一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统以及其制备方法，该基因递送系统包括磷酸钙及PEG接枝羧甲基壳聚糖，磷酸钙包裹基因形成内核，PEG接枝羧甲基壳聚糖包覆于内核表面，PEG链段形成亲水性外壳，从而形成具有PEG化核壳结构的纳米粒子，该纳米粒子的粒径为60～100nm。本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，在制备过程中无需使用有机溶剂、表面催化剂，过程简单可控，经济成本低，重复性好，适合于大规模生产，毒性低，转染效率高。另外，本发明还涉及制备该基因递送系统的试剂盒，以及本发明基因递送系统的体内外基因转染与基因治疗的用途。
【专利说明】一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物制剂领域和生物医药【技术领域】，具体来说涉及一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统及其制备方法。
【背景技术】
[0002]随着基因工程、纳米技术、现代医药技术等学科的发展，从基因水平治疗疾病正在成为一种极具前途的治疗手段。基因治疗是通过将核酸(DNA，siRNA，miRNA)导人组织和细胞，调控涉及疾病发生、发展的关键蛋白的表达，从而达到疾病治疗的目的。但核酸分子由于其分子量大、带负电性、亲水的特征，不能有效进入细胞；另外，核酸分子极易被血浆蛋白中的核酸酶降解。所以核酸分子需要由载体包载才能实现给药治疗的目的。
[0003]将核酸导入细胞进行表达是实现基因治疗的关键步骤，成功的基因治疗依赖于有效的基因载体。常见的载体分为病毒类载体和非病毒载体，其中，病毒类载体包括逆转录病毒、腺病毒(AV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)、痘苗病毒(VV)等，但是病毒类载体容易引起人体的免疫性反应，在临床应用中存在着较大的安全隐患。非病毒载体主要是由阳离子聚合物或脂质与核酸通过静电吸附制备得到得到的阳离子载体，与病毒载体相t匕，非病毒载体具有安全、有效、无免疫原性等优点。阳离子载体能有效包裹核酸，促进核酸进入细胞。但阳离子非病毒载体通常有由于阳离子特性带来的细胞毒性，且易于在血浆中沉淀，从而抑制其体内的给药治疗。
[0004]磷酸钙沉淀法广泛用于细胞转染，磷酸钙有良好的生物相容性、生物降解性，并且能够有效的包载核酸分子。另外，磷酸钙具有酸敏感性，在溶酶体酸性环境下，磷酸钙解离得到钙离子、磷酸根离子，增加溶酶体渗透压，促进溶酶体膜破裂，促使核酸分子实现溶酶体逃逸。但磷酸钙的胶体稳定性差，制备后快速沉淀，缺乏制备的重复性；沉淀的磷酸钙粒子且会引起细胞毒性。胶体稳定性差阻止了磷酸钙的体内应用。
[0005]制备稳定的磷酸钙纳米粒子成为实现核酸体内安全、有效递送的有效途径。LeafHuang等制备了脂质体包裹的磷酸钙杂化纳米粒，实现了静脉注射后核酸的系统递送，他们采用的是反向微乳法制备了稳定的脂质包覆磷酸钙纳米粒(Li J, Chen YC, TsengYC,Mozumdar S，Huang L.Biodegradable calcium phosphate nanoparticle,withlipid coating for systemic siRNA delivery.Journal of control ledrelease.2010; 142:416-21.)。中国专利申请(200910264114.6)授权了 “一种载有基因的磷酸钙复合纳米粒及其制法与用途”，也采用了微乳法制备磷酸钙纳米粒。但这种制备方法相对复杂且用到了有潜在毒性的有机溶剂和表面活性剂，不利于扩大生产。
[0006]于是，我们尝试开发一种新型的杂化纳米磷酸钙基因载体，该载体具有制备简单、经济成本低、使用方便、转染效率高、生物相容性好、可用于体内注射给药等综合优势，这对基因治疗的发展有重大意义。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于开发一种新型的基因递送系统，提高基因的体内外转染效率，促进基因治疗的发展。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，包括磷酸钙及PEG接枝羧甲基壳聚糖，其特征在于，磷酸钙包裹基因形成内核，PEG接枝羧甲基壳聚糖包覆于内核表面，PEG链段形成亲水性外壳，从而形成具有PEG化核壳结构的纳米粒子，其中所述PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60%，并且该纳米粒子的粒径为60~lOOnm。
[0010]优选地，所述PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40%。
[0011]本发明更提供一种制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，包括以下步骤:
[0012]I)制备试剂a，包含钙盐、缓冲剂，余量为水； [0013]2)制备试剂b，包含PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠、缓冲剂，余量为水；
[0014]3)将基因与试剂a混合，再与试剂b等体积混合均匀，
[0015]其特征在于，
[0016]在所述试剂a中，钙盐为CaCl2Xa(NO3)2中的一种或两种任意比例的组合，缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一种或两种以上的任意比例组合；
[0017]在所述b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60% ;磷酸盐包括 Na3P04、Na2HPO4, NaH2PO4, K3PO4, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)3P04、(MM)2HPO4 的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一种或两种以上的任意比例组合。
[0018]优选地，试剂a中的钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2,缓冲剂为Ifepes或Tris ;试剂b中的PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40% ;磷酸盐为Na2HPO4或NaH2PO4 ；缓冲剂为ifepes或Tris。
[0019]优选地，基因与试剂a混合时的基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为10~200 μ g/mL。
[0020]更优选地，基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为40~120 μ g/mL。
