本发明尤其涉及一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法。
背景技术：
20世纪80年代以后，随着经济生活水平的提高，饮食结构与生活习惯发生了改变，使得高尿酸血症与痛风的发病率呈逐年递增趋势，国内外学者对其进行了大量的研究，在流行病学方面，高尿酸血症的发病率因种族和地区不同而有差异，各国报道不相一致，我国痛风发病率达0.26％～0.34％，高尿酸血症的发病率达5.78％～13.8％，痛风所伴随的高尿酸血症也已经成为冠心病、高血压的重要危险因素之一。(Abbott RD,Brand FN,Kannel WB,Castelli WP.Gout coronary heart disease:the Framingham Study[J].J Clin Epidemiol,1988,41(3):237-242.Johan Sundstrom,Lisa Sullivan,Ralph B.D Agostino,et al.Re-lations of Sterum Uric to Longitudinal Blood pressure Tracking and Hypertension Incidence[J].Hypertension,2005,45:25.)
马里诬那群岛(Marian)血尿酸均值在434.35±101.15umol/L，患病率达6.2％。新西兰不同种族的患病率为3.8％-5.9％，美国为0.5％-4.3％，南美为1.3％，整个欧美地区约2％-18％，痛风发病率欧美约占总人口0.13％-0.31％，年发病率约为0.020％-0.035％。古萍随机抽取2004年在广东省人民医院健康体检人群26621例的资料进行高尿酸血症患病率及相关疾病的发生率统计分析。高尿酸血症的患病率为21.8％，男性患病率显著高于女性。高尿酸血症中高脂血症、高血压、高血糖、冠心病、脂肪肝等发生率显著高于血尿酸正常组。(古萍.广州市体检人群高血尿酸症患病情况及相关疾病分析[J].中国热带医学,2006,6(6):1082-1084.)朱文华等对体检中心1249名体发现的高尿酸血症与高血脂和肥胖进行了分析，其中血尿酸增高364例，占29.1％，高脂血症325例，占89.2％，体重超标279例，占76.6％，明显高于正常组，且有统计学差异。由此可见作为嘌呤代谢紊乱的原发性痛风不仅与年龄，还与高血压、高血脂、糖尿病、冠心病、肥胖等密切相关。(朱文华,陈蕾倩,方力争等.高血尿酸症与血脂、肥胖相关因素分析[J].浙江预防医学,2004,16(12):70-74.)
目前对高尿酸血症和痛风的预防主要是限制高嘌呤食物，控制饮酒，在治疗上既要控制急性发作的关节炎，又要长期治疗高尿酸血症，预防痛风石沉积。化学药物分为治疗痛风性关节炎和纠正高尿酸血症两类。前者有秋水仙碱、非甾体类抗炎药、糖皮质激素，它们能快而有效地缓解疼痛，减轻炎症；后者有丙磺舒、苯溴马隆(促进尿酸的排泄)和别嘌呤醇(抑制尿酸的生成)。但这些药物的不良反应较多，苯溴马隆可导致严重的肝损害及神经系统不良反应。(张开达.痛风利仙致神经系统严重不良反应l例.中国医院药学杂志,2000,20:639.)别嘌呤醇是唯一在临床上使用的黄嘌呤氧化酶抑制剂，能够通过抑制黄嘌呤氧化酶抑制尿酸的生成，但其存在可致皮肤过敏、肝损伤、威胁生命的超敏变态反应综合症等毒副作用。降尿酸西药，由于品种单一，且存在不良反应，限制了临床应用。(郭丽萍,王睿.高血尿酸症的流行病学特点和药物应用[J].中国药物应用与监测,2006,3(4):24-27.)
中医药治疗高尿酸血症和原发性痛风的报道较多。在临床实践和日常生活中，人们发现一些能治疗高尿酸血症的行之有效的单味中药，其中很多药物的活性成分及药理作用已经被阐明。如萆薢、秦皮、白艾、朝鲜蓟、威灵仙、车前子、黄柏、金钱草、秦艽等有一定的降尿酸作用。(林伟青,谢健,王海东.白艾提取液对高尿酸血症大鼠的实验研究[J].中华风湿病学杂志,2005,9(8):509-510.林凤平,任开明,宋恩峰等.威灵仙对尿酸性肾病大鼠的实验研究[J].中成药,2006,28(6):842-845.)
