阳离子水包油乳液的制作方法
【专利摘要】本发明涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
【专利说明】阳离子水包油乳液
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2011年7月6日提交的美国临时申请61/505，109，2011年10月11日提交的美国临时申请61/545，936，和2012年I月11日提交的美国临时申请61/585，641的权益，上述申请各自的全部内容通过引用纳入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并通过引用全文纳入本文。所述ASCII副本创建于2012年7月5日，命名为PAT54691.txt，大小为424，203字节。
【背景技术】
[0005]核酸治疗在治疗从遗传紊乱到获得性病症的疾病中具有前景，所述疾病如癌症、感染性紊乱(AIDS)、心脏病、关节炎、和神经变性疾病(如帕金森病和阿尔茨海默病)。不仅可递送功能基因来修复遗传缺陷或诱导外源基因产物表达，而且还可递送核酸来抑制内源基因表达以提供治疗效果。基因表达的抑制可通过例如反义寡核苷酸、双链RNA(如siRNAs、miRNAs)或核酶来介导。
[0006]该治疗的关键步骤是体内递送核酸分子到细胞中。然而，体内递送核酸分子，尤其是RNA分子，面临许多技术障碍。首先，由于细胞和血清核酸酶，体内注入的RNA的半衰期仅约70秒(参见例如Kurreck, Eur.J.Bioch.270:1628-44 (2003))。已试图通过使用化学修饰来提高注射RNA的稳定性；然而，数个化学变化的例子导致细胞毒性效果增强或功能丧失或降低。在一个具体示例中，·细胞不耐受RNAi双链的剂量,该双链中每个第二磷酸被替换为硫代憐酸酯(Harborth 等，Antisense Nucleic Acid Drug Rev.13 (2): 83-105 (2003))。因此，需要开发能体内递送足量核酸分子(尤其是RNA分子)以引起治疗响应，但对宿主没有毒性的递送系统。
[0007]基于核酸的疫苗是疫苗的诱人替代方案。例如，肌肉内(IM)免疫接种编码抗原的质粒DNA可诱导细胞和体液免疫响应并保护抵御攻击。DNA疫苗比使用蛋白抗原或减毒病原体的传统疫苗具有一些优势。例如，与蛋白疫苗相比，DNA疫苗可更有效地产生具有天然构型的适当折叠抗原和产生细胞免疫响应。DNA疫苗还不具有灭活或减毒病原体相关的一些安全问题。例如，灭活的病毒制剂可包含残留的活病毒，且减毒病毒可变异并回复为致病表型。
[0008]基于核酸的疫苗的一个限制是通常需要大剂量的核酸以在非人灵长类和人中获得有效的免疫响应。因此，需要递送系统和佐剂来提高基于核酸的疫苗的效力。已开发各种方法用于将核酸分子导入细胞，如磷酸钙转染、聚戊二烯转染、原生质体融合、电穿孔、微注射和脂质转染。
[0009]阳离子脂质已被配制为脂质体来递送基因到细胞中。此外，已开发阳离子脂质乳液来递送DNA分子到细胞中。参见例如，Kim等，International Journal ofPharmaceutics, 295, 35-45 (2005)。
[0010]Ott 等(Journal of Controlled Release, 79 卷，1-5 页，2002)描述了用阳离子亚微米乳液作为DNA的递送系统/佐剂的方案。该亚微米乳液是基于MF59，一种水佐剂中的有效鲨烯，其是市售批准产品Fluad?的组分。1，2- 二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)用于促进质粒DNA的胞内递送。
[0011]Yi 等(Pharmaceutical Research, 17，314-320 (2000))公开了使用豆油和 DOTAP为阳离子脂质的阳离子水包油乳液。胆固醇、DOPE和聚合脂质也包括在一些乳液中。所述乳液显示能在最多至90%血清存在下增强DNA的体外转染效率。乳液颗粒的平均粒度在18Inm到344nm，且所述粒度在乳液稀释于PBS缓冲液后有增大。
[0012]Kim 等(Pharmaceutical Research, 18 卷，54-60 页，2001)和 Chung 等(Journalof Controlled Release，71卷，339-350页，2001)描述了用于提高DNA分子体外和体内转染效力的各种水包油乳液。在经测试的阳离子脂质中，就DNA递送而言，DOTAP形成的乳液最稳定、有效。在经测试的油中，S烯、轻质矿物油和霍霍巴豆油形成小颗粒的稳定乳液。体外转染的效率显示为与乳液的稳定性相关(例如，100mg/mL的鲨烯和24mg/mL的DOTAP配制的乳液显示高体外转染效率)。乳液的制备首先经混合阳离子脂质和水来形成脂质体悬液(通过超声处理)。脂质体随后被加入油(如鲨烯)中并超声处理混合物以形成水包油乳液。
[0013]编码抗原或其衍生物的RNA分子也可用作疫苗。RNA疫苗比DNA疫苗具有某些优势。然而，与基于DNA的疫苗相比，基于RNA的疫苗收到的关注相对较少。在作为治疗剂或疫苗给予时，RNA极易被核酸酶降解。此外，RNA不能主动运输到细胞中。参见，例如 Vajdy, M.Mucosal adjuvants and delivery systemsfor protein-, DNA-andRNA-based vaccines (基于蛋白、DNA和RNA的疫苗的胃肠道外佐剂和递送系统),ImmunolCell Biol，2004(6):617-27 页。
[0014]因此，需要提供用于核酸分子或其它带负电分子的递送系统。所述递送系统可用于基于核酸的疫苗，尤其是基于RNA的疫苗。
【发明内容】
[0015]本发明涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:脂质比例。所述油和阳离子脂质是乳液的单独组分，并优选所述油不是离子型的。所述阳离子脂质可与带负电分子相互作用，从而将所述分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述的阳离子乳液可用于递送带负电分子如核酸分子(例如编码抗原的RNA分子)至细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
[0016]一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中(i)油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1 (摩尔:摩尔)到约43:1 (摩尔:摩尔)。所述水包油乳液可含约0.2%-约8%(w/v)的油。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。
[0017]另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中⑴油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4% (w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2% (w/v)存在。
[0018]这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.01到约2.5%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80 (聚山梨酯80)，例如各0.5%(w/v)。
