一种兼具导电和抗氧化性能的支架材料及其制备方法与流程

本发明属于组织工程生物材料制备技术，具体涉及一种兼具导电和抗氧化性能的支架材料及其制备方法。

背景技术：

心肌梗死是危害人类健康及生命的主要疾患之一，被诊断为心梗的患者的五年内存活率仅为50％。传统治疗手段无法从根本上修复受损心肌。近年来的研究表明，以生物材料和种子细胞为基础的心肌组织工程在心肌梗死的治疗方面具有潜在的应用前景。其中生物材料其非常关键的作用，可为受损心肌的修复提供必要的力学支撑，并为移植和宿主细胞的存活和增殖提供适宜的微环境。心肌是一种电活性组织(1.6×10^-3S cm^-1到5×10^-5S cm^-1)以传递电信号并引发心脏跳动，电信号传递对于心肌细胞类功能的发挥和受损心肌的修复具有十分重要的作用。但是目前心肌组织工程采用的大多数支架材料能够模拟心肌细胞外基质组分，主要包括，明胶、海藻酸钠、纤维蛋白、Matrigel和胶原等。虽然这些传统支架材料的使用一定程度上提高细胞在心梗区域的滞留率与存活率，同时促进受损心肌的修复。但是缺乏导电性的本质使其不利于细胞-细胞间电信号传递，致使体外构筑的工程化心肌的跳动是混乱和无规律的，缺乏与宿主心肌的整合能力，进而影响受损心肌的修复。因此研制基于导电的性的多孔支架材料是心肌组织工程的研究热点。

此外，局部缺血、缺氧和炎症微环境是心肌梗死的主要特征，因此，清除心梗区域过多的氧自由基(ROS)是心肌修复的关键。然而，以往的心肌组织工程用支架材料的研究多以提高材料的化学、物理以及加工性能为出发点，对其调控ROS的心梗微环境的功能的重视程度不足。因此，研制兼具导电特性和抗氧化能力的支架材料在心肌组织工程治疗心肌梗死临床转化方面具有潜在的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种兼具导电和抗氧化特性的多孔支架材料。

本发明的目的还在于提供上述新型心肌组织工程用支架材料的制备方法。

一种兼具导电和抗氧化性能的支架材料，由谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体和明胶复合而成；所述谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体质量百分比为1-70％。

所述谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体制备方法如下：

(1)将9.21g N-苯基-1,4-对苯二胺和丁二酸酐5.00g加入到300ml二氯甲烷搅拌反应12h，过滤，用乙醚洗涤沉淀，直到滤液无色，在真空干燥箱中干燥12-48h，获得N-((4-苯胺基)苯基)丁酰胺，备用；

(2)将步骤(1)获得的13.6g N-((4-苯胺基)苯基)丁酰胺和2.60g对苯二胺溶于72mL DMF中，冰浴搅拌2小时后，在其中加入预冷的288.39mL混合溶液，混合溶液中包含144.19mLDMF、120.16mL蒸馏水和20.04mL浓盐酸；

(3)将10.96g过硫酸氨溶于240.31mL 1mol/L的盐酸溶液中，并将其缓慢加入步骤(2)获得的混合溶液中，快速搅拌1-2h后，将该溶液加入1442mL蒸馏水中，过滤，获得沉淀，备用；

(4)将步骤(3)获得的沉淀溶于1442mL 1mol/L的氨水中，并加入13.72ml水合肼，搅拌还原过夜，加入1mol/L盐酸调至pH为2～3，过滤，将沉淀于真空干燥48h-72h，将其溶于100mL DMF中,然后缓慢滴加到快速搅拌的乙醇中，过滤，沉淀，在真空干燥，在索氏提取器中先用1,2-二氯乙烷抽提，再用四氢呋喃抽提12-24小时，干燥，得到羧基封端的苯胺五聚体，备用；

(5)将步骤(4)获得的0.77g羧基封端的苯胺五聚体，0.65g NHS以及1.175g EDC加入到10ml DMF中,室温充氮搅拌反应24h-36h，过滤，放在冷乙醚中沉淀，再用乙醇洗涤沉淀3遍。37℃烘箱烘干，产物为羧基封端的苯胺五聚体的活泼酯，备用；

(6)将1.8g谷胱甘肽溶于200ml DMF中,室温搅拌1h后，获得GSH的DMF溶液备用；

(7)将步骤(5)获得的2.542g羧基封端的苯胺五聚体的活泼酯溶于100ml DMF，并在其中加入步骤(6)获得的谷胱甘肽DMF溶液，搅拌反应24h-36h后，倒入300ml的超纯水中，沉淀，离心得沉淀物，37℃烘箱烘干，得到谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体。