研究显示，淫羊藿、薏苡仁、泽泻、车前子、秦艽能增加尿酸排泄，秦艽还可增加尿酸的溶解；泽兰、当归可抑制尿酸合成。另有研究显示，秦皮、车前草、大黄、苍术可促尿酸从肾排除，大黄能促尿酸从大便排出体外；百合、山慈菇等具有类秋水仙碱样作用，可抑制白细胞趋化性，从而减轻痛风性关节炎的炎症反应；冬瓜皮、大腹皮、桑白皮、陈皮、木香、茯苓皮等行气利水药可提高内生肌酐清除率，增加尿量，排出尿酸，降低血尿酸。(李表,孙林.现代肾脏病治疗学[M].南昌:江西科学技术出版社,2000,537-543.沈庆法.中医临床肾脏病学[M].上海:上海科学技术文献出版社,1998:206-211.)
咖啡豆为茜草科咖啡亚科咖啡属植物种子，微苦，涩，平，具醒神、利尿、健胃功效。咖啡豆及咖啡产品的化学成分已超过1500个，主要化学成分为挥发性成分、生物碱、酚类、咖啡酸衍生物、脂肪等。咖啡豆及咖啡产品含有丰富的化学成分，咖啡因具有很强的中枢兴奋作用，可减少睡意、减轻疲劳，保肝利胆，降血脂，抗氧化，清除体内自由基，抑制突变，抗癌，抗菌，抗病毒，免疫调节，解痉，降压等药理作用。
中药治疗高尿酸血症及痛风的疗效显著，但中药在使用过程中存在不足表现在几个方面：1、常规制备及服用方法不方便，如煎煮法，耗时、服用时味道重，且因个人的煎煮时间和煎煮方法不同，疗效不能完全保证；2、服用剂量大，煎煮或直接粉碎制备的剂型，组成成分包括了有效组分和无效组分，服用剂量大，不能达到专病专治的效果，且有可能产生毒副作用；3、运用现代分离纯化技术获取单体化合物产率低、成本高，不易实现规模化和产业化；4、通过现代合成技术实现该单体化合物群尚有一定技术难度，且成本高。
技术实现要素：
针对上述制备方法中化学药物不良反应多、中药使用不方便及服用剂量大的等问题，本发明提供一种从咖啡中提取用量小、使用方便、不良反应少的防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法。
本发明的目的将通过以下技术方案实现：一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，包括以下步骤：称取一定质量原料咖啡，敲破种皮，加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇回流提取2次，每次2h，合并2次的提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液pH值为9，搅拌，放冷，经过高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH为中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，将所得洗脱液制备成产品。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述的咖啡包括Coffeaabpuer A、Coffeaabpuer B、Coffeaabpuer C、Coffeaabpuer D、Coffeaabpuer E、Coffeaabpuer F、Coffeaabpuer G、Coffeaabpuer H中的一种或多种。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述产品包括胶囊剂、片剂、合剂、食品添加剂和保健茶。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述胶囊剂的制备方法为：所得洗脱液真空浓缩，真空干燥或喷雾干燥得细粉，加甘露糖20倍量、半乳糖、硬脂酸镁等辅料，制粒装胶囊。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述片剂的制备方法为：所得洗脱液真空浓缩，真空干燥或喷雾干燥得细粉，加入淀粉20倍量、硫酸钙、甘露糖，10％PVP(聚维酮)乙醇液20倍量，制粒，烘干，压片。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述合剂的制备方法为：所得洗脱液真空浓缩至相对密度1.2的浸膏，装瓶制作口服液。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述食品添加剂的制备方法为：所得洗脱液真空浓缩，真空干燥或喷雾干燥得细粉，作为食品添加剂。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述食品添加剂为保健食品添加剂，保健食品添加剂的制备方法为：所得洗脱液浓缩为相对密度1.2的浸膏，作为保健食品添加剂。
优选的，所述的一种从咖啡中提取防治高尿酸血症及痛风药食两用单体的制备方法，所述保健茶的制备方法为：所得洗脱液浓缩为相对密度1.2的浸膏，与铁观音茶叶按质量比1：50混合，置于55℃条件下烘干8小时，再粉碎成20目，灭菌包装入库，制成6g一包的降尿酸保健茶。
本发明的有益效果是：本发明所述咖啡豆中含有丰富的化学成分，所述单体为二萜与单链烷、烯、及双烯酸连接而成的酯类成分，且二萜环内具有内酯键，可通过碱开环成盐后加酸调节其pH，降低其在水中的溶解，达到初步纯化。本发明所述咖啡中含有绿原酸、咖啡酰基奎宁酸，二咖啡酰基奎宁酸，而这些成分能够有效降低尿酸，在临床上具有治疗高尿酸血症和痛风潜在应用。本发明采用水煎煮，去除咖啡中的挥发性成分，再用70％乙醇回流提取，大孔树脂纯化，有目的的富集目标单体化合物群，成本低，收率高，容易实现产业化和规模化。该发明制备的胶囊剂、片剂、合剂、食品添加剂以及保健茶等剂型，服用方便化、具有多元化特点。
