王枣子总萜有效部位及其提取方法、应用、组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了王枣子总萜有效部位及其提取方法、应用、组合物。该王枣子总萜有效部位含有齐墩果酸和熊果酸，按原料重量百分比组成含有0.02-0.5％的齐墩果酸、0.05-1％的熊果酸。本发明以药物的主要成分生产加工成为适宜的药物制剂作为治疗免疫肝损伤疾病，能改善肝脏状态，无副作用，经药效学试验证明其疗效显著；本发明中的药物原料来源易得，易于产业化，可根据需要制成各种剂型，为临床提供更加方便、更加有效、质量更加可控的现代中药，为患者带来更多的利益，从而产生巨大的社会效益。本发明还公开该王枣子总萜有效部位的提取方法与在抗免疫肝损伤疾病中的应用、具有该王枣子总萜有效部位的药物组合物。
【专利说明】王枣子总萜有效部位及其提取方法、应用、组合物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及中药王枣子提取领域，具体涉及一种王枣子总萜有效部位、从中药王 枣子中提取王枣子总萜有效部位的方法及该王枣子总萜有效部位在抗免疫肝损伤疾病中 的应用、具有该王枣子总萜有效部位的药物组合物。
【背景技术】
[0002] 病毒性肝炎是一种全世界常见病，我国属流行严重地区，各种类型病毒性肝炎严 重威胁着人民的健康，西方国家以丙型肝炎最多，我国主要流行乙型肝炎。在我国，乙型肝 炎病毒携带者占人口的10%，占全世界携带者的1/3以上。现乙型肝炎患者约为3000万。 本病病程迀延，易转变为慢性活动性肝炎、肝硬变及肝癌。我国每年因患乙型肝炎转变为肝 癌而致死者达16万人以上，若加上因急性肝功能衰竭及肝硬变而致死者则更多，因此，慢 性肝炎的治疗便成为一个迫切需要解决的重大问题。
[0003] 目前国内外用于慢性肝炎治疗的药物品种甚多，归纳起来，大体可以分为三类： (一）抗病毒药，主要有干扰素和几种核苷类类似物，干扰素对乙型和丙型肝炎的治疗效果 约为30-50%，对丙型肝炎的效果似乎比对乙型肝炎稍好，但是停止用药后一年内大部分病 人复发，而且药费相当昂贵，进口干扰素一个病人需要人民币数万元，国产干扰素一个病人 药费也在一万元以上，干扰素需要肌肉注射，部分病人用药后有流感样症状的副反应。某些 核苷类类似物对肝炎的治疗效果不如干扰素，亦存在停止用药后出现回跳复发现象，药品 价格亦相当昂贵，部分病人有副反应。为提高疗效，国外有人试用干扰素与某些核苷类抗 病毒剂合并使用，结果疗效未见提高。（二）改善肝功能药，又称抗肝细胞损伤药，如联苯 双酯、五味子制剂及某些中草药，甘草甜素先由日本研制成功，水飞蓟素为德国产品。这类 药物对降低血清转氨酶，退黄疽有一定效果，其中由我国自行研制的联苯双酷的作用优于 其他同类型的药物。但是这类药物于停止使用后，大多数的病人亦出现反跳即复发，对肝炎 病毒慢性指标转阴似无疗效，药费较便宜，副反应少。（三）免疫调节药，如转移因子、白细 胞介素-2、胸腺肽等，主要来源于非特异性免疫调节剂，大多用在不能应用干扰素治疗的病 人，或作为联合用药，治疗慢性乙型肝炎，HBeAg转阴率在20-30%左右，此类药物治疗肝炎 的确切疗效还有待更多的验证，价格亦相当昂贵。从以上所述可以看出，目前尚无满意的治 慢性病毒性肝炎的药物。
[0004] 慢性病毒性肝炎特别是乙型肝炎，由于肝炎病毒具有可嵌合入人肝细胞中的DNA、 RNA等生物遗传性物质，利用宿主细胞的遗传物质进行复制，上述分子生物性，导致抗病毒 剂的寻找是当今世界面临的一个难题。此外，几乎所有的病毒性的发生，不仅取决于病毒， 还取决于人的个体因素。目前的研宄发现，机体自身疫应答在病毒性肝炎的发展机制中具 有非常重要的意义，乙型肝炎病毒对肝细胞伤主要是由免疫反应引起的，同时肝炎病毒感 染诱导的肝细胞凋亡或坏死都伴有片断化或是弥漫性降解的损伤现象，故除抗病毒外，促 进损伤肝细胞的修复以找针对性较强的免疫调节药物，也将是该类疾病治疗药物研宄的方 向之一。
[0005] 从中草药中研宄开发保肝药物是一极具前景的领域。国外已有成功的先例，如日 本从甘草中研制开发的甘草甜素类药物和欧洲所开发的水飞蓟素 ，己成为国际天然药物市 场上重要的保肝产品。目前我国临床上也有不少的天然药物制剂用于肝炎的治疗，但从临 床疗效、品种销量和附加值看，中草药制剂并不占优势。自1985年我国《新药审批方法》实 施以来，已批准的国家级中药新药约1000个，其中可用于肝炎治疗的中药新药约70个，并 且大部分抗肝炎中药新药为三类、四类，说明对于慢性肝炎等难治性疾病，中医中药有一定 的独特疗效，同时亦说明，抗肝炎新药开发存在低水平重复现象，由于中药药效物质基础以 及作用机理不明确，至今未有高效低毒的现代抗肝炎中药面世。
