一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法
【专利摘要】本发明涉及一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，属于生物制剂【技术领域】。该方法具体包括以下步骤：(1)制备免疫原准备：采用猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白；(2)采用免疫程序；(3)抗体效价测定；(4)纯化卵黄抗体；(5)鉴定卵黄抗体。本发明采取水稀释法，该法安全可靠没有污染，成本低，经过以上处理的高免蛋可以获得活性高、纯度高，产量高，性质稳定的卵黄抗体，操作方法简单易行可靠，有利于工业化生产。
【专利说明】一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，属于生物制剂【技术领域】。
【背景技术】
[0002]猪传染性胃肠炎(TGE)与猪流行性腹泻(PED)是引起猪腹泻的两种传染性肠道病毒病，均为冠状病毒属成员。由于这两种疫病传播快、引起的病死率高，在流行季节可呈暴发流行，给养猪业造成重大的经济损失，是我国当前猪病防控中的重点疫病。目前，疫苗接种仍然是预防该病的主要措施，尚无有效的治疗药物，一旦发病，往往损失惨重，并且随着国内一些抗生素逐渐被禁用及耐药性的产生，抗生素替代品的研究日益受到重视。因此，开发高效特异性防治药物已经成为临床上的迫切需求。
[0003]卵黄抗体(IgY)是用抗原免疫蛋鸡后产生的抗体由血液转入卵黄中形成的，其化学性质稳定、产量高、成本低，有开发功能性食品和新药的潜能。鸡卵黄可富集从鸡血清中转移而来的大量特异多克隆抗体IgY，这些抗体与哺乳动物产生的抗体相比具有许多明显的优点。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fe受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。目前IgY的应用主要是疾病的诊断检测和防治、食品添加剂及化妆品领域等。而且卵黄抗体作为一种高效的生物活性免疫球蛋白在兽医领域具有取代抗生素、抗血清等治疗手段的巨大潜力和优势。国内外已有抗细菌及病毒IgY产品问世，应用广泛的IgY有抗传染性法氏囊病、抗小鹅瘟病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗番鸭细小病毒病、抗鸡减蛋综合征等。卵黄抗体在猪病病原方面研究较少，且多针对猪细菌性腹泻，如大肠杆菌的K88、K99、987P标准菌株和地方分离菌株制成多价菌体IgY、大肠杆菌的0157:H7、志贺菌、沙门氏菌等为免疫原制成的IgY等，病毒方面的研究有抗猪瘟病毒、轮状病毒、圆环病毒等的卵黄抗体，关于猪腹泻病毒的卵黄抗体鲜有报道，所以缺乏卵黄抗体为猪病 毒性腹泻提供防制手段的理论研究。再有鸡卵黄免疫球蛋白作为抗体家族的重要成员，是一种高产、优质的多克隆抗体，具有来源丰富、易于获得、使用方便、成本低廉等特点。综上所述，研究抗猪病毒性腹泻卵黄抗体提取纯化工艺，寻找一种简便、高效、经济的方法，有很大应用价值。
[0004]制备抗猪病毒性腹泻卵黄抗体首先是要选取试验动物，准备免疫原，按照一定的程序免疫蛋鸡，刺激机体产生抗该病毒的抗体并转移到卵黄中，并进行提取纯化，以获得高纯度的卵黄抗体。
[0005]一般来说，用于生产卵黄抗体的鸡最好选用近交系的蛋鸡。根据生产IgY的不同目的选择合适的鸡群，如用于治疗目的的IgY的生产应选用SPF鸡，而用于预防目的的IgY的生产可以选用商用蛋鸡。使用SPF鸡的优点是可产生高滴度抗体，而使用商品蛋鸡既价格低廉，又可在产蛋前用来制备抗体而不影响产蛋，因此可以减少制备卵黄抗体的成本。抗原注射途径可选用皮下、皮内、肌肉、静脉、腹股沟、法氏囊注射或通过口服等，也可将多种免疫方法综合使用。通常使用油乳类佐剂如弗氏不完全佐剂可以产生明显的抗体反应。在抗原剂量选择上，应将不同浓度的抗原和佐剂结合后进行测试。通常免疫的鸡至少7周龄，最好分两个部位注射，剂量为0.15-lml。至少要免疫两次。IgY分离主要是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白，以获得水溶性组分(WSF)。卵黄中的主要成分是蛋白质和脂肪，其比例约为1:2。大部分蛋白质是脂蛋白，存在于卵黄颗粒中，不溶于水，只有卵黄球蛋白是水溶性的，IgY是一种Y-卵黄球蛋白。因此如何去除高浓度的脂类是IgY提纯的关键。