具体实施方式
为更好地理解本发明，下面通过以下实施例对本发明作进一步具体的阐述，但不可理解为对本发明的限定，对于本领域的技术人员根据上述发明内容所作的一些非本质的改进与调整，也视为落在本发明的保护范围内。
实施例1、本发明制备的胶囊剂
1)称取原料咖啡豆，敲破种皮，3#空胶囊壳若干备用；
2)原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液其pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，真空干燥或喷雾干燥得细粉，加甘露糖20倍量、半乳糖、硬脂酸镁等辅料等辅料，制粒，烘干，装入3#空胶囊壳，每粒空胶囊壳装内容物约0.32g，洁净、选粒，制成适当包装规格的成品。
实施例2、本发明制备的片剂
1)称取原料咖啡豆，敲破种皮；
2)原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液其pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，真空干燥或喷雾干燥得细粉，加入淀粉20倍量、硫酸钙、甘露糖，10％PVP(聚维酮)乙醇液20倍量，制粒，烘干，压制成片重为约0.4g的原片，包糖衣，选片，制成适当包装规格的成品。
实施例3、基于发明制备合剂
1)称取原料咖啡豆，敲破种皮，10mL/支的口服液小瓶备用；
2)原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液其pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，浓缩至相对密度1.2，加入甜味剂、防腐剂、澄清剂、助溶剂等，放置，滤过，取滤液，灭菌，灌装成10mL/支的口服液，轧盖，制成适当包装规格的成品。
实施例4、本发明制备的食品添加剂
1)称取原料咖啡豆，敲破种皮；
2)原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液其pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，浓缩至相对密度1.2的浸膏，灭菌，适当容器密封，作为食品添加剂；或真空浓缩，真空干燥或喷雾干燥得细粉，适当容器密封，作为食品添加剂。
实施例5、基于发明制备保健茶
1)称取原料咖啡豆，敲破种皮，铁观音茶若干备用；
2)原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液其pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，所得洗脱液浓缩为相对密度1.2的浸膏，与铁观音茶叶按质量比1：50混合，置于55℃条件下烘干8小时，再粉碎成20目，灭菌包装入库，制成6g一包的降尿酸保健茶。
实施例6、本发明对高尿酸血症和痛风性的作用
实验动物：KM小鼠，SPF级，雄性，体重18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。正常饲养3天后供试。
药物与试剂：咖啡豆(市售)；腺嘌呤(批号：Z00070608)，广州市齐云生物技术有限公司；氧嗪酸钾(批号：T4514)，Adamas-beta(阿达玛斯-贝塔公司)；别嘌呤醇(上海信谊万象股份有限公司，批号：100583)；尿酸试剂盒(批号：20110314)南京建成生物工程研究所；尿素氮试剂盒(批号：20110225)南京建成生物工程研究所；肌酐试剂盒(批号：20110311)南京建成生物工程研究所。
本发明药物制备：称取咖啡豆，敲破种皮，原料药材加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并2次提取液，减压回收乙醇，加氨水调节提取液pH值至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调节滤液pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱,用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，真空浓缩，真空干燥或喷雾干燥得细粉，临用前用蒸馏水配制成所需浓度。
根据临床成人每日剂量0.03g/60kg和动物公斤剂量折算系数法换算出本发明低、中、高剂量组的剂量，即低剂量按0.015g·kg-1·d-1给药，中剂量组按0.030g·kg-1·d-1给药，高剂量组按0.060g·kg-1·d-1给药，别嘌呤醇组按0.04g·kg-1·d-1给药。采用腺嘌呤灌胃和氧嗪酸钾腹腔注射联合应用，造成高尿酸血症小鼠动物模型。取SPF级昆明种雄性小鼠60只，重量18-22g，随机分为6组，即本发明高、中、低剂量组、模型组、空白组和别嘌呤醇组。每组10只。空白组和模型组每天灌胃给予等量的蒸馏水。其余各组按照浓度灌胃给药，共14天。除空白组外，于给药后第10-14天灌胃给予腺嘌呤(50mg/kg)，于末次给药后1h，腹腔注射氧嗪酸钾(300mg/kg)。注射后2h眼眶取血分离血清，按照试剂盒说明进行操作，测定血清尿酸以及尿素氮含量。
