二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法
【专利摘要】本发明属生物医药【技术领域】，具体涉及二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法。主要用于治疗由于临床上各种疾病引起的急性肺损伤，误服百草后引起的急性中毒后造成的肝损伤；从形态学特征证实二氯甲烷在体内转换成一氧化碳，而一氧化碳在肺疾病中具有抗炎等组织细胞保护效应；能够有效减轻肺组织的形态学损伤，减轻大鼠症状，提高其生存率，并改善生存质量；生化检测指标等证实，二氯甲烷是通过在体内代谢生成一氧化碳发挥其抗炎、抗损伤的细胞保护效应的。
【专利说明】二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法
【技术领域】
[0001] 本发明公开了二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法，属于生物医药领域。
【背景技术】
[0002] 在甲烷氯化物中，二氯甲烷（methylene chloride，MC)的毒性最低。其在肝内由 细胞色素P4502E1 (CYP 2E1)催化生成一氧化碳（carbon monoxide,CO)而导致碳氧血红蛋 白（CO-Hb)浓度升高，该代谢具有高亲和性和低容量的特性，即进入体内很容易代谢生成 CO和CO 2，且在低浓度时已达到饱和，即使增大剂量，其代谢产物CO也保持相对较低的浓度 不再增大，使血中CO-Hb浓度不致过高而引起严重组织缺氧。越来越多的研究提示CO在多 种在体动物肺疾病模型中都具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗缺血/再灌注损伤等组织细胞保 护效应。本研究通过观察MC对盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP)诱导 急性肺损伤（acute lung injury,Au)大鼠中性粒细胞在肺脏聚集、脂质过氧化损伤产物生 成、炎症细胞因子的影响，实验结果证明二氯甲烷对急性肺损伤具有明显的保护作用。给予 CO的途径主要有直接吸入、上调血红素加氧酶一 1表达、应用CO释放复合物及其他生成CO 的前体药物（如MC)等。MC主要由肝内CYP 2E1催化生成CO而导致CO-Hb浓度升高，该代 谢具有高亲和性和低容量的特性，即进入体内很容易代谢生成CO和C02,且在低浓度时已 达到饱和，即使增大剂量其代谢产物CO也保持相对较低的浓度不再增大，而使血中CO-Hb 浓度不致过高而引起严重组织缺氧。所以如果能以MC作为CO供体通过口服即能达到给予 目的，无疑会更方便，且不需要特殊的环境、特殊的设备，更不会对环境造成污染或影响医 护人员的健康。
【发明内容】
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[0003] 本发明公开了二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法，用于治疗急性肺损伤的 一种方法。
[0004] 本发明通过以下实验证明二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法：将40只SD 大鼠按随机数字表法分为SHAM组、CLP组、MC组和DSF+MC组4组，每组10只。IOh后右 侧颈总动脉放血处死。左肺行支气管肺泡灌洗，灌洗液进行白细胞计数，检测蛋白浓度和 TNF-α及IL-10水平；右肺下叶观察大鼠肺组织病理变化，其他肺叶匀浆后检测丙二醛和 髓过氧化物（myeloperoxidasedefieieney，MPO)。另取40只大鼠随机分组处理同上，手术 后分笼，观察其活动、刺激后反应；记录72h生存率。CLP组大鼠肺部炎症和损伤明显，MC 组肺泡壁无增厚，肺泡内炎症细胞浸润减少，肺组织内TNF-α降低，IL-10增高，丙二醛降 低，术后72h生存率显著增高。MC+DSF组肺泡壁增厚，肺泡内炎症细胞浸润增多；肺组织内 TNF-α增高，丙二醛升高，术后72h生存率显著增高。实验结果证明二氯甲烷对急性肺损伤 具有明显的保护作用。
[0005] 具体实施方法
[0006] 下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
[0007] 将40只健康成年雄性SD大鼠，体重为280g?3309,按随机数字表法分为SHAM组 (以橄榄油灌胃；2h后麻醉，仅打开腹腔，游离盲肠至腹腔外，即还纳关腹）；CLP组（以橄榄 油灌胃后；2h后麻醉施行CLP) ;MC组（橄榄油灌胃IOh后以MC灌胃液灌胃；2h后麻醉施行 CLP)和DSF+MC组（DSF灌胃液灌胃IOh后以MC灌胃液灌胃；2h后麻醉施行CLP)4组，灌胃 液容量为〇. 3ml，工具药的给予量分别为：DSF液取3. 4mmol/kg体重，MC液取6. 4 μ mol/kg 体重。每组10只动物。
[0008] 麻醉、固定后，消毒并切开腹部，打开腹腔，游离盲肠出腹腔，避免损伤肠系膜血 管；为避免引起肠梗阻，在距回盲瓣Icm的远端处结扎盲肠，在肠系膜对侧游离面以16号穿 刺针贯穿盲肠，针孔间距约3mm，以4号丝线贯穿留置瘘口内，轻挤盲肠使少量内容物溢出 瘘口；还纳盲肠回腹腔内，逐层缝合关闭腹腔。术后皮下注射生理盐2ml/100g^nl/100g体 重，分笼喂养，观察大鼠活动、刺激后的反应等一般情况。
