本发明涉及医用配制品，尤其是眼科外用抗细菌感染的药物。
背景技术：
：多种细菌均能侵袭人体眼部表面，造成眼部细菌感染，最常见的是细菌性结膜炎和细菌性角膜炎。此类患者若没有接受及时而有效的治疗或治疗方法不当，可导致眼结膜严重损伤、角膜溃疡穿孔，使视力下降甚至失明。临床研究发现，喹诺酮类药物是治疗这两种眼部疾病较为有效的药物。盐酸左氧氟沙星是第三代喹诺酮类抗生素，它可穿透细胞膜进入细菌体内，破坏细菌DNA旋转酶的活性，使其DNA的转录复制无法进行，进而导致细菌的细胞本体凋亡。此外，盐酸左氧氟沙星的抗菌谱较广，涵盖了大部分的革兰阳性菌、革兰阴性菌及丙酸杆菌等易诱发眼部感染性疾病的厌氧菌属。因此，目前临床常用盐酸左氧氟沙星滴眼液治疗敏感细菌引起的细菌性结膜炎、细菌性角膜炎。然而，目前临床使用的不含增稠剂的盐酸左氧氟沙星滴眼液不能在眼内长时间停留，需要多次滴眼才能维持有效治疗浓度；传统左氧氟沙星滴眼液/盐酸左氧氟沙星滴眼液/乳酸左氧氟沙星滴眼液等滴眼液均采用苯扎氯铵(BAC)作为防腐剂，防腐剂能抑制滴眼液储存和使用过程的细菌污染，但是对于需要长期使用滴眼剂的患者，滴眼液中的防腐剂可破坏角膜上皮脂质层，改变细胞的通透性，导致更多的活性化合物透过。防腐剂还会引起如结膜充血、流泪、畏光、灼烧或刺痛感等过敏反应，防腐剂不仅损害眼表分泌黏液的细胞，导致泪腺功能退化，甚至会损害眼睛导致盲目。因此，开发一种能在眼内长时间停留，靠自身抑菌能力就能防止储存、运输和使用过程的细菌污染的治疗敏感细菌引起的细菌性结膜炎、细菌性角膜炎的药物成为亟待解决的事情。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种局部作用效果好、生物利用度高、性质稳定、毒副作用较小、药物主要在局部起作用的治疗敏感细菌引起的细菌性结膜炎、细菌性角膜炎的药物制剂。本发明是这样实现的：一种盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液，是以盐酸左氧氟沙星为药效原料，配以玻璃酸钠起增稠剂作用，再配以眼局部可以接受的药剂学上所说的金属离子络合剂、渗透压调节剂和pH调节剂，所制备成的眼用制剂，每100重量份成品制剂中盐酸左氧氟沙星的含量为0.30～1.00重量份；每100重量份成品制剂中玻璃酸钠的含量为0.1～1.00重量份；玻璃酸钠的最佳用量为，每100重量份成品制剂中玻璃酸钠的含量为0.488％重量份。所述金属离子络合剂为依地酸二钠、葡萄糖酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、氨基三乙酸中任何一种或所述品种的任意组合。金属离子络合剂的用量以与盐酸左氧氟沙星的重量比表示为，盐酸左氧氟沙星∶金属离子络合剂＝1∶0.01～0.50。所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、葡萄糖、硼酸、硼砂、甘油、甘露醇中的任何一种或所述品种的任意组合，调节滴眼液的渗透压摩尔浓度为280～330mOsmol/kg。所述pH调节剂为氢氧化钠、盐酸、枸橼酸钠、枸橼酸、硼酸、硼砂中的任何一种或所述品种的任意组合，调节成品药剂的pH值为5.0～7.0。按本发明方法制备的不含防腐剂的盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液，利用盐酸左氧氟沙星自身的广泛的抗菌杀菌能力，除了能治疗敏感细菌引起的细菌性结膜炎、细菌性角膜炎之外，还能防止储存、运输和使用过程中微生物的污染，降低长期使用含防腐剂滴眼液对眼表的损害风险，提高生物安全性。配方中增稠剂玻璃酸钠是一种存在于眼部和身体其他一些位置的天然物质。玻璃酸钠的特性是可以在眼睛表面形成一种规则、稳定、长效的水分膜，不易被洗去，而且不会引起视力模糊并可长时间保护眼睛不会有干涩和刺激感。玻璃酸钠可使治疗水平的活性药物在眼表停留时间延长，提高眼内生物利用度，显著减少给药次数，有助于增加患者的依从性和治疗成功率，且能减轻药物对眼的刺激，促进眼部创伤的愈合，缓解眼部不适症状。附图说明图1为实验例2插图，图的名称为本发明滴眼液和参比制剂给药后的平均药-时曲线(n＝5)具体实施方式以下通过实施例对本发明作进一步说明。