富芸香苷提取物及制造它的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从植物获得富芸香苷提取物的方法和由这样获得的Uncaria elliptica的富芸香苷提取物。
【专利说明】富芸香苷提取物及制造它的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及富芸香苷提取物和制造富芸香苷提取物的方法。
【背景技术】
[0002] 芸香苷（rutin)是用作轻乙芦丁（Troxerutin)的原材料的天然类黄酮，其增 加毛细管的耐力并降低静脉血管壁的渗透性。临床研究显示，用芸香苷衍生物羟乙芦丁 (Venoruton)治疗患者导致血栓形成后综合征（post thrombotic syndrome)的改善。参见 Panminerva Medicine, 53,第13页，2011。另一个研究发现，芸香苷是最有效的抗血栓形成 剂之一。参见 The Journal of Clinical Investigation(临床研究期刊），122,第 6 号， 2012。芸香苷作为用于药剂的原材料正在变得更加重要。
[0003] 为了从多种植物源,例如槐树（Sophora Japonica)(亚洲）、Fava d' anta(巴西） 和Uncaria elliptica(巴西）中提取和纯化芸香苷,典型地使用水和甲醇溶剂。然而,在 实践中，得自这样的植物源的富芸香苷提取物具有很多缺点，比如是浓棕色的，且与来自其 他源的富芸香苷提取物相比含有更高的铁含量。该棕色归因于在植物中的色素。
[0004] 发明概述
[0005] 通过常规的提取和/或纯化方法非常难以消除该棕色和降低铁含量，因为铁似乎 紧密地结合至色素中。已经进行了克服这些缺点的尝试。然而，这些尝试未能在保持良好 的芸香苷收率的同时减少结合在色素中的铁。
[0006] 对于适合于大规模的能够制备具有高的芸香苷含量、低的铁含量和减少的着色的 富芸香苷提取物的应用的经济方法，存在着需要。
[0007] 本发明基于以下出人意料的发现：醇和酸的特别的组合，其能够用于从植物获得 铁含量和着色低的富芸香苷提取物。
[0008] 因此，本文描述的是从植物获得富芸香苷提取物的方法。该方法包括：将含有芸香 苷的植物提取物溶解在甲醇或乙醇中，以获得粗制芸香苷提取物溶液，所述固态的含有芸 香苷的植物提取物含有90重量％至95重量％芸香苷和100至300ppm铁；减少所述粗制芸 香苷提取物溶液的体积，以获得浓缩物；通过向所述浓缩物加入所述含有芸香苷的植物提 取物的1-15重量％的酸、和任选地加入C1-C4醇、水、或者C1-C4醇和水，从而获得混合物， 其中，所述含有芸香苷的植物提取物构成所述混合物的8 %至30 % (w/v)，并且所述酸选自 由以下各项组成的组：抗坏血酸、柠檬酸、酒石酸、没食子酸和苹果酸；允许所述混合物静 置，以形成沉淀物；和将所述沉淀物分离，从而获得含有少于20ppm铁的富芸香苷提取物。 [0009] 所述含有芸香苷的植物提取物可以是由用水、醇或醇的水溶液提取Uncaria elliptica、槐树或Fava (Γ anta产生的粗制沉淀物形式获得的。
[0010] 在一些实施方案中，以含有芸香苷的植物提取物的1-10重量％，例如，1-5重量％ 或2-4重量％，加入酸。在加入水和C1-C4醇的情况下，水与C1-C4醇的比率可以是I : 1 至5 : 1，例如，I : 1至3 : 1。可以分别地、同时地、或者以C1-C4醇水溶液的形式，加入 水和C1-C4醇。
[0011] 本文的特征还在于Uncaria elliptica的富芸香苷提取物，该提取物含有通过 HPLC测量得出的97%至99%的芸香苷，和少于20ppm的铁，该提取物在550nm的吸收低于 0.2。该提取物还可以含有5重量％至10重量％水。它可以通过上述方法制备。
[0012] 实施方案描述
[0013] 在以下说明书中，描述本发明的一个以上实施方案的细节。通过说明书和通过权 利要求，本发明的其他特征，目的和优点将是明显的。
[0014] 本文描述的是一种使用醇和酸的新组合从植物源获得富芸香苷提取物的方法。通 过本方法获得的富芸香苷提取物与通过常规方法制备的提取物相比具有明显降低的着色 和铁含量。
[0015] 使用本领域中已知的常规方法，可以由不同植物源，例如槐树（Sophora Japonica)(亚洲）、Fava d' anta (巴西）和Uncaria elIiptica (巴西）制备含有芸香苷 的固态提取物。这样的方法包括但不限于：在不同溶剂中浸渍、加热、摇动、搅拌或泡制植物 材料，例如茎和叶。所用的植物材料可以为整体干燥的植物、粉碎的植物、或者粉末的形式。 溶剂包括水、醇（例如甲醇）或醇的水溶液。在提取之后，可以通过过筛、过滤、加压或其 他合适的技术，将提取物溶液从固体分离。可以将滤液浓缩并冷却，以允许沉淀物形成，从 而获得含有芸香苷的固态提取物。对于各种提取方法的描述，参见例如中国专利1013579; US2006/0099690;和 Dighe 等，International Journal of Pharma and Bio Sciences (制 药和生物科学国际期刊），2(1) :750-757(2011)。