[0006]目前已建立许多提纯IgY的方法，综合分为以下几类:(1)沉淀法:沉淀法又分为有机物沉淀法和有机试剂沉淀法，有氨基酸盐或硫酸钠法、聚乙烯醇(PEG)法、辛酸法、聚乙二醇法、氯仿法、苯酚、丙酮法等。这些方法能初步纯化蛋白质，产量约为ImL黄提取
5.0~7.5mg,纯度(2)色谱层析法:有亲和层析法、离子交换色谱法、疏水作用色谱法和凝胶过滤柱层析法等。色谱层析法因其设备昂贵，操作过程繁琐，处理样少，只是作为实验室纯化法。
[0007]盐析破坏蛋白质的水化层，使疏水基团暴露，蛋白质的可溶性随着盐浓度的增加呈对数下降，蛋白质很容易沉淀析出。采用盐析技术提取和浓缩IgY是一个简单温和的方法。虽然分离率不高，但适用于大量生产，而且价值便宜，特别适用于纯化流程的前期的最终的浓缩。在低离子强度的酸性条件下，辛酸可与绝大多数的卵黄蛋白反应，形成不可逆的沉淀，唯有IgY类抗体蛋白不发生反应，仍留在上清中，离心除去沉淀，将上清液经过超滤设备浓缩分离后，可以提高后续硫酸铵法分离率低的弊端，将上清的PH调整到7.0左右，用硫酸铵使IgY析出，可得到纯度90%以上的IgY，该法经济、简便、快速，不损害抗体活性。
[0008]现有在使用的技术有氯仿法:蛋黄抗体为存在于蛋黄中的水溶性蛋白质，其总量仅为蛋黄固形物的10%，其余大部分是颗粒状的蛋黄高磷蛋白、脂蛋白、可溶性的低密度脂蛋白和少量色素，这些物质存在于蛋黄液中，使之甚为粘稠。氯仿法可以分离出水溶性成分和变性的脂类，通过离心或过滤去除变性脂类后，就可得到单纯的水溶性成分，即提纯的蛋黄抗体液。将高免鸡蛋浸入0.2%强力消毒灵溶液中浸泡lOmin，取出让其自然干燥，在无菌室内分离蛋清与蛋黄，充分除去蛋清，收集蛋黄，再将蛋黄用搅拌机充分搅拌呈均匀膏状。量取1OOmL蛋黄液，200mL生理盐水和1OOmL氯仿，按生理盐水:氯仿(三氯甲烷):蛋黄液=2:1:1的比例混合后充分摇匀，静置约2-3h，让蛋黄液和氯仿充分反应，再用离心机3000r / min，离心30min，收集上清液，并量取其容量，上清液中既包含目的抗体。氯仿可以破坏与蛋白结和的磷脂，从而将二者分离，分离后的卵黄蛋白就溶于水中。该法提取抗体的量比较低，造成一些抗体损耗；还会氯仿有机溶剂会损伤抗体活性，造成抗体效价的降低；大量提取抗体，使用的氯仿的量就更多，氯仿有毒对操作者和环境都带来严重污染，只是适合少量生产。
[0009]卵黄抗体是具有很大潜力的，其生产技术应适合大规模的生产，氯仿法不符合条件。另外常用的方法有聚乙二醇沉淀法，聚乙二醇溶于水中不会发热、升温，不会引起蛋白质变性，沉淀蛋白质的时间较短且不影响离心处理，并有促进蛋白质结晶的作用。将收集的高免蛋浸泡消毒，无菌分离蛋黄，经无菌搅碎机搅拌5min,按1:1加入无菌生理盐水,用双层无菌纱布过滤，加入青霉素、链霉素各1000单位、叠氮钠至0.01 %浓度，置4°C冰箱备用。在高免卵黄液中加入4倍体积的PBS缓冲液，充分摇匀，再加入PEG6000，使其最终浓度达4%，搅拌1Omin后，4000r / min离心30min。无菌收集上清液再加入PEG6000，使其最终浓度为12%，搅拌lOmin，同上离心，弃上清液，所得产品即提取的IgY。该方法中，聚乙二醇易溶于水，在得到的目的上清液中目前尚没有办法去除，对畜禽的危害迄今也尚无确切定论。
【发明内容】
[0010]本发明的目的在于提供一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，采用水稀释辛酸法，结合超滤法和硫酸铵沉淀法获取高纯度和高效价的卵黄抗体。
