一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，将罗非鱼皮鱼鳞清洗沥干，置于0.4～0.6mol/L盐酸中浸泡20～60min脱钙，0.1～0.6mol/L氢氧化钠浸泡30～60min脱脂；然后再将固液比为8～12：100的鱼皮鱼鳞和水添加到发酵罐中，121℃灭菌30min；向发酵罐中接入菌种，35℃发酵24～48h；发酵结束后过滤去除菌体和杂质，收集滤液I；滤液I再经超滤膜超滤获得含有蛋白肽的滤液II和含有纤溶酶的截留液。本发明直接以发酵方法同时制取具降压活性的蛋白肽和能溶解血栓的纤溶酶两种产物，原料利用率高，显著降低了生产成本，且环保不污染环境，具有广泛的应用价值。
【专利说明】一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法。
【背景技术】
[0002]纤溶酶(Plasmin)是指能专一降解纤维蛋白凝胶的蛋白水解酶，是纤溶系统中的一个重要组份。纤溶酶主要通过降解纤维蛋白和纤维蛋白原，水解多种凝血因子，使纤溶酶原转变为纤溶酶，水解补体等途径降解纤维蛋白使其降解为小分子可溶片段，易于分解和从血循环系统中清除。纤溶酶作用于纤维蛋白原及纤维蛋白，促使组织纤溶酶原激活物由内皮细胞释放，并增强其活性，具抗血栓功能；并可降低血小板聚集及血液粘度，降低心肌耗氧量，改善微循环。
[0003]蛋白肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由两个氨基酸组成，大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成，具有十分重要的生物学意义。现代生物代谢研究发现:人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，不像以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更多的是以低肽的形式直接吸收，而且二肽和三肽的吸收速度比相同组成的氨基酸快。其中，某些低肽不仅能提供人体生长发育所需的营养物质，且同时具有重要的生理功倉泛。
[0004]现有技术中多利用生物酶解的方法制备，包括氯化钠去除杂蛋白，氢氧化钠脱脂，添加多种蛋白酶进行酶解进而得到胶原蛋白。利用酶解法生产胶原蛋白需要添加昂贵的蛋白酶，生产成本较高。目前，尚没有一种以罗非鱼皮鱼鳞为原料采用微生物发酵的方法同时生产蛋白肽及纤溶酶的方法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种利用罗非鱼的鱼皮鱼鳞为原料同时生产具有重要生物活性的蛋白肽及纤溶酶的方法。
[0006]本发明所采用的技术方案是提供一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，包括以下步骤:
[0007](I)原料处理:将罗非鱼皮鱼鳞清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的盐酸溶液中浸泡20~60min脱钙，然后水洗至中性浙干；将经脱钙处理后的鱼皮鱼鳞置于0.1~0.6mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡30~60min脱脂，然后水洗至中性，搅碎烘干备用；
[0008](2)灭菌:将步骤I中处理好的鱼皮鱼鳞和水按固液比8-12:100的比例添加到发酵罐中，121°C灭菌30min ；
[0009](3)接种发酵:向发酵罐中接入经液体培养基扩大培养的枯草芽孢杆菌于35°C条件下发酵24~48h ;接入的菌种量为2~6% ；
[0010](4)发酵结束，过滤去除菌体和杂质，收集滤液I ;所述滤液I再经超滤膜超滤获得含有蛋白肽的滤液II和含有纤溶酶的截留液；[0011](5)所述含有蛋白肽的滤液II经真空浓缩，喷雾干燥得所述蛋白肽；所述含有纤溶酶的截留液经冷冻干燥得所述纤溶酶。
[0012]本发明的目的还在于提供所述利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法获得的蛋白肽在食品、保健品或化妆品中的应用。
[0013]本发明的目的还在于提供所述利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法获得的蛋白肽及纤溶酶在溶解血栓和预防血栓形成的保健品或药物中的应用。
[0014]本发明的有益效果在于，利用罗非鱼生产加工过程中的废料鱼皮和/或鱼鳞作为生产原料，采用微生物发酵的方法同时制得具有降压活性的蛋白肽和溶解血栓活性的纤溶酶两种产物，且不需要加入昂贵的蛋白酶和添加剂，生产工艺简单，成本低廉。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是尿激酶在琼脂糖-纤维蛋白平板上的溶菌圈,其中，I~5所对应的酶活力分别是 20、40、60、80、160IU/ml ；
