肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂的制作方法
【专利摘要】本申请涉及肿瘤基因领域，公开了肿瘤靶向药物有效性检测、富集突变方法、引物对及试剂。本申请的方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况，其关联基因包括EGFR、KRAS和BRAF中的至少一个，具体可采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法。本申请还公开了一组引物对，一种包括该引物对的试剂和试剂盒。本申请通过对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的突变情况进行检测，可为肿瘤靶向药物有效性提供指导。通过以本申请公开的引物对进行COLD-PCR扩增可富集突变，将扩增结果测序可使常规PCR/sanger测序法检测突变率的灵敏度从原来的20%提高到1%，大大的降低了检测的假阴性率。
【专利说明】肿瘤靶向药物有效性检测、突变富集方法、引物对及试剂
【技术领域】
[0001]本申请涉及肿瘤基因领域，尤其涉及一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法、一组引物对以及一种试剂及试剂盒。
【背景技术】
[0002]肿瘤是当今威胁人类健康的最大疾病，人们一直在寻找针对肿瘤的治疗药物。随着当代分子生物学、细胞生物学的发展，靶向药物作为一种新兴的高科技药物逐渐进入肿瘤治疗领域，且快速发展成为治疗肿瘤的有效措施。靶向药物治疗就是使药物瞄准肿瘤部位，在局部保存相对高的浓度，延长药物的时间，提高对肿瘤的杀伤力，而对正常组织细胞作用较小。
[0003]靶向药物与一般常规化疗药物不同，靶向药物通过与肿瘤细胞的特征性位点结合，干预控制肿瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路。而肿瘤细胞具有有多样性，肿瘤细胞的特征性位点也因人而异。因此在使用肿瘤靶向药物之前，对患者体内的基因进行检测，以判断其体内是否有符合条件的基因，一定程度上预知药物是否会奏效。因此有必要设计肿瘤靶向药物有效性的检测方法。
【发明内容】
[0004]针对上述现状，本申请的目的在于提供一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法、一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法、一组引物对和一种试剂及试剂盒。
[0005]为实现上述目的，本申请提供了一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的`基因突变情况，所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
[0006]进一步的，上述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况包括检测受体内以下a-h中至少一组突变位点的突变情况:
[0007]a、EGFR基因第709和/或719号密码子；
[0008]b、EGFR基因第746-750号密码子；
[0009]c、EGFR基因第790号密码子；
[0010]d、EGFR基因第858号密码子；
[0011]e、KRAS基因第12和/或第13号密码子；
[0012]f、KRAS基因第61号密码子；
[0013]g、KRAS基因第146号密码子；
[0014]h、BRAF基因第600号密码子。
[0015]本申请中检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况是采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法进行。
[0016]进一步的，在所述测序步骤后，包括分析测序结果，即根据所述测序结果判断肿瘤靶向药物的有效性。[0017]具体的，上述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对对核酸样品进行第一扩增步骤和第二扩增步骤，第一扩增步骤结束后进入第二扩增步骤。
[0018]进一步的，所述突变位点a-h各自对应的COLD-PCR的引物对依次为:
[0019]a:引物对A:上游引物为Seq ID N0.1所示序列，下游引物为Seq ID N0.2所示序列；
[0020]b:引物对B:上游引物为Seq ID N0.3所示序列，下游引物为Seq ID N0.4所示序列；
[0021]c:引物对C:上游引物为Seq ID N0.5所示序列，下游引物为Seq ID N0.6所示序列；
[0022]d:引物对D:上游引物为Seq ID N0.7所示序列，下游引物为Seq ID N0.8所示序列；
[0023]e:引物对E:上游引物为Seq ID N0.9所示序列，下游引物为Seq ID N0.10所示序列；
[0024]f:引物对F:上游引物为Seq ID N0.11所示序列，下游引物为Seq ID N0.12所示序列；
[0025]g:引物对G:上游引物为Seq ID N0.13所示序列，下游引物为Seq ID N0.14所示序列；
[0026]h:引物对H:上游引物为Seq ID N0.15所示序列，下游引物为Seq ID N0.16所示`序列。
[0027]上述第一扩增步骤可为常规PCR扩增，依次包括预变性、第一循环和终延伸，该第一循环依次包括变性、退火和延伸。上述第二扩增依次包括预变性、第二循环和终延伸，该第二循环依次包括变性、杂交温度处理、临界温度(Tc温度)处理、退火和延伸。
