本发明涉及生物医药材料技术领域，具体来说，本发明公开了一种新型巯基纳米粒子的制备方法。
背景技术：
载药纳米粒子在黏膜给药体系中表现出独特的纳米效应，不但可以提高药物的靶向性，改变药物的动力学，而且通过延长在黏膜内的滞留时间还可改变膜转运机制，增加药物对膜的通透性，有效地克服了酶等生物屏障，是很有发展前景的优良给药途径，尤其是作为生物大分子药物的给药途径，可有效地解决生物大分子在体内易失活及半衰期短等问题。目前纳米药物的黏膜吸收研究仅限于少数纳米粒子的体系，远没有达到预期的目标。为了实现这一目标，选择具有黏附性的纳米粒子是极为重要的，因为纳米粒子通过黏膜黏附可以实现释药体系在特定部位的定位释放。研究结果表明，黏附性聚合物与被吸附组织的紧密接触可以提高大分子药物如蛋白质类和多肽类药物的透过性。
瓜尔胶是一种可降解的生物相容性材料，瓜尔胶分子通常以卷曲的球形结构存在，主链甘露糖在里，其大量羟基基本被包裹在分子内部，又由于分子内氢键作用，使得其水溶性大大降低，不能快速溶胀和水合。瓜尔胶能与黏膜蛋白形成氢键，具有良好的生物黏附性能，但这种基于非共价键的黏附作用并不能有效地克服体内的清除机制而保证药物在指定部位的持续释放。
技术实现要素：
本发明针对上述存在的问题，提供了一种可以提高药物的黏膜吸收的新型巯基纳米粒子的制备方法。
本发明是这样实现的：
一种基于瓜尔胶/半胱氨酸偶合物的新型巯基纳米粒子的制备方法，所述步骤如下：
步骤(a)：将0.5-2g的瓜尔胶溶于100～200mL水中，调节pH值至5-6将瓜尔胶溶解，加入氧化剂，室温搅拌2h，然后加入100-250μL的乙二醇，室温搅拌1h，透析三天，每天换水三次，冷冻干燥，在4℃下保存，得到醛基化的瓜尔胶；
步骤(b)：将0.1-0.3g的吗啉乙磺酸与醛基化的瓜尔胶在30-50mL蒸馏水中混合均匀，加入0.25-1.0g的的半胱氨酸，调节pH＝5，最后用蒸馏水调整为50ml，3h室温孵化，加入2-6g的NaCNBH3，室温反应24-72小时，然后在10℃黑暗环境下透析6次，最后冷冻干燥得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，在4℃下保存。
可选的，所述步骤(a)中加入的氧化剂为高碘酸钠或者双氧水或者次氯酸钠或者高碘酸钾。
优选的，所述步骤(a)中加入的氧化剂为0.8-2g的高碘酸钠。
优选的，所述步骤(a)中采用盐酸或者10％～20％硫酸调节pH值至5-6将瓜尔胶溶解。
优选的，步骤(a)所采用的瓜尔胶为透明型瓜尔胶，分子量在160～180万。
优选的，步骤(b)中采用盐酸调节混合液的pH＝5。
优选的，在步骤(b)中，在10℃黑暗环境下透析6次，第一次用蒸馏水透析，第二次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，第三次和第四次用1％的NaCl溶液透析，最后2次用0.2mmol/L的HCl溶液透析。
本发明方法制备的基于瓜尔胶/半胱氨酸偶合物(GG-Cys)的新型巯基纳米粒子，是一种可用于保护或治疗胃肠道中的病损的长效医学产品。该纳米粒子在该病损位点和其附近施用后，粘合到该胃肠组织并且能在该病损位点和其附近保留足以容许该病损愈合或被治疗的时间。该产品是由瓜尔胶经过两步改性后获得，粒径在800nm左右，用该产品载药后其包封率为96.7％，载药量达8.79％，具有良好的水溶性和生物降解性。本发明选用的原料来源广泛，安全，产品具有一定功能性，无有害残留，具有很好的应用前景。
附图说明
图1：为实施例1中半胱氨酸(Cys)、瓜尔胶与半胱氨酸共轭(GG-Cys)的HNMR图；
图2：为实施例1中半胱氨酸(a)，瓜尔胶(b)，醛基化瓜尔胶(c)以及醛基化瓜尔胶与半胱氨酸(d)共轭红外谱图；
图3：为实施例1中大黄素载药前后的红外谱图：大黄素(a)，载大黄素后(b)；
图4：为实施例1中大黄素与载体的紫外谱图：载体(a)，大黄素(b)；
图5：图为浓度10～80μg/mL的大黄素在459nm处的标准曲线图；
图6：为实施例1中分别为大黄素在35％乙醇释放介质累积释放图：大黄素在水溶液体外释放图(a)，以大黄素的丙二醇(PDO)溶液为参照，同样方法进行体外释放图(b)。
具体实施案例
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