[0019]优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质选自下组:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰-Sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1- (2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
[0020]在一些实施方式中，所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和D0TAP，其中⑴油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1 (摩尔:摩尔)，且(ii)所述乳液中DOTAP的浓度为至少约2.58mM(l.8mg/mL)，或从约
2.58mM(l.8mg/mL)到约 7.16mM(5mg/mL)。所述油可为S烯或角S烧。
[0021]在一些实施方式中，所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和D0TAP，其中⑴油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中DOTAP的浓度为至少约2.58mM(l.8mg/mL)，且(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v) 存在。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，DOTAP的浓度从约2.58mM(l.8mg/mL)到约7.16mM(5mg/mL)。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4% (w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2% (w/v)存在。
[0022]本发明还提供一种制备水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中⑴油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇，所述方法包括(a)直接将阳离子脂质溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(c)通过均质化将所述油相分散在水相中。所述油可加热到温度约30°C~约65°C以促进所述阳离子脂质分散在油中。也可使用更高的温度，只要油或者阳离子脂质没有显著降解。
[0023]本发明还提供一种制备水包油乳液的方法，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中⑴油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，(iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在，且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇，所述方法包括(a)直接将阳离子脂质溶解于油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；以及(C)通过均质化将所述油相分散在水相中。所述油可加热到温度约30°C~约65°C以促进所述阳离子脂质分散在油中。也可使用更高的温度，只要油或者阳离子脂质没有显著降解。
[0024]另一方面，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有阳离子脂质和在25°C下为液相的油，且⑴油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中阳离子脂质的浓度为至少约1.25mM;以及(iii)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选所述乳液颗粒的平均直径在约80nm至180nm,或约80nm至150nm,或约80nm至约130nm,以及所述组合物的N/P比例至少约4:1，或从约4:1至约20:1，或从约4:1至约15:1。在某些实施方式中，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。所述水包油乳液可含约0.1%-约5%(w/v)的油。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。 [0025]另一方面，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有阳离子脂质和在25°C下为液相的油，且⑴油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中阳离子脂质的浓度为至少约1.25mM ； (iii)所述油以约0.1%至约4%(w/v)存在；以及(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。优选所述乳液颗粒的平均直径在约SOnm至180nm，或约80nm至150nm，或约80nm至约130nm，以及所述组合物的N/P比例至少约4:1，或从约4:1至约20:1，或从约4:1至约15:1。在某些实施方式中，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1(摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。在一些实施方式中，所述油以0.6%至4%(w/v)存在。在一些实施方式中，所述油以约1%至约3.2% (w/v)存在。
[0026]这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选地，表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.005到约1.25%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80 (聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5% (w/v)。
[0027]优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质是选自下组:1，2- 二油酸氧基-3- ( 二甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酸_sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
[0028]在一些实施方式中，本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，其中所述颗粒含有DOTAP和在25°C下为液相的油，且⑴油:DOTAP的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)；(ii)所述组合物中 DOTAP 的浓度为至少约 1.29mM,或从 1.29mM(0.9mg/mL)到约 3.58mM(2.5mg/mL)。所述油可为鲨烯或角鲨烷。可选的，N/P比为至少4:1。
