一种壳聚糖-纳米银伤口敷料及其制备方法
【专利摘要】本发明提供一种壳聚糖-纳米银伤口敷料，所述伤口敷料包括贴合伤口面的吸水抗菌层和疏水层，所述吸水抗菌层含壳聚糖和纳米银，该层是将海绵状壳聚糖浸泡在含纳米银的溶胶中，通过冷冻干燥的方法将纳米银均匀复合在海绵状壳聚糖上；另一面为疏水层。其制备方法包括以下步骤：（1）制备壳聚糖-纳米银海绵；（2）将疏水改性剂浓度为10-50mmol/L的乙醇溶液均匀喷涂在步骤（1）所得壳聚糖-纳米银海绵的一面上，并在-18℃以下进行预冷冻，然后进行冷冻干燥处理得到壳聚糖-纳米银伤口敷料。本发明所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料所使用的壳聚糖、纳米银和脂肪酸等疏水改性剂生物安全性高，对人体细胞无毒副作用，且壳聚糖为海绵结构，柔软性好，透气性高。
【专利说明】一种壳聚糖-纳米银伤口敷料及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医用敷料生物材料制备【技术领域】，具体涉及一种壳聚糖-纳米银伤口敷料及其制备方法。
【背景技术】
[0002]皮肤是人体的重要器官，是机体与外界的天然屏障与沟通的桥梁。由于烧伤、创伤和皮肤溃疡等原因而导致皮肤组织的缺损，将可能会导致伤口感染。目前，应对皮肤伤口的一个有效方法是使用伤口敷料。
[0003]传统的伤口敷料包括纱布、脱脂棉、绷带等。但从医学角度来看，这些传统的伤口敷料由于不具备治疗和修复伤口等性能，也不具有抗菌活性，在临床中应用范围受到局限。因而可促进伤口愈合、高效抗菌、使用更方便的新型医用敷料逐渐发展起来。
[0004]壳聚糖可生物降解、生物相容性好、具有抗菌活性且无毒副作用，可在伤口处提供非蛋白基质促进细胞增殖、组织生长和血液凝结，并减轻神经末端的疼痛。此外，壳聚糖具有良好的亲水性，可以快速吸收伤口渗出液，保持伤口一定的湿润程度。根据伤口“湿性愈合”理论，湿润的环境有利于坏死组织和纤维蛋白的溶解，有利于细胞增殖分化和移动，加速肉芽组织的形成。而且，具有良好亲水性的壳聚糖伤口敷料，能使之不易与新生肉芽组织粘连，更换敷料时能减轻疼痛，避免使用时所造成的二次机械性损伤。因此，壳聚糖基伤口敷料得到人们的广泛关注，目前已经商品化的壳聚糖敷料有医用CAD (醋酸纤维素)壳聚糖敷料、壳聚糖抗菌护创膜、邦邦贴等各种壳聚糖生物外用敷料等。
[0005]单纯的壳聚糖敷料对病原菌的抑制效果并不理想，因此相关的研究中普遍往壳聚糖中加入抗菌剂以提高其抗菌活性。无机抗菌剂由于其广谱高效的抗菌活性以及不易产生耐药性，因而被广泛应用于伤口敷料中。其中银系列的材料近年来在无机抗菌剂领域备受关注，如目前已经商品化的康力迪含银壳聚糖敷料，该敷料在壳聚糖止血敷料的基础上加入了银离子，从而提高其抗感染能力。然而，含银离子的敷料在使用中会致使伤口处银离子浓度过高，若长期使用，过度聚集的银离子可能对人体的健康有一定的风险。近年来随着纳米技术的发展，人们发现纳米银对常见病原菌的抗菌活性远高于银盐，且与银盐相比，可克服银盐中具有抗菌活性的银离子释放过快且难以控制的缺点，对人体的毒性更低。为此，制备含纳米银的壳聚糖敷料成为近年来的研究热点。
[0006]现有含纳米银的壳聚糖敷料普遍具有吸收创面渗液、促进伤口凝血和伤口愈合、生物相容性良好等优点。然而这些敷料通常都是裸露在空气中，在与外界交换气体的同时，也可能会导致一些不洁净的液体渗透进伤口，从而刺激伤口、影响伤口愈合。这也是目前临床上应用伤口敷料所存在的一个不足之处。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，提供一种表面具有防水功能的壳聚糖-纳米银伤口敷料及其制备方法。该伤口敷料贴合伤口面柔软度高、透气性好、生物安全性高，并且制备方法简单。
[0008]本发明为解决上述技术问题采用以下技术方案:
[0009]一种壳聚糖-纳米银伤口敷料，该伤口敷料包括贴合伤口面的吸水抗菌层和疏水层，所述吸水抗菌层含壳聚糖和纳米银，该层是将海绵状壳聚糖浸泡在含纳米银的溶胶中，通过冷冻干燥的方法将纳米银均匀复合在海绵状壳聚糖上；另一面为疏水层。
[0010]按上述方案，所述纳米银粒径为10_20nm ;所述疏水层包括疏水改性剂软脂酸、硬脂酸、花生酸或山嵛酸中的一种或多种。疏水层由直链脂肪酸构成，呈光滑平坦的结构，少量孔隙存在，能防止外界液体渗入。由于疏水层很薄(厚度在1-10 μ m),且有少量孔隙存在，所以不影响敷料的透气性。
[0011]按上述方案，所述海绵状壳聚糖的制备方法为:将壳聚糖溶解在0.5-2wt%的醋酸溶液中，制备得到质量体积比为1-3% (w/v)的壳聚糖醋酸溶液，并在_18°C以下进行预冷冻8-16h，然后进行冷冻干燥处理，随后将所得产物浸泡在碱液中除去残留的醋酸，再用去离子水反复冲洗至中性，得到海绵状壳聚糖。
[0012]优选的是，所述壳聚糖脱乙酰度为70-100%，粘度为100_200cPa.S。 [0013]优选的是，所述冷冻干燥处理的条件为:冷冻干燥机冷阱温度等于或低于_40°C，真空度< 10Pa，冷冻干燥时间为16-24h。