[0006] 唇形科香茶菜属含有多种活性物质，程培元等对我国已研宄的香茶菜属中的25 个品种的70多个新二萜类化合物作了综述，发现其中相当部分化合物具有细胞毒、抗肿瘤 和抗菌活性，并对香茶菜属植物中二萜类化合物抗肿瘤活性基因及构效关系作了探讨。在 药效学方面，文献报道了香茶菜甲素对四氯化碳肝损伤的保护，发其具有明显的护肝作用。 在临床上文献报道了香茶菜属植物三姐妹Rterifdia Haraa复方制剂治疗乙肝有明显疗 效。
[0007] 肝脏是产生细胞因子的主要器官，又是细胞因子的主要靶器官之一，细胞因子网 络的平衡失常是多种肝病，如慢性病毒性肝炎导致的肝细胞损伤、肝细胞纤维化的主要病 理机制。近年来研宄最为广泛的转录调控因子NF- K B是调节前炎性细胞因子、细胞表面受 体和粘附因子表达的最重要的转录调控因子。在肝脏的炎症损伤方面，NF-κ B通过调控前 炎性细胞因子（IL-6, TNF-α)、趋化因子和细胞粘附因子的转录直接参与肝脏的急性和慢 性炎症。
[0008] 近年来的研宄表明，肿瘤坏死因子-α (TNF-α )在肝脏炎症性损伤中起着非常重 要的作用。在ConA注射2后小时，TNF-α已为峰值，预先给予抗TNF-α血清，血清TNF-α 水平下降，并且完全保护了肝脏受损伤，鉴于巨噬细胞合成TNF- α的能力大于T淋巴细胞， 可以推测T淋巴细胞活化后刺激巨噬细胞释放TNF- α，可能在这一病理过程中发挥重要作 用。
[0009] 王赛子Rabdosia amethy Stoides(Benth)Hara系唇形科香茶菜属植物，我省主要 生长在宿州北部一带的山区，是野生药用植物。长期以来，当地群众有服用王枣子汤来治疗 疾病的传统，且流传着"是疮不是疮，三碗王枣子汤"的说法。民间用于治疗急性传染性肝 炎，具有抗菌、消炎和抗肿瘤作用等。王枣子含有很多化学成分，如王枣子提取物IG-I及 H-l、H-9,王枣子IG-I及甲素，王枣子乙素、二萜类、三萜类、总萜、黄酮及葡萄糖苷等，其中 总萜类成分对刀豆蛋白A(ConA)诱导的免疫肝损伤具有显著的保护作用。
[0010] 在病毒性肝炎的病理进程中，T淋巴细胞的活化导致的肝细胞免疫损伤是导致肝 功能损害的直接因素。多年来应用的实验性肝损害模型（如细菌脂多糖、D氨基半乳糖）所 介导的肝损害，多不能很好地反映此病理特点，不适用于有护肝作用的免疫调节剂或影响 免疫系统的护肝药的药效评价。自1992年Tiegs等成功应用刀豆蛋白A诱发了小鼠特异性 肝损伤，其致病特点与我们目前所知的人类病毒性肝炎的病理机制有许多的相似之处。一 般认为，肝内免疫反应是引起病毒性肝损伤的重要机制之一，例如乙型肝炎的发病过程中， 引起肝细胞损伤和破坏的直接因素是T细胞介导的细胞免疫反应。以免疫学机制诱发的肝 损伤模型的建立，为肝损伤的研宄开辟了新的途径，对研宄病毒性肝炎的防治具有重要意 义。因此，我们选用免疫性肝损伤模型开展王枣子总萜护肝作用的研宄。然而王枣子总萜 有效部位并不容易提取，这对王枣子总萜的应用起到了一定的阻碍，不利于王枣子总萜的 医药推广。
【发明内容】
[0011] 本发明公开了一种王枣子总萜有效部位、从中药王枣子中提取该王枣子总萜有效 部位的方法及该王枣子总萜有效部位在抗免疫肝损伤中的应用、具有该王枣子总萜有效部 位的药物组合物。本发明研宄了王枣子总萜护肝作用的初步分子作用机理，为把王枣子总 萜开发成防治肝损伤的药物提供理论依据。本发明对王枣子总萜类成分进行提取、分离与 纯化，并基于人类病毒性肝炎免疫紊乱的病理特点，建立小鼠免疫性肝损伤的模型，观察王 枣子总萜对免疫性肝损伤小鼠血清酶学和病理组织学的影响，王枣子总萜对免疫肝损伤关 键炎性介质TNF-α和IFN-Y蛋白水平的影响，以及对TNF-α上游信号分子核转录分子 NF-κ B的调控机制研宄，探讨免疫性肝损伤过程中，王枣子总萜护肝作用的初步分子作用 机理，为把王枣子总萜开发成防治肝损伤的药物提供理论依据。
[0012] 本发明是这样实现的，一种王枣子总萜有效部位，其含有齐墩果酸和熊果酸，按原 料重量百分比组成含有〇. 02%至0. 5%的齐墩果酸、0. 05%至1 %的熊果酸。按该王枣子总 萜有效部位的重量百分比，齐墩果酸含量占〇. 8%至8%，熊果酸含量占1. 0%至12%。