[0029]在优选实施方式中，所述组合物带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)且PH在约6.0到约8.0，优选约6.2到约6.8。所述还可包含无机盐，且无机盐浓度优选不超过30mM。可选地，所述组合物还可含有非离子型等张剂，并优选是等渗的。
[0030]本发明还提供制备含核酸分子(优选RNA分子)组合物的方法，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，所述方法包括(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)组合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。在一些实施方式中，所述阳离子水包油乳液和RNA溶液以约l:l(v/v)的比例组合。所述含RNA分子的水溶液优选带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)，可含有无机盐(例如NaCl)，所述盐优选以约20mM存在或更少。在一种实施方式中，所述含RNA分子的水溶液含有2mM柠檬酸盐缓冲剂和20mM NaCl。可选地，所述含RNA分子的水溶液还含有非离子型等张剂，并且是等渗的。在一种实施方式中，所述水溶液还含有约560mM蔗糖。可选地，所述含RNA分子的水溶液还含有聚合物或非离子型表面活性剂，如Pluronic? F127，含量从约0.05%到约20%(w/v)。
[0031]另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相的颗粒，所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。
[0032]这方面的所述水包油乳液还可包含表面活性剂如非离子型表面活性剂。优选地，表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。表面活性剂存在量可为约0.01到约2.5%(w/v)。在一些实施方式中，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。在一些实施方式中，所述水包油乳液含有等量的SPAN85(失水山梨糖醇三油酸酯)和吐温80 (聚山梨酯80)，例如各0.25%或0.5%(w/v)。
[0033]优选所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。例如，在一些实施方式中所述阳离子脂质是选自下组:1，2- 二油酸氧基-3- ( 二甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酸_sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯`化铵(DOTMA)。
[0034]本发明提供一种含核酸分子(优选RNA分子)的组合物，所述核酸分子与阳离子水包油乳液的颗粒复合，所述乳液含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。优选地，所述水包油乳液是稳定的。在一些实施方式中，所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM。在一些实施方式中，所述油是鲨烯或角鲨烷。优选地，所述组合物的N/P比至少约4:1。
[0035]在优选实施方式中，所述组合物带缓冲(例如，含柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂)且PH在约6.0到约8.0，优选约6.2到约6.8。所述还可包含无机盐，且无机盐浓度优选不超过30mM。可选地，所述组合物还可含有非离子型等张剂，并优选是等渗的。
[0036]本发明还涉及在对象中产生免疫响应的方法，所述方法包括给予有需要的对象本文所述的组合物。优选在单次给药中给予所述对象的阳离子脂质(作为所述组合物的成分)的量不超过约30mg。在【具体实施方式】中，所述阳离子脂质是DOTAP且单次给药中给予对象的DOTAP总量不超过约24mg,或者不超过约4mg。【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1是编码5种CMV蛋白的五顺反子RNA复制子A526、A527、A554、A555和A556的示意图。亚基因组启动子用箭头表示，标记了其它控制元件。
[0038]图2的荧光柱状图显示用A527RNA复制子转染的BHKV细胞表达gH/gL/UL128/UL130/UL131五聚体复合物。用抗体进行细胞染色，所述抗体结合五聚体复合物上所呈递的构象表位。
[0039]图3是示意图和图表。该示意图显示编码CMV gH和gL的双顺反子RNA复制子A160和A531-A537。该图表显示免疫血清的中和活性，所述免疫血清来自用含有复制子的VRP免疫的小鼠。
[0040]图4显示免疫血清中抗VZV蛋白的抗体应答，所述免疫血清来自用编码VZV蛋白的单顺反子RNA复制子或编码VZV gE和gl、或gH和gL的双顺反子RNA复制子免疫的小鼠。所述小鼠经7 μ g RNA免疫，该RNA以CMF32配制。
【具体实施方式】
[0041]1.概述
[0042]本发明一般涉及阳离子水包油乳液，其含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例。所述油和阳离子脂质是乳液的单独组分，并优选所述油不是离子型的。所述阳离子脂质可与带负电分子如核酸相互作用，从而将所述带负电分子锚定到所述乳液颗粒。本文所述阳离子乳液可用于体内递送带负电分子，例如核酸分子(如编码蛋白或肽的RNA分子，小干扰RNA，自复制RNA等)到细胞，并可用于配制基于核酸的疫苗。
[0043]具体地，本发明是基于以下发现:能成功制得含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例的阳离·子水包油稳定乳液。含有高浓度阳离子脂质的乳液使得能够用乳液颗粒配制更多带负电的分子(如RNA分子)，从而提高递送效率。具体地，对于很多治疗剂如疫苗，优选小体积(例如，每剂0.5mL)给药。如本文所述的含有高浓度阳离子脂质并具有限定的油:阳离子脂质比例的乳液将能在特定的体积内递送更高剂量的RNA。
[0044]在优选实施方式中，RNA分子与所述水包油乳液的颗粒复合。相对于游离(“裸露”)RNA,复合的RNA分子稳定且受保护免于RNA酶介导的降解，并且能被细胞更有效摄入。
[0045]此外，当所述RNA被递送以诱导编码蛋白的表达时，例如在RNA疫苗的情况中，含有高浓度阳离子脂质的乳液能提高与乳液颗粒复合的RNA分子的量。由于更多RNA分子被递送至宿主细胞，所编码蛋白抗原的产生量更高，继而增强所述RNA疫苗的效力和免疫原性。最后，所编码蛋白的免疫原性可由于乳液的佐剂效应而得以增强。因此，除了更有效递送带负电分子(如编码抗原的RNA分子)之外，阳离子乳液还可通过佐剂活性增强免疫响应。例如，如本文所述和示例的，与低DOTAP乳液复合的RNA分子相比，RNA分子(编码呼吸道合胞病毒(RSV)F蛋白)和高DOTAP乳液复合的制剂在RSV小鼠模型和棉鼠模型中产生更高的免疫响应。