[0009] 术后IOh采集标本。麻醉大鼠后，右侧颈总动脉穿刺置管，以5ml/min速度放血处 死大鼠。左肺进行灌洗，收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF)， 光镜下计数白细胞，ELISA检测TNF-α和IL-10浓度。右肺取下叶以4%甲醛固定，苏木素 伊红（HE)染色，光镜下观察病理变化；其余叶匀浆，邻连茴香胺法检测MPO活性，硫代巴比 妥酸法测定丙二醛含量。
[0010] 另取40只大鼠分组及实验方法同上，CLP术后分笼，自由食水，观察大鼠活动、刺 激后的反应等一般情况，并以12h为单位记录大鼠72h内生存率。生存率数据以百分率表 示，其余统计资料以均数土标准差（X 土 S)表示。
[0011] 1 一般情况与生存率观察：在CLP术后6h，动物蜷缩、嗜睡，活动度减少，不进食， 刺激后可见痛觉反应；其后毛发坚立，呼吸以腹式为主，渐趋窘迫；16h可见少量泡沫状分 泌物自鼻腔溢出。MC组24h生存率为90%，明显高于CLP组（P〈0. 01) ;DSF组生存率仅为 20%，显著低于MC组（P〈0. 01)。术后72h，MC组、CLP组和DSF组生存率分别为80%、0% 和0%。本实验条件下，CLP大鼠的死亡高发时段在第1个24h内，手术后24h仅10 %大鼠 存活，且呼吸窘迫。而MC组大鼠醒后的6h左右，呼吸以腹式为主，急促，口鼻有浆液性分泌 物，毛发坚起，活动度差；但之后症状逐渐减轻，在第1个24h内90%的大鼠存活，且其后并 未重新出现症状；手术后72hMC组生存率为80%，显著高于CLP组。在DSF+MC组，由于阻 断了 MC生成CO的代谢途径，症状加重，生存率显著下降。以上结果提示MC在体内代谢生 成的CO发挥了保护作用，减轻大鼠症状，提高其生存率，并改善生存质量。
[0012] 2肺组织形态学变化：400倍光镜下显示，SHAM组肺泡结构完整，肺泡间隔无增宽， 肺泡腔内见少量淋巴细胞和单核巨噬细胞;MC组肺泡结构完整，肺泡间隔稍增宽，可见炎 性细胞浸润；CLP组肺组织明显受损，可见肺泡间隔增宽，肺泡完整性被破坏，大量炎症细 胞浸润，肺泡内充满浆液性渗出液，大量红白细胞渗出；DSF+MC组肺组织明显受损，可见肺 泡间隔增宽，肺泡完整性被破坏，大量炎症细胞浸润，肺泡内充满浆液性渗出液，大量红白 细胞渗出。研究提示CO在动物肺疾病模型中具有抗炎等组织细胞保护效应。
[0013] 3BALF内炎症因子水平：与CLP组相比，MC组大鼠BALF中IL-10水平增高 (P〈0. 01) ;TNF_a水平降低（p〈0. 01);与MC组相比，DSF组大鼠BALF中IL-10水平较低 (P〈0. 01)，TNF-a水平较高（P〈〇. 05)，见表1。BALF内白细胞计数：SHAM组大鼠BALF中白 细胞计数很少；与CLP组比较，MC组大鼠BALF中白细胞计数降低（P〈0. 01);与MC组比较， DSF组大鼠BALF中白细胞计数增高（P〈0. 01)，见表1。CLP组大鼠肺部炎症明显，且处于进 展中，肺组织损伤较重；MC组大鼠肺部炎症局限，肺组织损伤不明显；DSF组大鼠肺部炎症 明显，肺组织损伤较重。而DSF为CYP2E1抑制剂，阻断MC在体内生成CO,提示MC是通过在 体内代谢生成CO发挥其抗炎、抗损伤的细胞保护效应的。
[0014] 4肺组织MPO和丙二醛含量检测：MC组大鼠肺组织内MPO活性与CLP组相比显著 减少（P〈0. 01) ;DSF组大鼠肺组织内MPO与MC组相比显著增高（P〈o. 05)，见表1。在CLP 组大鼠肺组织中MPO活力很高，提示其中大量中性粒细胞浸润，且丙二醛含量很高，提示大 量细胞受到损伤。而在MC组大鼠肺组织中MPO活力显著降低，丙二醛含量显著降低，提示 无大量中性粒细胞浸润组织，组织细胞未受到明显损伤；在DSF组大鼠肺组织中，MPO活力 很高，提示其中大量中性粒细胞浸润，且丙二醛含量很高，提示大量细胞受到损伤。这些与 病理切片所显示的一致，与BALF中白细胞计数也一致：在CLP组大鼠BALF中白细胞计数很 高，MC组显著降低，而与DSF组相比MC组则显著增高。在CLP组大鼠BALF中IL-10浓度偏 低，而促炎细胞因子TNF-a偏高，提示炎症明显，且可能进一步发展；在MC组大鼠BALF中， IL-10浓度显著升高，处于较高水平，TNF-α浓度相比CLP组明显降低，提示炎症较为局限； 在DSF组大鼠BALF中IL-10浓度偏低，而促炎细胞因子TNF-α偏高，提示炎症明显，且可 能进一步发展。MC组大鼠肺组织内丙二醛含量与CLP组相比减少（P〈0. 01) ;DSF组与MC组 相比增高（P〈〇. 05)，见表1。
[0015] 表1各组大鼠生化指标检测结果（X土 s，η = 10)
[0016]
【权利要求】
1. 二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法。
2. 根据权利要求1所述的二氯甲烷在急性肺损伤中的一种治疗方法，其特征在于：在 临床发现有急性肺损伤时应及时应用二氯甲烷；用量为lml/kg/d ;应用方法为口服，三次/ 天。
【文档编号】A61K31/02GK104434887SQ201410764768
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月12日 优先权日:2014年12月12日
【发明者】庞庆丰, 范红斌, 杜斌, 陈俊良 申请人:江南大学