主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法和应用。

背景技术：

恶性肿瘤是一种以局部表现为主的全身系统性疾病，严重威胁着人类的健康。近年来，恶性肿瘤的发病率逐渐增高。随着有关恶性肿瘤知识的普及、危险因素的干预和普查的广范开展，早期检出率不断提高，加上各种治疗手段的进步，病死率有所下降。但如何使病人获得最合适的，即效果好，副反应小的治疗仍然是肿瘤科医生所不懈追求的目标。传统的手术、化疗、放疗等治疗手段都有其一定的局限性，新兴的内分泌治疗、靶向治疗、生物治疗等不断地显示出其优越性。

纳米科学是一门涵盖多学科跨领域的前沿交叉学科，近年来飞速发展，其与医学的交叉碰撞产生了令人瞩目的成果，如白蛋白紫杉醇、脂质体阿霉素等纳米载药体系明显提高了化疗药物的抗肿瘤疗效，降低了毒副作用，临床意义重大，经济、社会效益显著。白蛋白结合型紫杉醇是唯一应用白蛋白纳米技术构建的靶向化疗药物，利用独特的纳米技术使疏水性紫杉醇与白蛋白结合，无需使用有毒溶剂。在血液中以两种形式存在:游离型紫杉醇(5％-10％)和白蛋白结合型紫杉醇(90-95％)，游离型紫杉醇体积很小，能够以被动转运的方式穿过血管内皮细胞间隙到达肿瘤细胞，导致其凋亡。白蛋白结合型紫杉醇利用白蛋白在体内的天然转运机制(gp60-caveolin-1-SPARC)，以主动转运的方式穿过血管内皮细胞进入肿瘤间质，使紫杉醇更多分布于肿瘤组织，达到更高的肿瘤细胞内浓度。(曲妥珠单抗)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，特异性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。通过抑制HER2下游的信号通路从而抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。纳米药物靶向治疗肿瘤领域正不断朝着更精准更多重靶向的方向发展。本研究即受此思路启发，充分拓展内涵，在现有科技水平上，首次将与两种临床上市药物进行药物重组，构建一种精准且双重靶向HER2(+)恶性肿瘤细胞、组织的主动靶向纳米载药体系。预期获得相比重组药物中每一单一组分更有的抗肿瘤作用。

技术实现要素：

解决的技术问题：本发明的目的在于秉承精准医学的理念，提供一种靶向HER2(+)肿瘤细胞的主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法和应用，其中组分对HER2(+)肿瘤细胞具有靶向作用，且能通过抑制HER2下游信号通路来发挥抗肿瘤作用，组分具有对紫杉醇高载药性能、EPR被动靶向肿瘤组织等特点，将广谱的抗肿瘤药物双重靶向输送至肿瘤组织、细胞。二者协同可实施精准有力的双重打击，同时减少对正常组织、细胞的毒副作用。

技术方案：主动靶向抗肿瘤纳米药物的制备方法，步骤为：按比例，取5mg/mL白蛋白结合型紫杉醇0.5mL加入1mL PBS中，再加入5.75×10^-7g/mL NHS100μL，以10rpm速度反应30min后，加入2.3×10^-7g/mL EDC10μL及0.2mg/mLAnti-ErbB 2单克隆抗体20μL，4℃层析柜中以10rpm反应24小时后收集反应物，高速离心机以10000rpm离心45min后收集沉淀，用1mL PBS重悬得偶联化合物。

上述制备方法所获得的偶联化合物。

上述偶联化合物在制备主动靶向抗肿瘤纳米药物中的应用。

上述的肿瘤指实体肿瘤。

有益效果：实验研究表明，通过使用重组新一代主动靶向抗肿瘤纳米药物，在细胞水平可以观察到对HER2(+)肿瘤细胞相比两种独立组分较高的毒性、凋亡率及细胞周期阻滞效果。动物水平上可以观察到其对荷瘤裸鼠更高的肿瘤抑制率及更小的毒副作用。