[0046]因此，一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中⑴油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约8:1(摩尔:摩尔)，(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM，且(iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
[0047]另一方面，本发明提供一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其中所述乳液的特征在于:(a)所述颗粒的平均直径在约SOnm至180nm ； (b)所述乳液含有油和阳离子脂质，其中⑴油:阳离子脂质的比例(摩尔:摩尔)为至少约4:1(摩尔:摩尔)，
(ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度为至少约2.5mM, (iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且(iv)其前提是所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
[0048]所述阳离子乳液还可含有表面活性剂(例如，吐温80、SPAN85、或其组合)。
[0049]在另一方面，本发明还提供阳离子水包油乳液的数种具体制剂，其含有高浓度阳离子脂质并可用于递送带负电分子。
[0050]另一方面，本发明提供一种制备水包油乳液的方法，所述方法包括:(I)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(2)提供所述乳液的水相；和(3)将所述油相分散在所述水相中(例如，通过均质化)。若需要，所述油可加热到温度约30°C~约65°C以促进所述阳离子脂质溶解在油中。优选地，油相的油:阳离子脂质比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)，并且可选或补充地，所述颗粒的平均直接从约80nm到ISOnm和/或油相中的阳离子脂质浓度至少约5mM。
[0051]另一方面，本发明提供制备包含带负电分子(如RNA分子)的组合物的方法，所述带负电分子与阳离子水包油乳液颗粒复合，所述方法包括:(i)提供本文所述的水包油乳液；(ii)提供含所述RNA分子的水溶液；以及(iii)组合(ii)的水溶液和(i)的水包油溶液，从而制备所述组合物。若需要，含所述RNA分子的水溶液可含有盐(NaCl)、缓冲剂(例如柠檬酸盐缓冲液)、非离子型等张剂(例如蔗糖、海藻糖、山梨糖醇或右旋糖)、聚合物(例如Pluronic? F127)、或其组合物。
[0052]本发明所述阳离子乳液可用`于递送带负电分子，如核酸(如RNA)。所述组合物可给予有需要的对象来产生或增强免疫响应。所述组合物还可与另一免疫原性分子、免疫原性组合物或疫苗共递送以增强所诱发免疫响应的效能。
[0053]2.定义
[0054]本文所用的术语“约”指某数值的+/_5%。
[0055]“抗原”指含一个或多个表位(线性、构象或兼有)的分子。
[0056]“缓冲液”指抗拒溶液pH变化的水溶液。
[0057]本文所用“核苷酸类似物”或“修饰的核苷酸”指在核苷的含氮碱基(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U)，腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))中或其上含一种或多种化学修饰(如取代)的核苷酸。
[0058]如本文所用，乳液“颗粒”指悬浮在水包油乳液的水(连续)相中的油滴。所述颗粒还包含阳离子液体，和可选的其它组分，如表面活性剂。
[0059]术语“聚合物”指由相同或不同的个体化学部分连接在一起所组成的分子。如本文所用，术语“聚合物”指那些首尾相连而形成线性分子的个体化学部分，以及以分支(如“多臂”或“星型”)结构形式连接在一起的个体化学部分。示例性聚合物包括，例如，泊洛沙姆。泊洛沙姆是非离子三嵌段共聚物，其具有聚氧丙烯(聚(环氧丙烷))中央疏水链，侧连两条聚氧乙烯(聚(环氧乙烷))亲水链。[0060]如本文所述，“糖(saccharide) ”涵盖单糖、寡糖或以直链或环形或其组合的形式形成糖链的多糖。寡糖是具有2种或更多单糖残基的糖。糖的示例包括葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、麦芽四糖、蔗糖和海藻糖。
[0061]当乳液颗粒在4°C下至少1个月，优选至少2个月保持分散而没有显著聚集或聚结时，乳液是“稳定的”。当乳液于4°C保存I个月，或优选2个月时，稳定乳液的平均颗粒直径(数量平均直径)的改变不超过10%。
[0062]术语“表面活性剂”是本领域术语并通常指同时具有亲水基团(如极性基团)和疏水基团的任何分子，亲水基团在能量上倾向于被水溶剂化，而疏水基团不能被水良好溶剂化。术语“非离子表面活性剂”是本领域已知术语并通常指其亲水基团(如极性基团)不带静电荷的表面活性剂分子。
[0063]乳液的“ζ电势”通过乳液颗粒的电泳迁移率来确定。颗粒在单位电场内的速度被称作其电泳迁移率。(电势通过亨利方程与电泳迁移率关联:..2v, ~
[0064]
【权利要求】
1.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，并且 其中: (i)油:脂质(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)； (ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM ;且 (iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
2.如权利要求1所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约150nmo
3.如权利要求1或2所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约SOnm到约130nm。
4.如权利要求1-3中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
5.如权利要求1-4中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1 (摩尔:摩尔)。
6.如权利要求1-5中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液含有约0.2%到约8%(w/v)的油。
7.如权利要求1-6中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。`
8.如权利要求1-7中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
9.如权利要求8所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
10.如权利要求8或9所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
