用于控制中枢神经系统中肿瘤增殖的氙与NMDA受体拮抗剂的组合的制作方法

NMDA受体/通道是神经元细胞的质膜分子实体。这些受体是释放入突触和突触外间隙的谷氨酸分子的靶标，谷氨酸是提供从一个神经细胞到另一个神经细胞的沟通的兴奋性神经递质。

NMDA受体/通道也存在于神经胶质细胞上，神经胶质细胞是中枢神经系统的非神经元细胞(Lee等人，PloSOne，2010；Dzamba等人，Curr Neuropharmacol，2013)。

刺激星形细胞类型的神经胶质细胞上的NMDA受体促成轴突神经末梢控制谷氨酸释放和脑可塑性调节(Conti等人，Cereb.Cortex，1999)。

然而，这种功能在星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体肿瘤中受到破坏(Takano等人，Nat Med，2001；Rzeski等人，Biochem Pharmacol，2002)。实际上，已经观察到，这些受体的各种拮抗剂、特别是美金刚阻断NMDA谷氨酸受体通过需要这些细胞中钙流量减少的机制基本上减少了星形细胞类型和/或其前体的神经胶质肿瘤细胞增殖(Rzeski等人，Proc.Natl.Acad.Sc.USA，2001)。

然而，美金刚的作用受到限制，因为该分子并非没有副作用，例如意识错乱、头晕、睡意、头痛、失眠症、激动、幻觉、呕吐、焦虑等。

因此，问题在于提供一种治疗方法，其能够缓解中枢神经系统细胞、特别是星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的任何肿瘤细胞增殖或将其减少到最低限度，同时限制所用美金刚的剂量和因此与应用该化合物相关的不良反应，以便保护人类、即人类患者神经组织的完整性和功能。

本发明的技术方案涉及一种药物组合，其包含氙气体和液体或固体形式的至少一种NMDA受体拮抗剂，该药物组合用于治疗或缓解人类中枢神经系统、特别是神经胶质细胞、特别是星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体肿瘤增殖，特别是美金刚类或美金刚衍生的化合物、例如硝基美金刚的NMDA受体拮抗剂。

换句话说，本发明涉及包含氙气体的药物，其通过与液体或固体形式的至少一种NMDA受体拮抗剂组合吸入应用，用于治疗或缓解中枢神经系统细胞、特别是神经胶质细胞、优选星形细胞类型和/或其前体的肿瘤增殖。

实际上，在本发明的上下文中，已经证实氙和NMDA受体拮抗剂、例如美金刚或美金刚衍生的化合物、特别是硝基美金刚的组合使得这些化合物产生协同作用，且这类组合可以构成用于抗击中枢神经系统细胞、特别是星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体肿瘤增殖的富有希望的疗法。