上述兼具导电和抗氧化性能的支架材料的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)将明胶溶于二甲基亚砜中，配置质量浓度为8％的明胶二甲基亚砜溶液，备用；

(2)称取谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体加入步骤(1)制备的明胶二甲基亚砜溶液中，使谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体的浓度为1-70％，然后在其中加入0.9％的戊二醛水溶液，快速混匀后，室温下注入到模具中，静置其变成凝胶状；

(3)静置12h后，取出凝胶放入水中浸泡，浸泡3天，每天换3次水，再将凝胶放入已配置好的5％氰基硼氢化钠水溶液中浸泡4h，除去未反应戊二醛，水中浸泡24h，充分除去氰基硼氢化钠，形成明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽水凝胶；

(4)将步骤(3)获得的明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽水凝胶置于-45℃冰箱中预冻12小时以上，再放入冻干机中冷冻干燥，获得兼具抗氧化能力和导电特性的明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽支架材料。

所述明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽支架材料具有可调的电学特性和力学强度，其导电率为0.1-10×10^-5S/cm,压缩模量为60-140kPa。

上述的兼具导电和抗氧化性能的支架材料在修复受损心肌中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明制备的兼具导电和抗氧化性能的支架材料在化学结构上由生物相容性良好的明胶和导电抗氧化的谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体构成。该支架材料具有可控的力学强度(压缩模量：为60-140kPa)，可调的导电特性(电导率：4-10X10^-5S·cm^-1)。具有制备方法简单，组分均一可控的特点。本发明的制备的双网络导电水凝胶具有良好的生物相容性，能够支持多种细胞的粘附与生长。特别是在氧自由基问环境下可有效减小细胞的氧化应激损伤，同时可促进棕色脂肪来源的间充质干细胞向心肌细胞分化，且随着支架中水谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体含量的增加，分化效果越明显。这些优异的性能说明，该方法制备的兼具导电和抗氧化心梗的多孔支架材料在心肌组织工程中具有良好的应用前景。

附图说明

图1(A)苯胺五聚体-谷胱甘肽复合物合成路线，(B)羧基封端的苯胺五聚体及苯胺五聚体-谷胱甘肽复合物的核磁谱图，(C)羧基封端的苯胺五聚体及苯胺五聚体-谷胱甘肽复合物的分外光谱图。

图2明胶支架、明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽支架及明胶/羧基封端苯胺五聚体扫描电镜图。

图3棕色脂肪干细胞在支架中在正常环境和ROS微环境下培养7天时的HE染色照片。

图4棕色脂肪干细胞在支架中在正常环境和ROS微环境下培养7天时的DHE荧光染色照片。

图5棕色脂肪干细胞在支架中在正常环境和ROS微环境下培养7天时的cTnT荧光染色照片。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

实施所用的主要原料为明胶、N-苯基-1,4-对苯二胺、丁二酸酐、碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二氯甲烷、对苯二胺、戊二醛、四氢呋喃等均为化学纯。

实施例1兼具导电和抗氧化性能的苯胺五聚体-谷胱甘肽复合物合成

(1)将9.21g N-苯基-1,4-对苯二胺和丁二酸酐5.00g加入到300ml二氯甲烷搅拌反应12h。过滤，用乙醚洗涤沉淀，直到滤液无色。在真空干燥箱中干燥12-48h，获得N-((4-苯胺基)苯基)丁酰胺，备用。

(2)将步骤(1)获得的13.6g N-((4-苯胺基)苯基)丁酰胺和2.60g对苯二胺溶于72mL DMF中，冰浴搅拌2小时后，在其中加入预冷的288.39mL混合溶液(包含144.19mLDMF、120.16mL蒸馏水和20.04mL浓盐酸)。

(3)将10.96g过硫酸氨溶于240.31mL盐酸溶液(1mol/L)，并将其缓慢加入步骤(2)获得的混合溶液中，快速搅拌1-2h后，将该溶液加入1442mL蒸馏水中，过滤，获得沉淀，备用。

(4)将步骤(3)获得的沉淀溶于1442mL的氨水(1mol/L)中，并加入13.72ml水合肼，搅拌还原过夜。加入适量1mol/L盐酸调至pH为2～3，过滤，将沉淀于真空干燥48h-72h。将其溶于100mL DMF中,然后缓慢滴加到快速搅拌的乙醇中，过滤，沉淀，在真空干燥。在索氏提取器中先用1,2-二氯乙烷抽提，再用四氢呋喃抽提12-24小时，干燥，得到羧基封端的苯胺五聚体(CCAP)，备用。