[0013] 本发明还提供一种从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其包括以下步骤：
[0014] (1)取干净的王枣子粉碎，加15至35倍重量、70%至95%的乙醇，50至80°C超 声提取40至lOOmin，提取液过滤，滤液用盐酸调pH值=1-3,对滤液加热回流水解20至 40min，向水解液里加入0. 5-1. 0倍体积的水充分混匀，再用等体积的三氯甲烷萃取若干 次，合并萃取液；
[0015] (2)将所得的王枣子萃取液减压浓缩，进行柱分离，以水及乙醇洗脱，收集相应流 份，冻干，即得上述王枣子总萜有效部位。
[0016] 作为上述方案的进一步改进，该分离柱为大孔树脂柱，该大孔树脂柱的大孔吸附 树脂为D101、AB-8、HPD100A、HPD400、HPD600、HPD750中的至少一种。优选地，吸附时间为 6至10小时后，以1至4BV/h流速进行洗脱，先用3至6BV的水洗柱除去水溶性杂质，再用 3至6BV40%至60%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，冻干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部 位。
[0017] 作为上述方案的进一步改进，该分离柱为聚酰胺柱，以水洗脱，提取液与填料的 重量比为1 : 25-40,洗脱1-3个柱体积后，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯度 多50 %王枣子总萜有效部位。
[0018] 作为上述方案的进一步改进，该分离柱为葡聚糖凝胶柱，该葡聚糖凝胶柱选自 G-10、G-25、G-50、LH-20。优选地，以水洗脱，提取液与填料的重量比为1 : 20-50,洗脱1-3 个柱体积后，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部。
[0019] 作为上述方案的进一步改进，该分离柱为反向C18,以水洗脱，提取液与填料的重 量比为1 : 10-20,洗脱2-4个柱体积后，开始收集流份收集相应的流份5-11个柱体积，冻 干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部位。
[0020] 作为上述方案的进一步改进，该分离柱为C8柱，以水洗脱，提取液与填料的重量 比为I : 20-50,洗脱1-3个柱体积后，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯度多50% 王枣子总萜有效部位。
[0021] 本发明还提供一种上述王枣子总萜有效部位在抗免疫肝损伤中的应用。特别是在 治疗病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝纤维化、肝硬化及肝癌等 的应用。
[0022] 本发明还提供一种治疗免疫肝损伤疾病的药物组合物，该药物组合物中包含一种 作为主要成分的上述王枣子总萜有效部位。
[0023] 本发明的有益效果如下：
[0024] (1)提供一种从中药材王枣子中提取的总萜类有效部位，以药物的主要成分生产 加工成为适宜的药物制剂作为治疗免疫肝损伤疾病，能改善肝脏状态，无副作用，经药效学 试验证明其疗效显著；
[0025] (2)本发明中的药物原料来源易得，易于产业化，可根据需要制成各种剂型，为临 床提供更加方便、更加有效、质量更加可控的现代中药，为患者带来更多的利益，从而产生 巨大的社会效益；
[0026] (3)本发明的药物所治疗的免疫肝损伤疾病主要包括：病毒性肝炎、自身免疫性 肝炎、肝坏死、脂肪肝、胆汁郁积、肝纤维化、肝硬化及肝癌等。
【专利附图】
【附图说明】
[0027] 图1为齐墩果酸和熊果酸对照品测定的色谱图。
[0028] 图2为王枣子提取液样品测定的齐墩果酸和熊果酸色谱图。
[0029] 图3齐墩果酸标准曲线图。
[0030] 图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F为王枣子总萜不同剂量对肝损伤的保护作用 的HE染色图：图4A正常对照组，图4B正常对照组+王枣子有效部位高剂量组，图4C模型 组，图4D王枣子有效部位低剂量组，图4E王枣子有效部位中剂量组，图4F王枣子有效部位 高剂量组。
