专利名称：一种载有基因的磷酸钙复合纳米粒及其制法与用途的制作方法
技术领域：
本发明属一非病毒基因传递系统的制备方法与应用，涉及载基因的磷酸钙复合纳米粒的制备、分离及其在骨髓间质干细胞中的传递。
背景技术：
基因治疗是以基因转移为基础，将外源基因导入体内达到治疗目的的一种治 疗方法。目前基因治疗的首要问题是如何选择合适的基因传递系统(gene delivery system，⑶S)。一般，⑶S可以分为病毒和非病毒两大类。病毒型⑶S所用的病毒主要 有慢病毒(参见Hyun-Joo Lee, Yong-Soo Lee, Hye-Sun Kim, et al Retronectin enhanceslentivirus-mediated gene delivery into hematopoietic progenitor cells [J]· Biologicals，2009，203-209)、腺病毒(参见=Wei-Wen Hu, Michael W. Lang, Paul H.Krebsbach. Digoxigeninmodification of adenovirus to spatially control gene delivery from chitosan surfaces[J]. Journal of Controlled Release,2009,135(3) 250-258)等。虽然病毒型GDS转染效率高，但由于该系统存在的自身局限性，如能诱导 宿主免疫反应、具有潜在的致瘤性、装载容量有限、代价高等，特别是1999年基因治疗临床 试验中，出现首例运用腺病毒载体致人死亡的严重后果(参见Roy I, Ohulchanskyy TY, Bharali DJ, et al. Optical tracking oforganically modified silica nanoparticles as DNA carriers -.a nonviral, nanomedicine approachfor gene delivery. Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102 (2) :279_284)，其安全问题迫使人们对病毒型的⑶S的选择持更为 谨慎的态度，目前，在严格控制病毒型GDS临床应用的同时，人们把注意力和希望逐步转向 非病毒⑶S的研究和应用。非病毒载体目前常用的如脂质体及多聚阳离子聚合物，多聚阳离子聚合物有多 聚氨基酸，壳聚糖(参见Ximing Xu, Capito RM, Spector Μ. Plasmid size influences chitosannanoparticle mediated gene transfer to chondrocytes[J]. J Biomed Mater Res A. 2008,84(4) 1038-48),阳离子明胶[5](参见Ximing Xu, Capito RM, Spector Μ. Delivery ofplasmid IGF-I to chondrocytes via cationized gelatin nanoparticles [J], J Biomed Mater Res A. 2008,84(1) :73_83)等。但脂质体和多聚阳离 子聚合物在体内外的不稳定性及高浓度时存在明显的细胞毒性作用限制了其进一步的应 用，开发具有安全高效的基因载体具有非常重要的意义。磷酸钙是机体的天然成分，具有良好的组织相容性和吸收性，易被细胞胞饮，无毒 副作用等特点，因此是一种优良的基因载体。磷酸钙基因载体通常采用共沉淀法制备，这种 方法使得DNA大部分包裹在磷酸钙内能够得到比较好的保护而不被降解。但采用上述共沉 淀法制备的纳米粒粒径一般大于IOOnm(参见Savita Bisht, Gajadhar Bhakta, Susmita Mitra, et al. pDNA loaded calcium phosphate nanoparticles :highly efficient non-viralvector for gene delivery[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2005，288 (6) : 157-168)，不利于转染效率的提高。中国专利申请(申请号200710034376. 4)公开了 “一种基因传输载体磷酸钙纳米的制备方法”，该发明公开的实际上是一种磷酸钙 纳米粒而非DNA-磷酸钙纳米粒的制备方法，其基因携带是制备好的纳米粒表面静电吸附 基因来实现的，形态为针形，转染效率往往有限。另外，目前磷酸钙纳米粒作为基因载体 所转染的细胞多为鼻咽癌CNE-2、人宫颈癌Hela(参见E. H. Chowdhury，Megumi Kunou, MasatoNagaoka, et al. High-efficiency gene delivery for expression in mammalian cells bynanoprecipitates of Ca-Mg phosphate [J] · Gene, 2004，341 :77_82)等肿瘤细 胞。