[0028]优选的，上述第一扩增步骤中，常规PCR可采用荧光PCR。
[0029]上述第一循环和第二循环的退火中，其引物退火温度的确定可包括以下步骤:利用上述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值。利用该引物对，以该引物退火温度预定值_5°C所得温度值的±4°C范围内的不同温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到不同温度下的常规PCR扩增产物。在上述扩增产物中选择出最优扩增产物，以该最优扩增产物的实验引物退火温度作为引物退火温度。
[0030]优选的，最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定。
[0031]优选的，引物的退火温度，对应上述A-H引物对，依次为:
[0032]引物对A:56_64°C，优选 62°C，
[0033]引物对B:56_64°C，优选 62°C，
[0034]弓丨物对C:56-64 0C，优选 59 O，
[0035]引物对D:56_64°C，优选 61°C，
[0036]弓丨物对E: 54-60 V，优选 58 V，
[0037]引物对F:56_64°C，优选 62°C，
[0038]弓丨物对G: 54-60 V，优选 57 O，
[0039]弓丨物对H: 54-60 V，优选 58 V。
[0040]上述第二循环的Tc温度处理中，其Tc温度的确定包括以下步骤:以上述引物对和上述引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品片段的Tm值。以上述引物对、上述引物退火温度以及上述Tm值±2°C范围内的不同温度作为实验Tc温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据不同实验Tc温度下的COLD-PCR扩增结果确定Tc温度。
[0041]优选的，上述常规PCR可采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值。
[0042]上述突变型样品包括突变序列。
[0043]上述突变型样品可选自真实样品和模拟样品中的至少一种。
[0044]上述突变型样品所含突变大于或等于1%。
[0045]优选的，临界温度，对应上述A-H引物对，依次为:
[0046]引物对A:83.5-85.5°C，优选 85°C，
[0047]引物对B:81.5-83.5°C，优选 83.1°C,
[0048]引物对C:91.5-93.5°C，优选 92.5°C,
[0049]引物对D:86.5-88.5°C，优选 87.3°C, [0050]引物对E:81.5-84.5°C，优选 83.2V，
[0051]引物对F:81.5-82.8°C，优选 81.9°C,
[0052]引物对G:76.5-79.5°C，优选 78.3°C,
[0053]引物对H:79-81 °C，优选 80.4°C。
[0054]另一方面，本申请还公开了一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法，该富集突变的方法包括COLD-PCR扩增步骤。肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
[0055]优选的，富集肿瘤靶向药物关联基因的突变包括富集上述突变位点a-h中的至少
一类突变。
[0056]进一步优选的，COLD-PCR扩增步骤中采用的引物对选自上述引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对，该引物对A-H与突变位点a-h依次对应。具体的，该富集突变的方法中，COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对对核酸样品进行第一扩增步骤和第二扩增步骤，第一扩增步骤结束后进入第二扩增步骤。
[0057]上述第一扩增步骤可为常规PCR扩增，依次包括预变性、第一循环和终延伸，该第一循环依次包括变性、退火和延伸。上述第二扩增依次包括预变性、第二循环和终延伸，该第二循环依次包括变性、杂交温度处理、临界温度(Tc温度)处理、退火和延伸。优选的，上述第一扩增步骤中，常规PCR可采用荧光PCR。
[0058]上述第一循环和第二循环的退火中，其引物退火温度的确定可包括以下步骤:利用上述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值。利用该引物对，以该引物退火温度预定值_5°C所得温度值的±4°C范围内的不同温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到不同温度下的常规PCR扩增产物。在上述扩增产物中选择出最优扩增产物，以该最优扩增产物的实验引物退火温度作为引物退火温度。
[0059]优选的，最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定。
[0060]优选的，引物的退火温度，对应上述A-H引物对，依次为: [0061]引物对A:56_64°C，优选 62°C，[0062]引物对B:56_64°C，优选 62°C，
[0063]引物对C:56_64°C，优选 59°C，
[0064]引物对D:56_64°C，优选 61°C，
[0065]弓丨物对E: 54-60 V，优选 58 V，