实施例1-6制备不含防腐剂的盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液原料组分和用量按本发明技术方案，配制不含防腐剂的盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液可选用的辅料品种不限于上表所列品种，还可以有以下多种选择：金属离子络合剂：可以采用药剂学上常用的金属离子络合剂，如依地酸二钠、葡萄糖酸钠、酒石酸钠、柠檬酸钠、氨基三乙酸中任何一种或所述品种的任意组合；金属离子络合剂的用量以与左氧氟沙星的重量比表示为，盐酸左氧氟沙星∶金属离子络合剂＝1∶0.01～0.50。使用渗透压调节剂调节成品滴眼液的渗透压摩尔浓度为280～330mOsmol/kg；所述渗透压调节剂为氯化钠、氯化钾、葡萄糖、硼酸、硼砂、甘油、甘露醇中的任何一种或所述品种的任意组合。使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5.0～7.0；所述pH调节剂为氢氧化钠、盐酸、枸橼酸钠、枸橼酸、硼酸、硼砂中的任何一种或所述品种的任意组合，调节成品药剂的pH值为5.0～7.0。制备方法为将增稠剂玻璃酸钠用注射用水使其分散放冷，作为溶液1；用注射用水溶解金属离子络合剂，作为溶液2；合并二液，搅拌均匀，加入用注射用水溶解好的盐酸左氧氟沙星，加注射用水至全量，搅匀。使用渗透压调节剂调节成品滴眼液的渗透压摩尔浓度为260～340mOsmol/kg；使用pH调节剂调节成品滴眼液的pH值为5.0～7.0，过滤，分装，即得。所用制备器具及包装容器均须灭菌。本发明不含防腐剂的盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液的有益效果通过以下实验例得以证明。实验例1药效学试验按本发明实施例2记载的方法所制备的制剂作为试验品，采用0.3％盐酸左氧氟沙星滴眼液(参比制剂Ⅰ，北京利祥制药有限公司，商品名：朗悦，规格24mg：8ml)、0.3％盐酸左氧氟沙星滴眼液(参比制剂Ⅱ，山东博士伦福瑞达制药有限公司，商品名：海伦，规格5ml：15mg)、生理盐水作为对照品，通过药效学试验，说明本发明盐酸左氧氟沙星滴眼液具有缓释效果，能提高治疗效果。1.损伤型细菌性结膜炎模型的建立1.1感染菌悬液的制备：用0.9％氯化钠注射液将培养2d的金黄色葡萄球菌液稀释成5×109cfu·ml-1(采用标准比浊管确定)。1.2结膜损伤和结膜感染：用无菌6号针头于兔子上睑结膜划4mm×4mm“+”，以刚划破为宜，轻轻拉眼睑成小杯形，小心地向结膜伤痕滴入2滴感染菌悬液，轻轻复原眼睑，所有兔子的左、右眼都照同法进行结膜感染。2.损伤型细菌性结膜炎的治疗2.1实验设3个组：a.自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液+海伦滴眼液；b.自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液+朗悦滴眼液；c.自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液+无菌生理盐水。每组6只动物，每只动物左眼和右眼分别滴入试验品和对照品。对感染结膜炎动物连续用药7d，每天上、下午各1次，每次0.1ml，观察眼部流泪及分泌物情况，结膜充血和水肿状况。2.2观察指标及评分标准：体征(结膜、水肿、分泌物)根据病情程度分为无、轻度、中度、重度分别计分为0分、1分、2分、3分。结膜充血分为：无充血为0分；睑结膜充血，色鲜红为1分；睑结膜及穹隆结膜充血，色介于鲜红与紫红为2分；睑结膜及球结膜充血，色紫红为3分。结膜水肿分为：无水肿为0分；可见结膜水肿为1分；水肿介于1～3分之间为2分；结膜水肿突出于眼球为3分。分泌物无为0分，较少为1分，较多为2分，甚多擦之即有为3分。3.细菌性结膜炎的治疗效果金黄色葡萄球菌感染24h后，兔眼呈紫红色，伴有明显水肿并使眼呈半闭合状，大量分泌物浸湿眼睑、睫毛和眼周围区域。细菌性结膜炎的具体治疗效果见表1。