(5)将步骤(4)获得的0.77g CCAP，0.65g NHS以及1.175g EDC加入到10ml DMF中,室温充氮搅拌反应24h-36h。过滤，放在冷乙醚中沉淀，再用乙醇洗涤沉淀3遍。37℃烘箱烘干，产物CCAP的活泼酯(AP-NHS)，备用。

(6)将1.8g谷胱甘肽溶于200ml DMF中,室温搅拌1h后，获得GSH的DMF溶液备用。

(7)将步骤(5)获得的2.542g AP-NHS溶于100ml DMF，并在其中加入步骤

(6)获得的谷胱甘肽DMF溶液，搅拌反应24h-36h后，倒入300ml的超纯水中，沉淀，离心得沉淀物。37℃烘箱烘干，谷胱甘肽修饰的苯胺五聚体(AP-GSH)。如图1为AP-GSH的形成过程及核磁和红外光谱表征。

实施例2兼具导电和抗氧化性能的明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽多孔支架制备

(1)将一定量的明胶溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置质量浓度为8％明胶DMSO溶液，备用。

(2)分别称取称取15mg,30mg,60mg和120mg的AP-GSH复合物分别加入步骤(1)制备的3ml明胶溶液中，使AP-GSH占明胶的百分比为6.25％，12.5％，25％和50％，搅拌2-3小时，形成均一稳定的溶液，备用。

(3)在步骤(2)获得的溶液中加入600μL的0.9％的戊二醛水溶液，快速混匀后，室温下注入到适宜的模具中，静置其变成凝胶状。

(3)静置12h后，取出凝胶放入水中浸泡，浸泡3天，每天换3次水。再将凝胶放入已配置好的5％氰基硼氢化钠水溶液中浸泡4h，除去未反应戊二醛，水中浸泡24h，充分除去氰基硼氢化钠，形成AP-GSH比例6.25％，12.5％，25％和50％水凝胶。

(4)将步骤(3)获得的Gel/AP-GSH水凝胶置于低温冰箱中预冻(-45℃)12小时以上，在放入冻干机中冷冻干燥，获得兼具抗氧化能力和导电特性的Gel/AP-GSH支架材料，该支架具有良好的空间结构(如图2所示)。

实施例3明胶/苯胺五聚体多孔支架制备

(1)将一定量的明胶溶于二甲基亚砜(DMSO)中，配置质量浓度为8％明胶DMSO溶液，备用。

(2)分别称取称取30mg的CCAP复合物分别加入步骤(1)制备的3ml明胶溶液中，使CCAP占明胶的百分比为12.5％，搅拌2-3小时，形成均一稳定的溶液，备用。

(3)在步骤(2)获得的溶液中加入600μL的0.9％的戊二醛水溶液，快速混匀后，室温下注入到适宜的模具中，静置其变成凝胶状。

(3)静置12h后，取出凝胶放入水中浸泡，浸泡3天，每天换3次水。再将凝胶放入已配置好的5％氰基硼氢化钠水溶液中浸泡4h，除去未反应戊二醛，水中浸泡24h，充分除去氰基硼氢化钠，形成CCAP比例为12.5％明胶/苯胺五聚体(Gel/CCAP)导电水凝胶。

(4)将步骤(3)获得的Gel/CCAP水凝胶置于低温冰箱中预冻(-45℃)12小时以上，在放入冻干机中冷冻干燥，获得导电性Gel/CCAP多孔支架材料。

实施例4兼具导电和抗氧化性能的明胶/苯胺五聚体-谷胱甘肽多孔在ROS微环境下的生物相容性

(1)将实施例3制备的多孔支架材料60Co辐照灭菌24小时，备用。

(2)将棕色脂肪干细胞，按照密度为8×105/ml的细胞种植在覆盖有支架的24孔板中，培养液中加入或不加100uM的双氧水，将其置于37℃培养箱中培养，隔天换液。

(3)培养7天时，对其进行切片并采用HE对其染色，如图4所示，支架中的细胞表现出很好的活性(如图3所示)，AP-GSH能够明显减少ROS对细胞的氧化应激损伤(图4所示)。

(4)培养7天时，对其进行切片并采用cTnT免疫荧光染色鉴定其向细胞分化的行为，如图5所示，在ROS微环境下兼具导电和抗氧化的多孔支架可促进干细胞向心肌细胞分化。

以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。