以瓜尔胶为原料(透明型瓜尔胶，分子量在160～180万)，制备巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，其具体步骤如下：
步骤(a)：将0.5g的瓜尔胶溶于100mL水中，加入1mL0.4mol/L盐酸溶液使其溶解，加入0.8g的高碘酸钠，室温搅拌2h，加入100μL的乙二醇，室温搅拌1h，透析3天，每天换水3次，冷冻干燥，在4℃下保存；
步骤(b)：将0.1g吗啉乙磺酸与醛基化的瓜尔胶在30mL蒸馏水混合均匀，加入0.25g的半胱氨酸，用0.4mol/L盐酸溶液调节pH＝5，最后用蒸馏水调整为50ml，3h室温孵化，加入2g的NaCNBH3，室温反应24小时，然后在10℃黑暗环境下透析6次，第一次用蒸馏水透析，第二次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，第三次和第四次用1％的NaCl溶液透析，最后2次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，冷冻干燥得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，在4℃下保存。
以大黄素为药物，得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米大黄素靶向药物载体：
将20mg巯基化后的瓜尔胶纳米粒子分散于2mL去离子水中，加入溶有0.4mg大黄素药物的2mL乙醇溶液，将两溶液混合后，以40kHZ超声处理30min，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，离心条件为9500rpm转速离心10min，最后对负载了药物的巯基化瓜尔胶纳米粒子进行冷冻，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。
实施例2
以瓜尔胶为原料(透明型瓜尔胶，分子量在160～180万)，制备巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，其具体步骤如下：
步骤(a)：将1g的瓜尔胶溶于140mL水中，加入2mL，0.4mol/LHCl使其溶解，加入1.5g的高碘酸钠溶液，室温搅拌2h，加入150μL的乙二醇，室温搅拌1h，透析3天，每天换水3次，冷冻干燥，在4℃下保存；
步骤(b)：将0.2g吗啉乙磺酸与醛基化的瓜尔胶在40mL蒸馏水混合均匀，加入0.5g的半胱氨酸，用0.4mol/LHCl调节pH＝5，最后用蒸馏水调整为50ml。3h室温孵化，加入2g的NaCNBH3，室温反应36小时，然后在10℃黑暗环境下透析6次，第一次用蒸馏水透析，第二次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，第三次和第四次用1％的NaCl溶液透析，最后2次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，冷冻干燥得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，在4℃下保存。
以大黄素为药物，得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米大黄素靶向药物载体：
将20mg巯基化后的瓜尔胶纳米粒子分散于2mL去离子水中，加入溶有0.4mg大黄素药物的1mL乙醇溶液，将两溶液混合后，以40kHZ超声处理30min，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，离心条件为9500rpm转速离心10min，最后对负载了药物的巯基化瓜尔胶纳米粒子进行冷冻，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。
实施例3
以瓜尔胶为原料(透明型瓜尔胶，分子量在160～180万)，制备巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，其具体步骤如下：
步骤(a)：将1.5g的瓜尔胶溶于140mL水中，加入0.5ml质量百分比为20％的硫酸溶液使其溶解，加入2g的高碘酸钠溶液，室温搅拌2h，加入200μL的乙二醇，室温搅拌1h，透析3天，每天换水3次，冷冻干燥，在4℃下保存；