[0021]作为优选方案，所述a试剂中的钙盐浓度为20~1000mM,缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0 ;所述b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为50~2000mg/L，磷酸盐浓度为0.5~10mM，NaCl浓度为50~500mM，缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~
10.0。
[0022]进一步优选地，所述a试剂中的钙盐浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~8.0 ;所述b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为200~800mg/L，磷酸盐浓度为1.5~3.0mM, NaCl浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~
8.0。
[0023]另一方面，本发明提供上述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统用于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物输送的用途，其中所述基因是DNA、siRNA、miRNA或shRNA中的任一或多种。
[0024]本发明还提供一种试剂盒，用于制备上述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，所述试剂盒包含钙盐或其包含缓冲剂的水溶液；以及PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠或者其包含缓冲剂的混合水溶液，其特征在于，钙盐或其包含缓冲剂的水溶液与PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠或者其包含缓冲剂的混合水溶液是分开独立包装的，其中钙盐为CaCl2、Ca(NO3)2中的一种或两种任意比例的组合；PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG 接枝率为 8% ~60% ;磷酸盐为 Na3P04、Na2HPO4、NaH2P04、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)3P04、(MM)2HPO4中的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一种或两种以上的任意比例组合。
[0025]与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在:
[0026]生产过程不使用有机溶剂、表面催化剂，过程简单可控，经济成本低，重复性好，适合于大规模生产；载体稳定性好，安全性好，体内外毒性极低；转染效率高，能有效实现体内外的基因递送，实现基因治疗。该载体具有制备简单、经济成本低、使用方便可靠、转染效率高、生物相容性好、可用于体内注射给药的优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1:本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的透射电镜照片。 [0028]图2:本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的细胞转染效果。
[0029]图3:本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的细胞毒性(MTT法)结果。
[0030]图4:本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的体内基因治疗给药的治疗效
果O
[0031]图5:本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的免疫毒性。
【具体实施方式】
[0032]羧甲基壳聚糖是一种水溶性阴离子壳聚糖衍生物，具有良好的生物相容性和生物降解性，能够通过静电作用有效吸附于正电性磷酸钙粒子表面，达到稳定磷酸钙粒子的目的。另外，PEG化也能够通过屏蔽作用稳定纳米载体，延长循环时间，达到长循环效果增加疗效。因此，PEG接枝羧甲基壳聚糖拥有稳定磷酸钙并得到杂化纳米粒的潜力，从而实现核酸的安全、有效的体内递送，实现疾病的基因治疗。另外，通过PEG接枝羧甲基壳聚糖与磷酸钙的纳米沉淀作用，自组装形成纳米粒子，更简化了制备生产过程。
[0033]本发明提供了一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，克服了现有技术的缺点，提高了基因的体内外转染效率，促进基因治疗的发展。该载体具有制备简单、经济成本低、使用方便可靠、转染效率高、生物相容性好、可用于体内注射给药的优点。
[0034]一方面，本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统包括磷酸钙、PEG接枝羧甲基壳聚糖两种组分；核壳结构，磷酸钙形成内核，PEG接枝羧甲基壳聚糖包覆于内核表面，PEG链段形成亲水性外壳；粒径为60~lOOnm。
[0035]所述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统能包载的基因分子包括DNA、siRNA、miRNA、shRNA,基因分子被包载于磷酸钙内核中。
[0036]另一方面，制备本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法包括如下步骤:
[0037]I)制备试剂a，包含钙盐、缓冲剂的水溶液；
[0038]2)制备试剂b，包含PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠、缓冲剂的水溶液。
[0039]3)基因先与试剂a混合，再与试剂b等体积混合均匀。
[0040]在所述a试剂中，钙盐为包括CaCl2、Ca (NO3) 2的一种或两种任意比例的组合，缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一种或两种以上的任意比例组合。
[0041]在所述b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60% ;磷酸盐，包括 Na3P04、Na2HP04、NaH2PO4、K3PO4> K2HPO4、KH2PO4、(NH4) 3P04、(NH4) 2ΗΡ04 的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一种或两种以上的任意比例组合。