[0016]图2是尿激酶标准曲线；
[0017]图3是本发明实施例所制备蛋白肽的高效液相色谱图；
[0018]图4是本发明实施例所制备蛋白肽的ACE抑制活性对比图(对应图3中的7个峰)。【具体实施方式】
[0019]为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
`[0020]本发明实施例提供一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，包括以下步骤:
[0021](I)原料处理:将罗非鱼皮鱼鳞清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的盐酸溶液中浸泡20~60min脱钙，然后水洗至中性浙干；将经脱钙处理后的鱼皮鱼鳞置于0.1~0.6mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡30~60min脱脂，然后水洗至中性，搅碎烘干备用；
[0022](2)灭菌:将步骤I中处理好的鱼皮鱼鳞和水按固液比8-12:100的比例添加到发酵罐中，121°C灭菌30min ；
[0023](3)接种发酵:向发酵罐中接入经液体培养基扩大培养的枯草芽孢杆菌于35°C条件下发酵24~48h ;接入的菌种量为2~6% ；
[0024](4)发酵结束，过滤去除菌体和杂质，收集滤液I ;所述滤液I再经超滤膜超滤制得含有蛋白肽的滤液II和含有纤溶酶的截留液；
[0025](5)所述含有蛋白肽的滤液II经真空浓缩，喷雾干燥得所述蛋白肽；所述含有纤溶酶的截留液经冷冻干燥得所述纤溶酶。
[0026]具体地，所述罗非鱼皮鱼鳞包括罗非鱼的鱼皮和鱼鳞中的一种或者两种任意比例的混合物。步骤I中对罗非鱼皮鱼鳞进行原料处理时鱼皮鱼鳞与盐酸溶液的固液质量比为1:4~8 ;经脱钙处理后的鱼皮鱼鳞氢氧化钠溶液与的固液质量比为1:4~8。发酵过滤出去菌体和杂质后收集得到的滤液I需经截留分子量为5000道尔顿的超滤膜再次过滤。超滤所得滤液II经真空浓缩，喷雾干燥制得蛋白肽粉，超滤所得截留液经冷冻干燥制得活性纤溶酶粉。
[0027]以下结合具体参数进一步说明。
[0028]实施例1
[0029]称取罗非鱼皮5kg清洗浙干,加0.2mol/L氢氧化钠40L,浸泡30min脱脂,水洗至中性，搅碎烘干备用。按固液质量比8:100加鱼皮和水到发酵罐中，121°C，30分钟灭菌。接种量2%接种枯草芽孢杆菌，发酵温度为35°C，发酵24小时。发酵结束，发酵液板框过滤去除菌体和杂质，收集过滤液。过滤液用5000dalton超滤膜超滤，过滤液为蛋白肽，截留液为纤溶酶。过滤液经真空浓缩，喷雾干燥得蛋白肽粉。纤溶酶经冷冻干燥得活性酶粉。
[0030]实施例2
[0031]称取罗非鱼皮和鱼鳞的混合物5kg清洗浙干，加入浓度为0.4mol/L的盐酸溶液60L,浸泡30min脱韩，水洗至中性后浙干；再加入0.4mol/L氢氧化钠60升,浸泡40分钟脱月旨，水洗至中性，搅碎烘干备用。按固液质量比12:100的比例加入鱼皮鱼鳞混合物和水到发酵罐中，121°C，灭菌30分钟。按4%的接种量接种枯草芽孢杆菌，发酵温度为35°C，发酵36小时。发酵结束，发酵液板框过滤去除菌体和杂质，收集过滤液。过滤液用5000dalton超滤膜超滤，过滤液为蛋白肽，截留液为纤溶酶。过滤液经真空浓缩，喷雾干燥得蛋白肽粉。纤溶酶经冷冻干燥得活性酶粉。
[0032]实施例3
[0033]称取罗非鱼皮和鱼鳞的混合物5kg清洗浙干，加入浓度为0.6mol/L的盐酸溶液60L,浸泡30min脱韩，水洗至中性后浙干；加0.6mol/L氢氧化钠80L,脱脂60分钟,水洗至中性，搅碎烘干备用。按固液比10:100比例加鱼皮和水到发酵罐中，121°C，30分钟灭菌。接种量6%接种枯草芽孢杆菌，发酵温度为35°C，发酵48小时。发酵结束，发酵液板框过滤去除菌体和杂质，收集过滤液。过滤液用5000dalton超滤膜超滤，过滤液为蛋白肽，截留液为纤溶酶。过滤液经真空浓缩，喷雾干燥得蛋白肽粉。纤溶酶经冷冻干燥得活性酶粉。
[0034]实验例I纤溶酶溶栓活性测试
[0035]纤溶酶的溶栓活性用国家标准琼脂糖-纤维蛋白平板法测定，分别取20、40、60、80、160IU/mL的样品溶液滴加到纤维蛋白平板上，如图1所示，测量透明圈的面积，以尿激酶活力单位的对数值为横坐标，透明圈面积的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，如图2所示。根据标准曲线以尿激酶活力单位表示纤溶酶的溶栓活性，测得纤溶酶活力的计算公式为:
[0036]溶纤酶活力(IU/mL)=0.843M-84.54 ；
[0037]式中M-溶圈面积(mm2)。