这类组合特别地基于这些化合物的作用模式。

因此，氙通过其对NMDA受体的拮抗作用具有兴奋性谷氨酸能信号传导途径-抑制特性(Dinse等人，Br J Anaesth，2005)。

因此，氙/美金刚或氙/硝基美金刚组合导致谷氨酸能受体、特别是NMDA类水平上的协同作用，但没有增加美金刚不良反应的风险。

换句话说，氙通过协同作用增加美金刚或硝基美金刚的有益效果，但不会导致美金刚或硝基美金刚的不良反应。

如果适合，本发明的气态药物可以满足如下标准的一个或多个：

-NMDA受体拮抗剂是固体形式，特别是片剂或胶囊形式；

-NMDA受体拮抗剂是美金刚；

-NMDA受体拮抗剂是美金刚衍生的化合物，例如硝基美金刚；

-NMDA受体拮抗剂是硝基美金刚；

-所述肿瘤增殖涉及中枢神经系统细胞；

-所述肿瘤增殖涉及神经胶质细胞；

-所述肿瘤增殖涉及星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体；

-施用于患者的NMDA受体拮抗剂的每日剂量小于或等于20mg/天；

-将氙气体在施用NMDA受体拮抗剂之前、与之同时或在其施用之后、优选在施用NMDA受体拮抗剂之后施用于患者；

-氙包含在气体混合物中，该气体混合物还包含氧，优选至少21％体积的氧；

-所述气体混合物由氙和氧组成；

-所述气体混合物由氙、氮和氧组成；

-所述患者是人类；

-待治疗的患者是男性或女性；

-氙为有效量；

-氙的量为非麻醉量，即亚麻醉量；

-它包含10％-80％体积的氙；

-它包含15％-80％体积的氙；

-它包含至少20％体积的氙；

-它包含低于60％体积的氙；

-它包含75％体积的氙；

-它包含20％-50％体积的氙；

-它包含20％-40％体积的氙；

-将氙在被患者吸入之前或吸入时与氧混合，或氙为“随时可用的”作为与氧的预混合物的气体混合物形式且任选地包含另一种气体化合物，例如氮；

-将包含氙的气体通过吸入施用于患者；

-将包含氙的气体每日一次或多次施用于患者；

-将包含氙的气体通过几分钟至几小时、典型地15分钟至6小时、优选少于4小时的吸入时间施用于患者；

-施用期限、剂量方案和频率取决于在考量下患者神经学病情的进展，且它们优先由临床医师或护理人员、视考量下患者的神经学病情的不同设定；

-将氙包装在贮气筒中，该贮气筒具有至多50升的体积(水当量)，典型地约0.5-15升；和/或小于或等于350巴绝对值的压力，典型地约2-300巴的压力；

-将氙包装在安装有整合的阀门或压力调节器的气体瓶中，从而能够控制流速并任选地控制递送气体压力；

-将氙气体包装在由钢、铝或复合材料制成的贮气筒中；

-在治疗过程中，通过经面罩或鼻罩或护鼻镜或经任意其它用于施用于可吸入气体的系统通过吸入将氙气体施用于患者。

根据另一个方面，本发明还涉及用于治疗或缓解人体患者的中枢神经系统细胞、特别是神经胶质细胞、优选星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的肿瘤增殖的治疗方法，在该方法中：

i)鉴定患有中枢神经系统细胞、特别是星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的肿瘤增殖的人类患者；

ii)通过吸入将包含氙的气态药物施用于所述患者；和

iii)将至少一种液体或固体形式的NMDA受体拮抗剂施用于所述患者，

以便能够抑制或缓解所述患者的肿瘤增殖。

优选地，在步骤i)中：

-所述人类患者是男性或女性的儿童；

-由临床医师等鉴定所述患者；

-根据成像、生物学试验、活组织检查等鉴定增殖；

-特别是在星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的水平上观察到中枢神经系统细胞的肿瘤增殖；

-所述中枢神经系统细胞的肿瘤增殖因Ca²⁺离子过量进入星形细胞类型细胞导致。

优选地，在步骤ii)中：

-将至少一种固体形式的NMDA受体拮抗剂施用于所述患者；

-优选通过经肠道、即通过口服施用至少一种NMDA受体拮抗剂；

-将片剂或胶囊形式的至少一种NMDA受体拮抗剂施用于所述患者；

-将美金刚或美金刚衍生物或化合物作为NMDA受体拮抗剂施用于所述患者；

-将美金刚或硝基美金刚作为NMDA受体拮抗剂施用于所述患者；

-将低于或等于20mg/天的每日剂量的NMDA受体拮抗剂施用于所述患者；

-在所述患者吸入氙之前、同时或在其之后将至少一种NMDA受体拮抗剂施用于所述患者。

优选地，在步骤iii)中：

-在考量下，根据患者的神经学病症的进展选择氙和/或设定期限、剂量方案和施用频率；

-施用有效量的氙；

-施用非麻醉量的氙；

-施用10％-75％体积的氙、优选20％-50％体积的氙；

-在由患者吸入之前或同时将氙与氧混合，优选与至少21％体积的氧混合；

-施用由氙和氧(二元混合物)或氙、氧和氮(三元混合物)组成的随时可用的气体混合物；

-将氙气体每日一次或多次施用于患者；

-将氙气体施用于患者，吸入时间为几分钟至几小时，典型地15分钟-6小时，优选少于4小时；

-通过面罩或鼻罩或护鼻镜或通过任意其它用于将气体施用于患者的系统或装置施用氙气体。

通过下列实施例并且参照附图可以更清楚地理解本发明，但是给出它们仅作为示例，而不起限定作用，其中：

-图1示例氙和NMDA受体拮抗剂的组合在模拟星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的细胞增殖的细胞模型中的效能；