[0042]作为优选方案，钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2，缓冲剂为Ifepes或Tr is。
[0043]作为优选方案，PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40% ;磷酸盐为 Na2HPO4 或 NaH2PO4 ;缓冲剂为 Ifepes 或 Tris。
[0044]进一步，在所述a试剂中，钙盐浓度为20~1000mM,缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0 ;在所述b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为50~2000mg/L，磷酸盐浓度为0.5~10mM，NaCl浓度为50~500mM，缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0。
[0045]进一步，作为优选方案，在所述a试剂中，钙盐浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~8.0 ;在所述b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为200~800mg/L，磷酸盐浓度为1.5~3.0mM, NaCl浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为
7.0 ~8.0。
[0046]在所述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备方法步骤(3)中，基因先与试剂a混合时基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为10~200 μ g/mL ;作为优选方案，基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为40~120 μ g/mL。
[0047]另一方面，提供所述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的用途，在于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物输送；其中所述基因为DNA、siRNA、miRNA、shRNA中的任一或多种。
[0048]另一方面，本发明提供一种用于所述新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统制备的试剂盒，该试剂盒含有独立包装的a、b两种试剂:试剂a，包含钙盐、缓冲剂的水溶液；试剂b，包含PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠、缓冲剂的水溶液。
[0049]所述试剂盒的a试剂中，钙盐为包括CaCl2、Ca(NO3)2的一种或两种任意比例的组合，缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、T ris的一种或两种以上的任意比例组合。
[0050]所述试剂盒的b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60% ;磷酸盐，包括 Na3P04、Na2HP04、NaH2P04、K3P04、K2HP04、KH2P04、(NH4)3P04、(MM)2HPO4 的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、M0PS、PBS、PIPES、Tris的一种或两种以上的任意比例组合。
[0051]作为所述试剂盒的优选方案，钙盐为CaCl2或Ca(NO3)2，缓冲剂为Ifepes或Tris。
[0052]更优选地，所述试剂盒中的PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40% ;磷酸盐为Na2HPO4或NaH2PO4 ;缓冲剂为Ifepes或Tris。
[0053]在所述试剂盒的试剂可以是浓缩物，待配制后使用，也可以即开即用。在一种实施方案中，a试剂中的钙盐浓度为20~1000mM,缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0 ;b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为50~2000mg/L，磷酸盐浓度为0.5~10mM，NaCl浓度为50~500mM，缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0。
[0054]作为该实施方案的优选方案，a试剂中的钙盐浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~8.0 ;b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为200~800mg/L，磷酸盐浓度为1.5~3.0mM, NaCl浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~
8.0。
[0055]本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统与现有技术相比，生产过程不使用有机溶剂、表面催化剂，过程简单可控，经济成本低，重复性好，适合于大规模生产；载体稳定性好,安全性好,体内外毒性极低；并且转染效率高,能有效的体内外的基因传递,实现基因治疗。
[0056]以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
[0057]实施例1:一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0058]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0059]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为200mg/L、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0060]3)取40 μ g基因DNA分子与ImL试剂混合，再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