11.如权利要求8-10中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
12.如权利要求8-11中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。
13.如权利要求12所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.5%(v/v)吐温 80 和约 0.5%(v/v) SPAN85。
14.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
15.如权利要求1-13中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
16.如权利要求15所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是D0TAP。
17.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约2.58mM(l.8mg/mL)。
18.如权利要求16所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是约，2.58mM(l.8mg/mL)到约 7.16mM(5mg/mL)。
19.制备权利要求1-18中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括:(a)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(C)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括加热所述油至温度在约30°C到约65°C之间。
21.一种组合物，其包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述颗粒包括在25°C时为液相的油，和阳离子脂质，其中: (i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约8:1(摩尔:摩尔)； (ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM ;且 (iii)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
22.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约SOnm到约180nm。
23.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约SOnm到约150nmo
24.如权利要求21所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约SOrnn到约130nmo
25.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约 4:1。
26.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1 到约 20:1。
27.如权利要求21-24中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1 到约 15:1。
28.如权利要求21-27中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约10:1(摩尔:摩尔)到约43:1 (摩尔:摩尔)。
29.如权利要求21-28中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.1%-约5%(w/v)的油。
30.如权利要求29所述的组合物，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
31.如权利要求21-30中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒还包含表面活性剂。
32.如权利要求31所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
33.如权利要求31或32所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
34.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.005%到约1.25%(v/v)的表面活性剂。
35.如权利要求31-33中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。
36.如权利要求35所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约.0.25%(v/v)吐温 80 和约 0.25%(v/v) SPAN85。
37.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
38.如权利要求21-36中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组:1，2-二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N-二油酰-N，N-二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3-二油烯氧基)丙基]-N, N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
39.如权利要求38所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是D0TAP。
40.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是至少约.1.29mM(0.9mg/mL)。
41.如权利要求39所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是约1.29mM(0.9mg/mL)到约 3.58mM(2.5mg/mL)。
42.如权利要求21-41中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
43.如权利要求42所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
44.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，所述方法包括: (i)提供权利要求1-18中任一项所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)组合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，(i)的所述阳离子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以约1:1 (v/v)的比例组合。
46.如权利要求44或45所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液含有盐。