-图2示例氙和NMDA受体拮抗剂的组合在神经元-胶质混合的培养物细胞模型中的效能。

实施例1

为了证实本发明氙和NMDA受体拮抗剂组合的效能，设置富含星形细胞类型细胞的培养物细胞模型，在该模型中，在特别地包含在用于补充培养基的胎牛血清(FCS)中的有丝分裂原的存在下扩增和维持增殖。

设置的技术如下所述且得到的结果报告在表1和图1中。

这些结果显示氙和美金刚在模拟星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体增殖的细胞模型中的协同抗增殖作用。

用于得到星形细胞初级培养物的方案

由取自妊娠15.5天的妊娠雌性Wistar大鼠的胚胎的完整脑制备培养物。

用于生产富含星形细胞(对于神经胶质原纤维酸性蛋白质或GFAP为免疫阳性的细胞)培养物的方法包含通过机械解离即非酶解离、使用Leibovitz L15培养基(Sigma Aldrich)得到完整胚胎前脑的均匀的细胞混悬液。

将相当于来自5个胚胎的脑组织的细胞混悬液的等分部分加入到各自包含5ml进料培养基的25cm²烧瓶(Costar)中，从而能够刺激星形细胞及其前体增殖(Sergent-Tanguy等人，J Neurosci Res，2006)，同时除去神经元细胞；在无包被的存在下神经元不会粘附烧瓶底部，这不同于星形细胞。所用的培养基是最低基础培养基(MEM)，其包含10％胎牛血清(FCS，Biowest)和10％马血清(HS，Sigma Aldrich)、1g/l葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和青霉素/链霉素混合物。当达到汇合时(即在7-10天培养后)，将粘附细胞(＞90％的星形细胞)放入PBS，然后通过轻打烧瓶分离。离心回收的细胞并且以机械方式研磨，然后放入培养物。然后将星形细胞在48-孔多孔板(Nunc)中培养。每个培养孔施加约30000个细胞。在与上述相同的培养基、但降至2％的补充血清的存在下放入细胞。

在培养期的自始至终不改变培养基。

培养物的药理学处理

通过培养基中存在FCS触发和维持增殖。

恰好在暴露于氙之前将NMDA受体阻滞剂美金刚(RD Systems)加入到培养物中。与美金刚同时加入用作参比抗增殖分子的cAMP的亲脂性形式二丁酰基环AMP(dbcAMP)(Mourlevat等人，Mol Pharmacol，2003)。

在受控气态气氛中的培养物维持

一旦进行药理学处理，则将培养物中包含细胞的多孔平皿板和用于加湿室内部隔室的板置于容纳树脂玻璃室的金属基板上。通过旋紧彼此连接两个部分(基板和树脂玻璃室)。

然后将包含(％体积)：20％O₂、5％CO₂和75％测试气体的关注的气体混合物注入带有进阀和排出阀的温育室，同时通过流量计控制排出流速。测试气体为氮和氙。

根据所用的混合物密度校正以10升/min为空气设定的参比排出流速。

当CO₂测量值在排出阀达到5％时，停止注射气体混合物，并且通过关闭进阀和排出阀使所述室完全气密。

然后在本实验方案的自始至终在37℃将暴露室放入包封物。

根据氚化胸腺嘧啶核苷蓄积测定细胞增殖

在通过打开进阀和排出阀并且将温育室从其基底部旋开打破密封后，在包含5mM葡萄糖的PBS的存在下放入培养物，并且与氚化胸腺嘧啶核苷(Perkin，70-90Ci/mmol；0.5μCi/孔)一起温育2h，以便根据Rousseau和同事所述的方法(Mol Pharmacol，2013)分析细胞增殖。

在FCS的存在下细胞增殖模型中得到的结果揭示出氙与美金刚的协同抑制作用，将其总结在下表1中并且呈现在图1中。

表1：对富含星形细胞的培养物的体外研究的主要结果的总结

在上表中，用“+”、“++”、“+++”或“++++”(++++＝无增殖存在)标志表示在关注的治疗的存在下与抑制星形细胞类型的神经胶质细胞增殖同义的有利响应。相反，用“-”标志表示无响应，与在细胞增殖方面无效能同义。

美金刚通过阻断NMDA受体起作用，且氙通过阻断这些相同的受体、但可能是通过不同的机制起作用，牵涉阻断一种氨基酸甘氨酸结合位点，甘氨酸即作为所述受体的共激活剂起作用。