[0011]为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
[0012]一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，具体包括以下步骤:
[0013](I)制备免疫原准备:免疫原是提取的蛋白、细胞上清液、疫苗等，需要含有特点抗原，刺激机体产生特定抗体，本发明中采用的是猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白，能刺激机体产生相应抗体并转移到卵黄中。
[0014](2)免疫程序:初次免疫剂量Im L，胸部皮下多点注射；分别间隔两周进行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫剂量分别为lml、1.5ml、lml，4免后28天加强免疫，注射剂量为lml。
[0015](3)测定抗体效价--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和采集血清，并利用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒检测高免卵黄抗体和血清效价，待血清抗体效价达到2000，卵黄抗体浓度达到约4.5mg / ml时收集高免蛋。
[0016](4)纯化卵黄抗体:将鸡蛋浸入0.1 %新洁尔灭水溶液中消毒15min,自然晾干,无菌条件下分离并收集卵黄；向其中加9倍体积4°C双蒸水，缓慢加入I %辛酸，充分搅拌均匀，盐酸调整pH值至5.3，4°C静置IOh后低温12000r / min离心25min，收集上清液，即为水溶性组分(WSF) ；WSF进行0.22 μ m滤膜微滤，除去细菌和杂质颗粒，然后进行超滤；超滤时调节WSF的温度为25°C，pH6.5，操作压力为0.05MPa，`留分子量为50KD膜包，浓缩倍数根据需要进行选择；对获得的浓缩液用氨水调PH至7.0,缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50%;4°C静置2h离心25min，取沉淀；再加入适量pH为7.4PBS溶解，加入饱和硫酸铵使其最终浓度为33%，静置2h，同上步离心，取沉淀并用适量PBS溶解，即为提取的卵黄抗体；
[0017](5)鉴定卵黄抗体:卵黄抗体的浓度采用紫外可见分光光度计和考马斯亮蓝法进行测定；卵黄抗体的纯度采用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PEGE)进行确定；卵黄抗体效价和特异性用猪病毒性腹?写抗体检测试剂盒和western bolting进行确定；卵黄抗体的无菌检测采用细菌培养法；并对卵黄抗体进行安全性检查、人工感染治疗效果鉴定。
[0018]本发明中，卵黄抗体本身是水溶性的，不会对环境和人体造成危害，无毒无害、成本低；单纯加水溶解卵黄，不能分离与磷脂等结合的抗体，而辛酸的加入可以弥补这一缺点，充分暴露出卵黄抗体，以获得高含量的水溶性组分。超滤可以进行蛋白质的浓缩分离，除盐去醇。卵黄采用9倍蒸馏水进行稀释后，体积较多，后续操作繁琐，引入超滤技术，对获得的WSF进行超滤，不仅可以浓缩WSF，还可以依据超滤膜的截留分子量将非目的蛋白给排除掉，分离出目标抗体，并为下一步的再纯化打下基础。超滤法成本低，易放大，简化操作过程，并可以提高提纯效率。超滤后的目的溶液已经经过了纯化一次，为了得到更高纯度的卵黄抗体，进行下一步的沉淀法。硫酸铵沉淀法是一种经典的蛋白分离纯化方法，该法依据目标蛋白的化学性质，在低离子强度、酸性条件下，辛酸可与绝大多数的卵黄蛋白反应，形成不可逆的沉淀，唯有IgY类抗体蛋白不发生反应，仍留在上清中，离心除去沉淀，将上清的pH调整到7.0左右，用硫酸铵使IgY析出，可得到纯度90%以上的IgY，该法经济、简便、快速，不损害抗体活性，回收率高。