[0014]本发明还提供上述壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其包括以下步骤:
[0015](I) 20_30°C下将海绵状壳聚糖浸泡在纳米银溶胶中，该纳米银溶胶中纳米银浓度为10-100 μ g/mL,浸泡16-24h后在-18°C以下预冷冻6_10h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0016](2)将浓度为10-50mmol/L的疏水改性剂的乙醇溶液均匀喷涂在步骤(1)所得壳聚糖-纳米银海绵的一面上，并在_18°C以下进行预冷冻30-60min，然后进行冷冻干燥处理得到壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0017]按上述方案，步骤(1)所述纳米银溶胶的制备方法为:将浓度为l_20g/L的聚乙烯吡咯烷酮水溶液与浓度为0.1-0.5mol/L的硝酸银水溶液混合，聚乙烯吡咯烷酮水溶液与硝酸银水溶液体积比为10:1-20:1，搅拌均匀后缓慢滴加浓度为0.01-0.lmol/L的硼氢化钠水溶液，滴加速率为每20秒滴加10 μ L，至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，得到纳米银溶胶。
[0018]按上述方案，步骤(2)所述冷冻干燥处理条件为:冷冻干燥机冷阱温度等于或低于-40°C，真空度< 10Pa，冷冻干燥时间为10-12h。
[0019]按上述方案，所述海绵状壳聚糖的制备方法为:将壳聚糖溶解在0.5-2wt%的醋酸溶液中，制备得到质量体积比为1-3%的壳聚糖醋酸溶液，并在_18°C以下进行预冷冻8_16h，然后进行冷冻干燥处理，随后将所得产物浸泡在碱液中除去残留的醋酸，再用去离子水反复冲洗至中性，得到海绵状壳聚糖。
[0020]按上述方案，所述壳聚糖脱乙酰度为70-100%，粘度为100_200cPa.S。
[0021]本发明的有益效果是:1.本发明所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料所使用的壳聚糖、纳米银和脂肪酸等疏水改性剂生物安全性高，对人体细胞无毒副作用，且壳聚糖为海绵结构，柔软性好，透气性高，还不易与创面粘连；2.该伤口敷料具有一面吸水，另一面防水的特性，可在吸收伤口渗液的同时，又能防止外界的不洁净液体及细菌渗进伤口，并且测试表明细菌无法在本伤口敷料表面上生长；3.本发明制备的伤口敷料中所含的纳米银颗粒尺寸均匀，抗菌活性高；4.本伤口敷料对人体正常细胞如HEK293 (人胚肾细胞)没有毒性，而且对细胞的生长有促进作用，具有优异的伤口修复能力和促进愈合能力；5.本发明所述的伤口敷料对临床常见的病原菌(金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、耐药铜绿假单胞菌、大肠杆菌、耐药大肠杆菌)具有良好的抑菌活性；6.本发明提供的伤口敷料具有良好的抗拉伸强度、延展性能以及吸水性能(拉伸强度达0.022-0.072MPa ；伸张率达20.663-40.764% ;吸水率达1165_1309%);7.与正常凝血相比，本发明提供的伤口敷料产品可使凝血时间提前29%以上，提前率可达到传统医用纱布(14.60%)的两倍以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明实施例1所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料疏水层表面水滴测试照片;
[0023]图2为实施例1所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料吸水抗菌层表面水滴测试照片;
[0024]图3为实施例1所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料疏水层与吸水抗菌层表面的SEM照片；
[0025]图4为实施例2所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料疏水层表面水滴接触照片；
[0026]图5为实施例2所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料吸水抗菌层表面水滴接触照片;
[0027]图6为实施例3所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料溶出的纳米银颗粒的TEM照片;
[0028]图7为实施例4和对比例I所制备的壳聚糖伤口敷料细菌渗透性测试照片，其中左图为培养24h后伤口敷料表面生长细菌的情况，右图为揭下伤口敷料后的情况；
[0029]图8为实施例5制备的伤口敷料进行抗细菌粘附性测试后疏水层表面和吸水抗菌层表面的SEM照片；
[0030]图9为小鼠创伤愈合测试照片，其中从左到右依次为使用不作任何处理的空白对照组，以及爱可欣?纳米银纱布和实施例6制备的伤口敷料处理后伤口的愈合情况；