[0066]引物对F:56_64°C，优选 62°C，
[0067]引物对G:54-60°C，优选 57°C，
[0068]弓丨物对H: 54-60 V，优选 58 V。
[0069]上述第二循环的Tc温度处理中，其Tc温度的确定包括以下步骤:以上述引物对和上述引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品片段的Tm值。以上述引物对、上述引物退火温度以及上述Tm值±2°C范围内的不同温度作为实验Tc温度，对突变型样品进行C0LD-PCR，根据不同实验Tc温度下的COLD-PCR扩增结果确定Tc温度。
[0070]优选的，上述常规PCR可采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值。
[0071]上述突变型样品包括突变序列。
[0072]上述突变型样品可选自真实样品和模拟样品中的至少一种。
[0073]上述突变型样品所含突变大于或等于1%。
[0074]优选的，临界温度，对应上述A-H引物对，依次为:
[0075]引物对A:83.5-85.5°C，优选 85°C，
[0076]引物对B:81.5-83.5°C，优选 83.1°C,
[0077]引物对C:91.5-93.5°C，优选 92.5°C,
[0078]引物对D:86.5-88.5°C，优选 87.3°C,
[0079]引物对E:81.5-84.5°C，优选 83.2V，
[0080]引物对F:81.5-82.8°C，优选 81.9°C, [0081]引物对G:76.5-79.5°C，优选 78.3°C,
[0082]引物对H:79-81 °C，优选 80.4°C。
[0083]同时，本申请提供了一组引物对，该引物对选自以上引物对A、B、C、D、E、F、G和H
中的至少一对。
[0084]该引物对可用于肿瘤靶向药物关联基因、富集肿瘤靶向药物基因的突变或肿瘤靶向药物有效性的检测，该肿瘤靶向药物关联基因为EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
[0085]具体的，该引物对可用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的引物退火温度，对应上述A-H引物对，依次为:
[0086]引物对A:56_64°C，优选 62°C，
[0087]引物对B:56_64°C，优选 62°C，
[0088]引物对C:56_64°C，优选 59°C，
[0089]引物对D:56_64°C，优选 61°C，
[0090]弓丨物对E: 54-60 V，优选 58 V，
[0091]引物对F:56_64°C，优选 62°C，[0092]弓丨物对G: 54-60 V，优选 57 °C，
[0093]弓丨物对H: 54-60 V，优选 58 V。
[0094]该弓丨物对可用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的Tc温度，对应上述A-H引物对，依次为:
[0095]引物对A:83.5-85.5°C，优选 85°C，
[0096]引物对B:81.5-83.5°C，优选 83.1°C,
[0097]引物对C:91.5-93.5°C，优选 92.5°C,
[0098]引物对D:86.5-88.5°C，优选 87.3°C,
[0099]引物对E:81.5-84.5°C，优选 83.2V，
[0100]引物对F:81.5-82.8°C，优选 81.9°C,
[0101]引物对G:76.5-79.5°C，优选 78.3°C,
[0102]引物对H:79-81 °C，优选 80.4°C。
[0103]本申请还提供了一种试剂，该试剂包括上述引物对。
[0104]本申请同时还提供了一种`包括上述引物对或试剂的试剂盒。
[0105]本申请的有益效果是:通过对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的突变情况进行检测，可以为肿瘤靶向药物有效性提供指导。
[0106]进一步的，本申请针对EGFR，KRAS和BRAF三个基因的8类突变位点，通过采用以本申请公开的引物对进行COLD-PCR扩增后测序的方法，可使得常规的PCR/sanger测序法检测突变率的灵敏度从原来的20%提高到1%，从而大大的降低了检测的假阴性率。
【专利附图】
【附图说明】
[0107]图1为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对A对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0108]图2为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对B对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0109]图3为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对C对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0110]图4为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对D对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0111]图5为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对E对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0112]图6为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对F对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0113]图7为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对G对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图；