[0038]实验测得本发明实施例1~3中所制得纤溶酶活平均值为215U/mg，可有效溶解血栓，在溶解血栓和预防血栓形成的保健品或药物中具有广泛的应用价值。
[0039]实验例2蛋白 肽的降压活性测试
[0040]用紫外分光光度计血管紧张素转换酶抑制肽(ACE)抑制活性方法测定:
[0041]S1:取100 μ l HHL (Hip-His_Leu)溶液和40 μ l培养物上清于2ml EP管中混合，于37°C保温3min，加入10μ l ACE溶液，于37度保温反应30min，加入250 μ llmol/L HCl溶液终止反应。再加入1.5ml醋酸乙酯，15s振荡混匀，5000转/分离心lOmin，用移液枪吸取Iml醋酸乙酯层，100°C下干燥lh，加入3ml去离子水，在228nm处测定其OD值A。其中，标准液为4ml缓冲液。
[0042]S2:将步骤SI中的40 μ I培养物换成40 μ I去离子水，其他不变，测得OD值B。
[0043]S3:将步骤I中的10 μ I ACE溶液换成10 μ I去离子水，其他不变，测得OD值C。
[0044]S4:计算 ACE 抑制率(％) = (B-A) / (B-C) *100%
[0045]本发明所制得活性蛋白肽经高效液相色谱层析分离得7个峰，如图3所示，依次编号为I~7，所测得7个峰的ACE抑制率为18.40~68.40%，其中第5个峰的ACE抑制率最高，可达68.40%，具有高效的降压活性，可用于制备降压活性的保健品及药物。
[0046]本发明方法可同时制得具有重要生物活性的蛋白肽和纤溶酶，所述蛋白肽分子质量小，利于身体以低肽的形式直接吸收，且吸收速度比相同组成的氨基酸快，能提供人体生长发育所需的营养物质，可用于制备具有特定功能的食品、保健品或化妆品。所制得活性蛋白肽成份丰富，含有如血管紧张素转换酶抑制肽(ACE)，可用于制备具有降压活性的保健品或药物；所制得活性蛋白肽还可作为原料进一步分离提纯制得其他活性肽，如促进矿物质吸收肽、防治肝性脑病肽、易消化吸收肽、抗菌肽、吗啡片肽、类吗啡拮抗肽、抑制胆固醇作用肽、机体防御功能肽。
[0047]进一步地，本发明利用罗非鱼生产加工过程中的废料鱼皮和/或鱼鳞作为生产原料，采用微生物发酵的方法同时制得具有降压活性的蛋白肽和溶解血栓活性的纤溶酶两种产物，且不不需要加入昂贵的蛋白酶和添加剂，生产工艺简单，成本低廉。
[0048]以上所述仅为本 发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)原料处理:将罗非鱼皮鱼鳞清洗浙干，置于0.4~0.6mol/L的盐酸溶液中浸泡20~60min脱钙，然后水洗至中性浙干；将经脱钙处理后的鱼皮鱼鳞置于0.1~0.6mol/L的氢氧化钠溶液中浸泡30~60min脱脂，然后水洗至中性，搅碎烘干备用； (2)灭菌:将步骤I中处理好的鱼皮鱼鳞和水按固液比8~12:100的比例添加到发酵罐中，121°C灭菌30min ； (3)接种发酵:向发酵罐中接入经液体培养基扩大培养的枯草芽孢杆菌于35°C条件下发酵24~48h ;接入的菌种量为2~6% ； (4)发酵结束，过滤去除菌体和杂质，收集滤液I;所述滤液I再经超滤膜超滤获得含有蛋白肽的滤液II和含有纤溶酶的截留液； (5)所述含有蛋白肽的滤液II经真空浓缩，喷雾干燥得所述蛋白肽；所述含有纤溶酶的截留液经冷冻干燥得所述纤溶酶。
2.根据权利要求1所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，其特征在于，所述罗非鱼皮鱼鳞包括罗非鱼的鱼皮和/或鱼鳞。
3.根据权利要求1或2所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，其特征在于，所述鱼皮鱼鳞与所述盐酸溶液的固液质量比为1:4~8。
4.根据权利要求1所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，其特征在于，所述经脱钙处理后的鱼皮鱼鳞与`所述氢氧化钠溶液的固液质量比为1:4~8。
5.根据权利要求1所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法，其特征在于，所述超滤膜的截留分子量为5000道尔顿。
6.一种如权利要求1~5任一项所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法获得的蛋白肽在食品、保健品或化妆品中的应用。
7.—种如权利要求1~5任一项所述的利用罗非鱼皮鱼鳞发酵生产蛋白肽及纤溶酶的方法获得的纤溶酶在溶解血栓和预防血栓形成的保健品或药物中的应用。
【文档编号】A61K38/01GK103820518SQ201410092219
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月13日 优先权日:2014年3月13日
【发明者】韩庆国, 魏文丰 申请人:深圳大学