[0031]图10为对实施例1至4做细胞毒性测试的结果，其中横坐标代表培养1-4天后的结果；纵坐标为细胞经MTT染色后在490nm处测得的吸光度。
【具体实施方式】
[0032]为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图对本发明作进一步详细描述。
[0033]对比例I
[0034]本对比例制备不含纳米银且未经不对称润湿改性的壳聚糖伤口敷料。
[0035]海绵状壳聚糖的制备:称取1.2g壳聚糖(脱乙酰度为82%，粘度为200cPa.S)，溶于50mL浓度为lwt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于-20°C预冷冻12h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度为_40°C,真空度为IOPa,冷冻时间为20小时。随后用
2.0mol/L的氨水溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0036] 壳聚糖伤口敷料的制备:将上述海绵状壳聚糖剪裁成2cmX2cm (厚度为0.3cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖伤口敷料产品。
[0037]实施例1
[0038]海绵状壳聚糖的制备:称取0.8g壳聚糖(脱乙酰度为70%，粘度为IOOcPa.S)，溶于50mL浓度为0.5wt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于_20°C预冷冻12h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度为_40°C,真空度为IOPa,冷冻时间为18小时。随后用1.0mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0039]纳米银溶胶的制备:称取1.2g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于60mL去离子水中，滴加6mL浓度为0.lmol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.04mol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为10 μ g/mL。
[0040]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0041](I)壳聚糖-纳米银海绵的制备:25°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡24h后倒出浸液，并放入冰箱中于-20°C预冷冻6h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0042](2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制软脂酸浓度为20mmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_20°C继续冷冻30min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_40°C，真空度10Pa，冷冻时间为IOh得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0043]对得到的壳聚糖-纳米银伤口敷料剪裁成2cmX2cm (厚度为0.3cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖-纳米银伤口敷料产品。
[0044]用注射器取I X 10_5mmol/L的罗丹明B染料溶液分别滴加在上述正方形小片的两面，观察液滴在两面的沾湿情况，照片如图1、2所示。由照片可见在软脂酸改性面上液滴会滑动离开表面；而在未改性的面上液滴则渗进内部，测试结果表明本壳聚糖-纳米银伤口敷料产品具有一面防水，另一面吸水的特性。
[0045]通过SEM测试本实施例所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料产品，其表面微观结构如图3所示。由图可见，软脂酸改性面为致密的平面结构；而未改性的面为致密的多孔结构，且孔径在100-200 μ m之间。两面迥异的表面微观结构，使产品具有一面防水(水滴易滑落)，另一面吸水的特性。
[0046]实施例2