[0114]图8为本申请的一种【具体实施方式】中，采用引物对H对样品进行COLD-PCR和常规PCR扩增后的产物电泳图以及对扩增产物进行sanger测序的测序结果图。
【具体实施方式】[0115]目前，市场上已有的一些肿瘤靶向药物主要是单克隆抗体药物、小分子药物和细胞凋亡诱导药物。例如，易瑞沙和特罗凯作为表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TKI)是用于非小细胞肺癌(NSCLC)靶向治疗的主要药物。EGFR基因突变是癌症患者是否对TKI敏感的强预测因子。研究发现KRAS基因、BRAF基因处于EGFR信号通路的下游，KRAS.BRAF基因突变时，可以导致EGRF信号通路持续激活。研究还表明，抗EGFR单克隆抗体类药物疗效与结直肠癌患者KRAS基因突变有明显相关，只有KRAS基因野生型患者才可能对药物治疗有效，而突变型患者对药物治疗无效。BRAF基因突变的肿瘤患者对EGFR-TKI及EGFR单抗药物治疗不敏感，更易发生肿瘤恶化，总生存率低。由于瘤细胞生长增殖的基因信号传导通路十分复杂涉及上游、下游的多个基因，因此有必要设计更有针对性的肿瘤靶向药物有效性检测方法。因此，本申请中对受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况进行检测，该关联基因包括EGFR基因，KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。本申请中受体是指靶向药物的被施予者，该受体可以是人体或动物体等，具体可根据基因检测的常规技术手段采用受体的离体样品例如血液或毛发等提取出核酸样品作为具体的检测对象。通过对上述基因的检测可为肿瘤靶向药物有效性提供指导。
[0116]本申请主要是检测EGFR，KRAS和BRAF三个基因中的8类突变位点的突变情况，涉及EGFR基因的第18、19、20、21外显子，KRAS基因的第2、3外显子，BRAF基因的第15号外显子。本申请中检测的突变位点具体为:
[0117]a、EGFR基因第709和/或719号密码子，均位于EGFR基因第18外显子上；
[0118]b、EGFR基因第746-750号密码子，位于EGFR基因第19外显子上，本申请中主要检测该段基因是否缺失；
[0119]c、EGFR基因第790号密码子，位于EGFR基因第20外显子上； [0120]d、EGFR基因第858号密码子，位于EGFR基因第21外显子上；
[0121]e、KRAS基因第12和/或第13号密码子，位于KRAS基因第2外显子；
[0122]f、KRAS基因第61号密码子，位于KRAS基因第3外显子；
[0123]g、KRAS基因第146号密码子，位于KRAS基因第3外显子；
[0124]h、BRAF基因第600号密码子，位于EGFR基因第15外显子上。
[0125]检测位点的详细信息可参见下表1:
[0126]表1、关联基因突变位点的详细信息表点
[0127]
【权利要求】
1.一种肿瘤靶向药物有效性的检测方法，包括检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况，其特征在于，所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种；优选的，所述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况包括检测受体内以下a-h中至少一类突变位点中的突变情况: a、EGFR基因第709和/或719号密码子； b、EGFR基因第746-750号密码子； c、EGFR基因第790号密码子； d、EGFR基因第858号密码子； e、KRAS基因第12和/或第13号密码子； f、KRAS基因第61号密码子； g、KRAS基因第146号密码子； h、BRAF基因第600号密码子。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述检测受体内肿瘤靶向药物关联基因的基因突变情况是采用包括COLD-PCR扩增步骤及测序步骤的方法进行； 其中，所述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对进行第一扩增步骤和第二扩增步骤:所述第一扩增步骤为常规PCR扩增，包括预变性、第一循环和终延伸，所述第一循环包括变性、退火和延伸； 所述第二扩增包括预变性、第二循环`和终延伸，所述第二循环包括变性、杂交温度处理、临界温度处理、退火和延伸； 优选的，所述引物对，对应所述a-h突变位点，依次为: a:引物对A:上游引物为Seq ID N0.1所示序列，下游引物为Seq ID N0.2所示序列， b:引物对B:上游引物为Seq ID N0.3所示序列，下游引物为Seq ID N0.4所示序列， c:引物对C:上游引物为Seq ID