表1试验各组眼损伤计分表结果表明，样品组在d3水肿和分泌物消失，结膜有轻微充血，d5结膜充血消失；海伦组在d3仍有轻微结膜充血和水肿，分泌物消失，d4水肿消失，d5结膜充血消失；朗悦组在d6仍有轻微结膜充血，d7完全消失；生理盐水在d7仍有轻微结膜充血和水肿。因此，自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液治疗效果好于对照组，特别是明显优于朗悦和生理盐水对照，和海伦对照药效相当。实验例2在兔眼房水内的药代动力学实验按本发明实施例2记载的方法所制备的制剂作为试验品，采用0.3％盐酸左氧氟沙星滴眼液(参比制剂Ⅰ，北京利祥制药有限公司，商品名：朗悦，规格24mg：8ml)、0.3％盐酸左氧氟沙星滴眼液(参比制剂Ⅱ，山东博士伦福瑞达制药有限公司，商品名：海伦，规格5ml：15mg)、生理盐水作为对照品，通过兔眼房水内的药代动力学实验，说明本发明盐酸左氧氟沙星滴眼液具有缓释效果，能提高药物的生物利用度。1.给药方法：采用自身对照、交叉实验设计，清洗期7d。健康新西兰兔25只，随机分为5组，每组5只10眼，实验过程中不禁饮水。每组先后随机给予自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液50μl，于给药后0.17、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6和8h抽取房水100μl，经HPLC测定给药后兔眼房水中左氧氟沙星的含量。7d清洗期后，给予参比制剂Ⅰ，同法处理。再经7d清洗期后给予参比制剂Ⅱ，同法处理。2.数据分析：用3p97、MicrosoftExcel2003和Origin6.0进行数据处理和作图，计算半衰期t1/2和平均滞留时间MRT，利用抛物线拟合法计算tmax和Cmax。AUC0-t以梯形面积法求得，AUC0-∞＝AUC0-t+Cn/λ，并计算相对生物利用度Fr。用成对t检验对自制滴眼液与参比制剂Ⅰ、Ⅱ进行相对生物利用度统计分析，结果见表2。以AUC0-t计算，得出自制滴眼液对参比制剂Ⅰ、Ⅱ的相对生物利用度为213.5％和110.4％，平均药时曲线见图1本发明滴眼液和参比制剂给药后的平均药-时曲线(n＝5)图。表2自制滴眼液和参比制剂的主要药动学参数(x±s，n＝5)结果显示，兔眼单次给药后，药动学结果显示盐酸左氧氟沙星在3种制剂中均符合一级动力学特点，本制剂的AUC为参比制剂Ⅰ的2倍，生物利用度显著提高；给药4h后，本制剂的房水药物浓度显著高于参比制剂Ⅰ，作用时间显著延长；与参比制剂Ⅱ相比生物利用度无显著差异。因此，在普通滴眼液内加入增稠剂，可增加房水浓度和延长作用时间，提高盐酸左氧氟沙星在眼部的疗效，减少滴眼次数。实验例3体外细胞毒性、急性毒性、皮肤刺激性试验按本发明实施例2记载的方法所制备的制剂作为试验品。参考GB/T16886.5-2003《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》中试验方法评价该滴眼液的体外细胞毒性；参照《药理实验方法学》，评价其急性毒性和皮肤刺激反应。1.体外细胞毒性试验1.1样品的制备：a.试验样品：将0.1ml自制盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液滴在直径10mm的8层滤纸圆片上；b.阴性对照：直径为10mm的高密度聚乙烯圆片；c.阳性对照：涂有邻苯二甲酸二辛酯的直径为10mm的聚氯乙烯圆片；d.生理盐水对照：将0.1ml生理盐水滴在直径10mm的8层滤纸圆片上。1.2操作步骤：采用琼脂扩散法检测细胞毒性。取正常传代的小鼠成纤维细胞(简称L-929细胞)10ml，接种于直径为90mm的培养皿内，每皿接种细胞3×106个，在37℃、5％CO2培养箱培养24h后，弃去原培养液，加入10ml琼脂培养基(3％琼脂与2倍的RPMI1640细胞培养液按1∶1混合)，待其凝固后，每一平皿内放阴、阳性及生理盐水对照各1片、试验样品2片、平行操作5皿，于37℃、5％CO2培养箱再培养24h，弃去所有样品(试验样品，阴、阳性及生理盐水对照)，用0.01％中性红染色20min后进行结果评定。