[0047]海绵状壳聚糖的制备:称取1.0g壳聚糖(脱乙酰度为95%，粘度为IOOcPa.S)，溶于50mL浓度为lwt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于-18°C预冷冻12h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_55°C，真空度4Pa，冷冻时间为24小时。随后用2.0mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。[0048]纳米银溶胶的制备:称取0.05g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于50mL去离子水中，滴加2.5mL浓度为0.lmol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.01mol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为20 μ g/
mL
[0049]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0050](I)壳聚糖-纳米银海绵的制备:30°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡24h后倒出浸液，并放入冰箱中于_18°C预冷冻8h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0051](2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制花生酸浓度为lOmmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_18°C继续冷冻60min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_55°C，真空度4Pa，冷冻时间为12h得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0052]对得到的壳聚糖-纳米银伤口敷料剪裁成2cmX2cm (厚度为0.4cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖-纳米银伤口敷料产品。
[0053]将本实施例所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料产品进行水接触角测试，使用接触角测量仪分别测试水滴在产品的花生酸改性面和未改性面的接触角。如图4和图5所示，水滴在花生酸改性面上的接触角为138° ;水滴在未改性面很快就被吸收到产品的内部，其接触角约为0°。测试结果表明，本产品具有一面疏水另一面亲水的不对称润湿性，这种特性可在吸收伤口渗液的同时，又能防止外界的不洁净液体渗进伤口。
[0054]实施例3
[0055]海绵状壳聚糖的制备:称取1.5g壳聚糖(脱乙酰度为100%，粘度为200cPa.s),溶于50mL浓度为1.5wt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于_22°C预冷冻8h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_58°C，真空度8Pa，冷冻时间为16h。随后用1.2mol/L的氨水溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0056]纳米银溶胶的制备:称取0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于45mL去离子水中，滴加2.5mL浓度为0.2mol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.lmol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为30 μ g/mL。
[0057]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0058](I)壳聚糖-纳米银海绵的制备:20°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡20h后倒出浸液，并放入冰箱中于-20°C预冷冻6h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0059](2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制硬脂酸浓度为50mmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_20°C继续冷冻40min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_58°C，真空度8Pa，冷冻时间为12小时得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0060]将本实施例所制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料裁剪出质量为20mg的小片，溶于5mL浓度为lwt%的醋酸水溶液中，并将得到的液体进行离心处理，取上清液得到纳米银分散液。通过TEM测试分散液中纳米银颗粒的形貌和尺寸，如图6所示。TEM测试结果表明，本实施例制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料中所含的纳米银颗粒尺寸均匀，粒径为10-20nm。
