(组3)，被诱发抗体的生成稍低些(图21)。但是，发现IgG2a与IgGl的比例在使用该胶体金作为佐剂的组3中比仅使用明矾作为佐剂的组2中更高(图22)。因此，可见该胶体金合成物作为佐剂使免疫应答偏向Thl应答。(b)细胞介导免疫应答的诱发已知强细胞介导免疫应答对病毒去除很关键。因此，为确认该治疗疫苗是否破坏了免疫耐受性并诱发了该表面抗原特异的细胞介导免疫应答，将免疫后的脾细胞分离，通过ELISP0T和ELISA以比较作为细胞介导免疫应答指标的干扰素、的生成。在使用转基因小鼠的实验中，在使用该胶体金合成物作为佐剂的组3中诱发了更高的细胞介导免疫应答(图23中的A和B)，与实例5的结果相似。
(2)血液中由表面抗原(HBsAg)组成的病毒样粒子的减少收集未免疫的血清和三级免疫的血清以分析血液中由表面抗原(HBsAg)组成的病毒样粒子的量。如前面所报道的，血液中病毒样粒子的量在阴性对照组中自然下降。但是，血液中病毒样粒子的量在使用该治疗疫苗免疫的组中显著下降。进一步的，在三级免疫后，与仅使用吸收到明矾上的该疫苗抗原免疫的组2相比较，在使用该疫苗抗原和胶体金合成物的混合物免疫的组3中检出了最少量的病毒样粒子(图24)。在仅使用吸收到明矾上的该疫苗抗原免疫的组2中，发现抗原的量暂时地下降，但是细胞介导免疫应答并未被诱发。因此，不能认为彻底去除了病毒。产业适用件如上所述,本发明提供了一种乙型肝炎疫苗，其包括由preSl, preS2及S抗原(L-HBsAg)组成的一完全乙型肝炎表面抗原，及一种复合HBV抗原疫苗，其包括该完全表面抗原及一重组核心抗原。该疫苗进一步包括胶体金作为佐剂以诱发强细胞介导免疫应答，从而用作乙型肝炎病毒的治疗疫苗。
权利要求
1.一种表达由L蛋白，M蛋白和S蛋白组成的一重组完全HBV表面抗原的表达载体，通过将具有一完整HBV包膜基因和一含有多聚腺苷酸化位点的完整3' -UTR核苷酸的编码区的一多核苷酸注入通过保藏编号KCCM 10202识别的一 pSGM载体制备。
2.根据权利要求I所述的表达载体，其中该多核苷酸具有碱基序列SEQID NO. I。
3.一种由根据权利要求I所述的表达载体改造的细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞，其中该细胞通过保藏编号KCTCl1058BP识别。
5.一种制备由L蛋白，M蛋白和S蛋白组成的一重组完全HBV表面抗原的方法，包括培养如权利要求3或4所述的该细胞。
6.一种由根据权利要求5所述的方法制得的重组完全HBV表面抗原。
7.一种包括根据权利要求6的重组完全HBV表面抗原的乙型肝炎疫苗。
8.根据权利要求7所述的乙型肝炎疫苗，其进一步包括一佐剂。
9.根据权利要求8所述的乙型肝炎疫苗，其中该佐剂为明矾，胶体金或两者的组合。
10.根据权利要求7所述的乙型肝炎疫苗，其为一治疗疫苗。
全文摘要
本发明关于一种表达由L蛋白，M蛋白和S蛋白组成的一重组完全HBV表面抗原的表达载体，通过将具有一完整HBV包膜基因和一含有多聚腺苷酸化位点的完整3′-UTR核苷酸的编码区的一多核苷酸注入通过保藏编号KCCM 10202识别的一pSGM载体制备。
文档编号A61P31/20GK102851313SQ20121011226
公开日2013年1月2日 申请日期2008年1月28日 优先权日2008年1月28日
发明者廉晶善, 安秉喆, 赵显镇, 金桐姸, 李周娟, 金基贤, 尹在承, 文洪模 申请人:多贝尔有限公司