表1中药组方对高尿酸血症小鼠血清尿酸含量的影响
注：*与模型组对照组相比较P＜0.01。▲与空白对照组相比较P＜0.05。
表1结果显示，与空白组相比，模型组小鼠血清尿酸含量显著增高(P<0.05)，说明高尿酸血症模型建立成功。与模型组相比较，本发明低、中、高剂量组，别嘌呤醇组均可显著降低高尿酸症小鼠血清尿酸含量(P<0.01)，本发明各剂量组与别嘌呤醇组比较，差异没有统计学意义(P>0.05)。
表2中药组方对高尿酸血症小鼠血清尿素氮含量的影响(
注：*与模型组对照组相比较P＜0.01。▲与空白对照组相比较P＜0.01。
表2结果显示，与空白组相比，模型组尿素氮含量明显升高(P<0.01)，本发明高剂量组显著降低高尿酸血症小鼠血清中尿素氮的含量(P<0.01)。本发明低剂量、中剂量组和别嘌呤醇组对高尿酸症小鼠血清尿素氮含量无明显影响(P>0.05)。
试验结论：本发明具有降低尿酸、改善痛风性肾病的作用。
实施例7、本发明亚慢毒性试验
实验动物：KM小鼠，SPF级，雄性，体重18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。正常饲养3天后供试。
药物与试剂：咖啡豆(广州市药材公司中药饮片厂)。
本发明药物制备：原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并提取液次，减压回收乙醇，加氨水调其pH至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩得滤液，用盐酸调pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱，用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，真空干燥或喷雾干燥得细粉，临用前用蒸馏水配制成所需浓度。
取KM小鼠80只，平均分为四组，灌胃前禁食10h，禁水6h。每天灌胃两次，每次0.6ml，连续14天，停药后再观察14天。本发明药物低剂量组：剂量为0.15g/kg/d，相当于人用量300倍；本发明药物中剂量组：剂量为0.75g/kg/d，相当于人用量的1500倍；本发明药物高剂量组：剂量为1.50g/kg/d，相当于人用量的3000倍；对照组：给予等量蒸馏水。
试验结果：各组小鼠动物给药5h内食量减少，兴奋，药物色溏便等，停药后恢复正常。各试验组在给药14d和停药后第14天时的平均体重与对照组相比无显著差异(P>0.05)。试验组小鼠的红细胞总数、白细胞总数、血红蛋白含量、血小板数在停药后第1天及停药后第14天与对照组相比无显著差异(P>0·05)。各个试验组小鼠的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶在停药后第1天及停药后第14天与对照组相比无显著差异(P>0.05)。在停药后第1天和第14天,剖检见各组心、肝、脾、肺、肾、胃和肠的形态、颜色、质地正常。病理组织学检查，本发明的高、中、低剂量组和对照组小鼠均未见明显病理变化。
经过实验，本发明的高、中、低剂量组均高于临床治疗剂量，在相应疗程内未发现任何亚慢性毒性反应。结合急性毒性试验，其用量相当于人用量的3000倍也未见任何毒副反应，因此本发明可作为防治高尿酸血症、痛风药用保健食品两用配方及制剂。
试验结论：本发明之亚慢性毒性试验表明本发明安全无毒。
实施例8、本发明急性毒性试验
实验动物：KM小鼠，SPF级，雄性，体重18-22g，由广州中医药大学实验动物中心提供。正常饲养3天后供试。
药物与试剂：咖啡豆(广州市药材公司中药饮片厂)。
本发明药物制备：原料加10倍量水煮沸1h，趁热过滤，残渣加20倍量70％乙醇加热回流提取2次，每次2h，合并提取液次，减压回收乙醇，加氨水调其pH至9，搅拌，放冷，高速离心浓缩液得滤液，用盐酸调pH至中性，上AB-8型大孔树脂柱，静态吸附2小时，用10BV水洗脱，弃去洗脱液，再用不同浓度乙醇由低至高依次洗脱,用薄层色谱法鉴别洗脱液中是否含有单体化合物群中某一单体及其相对含量，收集具有高占比目标化合物的洗脱液并合并，真空干燥或喷雾干燥得细粉，临用前用蒸馏水配制成所需浓度。
取KM小鼠80只，平均分为四组，灌胃前禁食10h，禁水6h。每天灌胃两次，每次0.6ml，连续7天。本发明药物低剂量组：剂量为0.15g/kg/d，相当于人用量300倍；本发明药物中剂量组：剂量为0.75g/kg/d，相当于人用量的1500倍；本发明药物高剂量组：剂量为1.50g/kg/d，相当于人用量的3000倍；对照组：给予等量蒸馏水。
试验结果：实验7天小鼠全部存活，仅见动物给药5h内食量减少，药物色溏便等，停药后恢复正常。4组动物在饮水、毛色、体重、粪便、及心、肝、脾、肺、肾、胸腺、脑、舌、胃、肠、膀胱、性腺(子宫、卵巢或睾丸和附睾)等主要脏器的形态、大小、光滑度等方面均无明显差异。以上说明，本发明毒副作用小，而且因受药物浓度和体积限制，找不出引起小鼠死亡的剂量，故无法测出本发明的LD50。小鼠最大给药量为1.50/kg/d，相当于人用量的3000倍。
实验结论：本发明之急性毒性试验表明本发明安全无毒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。