【具体实施方式】
[0031] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
[0032] 王枣子总萜有效部位含有齐墩果酸和熊果酸，按原料重量百分比组成含有0. 02% 至0.5%的齐墩果酸、0.05%至1%的熊果酸。齐墩果酸和熊果酸的分子式分别如下：
[0033]
【权利要求】
1. 一种王枣子总萜有效部位，其特征在于：其含有齐墩果酸和熊果酸，按原料重量百 分比组成含有0. 02%至0. 5%的齐墩果酸、0. 05%至1 %的熊果酸。
2. -种王枣子总萜有效部位，其特征在于：其含有齐墩果酸和熊果酸，按该王枣子总 萜有效部位的重量百分比，齐墩果酸含量占〇. 8%至8%，熊果酸含量占1. 0%至12%。
3. -种从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，其包括以下步骤： (1) 取干净的王枣子粉碎，加15至35倍重量、70%至95%的乙醇，50至80°C超声提取 40至lOOmin，提取液过滤，滤液用盐酸调pH值=1-3,对滤液加热回流水解20至40min，向 水解液里加入〇. 5-1. 0倍体积的水充分混匀，再用等体积的三氯甲烷萃取若干次，合并萃 取液； (2) 将所得的王枣子萃取液减压浓缩，进行柱分离，以水及乙醇洗脱，收集相应流份，冻 干，即得如权利要求1或2所述的王枣子总萜有效部位。
4. 如权利要求3所述的从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，该分 离柱为大孔树脂柱，该大孔树脂柱的大孔吸附树脂为D101、AB-8、HPD100A、HPD400、HPD600、 HPD750中的至少一种，吸附时间为6至10小时后，以1至4BV/h流速进行洗脱，先用3至 6BV的水洗柱除去水溶性杂质，再用3至6BV40%至60%乙醇洗脱，合并乙醇洗脱液，冻干， 即得纯度多50%王枣子总萜有效部位。
5. 如权利要求3所述的从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，该分 离柱为聚酰胺柱，以水洗脱，提取液与填料的重量比为1 : 25-40,洗脱1-3个柱体积后，开 始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部位。
6. 如权利要求3所述的从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，该分 离柱为葡聚糖凝胶柱，该葡聚糖凝胶柱选自G-10、G-25、G-50、LH-20,以水洗脱，提取液与填 料的重量比为1 : 20-50,洗脱1-3个柱体积后，开始收集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯 度多50 %王枣子总萜有效部。
7. 如权利要求3所述的从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，该分 离柱为反向C18,以水洗脱，提取液与填料的重量比为1 : 10-20,洗脱2-4个柱体积后，开 始收集流份收集相应的流份5-11个柱体积，冻干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部位。
8. 如权利要求3所述的从中药王枣子中提取总萜有效部位的方法，其特征在于，该分 离柱为C8柱，以水洗脱，提取液与填料的重量比为1 : 20-50,洗脱1-3个柱体积后，开始收 集流份2-6个柱体积，冻干，即得纯度多50%王枣子总萜有效部位。
9. 一种如权利要求1或2所述的王枣子总萜有效部位在抗免疫肝损伤中的应用。
10. -种治疗免疫肝损伤疾病的药物组合物，其特征在于：该药物组合物中包含一种 作为主要成分的王枣子总萜有效部位，该王枣子总萜有效部位为如权利要求1或2所述的 王枣子总萜有效部位。
【文档编号】A61P37/02GK104435095SQ201410648925
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月14日 优先权日:2014年11月14日
【发明者】段红, 翟科峰, 王维维, 孙玉雪, 曹稳根, 高贵珍, 赵亮 申请人:宿州学院