FCS诱导并且维持细胞增殖过程，这归因于促有丝分裂因子的高含量。

根据图1中示例的结果，注意到，氙和NMDA受体拮抗剂、即在这种情况中是美金刚的组合产生大于通过每种治疗方法各自产生的协同抗增殖作用。实际上，在增殖机制方面建立了氙/美金刚组合的实际协同作用。

首先，这些试验显示在血清有丝分裂原的存在下增殖在包含75vol％氮的气氛中得以维持。这种增殖可以用cAMP亲脂性类似物二丁酰基-cAMP显著地减少。

当氙替代氮时，未观察到显著的抗增殖作用。

美金刚在富含氮的气氛中直到10μM也没有抗增殖作用。然而，用10μM美金刚在富含氙的气氛中处理产生显著的抗增殖作用(-42.5％)。

美金刚在30μM时本身在富含氮的气氛中发挥抗增殖作用(-39.3％)，且这种作用在富含氙的气氛中得到显著增强(-75.2％)。

图1中图示的结果示例氙和美金刚在模拟星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体增殖的细胞模型中的协同保护作用。

这些结果使用富含得自大鼠脑的星形细胞类型的神经胶质细胞得到。一旦将它们放入培养物并且在体外在包含75％氮(N₂ 75)或75％氙(Xe 75)的气氛中在1、3、10或30μM测试的美金刚(MEM)存在下或无它们存在下或在cAMP的可溶性类似物二丁酰基-cAMP(用作参比抗增殖分子)的存在下达到D3，则维持这些培养物。

在处理结束时，回收培养物用于使用氚化胸腺嘧啶核苷掺入作为评价指数进行细胞增殖测定。

将结果表示为在75％氮气氛中(对照条件)维持的培养物的平均值的％(±SEM，n＝6)。

因此，通过单向方差分析(ANOVA)、然后通过用于多重配对比较(对于每个实验点，n＝6)的Student-Newman-Keuls方法检验进行的统计学研究证实：

-在包含75％氮的气氛中，在30μM美金刚或1mM dbcAMP的存在下，星形细胞增殖减少(#与维持在75％氮气氛中的对照培养物相比p＜0.05)；

-在包含75％氙的气氛中，星形细胞增殖从早至10μM美金刚与1mM dbcAMP就减少(#与维持在75％氮气氛中的对照培养物相比p＜0.05)；

-在富含氙的气氛中美金刚的抗增殖潜能被揭示出来或增加(§与暴露于75％氮气氛中的相同浓度的美金刚的培养物相比p＜0.05)。

因此，氙在与作为NMDA受体拮抗剂起作用的美金刚或硝基美金刚组合时在星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的中枢神经系统肿瘤增殖的治疗或缓解过程中产生了协同作用。

实施例2

为了证实本发明氙和NMDA受体拮抗剂的组合的协同作用是真实的，建立了另一种神经元-神经胶质混合的培养细胞模型，在该模型中，在神经元细胞的存在下观察到星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体增殖(Rousseau等人，Mol Pharmacol，2013)。

所用的技术如下所述且将得到的结果概括在表中并且示例在图2中，该图显示氙和美金刚在神经元细胞的存在下在模拟星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体增殖的细胞模型中的协同抑制作用。

用于得到神经元-胶质混合的培养物的方案

由取自妊娠15.5天的妊娠雌性Wistar大鼠的大鼠胚胎的中脑制备培养物。

中脑培养物的应用包含通过机械解离即非酶解离、使用Leibovitz L15培养基(Sigma Aldrich)得到均匀的细胞混悬液。

将该混悬液的等分部分加入到Nunc 48孔多孔板中，其已经被聚乙烯亚胺的薄层包被(1mg/ml，硼酸盐缓冲液，pH 8.3)，以便能够粘附神经元细胞(参阅Toulorge等人，Faseb J，2011)。

接种密度约为80000-100000细胞/培养孔。

将中脑培养物维持在MEM培养基中，其包含1g/l葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、非必需氨基酸和青霉素/链霉素混合物。在培养的第一周期间，该培养基还包含10％胎牛血清(FCS，Biowest)和10％马血清(HS，Sigma Aldrich)，但从第二周开始，降低两种血清的浓度(Gao等人，J Neurosci，2002)。