如何制备粒径小(< lOOnm)，形态为球形，并能实现干细胞高效转染的磷酸钙-DNA纳 米粒一直是人们研究的热点方向。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种载基因的复合纳米粒，及其制法。本发明的技术方案如下—种载有基因的磷酸钙复合纳米粒，它是载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，该复合 纳米粒为球形，粒径小于50nm。上述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒，所述的质粒DNA为转化生长 因子 (TGF- β 1)质粒。一种上述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒的制备方法，它是将0. IM Igepal C0-520溶于25ml环己烷，加入1. 0472 μ g氯化钙，搅拌混勻形成微乳1 ；将0. IM Igepal C0-520, 50 μ ITis-HCL (ρΗ 7. 4)溶于25ml环己烷，加入3. 4785 μ g磷酸氢二钠，磷酸氢二钠 与质粒的质量比为0.1 1 10 1，搅拌形成微乳2，将微乳2缓慢滴加到微乳1中，搅 拌lOmin，形成载基因的磷酸钙复合纳米粒的乳液。一种上述载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离方法，它由如下步骤组成(1)层析柱的预处理取90g硅球加入含有0. 336mL氨基丙基三乙氧基硅烷 (aminopropyltriethoxysilane, APS)，1. 5mL ^jCZi SI, 7. 5μ L双胃 ^K 白勺 150mL ZiIIiiit^, 搅拌过夜，70°C烘干备用；(2)载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离将上述制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒乳液过硅胶层析柱，先用无水乙醇洗 脱环己烷及游离的质粒和盐，然后用浓度为5X 10_4mol/L的NaCl的70%乙醇溶液500ml洗 脱载基因的磷酸钙复合纳米粒；(3)载有基因的磷酸钙复合纳米粒乙醇液的浓缩将步骤2所得的含有载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乙醇液在37°C旋转减压蒸 发6h除去乙醇，浓缩液置于12KD的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液中，4°C透析过夜，即得到 载有基因的磷酸钙复合纳米粒。实验证明本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米粒转染效果与市售转染试剂相当 (P > 0. 05)，显著高于游离质粒组(P < 0. 01)，这说明本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米 粒作为一种非病毒载体可有效实现DNA的干细胞传递。因此，本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米粒可以在干细胞传递中应用。本发明的有益之处是本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米粒质粒包裹到磷酸钙纳米粒中，形成包裹质粒DNA的磷酸钙“复合纳米粒”并用于骨髓间质干细胞的传递。该载 有基因的磷酸钙复合纳米粒粒径小于50nm，形态为球形，具有转染效率高，毒性低的特点， 为开发高效安全的非病毒基因传递系统提供了新的思路。
图1为载有基因的磷酸钙复合纳米粒的透射电镜图。
图2为分离获取得的骨髓间质干细胞。图3为ELISA法测定游离质粒、载有基因的磷酸钙复合纳米粒及市售转染剂 lipfectamine 2000转染3天和6天细胞表达的TGF-β 1结果图，(* =P > 0. 05)。图4为不同浓度载有基因的磷酸钙复合纳米粒与市售转染试剂 lipfectamine 2000 细胞毒性的试验结果(MTT 法)(*P > 0. 05，< 0. 05，*#P < 0· 01)。