步骤(b)：将0.3g吗啉乙磺酸与醛基化的瓜尔胶在40mL蒸馏水混合均匀，加入0.5g的半胱氨酸，用0.4mol/LHCl调节pH＝5，最后用蒸馏水调整为50ml。3h室温孵化，加入4g的NaCNBH3，室温反应48小时。然后在10℃黑暗环境下透析6次，第一次用蒸馏水透析，第二次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，第三次和第四次用1％的NaCl溶液透析，最后2次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，冷冻干燥得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，在4℃下保存。
以大黄素为药物，得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米大黄素靶向药物载体：
10mg巯基化后的瓜尔胶纳米粒子分散于2mL去离子水中，加入溶有0.4mg大黄素药物的2mL乙醇溶液，将两溶液混合后，以40kHZ超声处理30min，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，离心条件为9500rpm转速离心10min，最后对负载了药物的巯基化瓜尔胶纳米粒子进行冷冻，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。
实施例4
以瓜尔胶为原料(透明型瓜尔胶，分子量在160～180万)，制备巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，其具体步骤如下：
步骤(a)：将2g的瓜尔胶溶于200mL水中，加入1mL质量百分比为10％硫酸溶液使其溶解，加入2g的高碘酸钠溶液，室温搅拌2h，加入250μL的乙二醇，室温搅拌1h，透析3天，每天换水3次，冷冻干燥，在4℃下保存；
步骤(b)：将0.2g吗啉乙磺酸与醛基化的瓜尔胶在50mL蒸馏水混合均匀，加入1g的半胱氨酸，用0.4mol/LHCl调节pH＝5，最后用蒸馏水调整为50ml。3h室温孵化，加入6g的NaCNBH3，室温反应72小时。然后在10℃黑暗环境下透析6次，第一次用蒸馏水透析，第二次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，第三次和第四次用1％的NaCl溶液透析，最后2次用0.2mmol/L的HCl溶液透析，冷冻干燥得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米粒子，在4℃下保存。
以大黄素为药物，得到巯基化的瓜尔胶/半胱氨酸纳米大黄素靶向药物载体：
将20mg巯基化后的瓜尔胶纳米粒子分散于2mL去离子水中，加入溶有0.4mg大黄素药物的2mL乙醇溶液，将两溶液混合后，以40kHZ超声处理30min，然后进行磁力搅拌处理，将搅拌后的混合液进行离心处理，离心条件为9500rpm转速离心10min，最后对负载了药物的巯基化瓜尔胶纳米粒子进行冷冻，得到最终负载药物的纳米靶向缓控释系统。
对实施例1进行体外释放实验，大黄素为水难溶性药物，为满足漏槽条件，需在介质中加入有机溶剂，虽然加入有机溶剂与人体生理环境不符，但可通过比对游离药物和载药聚合物胶束的体外释放情况，为体内试验研究提供参考。选择35％乙醇为释放介质，将负载大黄素纳米粒子溶液1mL装入透析袋中，置于装有释放介质15mL的锥形瓶中，采用恒温(37℃)振荡法，分别在1，3，4，5，16，19，24，32h取出释放介质，同时补充等量等温的新鲜释放介质。以大黄素的丙二醇溶液为参照，按同样方法进行体外释放考察。采用紫外线测定，在波长为459nm下检测释放介质中药物含量，计算累积释放度，绘制释放曲线,结果如图6所示，表明大黄素原料药在32h内基本释放完全，达82.50％(a)；而Ed-PDO在32h内仅释放30％左右，呈现明显的缓释作用(b)。实验结果表明：实验案例1得到的负载大黄素后的巯基化瓜尔胶纳米粒子具有向缓控释作用且有较好的水溶性，载药率达96.7％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。