47.如权利要求46所述的方法，其特征在于，所述盐是NaCl。
48.如权利要求47所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约20mMNaCl。
49.如权利要求44-48中任一项所述的方法，其特征在于，包含所述RNA分子的水溶液是缓冲液。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。
51.如权利要求50所述的方法，其特征在于，所述缓冲液包含约2mM柠檬酸盐。
52.如权利要求44-51中任一项所述的方法,其特征在于,包含所述RNA分子的水溶液包含非离子型等张剂。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是糖或糖醇。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂选自下组:蔗糖、海藻糖、山梨糖醇、右旋糖和其组合。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述非离子型等张剂是蔗糖。
56.如权利要求55所述的方法,其特征在于,所述水溶液包含约560mM鹿糖。
57.如权利要求44-56中任一项所述的方法,其特征在于,包含所述RNA分子的水溶液包含聚合物。
58.如权利要求57所述的方法，其特征在于，所述聚合物是Pluronic?F127。
59.如权利要求57或58所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约0.05%到约20%(w/v)的聚合物。
60.如权利要求57-59中任一项所述的方法，其特征在于，所述水溶液包含约l%(w/V) Pluronic? F127。
61.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相的颗粒，其特征在于，所述乳液含有油和阳离子脂质，所述颗粒的平均直径从约80nm到180nm,所述油以0.6%至4%(w/v)存在；且所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM。
62.如权利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
63.如权利要求61或62所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的阳离子脂质浓度至少约2.5mM。
64.如权利要求61-63中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烧。
65.如权利要求61-64中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
66.如权利要求65所 述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
67.如权利要求66所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
68.如权利要求65-67中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
69.如权利要求65-68中任一项所述的水包油乳液,其特征在于,所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。
70.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
71.如权利要求61-69中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
72.如权利要求71所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是D0TAP。
73.—种组合物，其包含与权利要求61-72中任一项所述的阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子。
74.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约4:1。
75.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1到约20:1。
76.如权利要求73所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比为约4:1到约15:1。
77.如权利要求73-76中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
78.如权利要求77所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
79.如权利要求73-78中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液颗粒的平均直径为约80nm到约180nm。
80.如权利要求21-43和73-79中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物经缓冲且pH为约6.0-约8.0。
81.如权利要求21-43和73-80中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含无机盐，且无机盐浓度不超过30mM。
82.如权利要求21-43和73-81中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含非离子型等张剂并且为等渗的。
83.如权利要求1-20中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。
84.—种组合物，其包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述组合物用下述过程制得: (i)提供权利要求61-72中任一项所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)组合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
85.如权利要求21-43、73-82和84中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码两个或更多抗原的多顺反子RNA。
86.如权利要求85所述的组合物，其特征在于，所述多顺反子RNA是α病毒复制子。
87.如权利要求86所述的组合物，其特征在于，所述α病毒复制子含有编码第一抗原的第一核苷酸序列和编码第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性连接于控制元件。
88.如权利要求87所述的组合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性连接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性连接于第二控制元件。
89.如权利要求87或88所述的组合物，其特征在于，还包含编码第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性连接于控制元件。