1.3评定指标：用倒置显微镜观察试验样品和阴、阳性及生理盐水对照圆片下及周围褪色区域，并按表3所示指标评价每一样品的褪色指数和溶解指数，再按表4确定各组细胞毒性反应的分级。表3褪色指数和溶解指数评价标准表4细胞毒性反应分级评价标准分级褪色指数溶解指数说明000无细胞毒性111轻度细胞毒性22～32～3中度细胞毒性34～54～5重度细胞毒性1.4试验结果：各组褪色指数和溶解指数结果详见表5。表5各组细胞褪色指数和溶解指数结果由表5分析可知，阴性对照、阳性对照、生理盐水对照、试验样品的细胞毒性反应分别为0、2、1、1级。2.急性毒性试验2.1选小鼠20只，平均分为供试品组和空白对照组，每组10只，均采用静脉注射方式给药，供试品组以盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液按15mg·kg－1给药1次，相当于成人临床日用量的(成人每日盐酸左氧氟沙星为4.5mg，按成人体质量60kg计算，剂量为0.075mg·kg－1)200倍；空白对照组给相同体积的生理盐水。注射完毕后，观察14d小鼠的一般状态和死亡数，并记录体质量变化。2.2试验结果：注射后小鼠在观察期状况良好，活动、食欲正常，呼吸平稳，无惊厥、瘫痪和死亡等毒性反应，小鼠体质量日渐增加。利用SPSS统计软件将空白对照组和供试品组每天的体质量进行组间t检验分析，结果见表6。表6各组小鼠体质量比较(g，x±s，n＝10)时间/d供试品组空白对照组117.5±0.617.7±0.5218.3±1.018.5±0.8319.7±1.120.2±0.8521.3±1.321.9±0.8722.8±1.323.6±0.81025.6±1.526.6±0.71430.4±1.531.6±0.6由表6可知，供试品组与空白对照组小鼠在14d内体质量变化没有明显差异，表明该滴眼液对实验小鼠体质量没有明显影响。3.皮肤刺激反应实验3.1实验步骤：选用大耳白兔12只，实验前24h剪剃其背部脊柱两侧被毛备皮，去毛范围为3cm×3cm，随机分为皮肤完好组和皮肤破损组，每组6只，另在皮肤破损组兔的脊柱两侧用无菌针头划成“#”，以渗血为准。采用同体左右侧自身对照，将盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液滴到2.5cm×2.5cm的纱布块上，敷贴在左侧背部，阴性对照将生理盐水滴到2.5cm×2.5cm的纱布块上，敷贴在右侧背部，用半封闭性包扎带固定6h，每次用量均为1.5mg·d－1，每天1次，连续用药7d。末次用药24h后，用温水去除残留药物，分别于1、24、48、72h连续观察并记录涂药部位有无红斑及水肿等情况。3.2评定指标：红斑和水肿按以下标准进行评分：无红斑0分，红斑勉强可见为1分，红斑明显可见2分，严重红斑3分，紫红色红斑并有焦痂形成4分；无水肿0分，水肿勉强可见1分，边缘高出周围皮肤的水肿2分，皮肤隆起约1mm、轮廓清楚的水肿为3分，皮肤隆起1mm以上范围扩大的水肿4分。平均分值＝(红斑反应总分+水肿反应总分)/每组动物数，按平均分值进行刺激强度评价，皮肤刺激强度评价标准见表7。表7皮肤刺激强度评价标准分值反应类型0.0～0.49无刺激性0.5～2.99轻度刺激性3.0～5.99中度刺激性6.0～8.0强刺激性3.3试验结果：除去敷贴物后1、24、48、72h，观察各部位皮肤组织反应情况，皮肤完好组兔用药侧、对照侧皮肤均未发现红斑及水肿，皮肤刺激强度评价均为无刺激性(平均分值为0)。破损皮肤组1、24h时仅有1只出现红斑和水肿，48h后反应平均分值均为0，5d后伤口均愈合，基本恢复正常状态，皮肤刺激评价均为无刺激性(平均分值均小于0.50)，具体结果见表8。表8各组小鼠皮肤刺激实验结果自制的不含防腐剂盐酸左氧氟沙星缓释滴眼液的体外细胞毒性、急性毒性和皮肤刺激反应均符合相关国家规范和要求。本实验研究证明了该滴眼液用药的安全性，降低滴眼液对眼部的损伤作用和刺激作用。实验例4抑菌效力研究试验按本发明实施例3记载的方法所制备的制剂作为试验品，0.3％盐酸左氧氟沙星滴眼液(山东博士伦福瑞达制药有限公司，商品名：海伦，规格5ml：15mg)作为对照品，通过抑菌效力研究试验，说明不含防腐剂的盐酸左氧氟沙星滴眼液能利用自身抑菌作用，抑制储存、运输、使用过程中可能造成的微生物污染，提高其生物安全性。