[0019]该发明的有益效果在于:本发明采取水稀释法，该法安全可靠没有污染，成本低，辛酸的加入可以增加卵黄抗体的溶解量，提高抗体提取效率。辛酸也可以在获得WSF时的离心和之后的超滤过程、硫酸铵沉淀中除去不存在残留问题。超滤技术现已逐渐替代空间排阻色谱，成为蛋白质脱盐、脱醇和浓缩富集的首选方法，超滤分离技术因具有低成本、易放大、处理量大的特点，适合规模化生产。硫酸铵沉淀法所用试剂少，成本低，安全，沉淀后产物浓度高，有利于商品化卵黄抗体进行的处理。经过以上处理的高免蛋可以获得活性高、纯度高，产量高，性质稳定的卵黄抗体，操作方法简单易行可靠，有利于工业化生产。综上所述，该法不仅不需要有毒试剂，安全可靠，成本低，操作简单易行，处理量大，适合大规模生产，并且获得的卵黄抗体损伤量小，活性高，纯度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1是本发明实施例中纯化卵黄抗体的简易流程图。
[0021]图2是本发明实施例中提取的IgY的SDS-PAGE结果图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图和实施例对本发明的【具体实施方式】进行描述，以便更好的理解本发明。
[0023]实施例
[0024]一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，具体包括以下步骤:
[0025](I)制备免疫原准备:免疫原是提取的蛋白、细胞上清液、疫苗等，需要含有特点抗原，刺激机体产生特定抗体，本发明中采用的是猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白，能刺激机体产生相应抗体并转移到卵黄中。
[0026](2)免疫程序:初次免疫剂量Im L，胸部皮下多点注射；分别间隔两周进行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫剂量分别为lml、1.5ml、lml，4免后28天加强免疫，注射剂量为lml。对照组注射灭菌生理盐水。
[0027](3)抗体效价测定--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和采集血清，并利用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒检测高免卵黄抗体和血清效价，待血清抗体效价达到2000，卵黄抗体浓度达到约4.5mg / ml时收集高免蛋。
[0028](4)纯化卵黄抗体:具体流程如图1所示，将鸡蛋浸入0.1 %新洁尔灭水溶液中消毒15min，自然晾干，无菌条件下分离并收集卵黄。向其中加9倍体积4°C双蒸水，一定要缓慢加入1%辛酸，充分搅拌均匀，盐酸调整pH值至5.3，4°C静置IOh后低温12000r / min离心25min，收集上清液，即为水溶性组分(WSF)。WSF进行0.22 μ m滤膜微滤，除去细菌和杂质颗粒，然后进行超滤。超滤时调节WSF的温度为25°C，pH6.5，操作压力为0.05MPa,(根据使用的超滤设备的不同，操作压力是不一样的)截留分子量为50KD膜包，浓缩倍数根据需要进行选择。本发明中，超滤时间和超滤效果的关系，确定WSF浓缩8倍。对获得的浓缩液用氨水调PH至7.0,缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50%。4°C静置2h离心25min，取沉淀。再加入适量pH为7.4PBS溶解，加入饱和硫酸铵使其最终浓度为33%，静置2h，同上步离心，取沉淀并用适量PBS溶解，即为提取的卵黄抗体。
[0029](5)鉴定卵黄抗体:
[0030]卵黄抗体的浓度采用紫外可见分光光度计和考马斯亮蓝法进行测定，结果IgY最高浓度可达到9.5mg / ml。
[0031]卵黄抗体的纯度采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PEGE)进行确定，本发明实施例中提取的IgY的SDS-PAGE结果见图2，IgY纯度达到95%。