[0061]实施例4
[0062]海绵状壳聚糖的制备:称取1.2g壳聚糖(脱乙酰度为82%，粘度为200cPa.S)，溶于50mL浓度为2wt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于_20°C预冷冻12h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_46°C，真空度6Pa，冷冻时间为20h。随后用2.0moI/L的氨水溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0063]纳米银溶胶的制备:称取0.45g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于30mL去离子水中，滴加2.0mL浓度为0.3mol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.05mol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为60 μ g/
mLo
[0064]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0065](1)壳聚糖-纳米银海绵的制备:25°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡16h后倒出浸液，并放入冰箱中于_19°C预冷冻7h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0066](2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制山嵛酸浓度为50mmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_19°C继续冷冻50min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度-46°C，真空度6Pa，冷冻时间为IOh得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0067]对得到的壳聚糖-纳米银伤口敷料剪裁成2cmX2cm (厚度为0.2cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖-纳米银伤口敷料产品。
[0068]将本实施例制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料产品和对比例I制备的壳聚糖伤口敷料产品进行对比测试:壳聚糖-纳米银伤口敷料疏水的一面向上，与壳聚糖伤口敷料并列铺放在琼脂培养基上，然后各滴加200 μ L大肠杆菌菌液在两种伤口敷料上面(菌液浓度为106CFU/mL，即每毫升菌液中细菌的菌落数量为IO6个)，在37°C培养箱中放置24小时后观察。可见本实施例制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料疏水表菌液仍然留在表面没有渗进内部，而对照组壳聚糖伤口敷料表面的菌液已渗进样品；将两种伤口敷料揭开，壳聚糖-纳米银伤口敷料底部仍然保持洁净，没有菌落生长，而对照组壳聚糖伤口敷料的底部则观察到有大片菌落(图7)。测试结果表明:本实施例制备的纳米银-壳聚糖敷料产品可防止外界细菌渗进内部。
[0069]实施例5
[0070]海绵状壳聚糖的制备:称取0.5g壳聚糖(脱乙酰度为87%，粘度为150cPa.S)，溶于50mL浓度为0.8wt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于_19°C预冷冻15h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_55°C，真空度4Pa，冷冻时间为18小时。随后用1.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡处理2小时，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0071]纳米银溶胶的制备:称取0.25g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于50mL去离子水中，滴加3mL浓度为0.5mol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.08mol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为100μ g/mL。 [0072]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0073](I)壳聚糖-纳米银海绵的制备:20°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡24h后倒出浸液，并放入冰箱中于_19°C预冷冻9h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0074](2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制软脂酸浓度为30mmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_19°C继续冷冻45min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_55°C，真空度6Pa，冷冻时间为9h，得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0075]对得到的壳聚糖-纳米银伤口敷料剪裁成2cmX2cm (厚度为0.3cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖-纳米银伤口敷料产品。
[0076]对本实施例制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料产品进行抗细菌粘附性测试:从大肠杆菌(E.coli)培养板上挑取菌落配成悬液，并稀释浓度至106CFU/mL。把伤口敷料迅速浸泡在菌液中3秒后，再把伤口敷料浸泡在LB (溶菌肉汤)培养液中，振荡培养24小时后，从培养液中取出伤口敷料，加入2.5wt%的戊二醛溶液固定，15分钟后再依次用无菌PBS (磷酸盐缓冲液)溶液和无菌水反复冲洗3次，然后再用无水甲醇冲洗3次脱水，自然风干。用SEM观察固定后的伤口敷料吸水和疏水两面细菌粘附的情况。戊二醛溶液能迅速使蛋白质变性，使细菌固定在底材伤口敷料上面，如果有细菌存在可通过扫描电镜观察到通过甲醇脱水、干燥处理后留下的细菌外壳。SEM测试图片可见，本实施例制备的伤口敷料两面均没有观察到有大肠杆菌外壳，表明细菌无法在本伤口敷料上生长(图8)。
[0077]实施例6
[0078]海绵状壳聚糖的制备:称取1.3g壳聚糖(脱乙酰度为97%，粘度为200cPa.S)，溶于50mL浓度为1.2wt%的醋酸溶液中，完全溶解后将得到的壳聚糖醋酸溶液倒入玻璃培养皿并放入冰箱中于_18°C预冷冻12h。然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_50°C，真空度8Pa，冷冻时间为18h。随后用1.25mol/L的氨水溶液浸泡处理2h，再反复用去离子水洗，直至得到中性的海绵状壳聚糖。
[0079]纳米银溶胶的制备:称取0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP，重均分子量Mw=55，000)，溶解于40mL去离子水中，滴加3mL浓度为0.4mol/L的硝酸银水溶液，搅拌30分钟后缓慢滴加0.05mol/L的硼氢化钠溶液，每隔20秒滴加10 μ L，直至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，所得纳米银溶胶稀释至纳米银浓度为50 μ g/mL。
[0080]壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备:
[0081](I)壳聚糖-纳米银海绵的制备:30°C下将上述海绵状壳聚糖浸泡在上述制备的纳米银溶胶中，浸泡24h后倒出浸液，并放入冰箱中于_18°C预冷冻10h，得到壳聚糖-纳米银海绵；
[0082] (2)壳聚糖-纳米银海绵的不对称润湿性改性:配制硬脂酸浓度为50mmol/L的乙醇溶液，并均匀地喷涂在上述得到的壳聚糖-纳米银海绵表面上，然后放入冰箱中于_18°C继续冷冻60min，然后放置于真空冷冻干燥机中进行冷冻干燥处理，其中冷冻干燥机的参数为:冷阱温度_50°C，真空度8Pa，冷冻时间为llh，得到具有不对称润湿性的壳聚糖-纳米银伤口敷料。
[0083]对得到的壳聚糖-纳米银伤口敷料剪裁成2cmX2cm (厚度为0.3cm)的小片，并经紫外线照射消毒、封装，得到壳聚糖-纳米银伤口敷料产品。