90.如权利要求89所述的组合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性连接于第二控制兀件。
91.如权利要求89或90所述的组合物，其特征在于，还包含编码第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性连接于控制元件。
92.如权利要求91所述的组合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性连接于第四控制元件。
93.如权利要求91或92所述的组合物，其特征在于，还包含编码第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性连接于控制元件。
94.如权利要求93所述的组合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性连接于第五控制元件。
95.如权利要求87-94中任一项所述的组合物，其特征在于，所述控制元件独立选自下组:亚基因组启动子、IRES、和病毒2A位点。
96.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求21-43、73-82和84-95中任一项所述的组合物给予有需要的对象。
97.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的阳离子脂质总量不超过约30mg。
98.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约24mg。
99.如权利要求96所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约4mg。
100.一种水包油乳液，其含有分散在水性连续相中的颗粒，其特征在于，所述颗粒的平均粒径为约SOnm到180nm，所述乳液含有油和阳离子脂质，并且 其中: (i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔); (ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约2.5mM ； (iii)所述油以约0.2%至约8%(w/v)存在；且 (iv)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
101.如权利要求100所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约0.6%到4% (w/v)存在。
102.如权利要求100或101所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约1%到约3.2% (w/v)存在。
103.如权利要求100-102中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约150nm。
104.如权利要求100-103中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
105.如权利要求100-104中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述水包油乳液是稳定的。`
106.如权利要求100-105中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1 (摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
107.如权利要求100-106中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烷。
108.如权利要求100-107中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述颗粒还含有表面活性剂。
109.如权利要求108所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
110.如权利要求108或109所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
111.如权利要求108-110中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液含有约0.01%到约2.5%(v/v)的表面活性剂。
112.如权利要求108-111中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。
113.如权利要求112所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.5%(v/v)吐温 80 和约 0.5%(v/v) SPAN85。
114.如权利要求100-113中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
115.如权利要求100-113中任一项所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP) ,1,2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N, N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化铵(DODAC)、和N_[l_(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
116.如权利要求115所述的水包油乳液，其特征在于，所述阳离子脂质是D0TAP。
117.如权利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约 2.58mM(l.8mg/mL)。
118.如权利要求116所述的水包油乳液，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是约2.58mM(l.8mg/mL)到约 7.16mM(5mg/mL)。
119.制备权利要求100-118中任一所述的水包油乳液的方法，所述方法包括:(a)直接将阳离子脂质溶解在油中以形成油相；(b)提供所述乳液的水相；和(C)通过均质化将所述油相分散在所述水相中。
120.如权利要求119所述的方法，其特征在于，步骤(a)还包括加热所述油至温度在约30°C到约65°C之间。
121.—种组合物，其包含与阳离子水包油乳液颗粒复合的RNA分子，其特征在于，所述颗粒包括在25°C时为液相的油，和阳离子脂质，其中: (i)油:脂质的比例(摩尔:摩尔)至少约4:1(摩尔:摩尔)； (ii)所述乳液中阳离子脂质的浓度至少约1.25mM ;且 (iii)所述油以约0.1%至约4%(w/v)存在；且 (iv)所述阳离子脂质不是DC-胆固醇。
122.如权利要求121所述的组合物，其特征在于，所述油以约0.3%到2%(w/v)存在。
123.如权利要求121或122所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约0.5%到约1.6%(w/v)存在。