具体实施例方式本发明通过实施例作进一步的说明。实施例1 载有TGF- β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的制备0. IM Igepal C0-520溶于25ml环己烷，1. 0472 μ g氯化钙搅拌混勻形成微乳1 ； 0. IMIgepal C0-520 溶于 25ml 环己烧，50 μ lTis_HCL(pH 7. 4)，加入 3. 4785 μ g 磷酸氢二 钠，两者的质量比为磷酸氢二钠质粒=10 1，搅拌形成微乳2。将微乳2缓慢滴加到 微乳1中，搅拌lOmin，形成复合纳米粒的乳液。实施例2 载有TGF β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的制备方法同实施例1，只是加入的磷酸氢二钠分别为17. 3925 μ g，6. 9570 μ g， 3. 4785mg、l. 7393μ g 和 0. 3479μ g，磷酸氢二钠TGF-βΙ 质粒=5 1、2 1、1 1、 0.5 1和0. 1 1，得到磷酸二氢钠与TGF- β 1质粒不同比例的载有TGF- β 1质粒的磷酸 钙复合纳米粒乳液。实施例3 载有TGF- β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的分离纯化(1)层析柱的预处理取90g硅球加入含有0. 336mLAPS, 1. 5mL冰乙酸，7. 5 μ L双蒸水的150mL乙醇溶液 中，搅拌过夜，70°C烘干备用。(2)复合纳米粒的分离将上述制得的不同比例的载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒乳液过硅胶层 析柱，先用无水乙醇洗脱环己烷及游离的部分，然后用浓度为5X 10_4mOl/L的NaCl的70% 乙醇溶液洗脱载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒。(3)复合纳米粒的浓缩含有载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的乙醇溶液在37°C旋转蒸发6h除去 乙醇，浓缩液置于12KD的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液中，4°C透析过夜，即得到不同比例 的载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒。实施例4 载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒琼脂糖电泳将所制备的不同比例(质量比)的载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒1 %琼 脂糖凝胶80V电泳1. 5h，DNA经溴化乙锭(EB)染色显示，紫外透射仪观察并凝胶照相鉴定，其结果见图2，其中1.裸DNA ；2.磷酸钙质粒为10 1 ；3.磷酸钙质粒为5 1 ；4.磷 酸钙质粒为2 1 ;5.磷酸钙质粒为1 1 ;6.磷酸钙质粒为0. 5 1 ；7.磷酸钙 质粒为0.1 1。电泳结果可知，在磷酸钙质粒质量比大于等于2 1时，实现了很好的 滞留，在小于2 1时仍有部分质粒未被包埋而呈游离状态。实施例5 大鼠干细胞(MSC)的培养将SD大鼠拉颈处死，体积分数为75%乙醇浸泡3 5min，无菌条件下取出胫骨 和股骨；将其两端干骺端切除，显露骨髓腔，用无菌注射器吸取适量PBS彻底冲洗骨髓腔； 反复吹打冲出的骨髓，使骨髓细胞充分分散；所获骨髓单细胞悬液沿管壁缓慢滴加于预加 的Percoll分离液(相对体积质量1. 073)的离心管中，骨髓单细胞悬液与分离液的比例为 1 1 ;2000rpm，离心20min，吸取中间云雾状细胞层，用PBS洗涤3次；重新悬起细胞，加入 完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清的DMEM)，置于培养瓶中，37°C体积分数为5%的 CO2培养箱中培养。实施例6 载有TGF- β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的体外转染
转染前24h内将MSC按2X104/mL(2X104有单位吗？)接种于96孔培养板中，置 370C 5% CO2培养箱中培养至80% -90%融合。转染时，吸弃前一天铺板的培养液，用PBS 洗涤后，加入载有TGF- β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒以及DMEM培养液至100 μ L，继续培养 6h ；换用完全培养基继续培养。对照组用lipfeCtamineTM2000。实施例7 体外转染细胞的转染效率测定收集实施例5的细胞培养物上清，离心，加到酶标板中。分别设空白孔、标准孔、待 测样品孔。除空白孔外，余孔分别加标准溶液或待测样品lOOul，注意不要有气泡，轻轻混 勻，酶标板加上盖，37°C应120分钟。弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作 液IOOul，37°C，60分钟。洗板3次，350ul/每孔，甩干。每孔加检测溶液B工作液IOOul, 37°C，60分钟，洗板5次，甩干。