[0061]实施例2:—种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0062]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0063]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为200mg/L、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0064]3)取120 μ g基因DNA分子与ImL试剂混合，再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
[0065]实施例3:—种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0066]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0067]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为200mg/L、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0068]3)取80 μ g基因DNA分子与ImL试剂混合，再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
[0069]实施例4:一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0070]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0071]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为800mg/L、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0072]3)取80 μ g基因DNA分子与ImL试剂混合，再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
[0073]实施例5:—种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0074]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0075]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为400mg/L、Na2HPO4浓度为1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0076]3)取80 μ g基因siRNA分子与ImL试剂混合,再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基因转染载体。
[0077]实施例6:—种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的制备。
[0078]I)制备试剂a，含有CaCl2为250mM、Tris为20mM的水溶液，盐酸调节pH为7.4 ;
[0079]2)制备试剂b，含有PEG接枝羧甲基壳聚糖的浓度为800mg/L、Na2HPO4浓度为
1.5mM、NaCl浓度为280mM、Hepes浓度为50mM的水溶液，NaOH调节pH为7.4 ;
[0080]3)取80 μ g基因miRNA分子与ImL试剂混合,再与试剂b快速混合均匀，即制备得到杂化纳米磷酸钙的基 因转染载体。
[0081]如附图1所示，本发明的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统为均匀分布的球形，粒径为60~lOOnm。
[0082]实施例7:—种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的细胞转染。
[0083]取生长对数期H印G2细胞铺板于24孔板，生长24h后，细胞汇合度为50~60%。载有靶向hTERT基因的siRNA的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统细胞给药，每孔siRNA浓度为0.5 μ g。转染48h后，提取RNA，RT-PCR测量hTERT基因的表达。Lipofectamine2000以相同siRNA浓度转染细胞，作为对照。
[0084]如附图2所示，载有靶向hTERT基因siRNA的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的基因转染效率与市售制剂Lipofectamine2000相当。
[0085]实施例8 =MTT法测量本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的细胞毒性。
[0086]生长对数期!fepG2细胞铺板于96孔板，生长24h后，细胞汇合度为70~80%。吸去培养液，载有荧光素酶质粒PGL3的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统按浓度梯度给药。48h后，加入MTT溶液(5mg/mL in pH7.4PBS) 10 μ L，37°C，继续孵育4h。弃去上清液，加入150yL DMSO溶解蓝紫色的甲瓒结晶，用酶联免疫测定仪于570nm测定吸光度。计算细胞生存率。
[0087]实验结果如附图3所示，在基因浓度0.5~50 μ g/mL，细胞生存率都在100%，表明本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的低毒性。
[0088]实施例9:本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的的体内基因治疗效果。
[0089]以5X106!fepG2细胞接种于裸鼠腋下，获得肿瘤裸鼠模型。当肿瘤体积达到IOOmm3时，裸鼠随机分成3组，每组5只，各组分别尾静脉给药:载治疗基因的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，载非治疗基因的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，PBS0测量肿瘤体积随时间的变化。结果如附图4。
[0090]实验结果表明，静脉注射载有治疗基因的本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，能有效抑制肿瘤的生长，从而达到系统治疗肿瘤的目的。[0091]实施例10:本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的免疫毒性考察。
[0092]健康裸鼠随机分成两组，每组5只，分别给药本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统和PBS。给药4h后，裸鼠尾部取血，酶联免疫法测量血浆中的IFN — Y、IL-2和IL-6等免疫因子的浓度。