N0.5所示序列，下游引物为Seq ID N0.6所示序列， d:引物对D:上游引物为Seq ID N0.7所示序列，下游引物为Seq ID N0.8所示序列， e:引物对E:上游引物为Seq ID N0.9所示序列，下游引物为Seq ID N0.10所示序列， f:引物对F:上游引物为Seq ID N0.11所示序列，下游引物为Seq ID N0.12所示序列， g:引物对G:上游引物为Seq ID N0.13所示序列，下游引物为Seq ID N0.14所示序列， h:引物对H:上游引物为Seq ID N0.15所示序列，下游引物为Seq ID N0.16所示序列； 优选的，所述常规PCR为荧光PC R; 优选的，所述退火中，其引物退火温度的确定包括: 利用所述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值； 利用所述引物对，以所述引物退火温度预定值-5度所得温度值的±4度范围内的温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到扩增产物； 选择扩增产物中的最优扩增产物，以所述最优扩增产物的实验引物退火温度作为所述引物退火温度； 优选的，所述引物的退火温度，对应所述A-H引物对，依次为: 引物对A:56-64°C，优选62 °C， 引物对B:56-64°C，优选62 °C，引物对C: 56-64 °C，优选59 °C, 引物对D:56-64°C，优选61°C， 引物对E: 54-60 V，优选58 V， 引物对F:56-64°C，优选62 °C， 引物对G: 54-60 V，优选57 °C, 引物对H: 54-60 V，优选58 V ； 优选的，所述最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定； 优选的，所述第二循环中，其临界温度的确定包括: 以引物对和引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品扩增产物的Tm值； 以所述引物对、所述引物退火温度以及所述Tm值±2度范围内的温度作为实验临界温度，对突变型样品进行COLD-PCR，根据COLD-PCR扩增结果确定临界温度； 优选的，所述临界温度，对应所述A-H引物对，依次为:
引物对 A:83.5-85.5°C，优选 85°C，
引物对 B:81.5-83.5°`C，优选 83.1°C,
引物对 C:91.5-93.5°C，优选 92.5°C,
引物对 D:86.5-88.5°C，优选 87.3 °C,
引物对 E:81.5-84.5°C，优选 83.2V，
引物对 F:81.5-82.8°C，优选 81.9°C,
引物对 G: 76.5-79.5°C，优选 78.3 °C, 引物对 H:79-81°C，优选 80.40C ； 优选的，所述常规PCR采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值； 优选的，所述突变型样品包括突变序列； 优选的，所述突变型样品选自真实样品和模拟样品中的至少一种； 优选的，所述突变型样品所含突变大于或等于1%。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，在所述测序步骤后，进一步包括分析测序结果，根据所述测序结果判断肿瘤靶向药物有效性。
4.一种富集肿瘤靶向药物关联基因的突变的方法，其特征在于，所述富集突变的方法包括COLD-PCR扩增步骤； 所述肿瘤靶向药物关联基因包括EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种； 优选的，所述富集肿瘤靶向药物关联基因的突变包括富集以下a-h中的至少一类突变: a、EGFR基因第709和/或719号密码子， b、EGFR基因第746-750号密码子， c、EGFR基因第790号密码子， d、EGFR基因第858号密码子， e、KRAS基因第12和/或第13号密码子， f> KRAS基因第61号密码子， g、KRAS基因第146号密码子，h、BRAF基因第600号密码子； 优选的，所述COLD-PCR扩增步骤包括利用引物对进行第一扩增步骤和第二扩增步骤:所述第一扩增步骤为常规PCR扩增，包括预变性、第一循环和终延伸，所述第一循环包括变性、退火和延伸； 所述第二扩增包括预变性、第二循环和终延伸，所述第二循环包括变性、杂交温度处理、临界温度处理、退火和延伸； 优选的，所述引物对，对应所述a-h突变位点，依次为； a:引物对A:上游引物为Seq ID N0.1所示序列，下游引物为Seq ID N0.2所示序列， b:引物对B:上游引物为Seq ID N0.3所示序列，下游引物为Seq ID N0.4所示序列， c:引物对C:上游引物为Seq ID N0.5所示序列，下游引物为Seq ID N0.6所示序列， d:引物对D:上游引物为Seq ID N0.7所示序列，下游引物为Seq ID N0.8所示序列， e:引物对E:上游引物为Seq ID N0.9所示序列，下游引物为Seq ID N0.10所示序列， f:引物对F:上游引物为Seq ID N0.11所示序列，下游引物为Seq ID N0.12所示序列， g:引物对G:上游引物为Seq ID N0.13所示序列，下游引物为Seq ID N0.14所示序列， h:引物对H:上游引物为Seq ID N0.15所示序列，下游引物为Seq ID N0.16所示序列； 优选的，所述常规PCR为荧光PCR; 优选的，所述退火中，其引物退火温度的确定包括: 