124.如权利要求121-123中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约 80nm 到 180nm。
125.如权利要求121-124中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约 80nm 到 150nm。
126.如权利要求121-125中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒的平均直径为约80nm到约130nm。
127.如权利要求121-126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的N/P比至少约4:1。
128.如权利要求121 -126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1 到约 20:1。
129.如权利要求121-126中任一项所述的组合物，其特征在于，所述乳液的N/P比为约4:1 到约 15:1。
130.如权利要求121-129中任一项所述的组合物，其特征在于，油:脂质的比例(摩尔:摩尔)是约4:1 (摩尔:摩尔)到约43:1(摩尔:摩尔)。
131.如权利要求121-130中任一项所述的组合物，其特征在于，所述油是鲨烯或角鲨烧。
132.如权利要求121-131中任一项所述的组合物，其特征在于，所述颗粒还包含表面活性剂。
133.如权利要求132所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
134.如权利要求132或133所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂不是聚乙二醇(PEG)-脂质。
135.如权利要求132-134中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.005%到约1.25%(v/v)的表面活性剂。
136.如权利要求132-135中任一项所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂是SPAN85 (失水山梨糖醇三油酸酯)、吐温80 (聚山梨酯80)、或其组合。
137.如权利要求136所述的组合物，其特征在于，所述阳离子水包油乳液包含约0.25%(v/v)吐温 80 和约 0.25%(v/v) SPAN85。
138.如权利要求121-137中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质的头部基团包括季胺。
139.如权利要求121-138中任一项所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质选自下组:1，2- 二油酰氧基-3-(三甲基胺基)丙烷(DOTAP)、1，2- 二油酰-sn_甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOEPC)、N，N- 二油酰-N，N- 二甲基氯化铵(DODAC)、和N-[1-(2，3- 二油烯氧基)丙基]-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)。
140.如权利要求139所述的组合物，其特征在于，所述阳离子脂质是D0TAP。
141.如权利要求140所述的组合物，其特征在于，所述乳液中的DOTAP浓度是至少约1.29mM(0.9mg/mL)。
142.如权利要求140所述的组合物，其特征在于，所述组合物中的DOTAP浓度是约1.29mM(0.9mg/mL)到约 3.58mM(2.5mg/mL)。
143.如权利要求121-142中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码抗原的自复制RNA分子。
144.如权利要求143所述的组合物，其特征在于，所述自复制RNA是α病毒衍生的RNA复制子。
145.一种制备组合物的方法，所述组合物包含与阳离子水包油乳液的颗粒复合的RNA分子，所述方法包括: (i)提供权利要求100-118中任一项所述的水包油乳液； (ii)提供含有所述RNA分子的水溶液；以及 (iii)组合⑴的水包油乳液和(ii)的水溶液，从而制备所述组合物。
146.如权利要求145所述的方法，其特征在于，(i)的所述阳离子水包油乳液和(ii)的所述RNA溶液以约1:1 (v/v)的比例组合。
147.如权利要求61所述的水包油乳液，其特征在于，所述油以约1%到约3.2%(w/v)存在。
148.如权利要求121-144中任一项所述的组合物，其特征在于，所述RNA分子是编码两个或更多抗原的多顺反子RNA。
149.如权利要求148所述的组合物，其特征在于，所述多顺反子RNA是α病毒复制子。
150.如权利要求149所述的组合物，其特征在于，所述α病毒复制子含有编码第一抗原的第一核苷酸序列和编码第二抗原的第二核苷酸序列，其中所述第一核苷酸序列和所述第二核苷酸序列操作性连接于控制元件。
151.如权利要求150所述的组合物，其特征在于，所述第一核苷酸序列操作性连接于第一控制元件且所述第二核苷酸序列操作性连接于第二控制元件。
152.如权利要求150或151所述的组合物，其特征在于，还包含编码第三蛋白或其片段的第三核苷酸序列，其中所述第三核苷酸序列操作性连接于控制元件。
153.如权利要求152所述的组合物，其特征在于，所述第三核苷酸序列操作性连接于第三控制元件。
154.如权利要求152或153所述的组合物，其特征在于，还包含编码第四蛋白或其片段的第四核苷酸序列，其中所述第四核苷酸序列操作性连接于控制元件。
155.如权利要求154所述的组合物，其特征在于，所述第四核苷酸序列操作性连接于第四控制元件。
156.如权利要求154或155所述的组合物，其特征在于，还包含编码第五蛋白或其片段的第五核苷酸序列，其中所述第五核苷酸序列操作性连接于控制元件。
157.如权利要求156所述的组合物，其特征在于，所述第五核苷酸序列操作性连接于第五控制元件。
158.如权利要求150-157中任一项所述的组合物，其特征在于，所述控制元件独立选自下组:亚基因组启动子、IRES、和病毒2A位点。
159.—种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求121-144任一项所述的组合物给予有需要的对象。
160.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的阳离子脂质总量不超过约30mg。
161.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约24mg。
162.如权利要求159所述的方法，其特征在于，单次给药中给予所述对象的DOTAP总量不超过约4mg。
163.如权利要求1-18、21-43、61-83、85-95、100-118、121-144 或 147-158 中任一项所述的水包油乳液或组合物，其还包含抗氧化剂。
【文档编号】A61K47/06GK103796639SQ201280033539
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】L·布里托, M·陈, A·吉尔, 德里克·奥黑根, M·辛格 申请人:诺华股份有限公司