直到评价所关注的气体的作用时，将培养物放入恒温控制在37℃的常规的包封物，其中将CO₂维持在5％体积，且其中用水饱和气氛。

一旦将细胞放入培养物，则发生神经胶质增殖过程。在体外第二周期间分析，此时血清补充降至2％或在一些情况中降至0.1％。

培养物的药理学处理

在D7FCS和HS浓度降低后，将NMDA受体阻滞剂美金刚加入到培养物中，然后将它们置于受控的气氛中。

在受控气态气氛中培养物的维持

一旦进行药理学处理，则将培养物中包含细胞的多孔板和用于加湿室内部隔室的板置于容纳树脂玻璃室的金属基板上。通过旋紧彼此连接两个部分(基板和树脂玻璃室)。

然后将包含(％体积)：20％O₂、5％CO₂和75％测试气体的关注的气体混合物注入带有进阀和排出阀的温育室，同时通过流量计控制排出流速。测试气体为氮和氙。

根据所用的混合物密度校正以10升/min为空气设定的参比排出流速。

当CO₂测量值在排出阀达到5％时，停止注射气体混合物，并且通过关闭进阀和排出阀使所述室完全气密。

然后在本实验方案的7天时在37℃将暴露室放入包封物。

通过胸腺嘧啶核苷掺入的细胞增殖测量

在D14时，在通过打开进阀和排出阀并且将温育室从其基底部旋开打破密封后，根据实施例1中所述的方案，使用Rousseau和同事所述的技术(Mol.Pharmacol.，2013)作为基础使培养物进行氚化胸腺嘧啶核苷增殖试验。

星形细胞增殖模型中得到的结果揭示出氙与美金刚的协同抑制作用，将其总结在下表2中并且呈现在图2中。

还注意到，降低两种血清浓度至0.1％强烈地减少了星形细胞增殖，由此证实血清有丝分裂原在增殖过程中的关键作用。

表2：神经元-神经胶质混合的培养物模型中的体外研究的主要结果的总结

根据图2中呈现的结果，注意到，氙和NMDA受体拮抗剂、即在此情况中为美金刚的组合在星形细胞增殖方面产生协同抑制作用。用在氮气气氛中施加或维持培养物在富含氙的气氛中的美金刚处理培养物对增殖没有影响。培养基血清浓度的降低还导致星形细胞增殖减少，因此，证实美金刚/氙组合对通过血清有丝分裂原活化的机制具有活性。

实际上，建立了氙/美金刚组合的实际协同作用。

图2中所述的结果证实氙和美金刚在模拟星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体增殖的神经元-神经胶质混合培养细胞模型中的协同抑制作用。

使用大鼠中脑培养物得到这些结果，所述大鼠中脑培养物在培养第7天开始被放入在包含75％氮(N₂75)或75％氙(Xe 75)的气氛中、在10μM测试下的美金刚(MEM)存在或不存在下的培养基中，该培养基中补充了2％FCS和HS。还通过降低2类血清浓度至0.1％、同时维持细胞在富含氮或富含氙的气氛中进行一些实验。

然后回收培养物，用于使用氚化胸腺嘧啶核苷的细胞增殖测定。

将结果表示为在氮气气氛中维持D14时(对照条件)的培养物的％(±SEM)。

因此，通过ANOVA(ANalysis Of VAriance)、随后通过费歇尔检验(对于每个实验点，n＝13-15)进行的统计学研究证实：

-在包含75％氮的气氛中，如果血清浓度从2％降至0.1％，则仅星形细胞增殖减少(#与维持在75％氮气氛中的对照培养物相比p＜0.05)；

-在包含75％氙的气氛中，如果血清浓度降至0.1％或如果用美金刚处理培养物，则星形细胞增殖减少(#与维持在75％氮气氛中的对照培养物相比p＜0.05)；

-氙显示出与美金刚治疗的抗增殖作用或通过降低血清浓度改善产生的那些(§与暴露于75％氮气氛中的相同处理的相应培养物相比p＜0.05)。

因此，氙在与NMDA受体拮抗剂、例如作为NMDA受体拮抗剂起作用的美金刚或硝基美金刚联用时，在星形细胞类型的神经胶质细胞和/或其前体的中枢神经系统肿瘤增殖的治疗或缓解过程中产生协同作用。

换句话说，根据本发明，氙气体可以用于生产可吸入的药物，其在与至少一种液体或固体形式的NMDA受体拮抗剂联用时能够治疗或缓解人类的中枢神经系统中的肿瘤细胞增殖。