利用所述关联基因的参考序列设计引物，获得引物对及引物退火温度预定值； 利用所述引物对，以所述引物退火温度预定值-5度所得温度值的±4度范围内的温度作为实验引物退火温度对核酸样品进行常规PCR，得到扩增产物； 选择扩增产物中的最优扩增产物，以所述最优扩增产物的实验引物退火温度作为所述引物退火温度； 优选的，所述引物的退火温度，对应所述A-H引物对，依次为: 引物对A:56-64°C，优选62 °C， 引物对B:56-64°C，优选62 °C， 引物对C: 56-64 °C，优选59 °C, 引物对D:56-64°C，优选61°C， 引物对E: 54-60 V，优选58 V， 引物对F:56-64°C，优选62 °C， 引物对G: 54-60 V，优选57 °C, 引物对H: 54-60 V，优选58 V ； 优选的，所述最优扩增产物通过扩增产物的电泳结果确定； 优选的，所述第二循环中，其临界温度的确定包括: 以引物对和引物退火温度，对核酸样品进行常规PCR，确定常规PCR扩增得到的样品扩增产物的Tm值； 以所述引物对、所述引物退火温度以及所述Tm值±2度范围内的温度作为实验临界温度，对突变型样品进行C0LD-PCR，根据COLD-PCR扩增结果确定临界温度； 优选的，所述临界温度，对应所述A-H引物对，依次为:引物对 A:83.5-85.5°C，优选 85°C，
引物对 B:81.5-83.5°C，优选 83.1°C,
引物对 C:91.5-93.5°C，优选 92.5°C,
引物对 D:86.5-88.5°C，优选 87.3°C,
引物对 E:81.5-84.5°C，优选 83.2V，
引物对 F:81.5-82.8°C，优选 81.9°C,
引物对 G:76.5-79.5°C，优选 78.3°C, 引物对 H:79-81°C，优选 80.4°C ； 优选的，所述常规PCR采用荧光PCR，根据荧光PCR扩增产物的溶解曲线确定Tm值； 优选的，所述突变型样品包括突变序列； 优选的，所述突变型样品选自真实样品和模拟样品中的至少一种； 优选的，所述突变型样品所含突变大于或等于1%。
5.一组引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对A、B、C、D、E、F、G和H中的至少一对: 引物对A:上游引物为Seq ID N0.1所示序列，下游引物为Seq ID N0.2所示序列； 引物对B:上游引物为Seq ID N0.3所`示序列，下游引物为Seq ID N0.4所示序列； 引物对C:上游引物为Seq ID N0.5所示序列，下游引物为Seq ID N0.6所示序列； 引物对D:上游引物为Seq ID N0.7所示序列，下游引物为Seq ID N0.8所示序列； 引物对E:上游引物为Seq ID N0.9所示序列，下游引物为Seq ID N0.10所示序列； 引物对F:上游引物为Seq ID N0.11所示序列，下游引物为Seq ID N0.12所示序列; 引物对G:上游引物为Seq ID N0.13所示序列，下游引物为Seq ID N0.14所示序列; 引物对H:上游引物为Seq ID N0.15所示序列，下游引物为Seq ID N0.16所示序列。
6.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于，所述引物对用于肿瘤靶向药物关联基因的检测、富集肿瘤靶向药物关联基因的突变或肿瘤靶向药物有效性的检测，所述肿瘤靶向药物关联基因为EGFR基因、KRAS基因和BRAF基因中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于:所述引物对用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的临界温度分别为:
引物对 A:83.5-85.5 °C，优选 85 °C ;
引物对 B:8L 5-83.5°C，优选 83.1°C ;
引物对 C:9L 5-93.5°C，优选 92.5°C ;
引物对 D:86.5-88.5 °C，优选 87.3 °C ;
引物对 E:8L 5-84.5°C，优选 83.2°C ; 引物对？:81.5-82.81:，优选81.91:;
引物对 G:76.5-79.5°C，优选 78.3°C ；
弓 I 物对 H: 79-81V，优选 80.40C ο
8.根据权利要求5所述的引物对，其特征在于:所述引物对用于COLD-PCR扩增，且进行COLD-PCR扩增时的退火温度分别为: 引物对A:56-64°C，优选62 °C， 引物对B:56-64°C，优选62 °C，引物对C: 56-64 °C，优选59 °C, 引物对D:56-64°C，优选61°C， 引物对E: 54-60 V，优选58 V， 引物对F:56-64°C，优选62 °C， 引物对G: 54-60 V，优选57 °C, 引物对H: 54-60 V，优选58 V。
9.一种试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂包括如权利要求5-8任一项所述的引物对，所述试剂盒包括所述`试剂或权利要求5-8任一项所述的引物对。
【文档编号】C12Q1/68GK103865993SQ201210551712
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月18日 优先权日:2012年12月18日
【发明者】林楚瑜, 王静静, 席凤, 管彥芳 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司