[0016] 典型地，通过这些方法制得的含有芸香苷的固态提取物具有高的铁含量，例如， 100-300ppm，和严重的着色，例如，黄色或棕色，特别是在源自Uncaria elliptica.的提取 物中。芸香苷可以构成这些含有芸香苷的固态提取物的85重量％至90重量％。
[0017] 可以将这样制得的含有芸香苷的固态提取物溶解在醇溶剂，优选甲醇或乙醇中， 以获得粗制芸香苷提取物溶液。例如每Iml的溶剂可以溶解0. 05-0. 13g的固态提取物。可 以将粗制提取物溶液进一步浓缩，例如，在大气压下，以减少它的体积，例如，减少到四分之 一至十分之一。可以基于想要的下述混合物的体积和含量，预定粗制提取物溶液的最终体 积。
[0018] 向上述粗制芸香苷提取物溶液中，加入酸和任选地C1-C4醇，例如，甲醇、乙醇、丙 醇或正丁醇，以获得混合物。在混合物中也可以包含水。
[0019] 所用的酸选自抗坏血酸、柠檬酸、酒石酸、没食子酸和苹果酸。以上述用于制备粗 制芸香苷提取物溶液的含有芸香苷的固态提取物的约1-15重量％，例如，1-10重量％或 1-5重量％，向粗制芸香苷提取物溶液中加入酸。
[0020] 混合物必须含有至少一种C1-C4醇。例如，如上所述，可以使用甲醇或乙醇（即， C1-C4醇）并由含有芸香苷的固态提取物制造粗制芸香苷提取物溶液。可以无需向粗制芸 香苷提取物溶液中加入附加的C1-C4醇。在一些情况下，为了获得含有8%至30% (w/v) 含有芸香苷的固态提取物的混合物，可以例如以含有芸香苷的固态提取物的2-12倍（v/w) 添加 C1-C4醇、C1-C4醇水溶液，或C1-C4醇和水。添加的附加的C1-C4醇可以与用于制造 粗制芸香苷提取物溶液的醇相同或不同。
[0021] 芸香苷以各种水合物如一水合物、二水合物和三水合物的形式存在。已知的是，无 水合物（anhydrate)和一水合物是不稳定的。因此，优选的是在纯化过程中通过与水水合 而制备出相对稳定的二水合物或三水合物。因此，可以向粗制芸香苷提取物溶液中加入水。 可以独立地加入水。也可以以C1-4醇的水溶液的形式加入水。水与C1-C4醇的比率可以 是I : 1至5 : 1，例如，I : 1至3 : 1。如上所述，最终混合物优选含有8%至30% (w/ v)含有芸香苷的固态提取物。
[0022] 随后，使含有粗制芸香苷提取物溶液、C1-C4醇、酸和任选的水的混合物静置，用于 形成沉淀物例如晶体。例如，可以进一步将混合物浓缩，并且将浓缩的混合物搅拌并使其冷 却，以形成沉淀物。可以通过任何合适的技术，例如过滤收集沉淀物、用醇和/或水清洗、并 干燥。
[0023] 沉淀物，即富芸香苷提取物，可以含有当通过HPLC测量时97%至99%芸香苷，和 少于20ppm的铁，也是，少于lOppm。它还具有低的着色，例如，提取物在550nm的吸收低于 0.2。它还可以含有5重量％至10重量％水。富芸香苷提取物可以具有任何粒度，例如， 5 μ m(微米）以下。例如，它可以具有纳米大小的粒子。
[0024] 通过上述方法制备的富芸香苷提取物可用于多种应用。它可以是作为药物组合物 例如药品的制剂。它也可以用作营养补剂或食品添加剂。 实施例
[0025] 以下的具体实例被解释为仅仅是说明性的，并且无论如何不以任何形式限制公开 的其余部分。在没有进一步详细细节的情况下，据信本领域技术人员能够基于本文的描述 以本发明的最完整的范围利用本发明。本文引述的全部公开物通过引用将它们的全部结合 在此。
[0026] 通过以下过程，获得在以下实施例1-4中所述的铁含量、纯度和吸光度的值：
[0027] (1)铁含量
[0028] 精确获得I. Og的样品，并硫酸化。向残余物中加入2ml的盐酸。随后将样品干燥， 并在加入IOml水和一滴盐酸之后，在沸水中加热。在冷却之后，将体积精确调整至10. 0ml， 并随后通过0. 45微米过滤器过滤。通过ICP分析，测定样品溶液中铁的浓度。
[0029] (2)可见光吸收
[0030] 将I. Og的样品溶解在15ml的二甲基甲酰胺（DMF)中。在用DMF将体积调节至 20. Oml之后，将溶液过滤通过0. 45微米过滤器。在550nm，在I. Ocm的路径长度，测量过滤 后的样品的吸收。
[0031] ⑶ HPLC 分析
[0032] 按照欧洲药典专论三水合芦丁，相关物质（EP monograph Rutoside trihydrate， related substances),通过液相色谱进行HPLC分析。所用的试剂和条件简单陈述如下：
[0033] [化学 1]