附图说明

图1为本发明药物合成和作用机制示意图，其中①：重组主动靶向抗肿瘤纳米药物结构示意图：白蛋白结合型紫杉醇是唯一应用白蛋白纳米技术构建的靶向化疗药物，利用独特的纳米技术使疏水性紫杉醇与白蛋白结合，无需使用有毒溶剂。在血液中以两种形式存在:游离型紫杉醇(5％-10％)和白蛋白结合型紫杉醇(90-95％)，游离型紫杉醇体积很小，能够以被动转运的方式穿过血管内皮细胞间隙到达肿瘤细胞，导致其凋亡。白蛋白结合型紫杉醇利用白蛋白在体内的天然转运机制(gp60-caveolin-1-SPARC)，以主动转运的方式穿过血管内皮细胞进入肿瘤间质，使紫杉醇更多分布于肿瘤组织，达到更高的肿瘤细胞内浓度。(曲妥珠单抗)是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，特异性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。通过抑制HER2下游的信号通路从而抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。②、③：与通过EDC/NHS法“一步法”反应生成偶联物，通过尾静脉注射重组主动靶向抗肿瘤纳米药物至荷瘤裸鼠模型中，综合对Her2过表达乳腺癌细胞的靶向作用以及纳米制剂紫杉醇高载药性能、EPR被动靶向肿瘤组织等特点，将广谱的抗肿瘤药物主动靶向性的输送到HER2(+)肿瘤细胞中、实施精准有力的双重打击，减少对正常细胞的毒副作用。

图2为本发明药物电镜照片。

具体实施方式

本发明提供了重组新一代主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法，将(白蛋白结合型紫杉醇)与(曲妥珠单抗)两种临床上市药物通过EDC/NHS法进行“一步法”偶联构建药物传输系统，本发明主要运用于实体肿瘤，如HER2(+)乳腺癌、胃癌等。本发明的新一代主动靶向抗肿瘤纳米药物可以制成静脉注射的冻干粉制剂。综合对HER2(+)肿瘤细胞的靶向作用以及纳米制剂紫杉醇高载药性能、EPR被动靶向肿瘤组织等特点，将广谱的抗肿瘤药物双重靶向输送至肿瘤组织、细胞实施精准有力的双重打击，同时减少对正常组织、细胞的毒副作用。总之，本发明将两种临床上市药物进行重组，制备步骤简单，开发成本低，生物相容性高，在现代肿瘤靶向治疗中具有重要的价值。

实施例1

(1)重组新一代主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法

利用中的白蛋白组分与中的氨基或羧基末端通过EDC/NHS法将二者进行一步法偶联。具体步骤：取1mL(5mg/mL，货号：6109342)加入1mL PBS中，再加入100μL NHS(5.75×10^-7g/mL)以10rpm速度反应30min后，加入10μL EDC(2.3×10^-7g/mL)及10μL Anti-ErbB2单克隆抗体(0.2mg/mL，货号ab2428)，4℃层析柜中以10rpm反应24小时后收集反应物，高速离心机以10000rpm离心45min后收集沉淀，用1mL PBS重悬，分装保存。并通过动态光散射(DLS)检测其水和粒径、透射电镜检测观察复合物的粒径大小。结果显示所制得的药物具有良好的稳定性，粒径大小约为130±30nm(如图2所示)

(2)体外对肿瘤细胞作用的实验研究

通过CCK-8检测重组药物对HER2(+)乳腺癌及胃癌细胞抑制率的影响、AnnexinⅤ/PI双染法经流式细胞仪检测细胞凋亡情况、DAPI染料观察细胞核形态变化，上述结果显示重组药物相比单一组分具有更高的体外杀伤力。主要实验结果摘要如下：CCK-8法检测得出PTX、处理乳腺癌SK-BR-3细胞48H后得出其IC50分别为0.04、0.02、0.004ug/ml,上述三种剂型药物取紫杉醇等效浓度处理SK-BR-3细胞48H后其晚期凋亡率分别为6.2％、11.4％、18.2％。

(3)体内抗肿瘤作用的实验研究

建立HER2(+)乳腺癌及胃癌裸鼠移植瘤原位接种模型并观察裸鼠生存曲线及肿瘤抑制率，近红外染料预染药物并通过小动物活体成像观察其在裸鼠体内分布情况。结果表明，重组药物具有比单一组分更大的体内肿瘤抑制率，且能改善裸鼠的生存质量、延长生存期。小动物活体成像表明重组药物在肿瘤部位具有更高的蓄积性，提示重组药物较高的靶向性。

综上所述：我们经过实验研究，构建了新一代主动靶向抗肿瘤纳米药物及其制备方法，对细胞和动物的实验表明，该药物相比单一组分抗肿瘤效应更显著，因此，这种技术可望用于临床恶性肿瘤的综合治疗。本发明将大大加快新药开发的速度，对肿瘤精准治疗具有重要的价值。