[0084]使用本实施例制备的壳聚糖-纳米银伤口敷料产品进行治疗小鼠背部切割伤的实验，来说明本发明的伤口愈合效果。在这里还选用已经商品化的“爱可欣(Acasin ?)纳米银纱布”作阳性对照组，以及不作任何处理的一组作空白对照组。测试方法如下:取健康的BALB/c小鼠15只，全雄性，6-8周大，体重在20g左右。随机分为3组，每组5只，分别为“空白对照”组、“爱可欣?纳米银纱布”组以及“实施例6”组。依次对小鼠用乙醚作吸入麻醉后，用手术刀在小鼠背部划出长约IOmm的伤口，使皮下组织充分暴露。然后根据分组在小鼠伤口处作相应的处理。其中空白对照组不作任何处理；另外两组在敷贴前先用无菌生理盐水充分润湿爱可欣?纳米银纱布及本实施例制备的伤口敷料，然后通过输液贴将其固定在伤口上。处理伤口后将小鼠根据分组放进小鼠笼里继续饲养，并在术后若干天观察小鼠伤口的愈合情况，实验照片如图9所示。从小鼠伤口愈合情况可见，术后第2天使用实施例6制备的伤口敷料的小鼠伤口愈合程度明显要优于不作处理的和使用爱可欣?纳米银纱布的小鼠；而在术后第8天，使用实施例6制备的伤口敷料的小鼠伤口已基本愈合，而另外两组仍可见明显的伤口。由此可见，对于外部创伤所致的伤口，本发明提供的伤口敷料产品具有优异的伤口修复能力和促进愈合能力。
[0085]实施例7:产品的机械强度与吸水性能测试
[0086]下面通过实施例1-4的拉伸强度、伸张率和吸水率测试，来说明本发明所述伤口敷料产品的机械强度和吸水性能。测试结果如表1所示。
[0087]表1:产品的拉伸强度、伸张率与吸水率
【权利要求】
1.一种壳聚糖-纳米银伤口敷料，该伤口敷料包括贴合伤口面的吸水抗菌层和疏水层，所述吸水抗菌层含壳聚糖和纳米银，该层是将海绵状壳聚糖浸泡在含纳米银的溶胶中，通过冷冻干燥的方法将纳米银均匀复合在海绵状壳聚糖上；另一面为疏水层。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料，其特征在于:所述纳米银粒径为10-20nm;所述疏水层包括疏水改性剂软脂酸、硬脂酸、花生酸或山嵛酸中的一种或多种。
3.根据权利要求1或2所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料，其特征在于所述海绵状壳聚糖的制备方法为:将壳聚糖溶解在0.5-2wt%的醋酸溶液中，制备得到质量体积比为1-3%的壳聚糖醋酸溶液，并在_18°C以下进行预冷冻8-16h，然后进行冷冻干燥处理，随后将所得产物浸泡在碱液中除去残留的醋酸，再用去离子水反复冲洗至中性，得到海绵状壳聚糖。
4.根据权利要求3所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料，其特征在于所述壳聚糖脱乙酰度为 70-100%，粘度为 100-200cPa.S。
5.根据权利要求3所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料，其特征在于所述冷冻干燥处理的条件为:冷冻干燥机冷阱温度等于或低于_40°C，真空度< 10Pa，冷冻干燥时间为16-24h。
6.根据权利要求1-5任一所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)20-30°C下将海绵状壳聚糖浸泡在纳米银溶胶中，该纳米银溶胶中纳米银浓度为10-100 μ g/mL, 浸泡16-24h后在-18°C以下预冷冻6_10h，得到壳聚糖-纳米银海绵； (2)将浓度为10-50mmol/L的疏水改性剂的乙醇溶液均匀喷涂在步骤(1)所得壳聚糖-纳米银海绵的一面上，并在_18°C以下进行预冷冻30-60min，然后进行冷冻干燥处理得到壳聚糖-纳米银伤口敷料。
7.根据权利要求6所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其特征在于:步骤(O所述纳米银溶胶的制备方法为:将浓度为l_20g/L的聚乙烯吡咯烷酮水溶液与浓度为0.1-0.5mol/L的硝酸银水溶液混合，聚乙烯吡咯烷酮水溶液与硝酸银水溶液体积比为10:1-20:1，搅拌均匀后缓慢滴加浓度为0.01-0.lmol/L的硼氢化钠水溶液，滴加速率为每20秒滴加10 μ L，至混合后的溶液颜色呈黄棕色且取样后经氯化钠溶液鉴定无沉淀生成为止，得到纳米银溶胶。
8.根据权利要求6所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其特征在于:步骤(2)所述冷冻干燥处理条件为:冷冻干燥机冷阱温度等于或低于-40°C，真空度< 10Pa，冷冻干燥时间为10-12h。
9.根据权利要求6所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其特征在于，所述海绵状壳聚糖的制备方法为:将壳聚糖溶解在0.5-2wt%的醋酸溶液中，制备得到质量体积比为1-3%的壳聚糖醋酸溶液，并在_18°C以下进行预冷冻8-16h，然后进行冷冻干燥处理，随后将所得产物浸泡在碱液中除去残留的醋酸，再用去离子水反复冲洗至中性，得到海绵状壳聚糖。
10.根据权利要求6所述的壳聚糖-纳米银伤口敷料的制备方法，其特征在于:所述壳聚糖脱乙酰度为70-100%，粘度为100-200cPa.S。
【文档编号】A61L15/42GK103961738SQ201410145095
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年4月11日 优先权日:2014年4月11日
【发明者】陈嵘, 梁冬晖, 杨浩, 吕中 申请人:武汉工程大学