[0093]免疫毒性结果如附图5所示，与对照组相比，静脉注射本发明新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统没有引起免疫因子的增加，说明该载体的低免疫毒性。
[0094]上面结合具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属【技术领域】普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。
【权利要求】
1.一种新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，包括磷酸钙及PEG接枝羧甲基壳聚糖，其特征在于，磷酸钙包裹基因形成内核，PEG接枝羧甲基壳聚糖包覆于内核表面，PEG链段形成亲水性外壳，从而形成具有PEG化核壳结构的纳米粒子,其中所述PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60%，并且该纳米粒子的粒径为60~lOOnm。
2.如权利要求1所述的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，其特征在于，所述PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40%。
3.一种制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，包括以下步骤: .1)制备试剂a，包含钙盐、缓冲剂，余量为水； .2)制备试剂b，包含PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠、缓冲剂，余量为水； .3)将基因与试剂a混合，再与试剂b等体积混合均匀， 其特征在于， 在所述试剂a中，钙盐为CaCl2、Ca(NO3)2中的一种或两种任意比例的组合，缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris的一种或两种以上的任意比例组合； 在所述b试剂中，PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为I~100万，脱乙酰度大于.80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG接枝率为8%~60% ;磷酸盐包括 Na3PO4' Na2HPO4' NaH2PO4' K3PO4' K2HPO4' KH2PO4' (MM)3PO4、(MM)2HPO4 的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一种或两种以上的任意比例组合。
4.如权利要求3所述的制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，其特征在于，试剂a中的钙盐为CaCl2或Ca (NO3)2,缓冲剂为Ifepes或Tris ;试剂b中的PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为10~40万，脱乙酰度大于80%，羧甲基取代度为40~70%，PEG分子量为2000~6000，PEG接枝率为20%~40% ;磷酸盐为Na2HPO4或NaH2PO4 ;缓冲剂为Ifepes或 Tris0
5.如权利要求3所述的制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，其特征在于，基因与试剂a混合时的基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为10~200 μ g/mL。
6.如权利要求5所述的制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，其特征在于，基因质量(μ g)与试剂a体积(mL)的比例为40~120 μ g/mL。
7.如权利要求3至6中任一项所述的制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，其特征在于，所述a试剂中的钙盐浓度为20~1000mM,缓冲剂浓度为5~200mM，pH为.6.0~10.0 ;所述b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为50~2000mg/L，磷酸盐浓度为0.5~10mM，NaCl浓度为50~500mM，缓冲剂浓度为5~200mM，pH为6.0~10.0。
8.如权利要求7所述的制备新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统的方法，其特征在于，所述a试剂中的钙盐浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~8.0 ;所述b试剂中的PEG接枝羧甲基壳聚糖浓度为200~800mg/L，磷酸盐浓度为1.5~3.0mM,NaCl浓度为100~300mM，缓冲剂浓度为20~60mM，pH为7.0~8.0。
9.如权利要求1或2所述的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统用于体内外细胞的基因转染以及人或动物体内基因药物输送的用途，其中所述基因是DNA、siRNA, miRNA或shRNA中的任一或多种。
10.一种试剂盒，用于制备如权利要求1或2所述的新型杂化纳米磷酸钙基因递送系统，所述试剂盒包含钙盐或其包含缓冲剂的水溶液；以及PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠或者其包含缓冲剂的混合水溶液，其特征在于，钙盐或其包含缓冲剂的水溶液与PEG接枝羧甲基壳聚糖、磷酸盐、氯化钠或者其包含缓冲剂的混合水溶液是分开独立包装的，其中钙盐为CaCl2、ea(N(B)2中的一种或两种任意比例的组合；PEG接枝羧甲基壳聚糖的粘均分子量为1~100万，脱 乙酰度大于80%，羧甲基取代度为20~90%，PEG分子量为500~10000，PEG 接枝率为 8% ~60% ;磷酸盐为 Na3P04、Na2HPO4、NaH2P04、K3PO4、K2HPO4、KH2PO4、(NH4)3P04、(MM)2HPO4中的一种或两种以上的任意比例组合；缓冲剂为H印es、MOPS、PBS、PIPES、Tris中的一种或两种以上的任意比例组合。
【文档编号】A61K48/00GK103789348SQ201410055627
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年2月19日 优先权日:2014年2月19日
【发明者】孙敏捷, 谢颖, 张灿, 平其能, 张斐然 申请人:中国药科大学