[0034] 试验溶液：将0. IOg的待检测物质溶解在20ml的甲醇中，并用流动相B稀释至 100.Omlo
[0035] 参比溶液（a):将10. Omg的三水合芦丁 CRS溶解在10. Oml的甲醇中。
[0036] 参比溶液（b):用流动相B将I. Oml的参比溶液（a)稀释至50. 0ml。
[0037] 柱子（LiChrospher 100RP-8, C8,4. Ox 250mm，Agilent):
[0038] -尺寸：1 = 0· 25m，i. d. = 4. 0mm，
[0039] -固定相：用于色谱的辛基甲硅烷基硅胶（5 μ m)
[0040] -温度：30°C
[0041] 流动相：
[0042] -流动相A :将5体积的四氢呋喃与95体积的15. 6g/l磷酸二氢钠的溶液混合，该 磷酸二氢钠的溶液用磷酸调节至pH 3. 0。
[0043] -流动相B :将40体积的四氢呋喃与60体积的15. 6g/l磷酸二氢钠的溶液混合， 该磷酸二氢钠的溶液被用磷酸调节至PH 3.0。
[0044] [化学 2]
[0045] 梯度时间表
[0046]
【权利要求】
1. 一种从植物获得富芸香苷提取物的方法，所述方法包括： 将含有芸香苷的植物提取物溶解在甲醇或乙醇中，以获得粗制芸香苷提取物溶液，所 述含有芸香苷的植物提取物含有90重量％至95重量％芸香苷和100至300ppm铁； 减少所述粗制芸香苷提取物溶液的体积，以获得浓缩物； 通过向所述浓缩物加入所述含有芸香苷的植物提取物的1-15重量％的酸、以及任选 地加入C1-C4醇、水、或者C1-C4醇和水，从而获得混合物，其中，所述含有芸香苷的植物提 取物占所述混合物的8%至30% (w/v)，并且所述酸选自由以下各项组成的组：抗坏血酸、 柠檬酸、酒石酸、没食子酸和苹果酸； 使所述混合物静置，以形成沉淀物；以及 将所述沉淀物分离，从而获得含有少于20ppm铁的富芸香苷提取物。
2. 权利要求1所述的方法，其中所述含有芸香苷的植物提取物是以用水、醇或醇的水 溶液提取Uncaria elliptica、槐树或Fava (T anta产生的粗制沉淀物形式获得的。
3. 权利要求1所述的方法，其中加入所述C1-C4醇和水。
4. 权利要求1所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的1-10重量％ 加入。
5. 权利要求4所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的1-5重量％ 加入。
6. 权利要求5所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的2-4%加入。
7. 权利要求3所述的方法，其中所述C1-C4醇和水以含有5-80体积％水的C1-C4醇水 溶液的形式加入。
8. 权利要求3所述的方法，其中水与所述C1-C4醇的比率为按体积计的1 : 1至5 : 1。
9. 权利要求8所述的方法，其中水与所述C1-C4醇的比率为按体积计的1 : 1至3 : 1。
10. 权利要求1所述的方法，其中所述C1-C4醇是甲醇且所述酸是抗坏血酸。
11. 权利要求1所述的方法，其中所述C1-C4醇是正丁醇或丙醇。
12. 权利要求11所述的方法，其中所述酸是抗坏血酸。
13. 权利要求12所述的方法，其中所述C1-C4醇是正丁醇。
14. 权利要求13所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的1-10重 量％加入。
15. 权利要求14所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的1-5重 量％加入。
16. 权利要求15所述的方法，其中所述酸以所述含有芸香苷的植物提取物的2-4重 量％加入。
17. 权利要求13所述的方法，其中水与所述C1-C4醇的比率为按体积计的1 : 1至 5 : 1〇
18. 权利要求13所述的方法，其中水与所述C1-C4醇的比率为按体积计的1 : 1至 3 : 1〇
19. 一种Uncaria elliptica的富芸香苷提取物，所述提取物包含通过HPLC测量得出 的97%至99%的芸香苷，和少于20ppm的铁，所述提取物在550nm的吸收小于0. 2。
20. 权利要求19所述的富芸香苷提取物，其中所述提取物含有通过HPLC测量得出的至 少98%的芸香苷，和少于lOppm的铁，所述在550nm的吸收小于0? 1。
21.权利要求19所述的富芸香苷提取物，其中所述提取物含有5重量％至10重量％的 水。
【文档编号】A61K36/18GK104334569SQ201280073518
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2012年10月22日 优先权日:2012年10月22日
【发明者】南和伸, 谷胁慎治, 胜又亚希子 申请人:阿尔卑斯药品实业株式会社