[0032]卵黄抗体效价和特异性用猪病毒性腹湾抗体检测试剂盒和western bolting进行确定，结果IgY效价较高，测定的OD45tl,可达到2.900,高效价IgY可保持5周以上,westernbolting结果显示有目的条带。
[0033]卵黄抗体的无菌检测采用细菌培养法，取卵黄抗体溶液分别接种于普通营养琼脂和厌氧肉汤培养基上，于37°C培养24h，结果无细菌生长。
[0034]卵黄抗体的安全性检查，取健康小鼠10只，随机分为2组，一组为试验组，灌服纯化的卵黄抗体Iml另一组为对照组，灌服生理盐水1ml，连续观察7d，观察小鼠状况。结果试验组和对照组 小鼠7d内均未呈现异常症状，无死亡，说明所制备的卵黄抗体安全性较好。
[0035]卵黄抗体人工感染治疗效果鉴定，将24头刚出生未吃初乳的仔猪随机分成3组，每组8头，第I组为卵黄抗体治疗组;第2组为抗生素治疗对照组；第3组为空白对照组。各组仔猪以传染性胃肠炎病毒和流行性腹泻病毒混合液口服攻毒，每次2ml，一天2次。进行人工攻毒，结果攻毒24后，所有仔猪均出现腹泻症状，卵黄抗体治疗组口服卵黄抗体后腹泻症状逐渐减轻，大部分仔猪在4~5d后不再腹泻，个别仔猪在7d后恢复正常；抗生素治疗组出现腹泻和死亡，死亡主要出现在攻毒后2~3d，痊愈I头，死亡7头死亡，死亡率87.5% ;未采取治疗措施的空白对照组则全部死亡。
[0036]以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，其特征在于:具体包括以下步骤: (1)制备免疫原准备:采用猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白； (2)免疫程序:初次免疫剂量ImL，胸部皮下多点注射；分别间隔两周进行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫剂量分别为1ml、1.5ml、lml，4免后28天加强免疫，注射剂量为Iml ； (3)测定抗体效价--第1次免疫I周后每周收集高免蛋和采集血清，并利用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒检测高免卵黄抗体和血清效价，待血清抗体效价达到2000，卵黄抗体浓度达到4.5mg / ml时收集高免蛋； (4)纯化卵黄抗体:将鸡蛋浸入0.1 %新洁尔灭水溶液中消毒15min，自然晾干,无菌条件下分离并收集卵黄；向其中加9倍体积4°C双蒸水，缓慢加入I %辛酸，充分搅拌均匀，盐酸调整pH值至5.3，4°C静置IOh后低温12000r / min离心25min，收集上清液，即为水溶性组分(WSF) ;WSF进行0.22 μ m滤膜微滤，除去细菌和杂质颗粒，然后进行超滤；超滤时调节WSF的温度为25°C，pH6.5，操作压力为0.05MPa，截留分子量为50KD膜包，浓缩倍数根据需要进行选择；对获得的浓缩液用氨水调PH至7.0，缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50% ;4°C静置2h离心25min，取沉淀；再加入适量pH为7.4PBS溶解，加入饱和硫酸铵使其最终浓度为33%，静置2h，同上步离心，取沉淀并用适量PBS溶解，即为提取的卵黄抗体； (5)鉴定卵黄抗体:卵黄抗体的浓度采用紫外可见分光光度计和考马斯亮蓝法进行测定；卵黄抗体的纯度采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PEGE)进行确定；卵黄抗体效价和特异性用猪病毒性腹?写抗体检测试剂盒和western bolting进行确定；卵黄抗体的无菌检测采用细菌培 养法；并对卵黄抗体进行安全性检查、人工感染治疗效果鉴定。
【文档编号】A61P31/14GK103694348SQ201310660244
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月10日 优先权日:2013年12月10日
【发明者】刘聚祥, 曹立辉, 高岭 申请人:刘聚祥