研究试验参考《中国药典》2015年版四部通则1121抑菌效力检查法。1.菌液制备取经35℃培养24h的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的TSA斜面培养物适量，另取经25℃培养48h的白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂培养基斜面培养物适量，分别加入适量的无菌0.9％氯化钠溶液，制成含菌数约为108cfu·ml－1的菌悬液(此菌悬液用于抑菌效力实验)。取上述菌悬液用无菌0.9％氯化钠溶液倍量稀释制成含菌数约为50～100cfu·ml－1的菌悬液(此菌悬液用于微生物计数方法验证实验)；取经25℃培养7d的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加5ml含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液洗下孢子，制成含菌数约为107～108cfu·ml－1的孢子悬液(此孢子悬液用于抑菌效力实验)。用含0.05％(ml/ml)聚山梨酯80的0.9％无菌氯化钠溶液倍量稀释制成含孢子数约为50～100cfu·ml－1的孢子悬液(此孢子悬液用于微生物计数方法验证实验)。2.微生物计数方法的验证实验抑菌剂及左氧氟沙星具较强的抗菌活性，因此，细菌计数试验时，应采用薄膜过滤法削除抑菌活性。同时，氟喹诺酮药物与金属离子(Ca2+、Mg2+、Al3+)可发生络合并引起其抗菌活性下降，故选择在pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液中加入0.05mol·L－1硫酸锰。真菌计数试验时采用直接接种法。2.1细菌计数验证方法：分别取试验品和对照品1ml和50～100cfu试验菌，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(含硫酸锰0.05mol·L－1)稀释至100ml，全量通过薄膜过滤器后，再用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液(含硫酸锰0.05mol·L－1)冲洗滤膜4次(每次400ml)，将滤膜贴至胰酪胨大豆琼脂培养基平板，测定菌数。2.2真菌计数验证方法：分别取试验品和对照品1ml和50～100cfu试验菌，分别注入同一平皿中，立即倾注胰酪胨大豆琼脂培养基及沙氏葡萄糖琼脂培养基。按直接接种法测定其菌落数。结果见表9。表9计数方法验证结果3.抑菌效力测定方法3.1样品制备：分别取试验品和对照品(装量5ml)4支，转移内容物至具塞无菌玻璃试管中，混匀，备用。同法共制备5份。3.2样品接种：取“1”项下制成的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、白色念珠菌菌悬液(菌悬液含菌数约为108cfu·ml－1)及黑曲霉孢子悬液(孢子悬液含孢子数约为108cfu·ml－1)，分别直接接种试验菌0.1ml于上述5份样品中，每一容器接种1种试验菌，充分混合，使样品中的试验菌均匀分布。然后将接种的样品在试验期间置25℃培养箱中，避光贮存。3.3存活菌数测定在供试品刚接种0h、6h、24h、7d、14d、28d，分别从上述每个样品容器中取样品1ml，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级。菌数测定方法按“2”项下微生物计数方法的验证实验进行。其中测定细菌采用薄膜过滤法及胰酪胨大豆琼脂培养基；测定真菌采用直接接种法及沙氏葡萄糖琼脂培养基。测定每份供试品中所含的菌数。3.4抑菌效力试验结果见表10。表10抑菌效力菌量计数结果结果表明，实验组与对照组均能达到《中国药典》2015年版的抑菌效力标准。因此，可利用盐酸左氧氟沙星自身的充分抗菌效力，防止多剂量包装的滴眼液在正常储存或使用过程由于微生物的污染和繁殖对使用者造成的危害。当前第1页1 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