依序每孔加底物溶液90ul，37°C避光显色30分钟(此时肉 眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显)。依序每孔加终止溶 液50ul，终止反应(此时兰色立转黄色)。用酶联免疫检测仪在450nm波长测量各孔的光 密度(0D值)，计算各孔的蛋白表达浓度，结果见图3。载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒转染效果与市售转染试剂相当(P > 0. 05)，显著高于游离质粒组(P < 0. 01)，说明所发明的载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳 米粒作为一种非病毒载体可有效实现DNA的干细胞传递。实施例8 细胞毒性实验采用MTT比色法考察载有TGF- β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒的细胞毒性。2 X IO4 个/孔的MSC接种96孔板，37°C，CO2中继续孵育24h，待细胞贴壁后，每孔加入不同浓度 (4，6，8，10，16，20yg/ml)的载有TGF-β 1质粒的磷酸钙复合纳米粒及对市售转染试剂 lipfectamine 2000,分别作用48h后，每孔加MTT溶液100 μ L(5mg/ml)，继续培养4h，弃上 清，每孔加入二甲亚砜(DMSO) 100 μ L，酶联免疫检测仪测定570nm处各孔吸光度㈧，以培 养基为空白对照，并与脂质体lipfeCtamineTM2000相比较，取平均值，并计算细胞存活分数 (细胞存活率(%) =A57ck样品)/A57Q(对照)X100%)。其中A57tl(样品)为加入载体后的细胞吸光 度，A57ckwm)为空白对照的细胞吸光度，结果见图5。实验结果表明，随着非病毒载体用量的增加，所发明的载有TGFiil质粒的磷酸钙复合纳米粒细胞毒性明显小于市售转染试剂lipfectamine 2000(P < 0. 01)..,
权利要求
一种载有基因的磷酸钙复合纳米粒，其特征是它是载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，该复合纳米粒为球形，粒径小于50nm。
2.根据权利要求1所述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒，其特征是所述的基因质粒 是 TGF-3 1。
3.—种权利要求1所述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒的制备方法，其特征是它是 将0. 1M Igepal C0-520溶于25ml环己烷，加入1. 36M氯化钙，搅拌混勻形成微乳1 ；将0. 1M Igepal C0-520,50u lTis-HCL(pH 7.4)溶于25ml环己烷，加入磷酸氢二钠和基因质粒，加 入磷酸氢二钠的质量0.35M，磷酸氢二钠与质粒的质量比为0. 1 1 10 1，搅拌形成微 乳2，将微乳2缓慢滴加到微乳1中，搅拌lOmin，形成载有基因的磷酸钙复合纳米粒的乳 液。
4.一种权利要求1所述的载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离方法，它由如下步骤组成(1)层析柱的预处理取90g硅球加入含有0. 336mL氨基丙基三乙氧基硅烷(aminopropyltriethoxysilane， 八卩5)，1.51^冰乙酸，7.51^双蒸水的150mL乙醇溶液中，搅拌过夜，70°C烘干备用；(2)载有基因的磷酸钙复合纳米粒的分离将权利要求2制得的载有基因的磷酸钙复合纳米粒乳液过步骤(1)预处理的硅胶层析 柱，先用无水乙醇洗脱环己烷及游离的质粒和盐，然后用含有5X10_4mol/LNaCl的70%乙 醇溶液洗脱载基因的磷酸钙复合纳米粒；(3)载基因的磷酸钙复合纳米粒乙醇液的浓缩将步骤(2)所得的含有载基因的磷酸钙复合纳米粒的乙醇液在37°C旋转减压蒸发6h 除去乙醇，浓缩液置于12KD的透析袋中，置于磷酸盐缓冲液中，4°C透析过夜，即得到载基 因的磷酸钙复合纳米粒。
5.根据权利要求1所述的载基因的磷酸钙复合纳米粒在干细胞传递中应用。
全文摘要
一种载有基因的磷酸钙复合纳米粒，它是载有治疗基因的磷酸钙纳米粒，该复合纳米粒为球形，粒径小于50nm。本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米粒转染效果与市售转染试剂相当(P＞0.05)，显著高于游离质粒组(P＜0.01)，这说明本发明的载有基因的磷酸钙复合纳米粒作为一种非病毒载体可有效实现DNA的干细胞传递。因此，本发明的载基因的磷酸钙复合纳米粒可以在干细胞传递中应用。本发明公开了其制法。
文档编号A61K47/32GK101829330SQ20091026411
公开日2010年9月15日 申请日期2009年12月30日 优先权日2009年12月30日
发明者余江南, 徐希明, 曹霞, 苏伟燕 申请人:江苏大学