一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法与流程

本发明涉及一种体内止血敷料的制备方法，特别涉及一种以谷氨酰胺转移酶为交联剂的体内止血敷料的制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术：

胶原蛋白是一种高分子蛋白，一般呈白色、不透明的纤维状。它是生物体组成结构的主要成分之一，广泛地分布于动物的皮肤、骨骼和肌肉组织内。胶原具有止血性能，一方面可加强血小板的黏附和聚集形成血栓，阻止血液流出。另一方面，通过激活和诱导各种凝血因子还可启动内源性的凝血途径。但是胶原蛋白多来源于动物皮、筋腱等，可加工性差，在提取过程中会使蛋白部分生物活性丧失，而且其对人体而言属于一种异源物，可引起过敏等不良反应，应用于人体非常容易产生排异反应。因此需要寻找一种制备简单、安全性高的胶原蛋白作为原料。

谷氨酰胺转移酶是人体组织中本来就含有的一种酶，可与胶原蛋白发生交联反应，谷氨酰胺转移酶以肽键中谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基作为酰基的供体，以多肽链中赖氨酰残基于氨基作为酰基的受体，形成蛋白质分子内和分子间的ε-γ（-谷氨酰）赖氨酸异肽键。热交联是在真空条件下加热，使胶原分子严重脱水，自由羧基和羟基发生酯化反应以及羧基与氨基之间发生酰胺反应，从而改善止血敷料的机械性能，而且还可以保持止血敷料的内部孔状结构不变，使孔隙均匀完整。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种使用安全、可吸收、止血效果好的体内止血敷料的制备方法。

本发明的实现过程如下：

一种体内止血敷料的制备方法：以类人胶原蛋白为原料，加入注射用水搅拌溶解后，向类人胶原蛋白溶液中加入谷氨酰胺转氨酶进行交联后，通过控制降温速率为4-8 ℃/min进行降温预冻，真空冷冻干燥，Co60照射灭菌后得到体内止血敷料。

上述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白。

上述的类人胶原蛋白加入注射用水后的质量浓度为1%-5%；谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g。

具体来说，上述的体内止血敷料的制备方法，包括如下步骤：

（1）将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，使溶液中类人胶原蛋白的质量浓度为1%-5%；

（2）将溶液移入一次性无菌培养皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺转氨酶，谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g，反应温度为-4-0℃，交联时间为24-48小时；

（4）预冻过程中，降温速率控制为4-8 ℃/min；

（5）样品冻干处理24-72 h，冻干好的样品Co60照射灭菌10-30 h。

本发明具有以下优点：

（1）本发明所涉及的胶原蛋白为基因工程菌高密度发酵的人源性胶原蛋白，它从根本上解决了动物提取胶原蛋白的水不溶性和病毒隐患等问题，具有生物相容性好、促细胞生长、无病毒隐患和免疫排异反应低等优点，提高了体内止血敷料的安全性；

（2）本发明采用酶法交联，具体使用谷氨酰胺转氨酶交联胶原蛋白制备体内止血敷料，可以改善止血敷料的机械强度，提高止血效果，而且谷氨酰胺转移酶是人体组织中本身就含有的一种酶，其安全无毒，制备的止血敷料应用于临床时保证了其良好的生物安全性；

（3）本发明所制备的体内止血敷料合成工艺简单易实现，产品质量稳定、安全性高，工艺易放大且重现性能好，在医用生物材料与组织工程等相关领域有着良好的应用前景。

附图说明

图1为体内止血敷料的外观图；

图2为体内止血敷料的SEM图；

图3为体内止血敷料兔耳止血效果图；

图4为体内止血敷料兔肝脏止血效果图；

图5为体内止血敷料细胞毒性实验图；

图6 为体内止血敷料皮下植入图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。

一种体内止血敷料的制备方法，包括如下步骤：

（1）将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，搅拌使其完全溶解，使溶液中类人胶原蛋白的质量浓度为1%-5%，所述的类人胶原蛋白为使用基因重组大肠杆菌高密度发酵生产的一种人源型胶原蛋白；

（2）将溶液移入一次性无菌培养皿或模具中，每皿或每模具7-15 mL；

（3）加入谷氨酰胺转氨酶，加入谷氨酰胺转氨酶与类人胶原蛋白的比例为4-8U/g，反应温度为-4-0℃，交联时间为24-48小时；

（4）使用程序冷冻仪预冻过程中控制降温速率为4—8℃/min进行精确降温，一直降至-40—-80℃；

（5）在真空冷冻干燥机中冻干样品24-72 h；

（6）冻干好的样品通过辐照灭菌10-30 h。

本发明采用类人胶原蛋白为主要原料制备体内止血敷料，现有方法多采用超低温冰箱直接预冻，蛋白溶液直接置于低温，其中的液滴来不及反应而导致形成的冰晶杂乱无章，大小不一，在冻干时，冰晶升华而形成众多不均匀的孔，得到的体内止血敷料表面凹凸不平，边缘不整，机械强度差，止血功效低。而本发明中的预冻方法为按照设定的降温规律进行程序冷冻，冰晶的形成比较规律，当温度下降到一定程度时，首先形成许多晶核，随着温度继续下降，周围小液滴吸附到这些晶核表面后结晶，由于温度下降的速度恒定且一致，所有晶核的生长速率非常接近，最终形成形状大小接近的冰晶，冻干后得到大小接近的孔径，得到的体内止血敷料表面平整，孔径均一，机械强度大，在止血过程中不易被血流冲破而导致二次出血，大大提高了海绵的止血效果。

此外，对程序冷冻仪的降温速率进行深入的研究，如果降温速率大于10ºC/min，温度跳跃就会比较大，其冰晶的形成必然受到一定的影响，如果降温速率小于3ºC/min，富集在晶核上的液滴不能被快速的冷冻而有流动的可能，这样所有的晶体大小形状也都不规则。本发明的研究降温速率控制在4-8℃/min，得到的材料物化性能和止血效果最佳。

实施例1

将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为2.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应24 h，于程序冷冻仪中以-4℃/min的速度冻至-80℃，并保持2 h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干24 h，取出封装进行Co60辐照灭菌24 h，获得体内止血敷料。制备的海绵孔隙率为92%，吸水率为1500%。

实施例2

将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为2.5%，谷氨酰胺转移酶的质量为4U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应30 h，于程序冷冻仪中以-4℃/min的速度冻至-80℃，并保持2 h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干30 h，取出封装进行Co60辐照灭菌24 h，获得体内止血敷料。

实施例3

将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为4.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为6U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应40 h，于程序冷冻仪中以-6℃/min的速度冻至-80℃，并保持2 h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干48 h，取出封装进行Co60辐照灭菌24 h，获得体内止血敷料。

实施例4

将类人胶原蛋白溶解于注射用水中，溶解后，加入谷氨酰胺转移酶，搅拌使其完全溶解，使混合溶液中的类人胶原蛋白的质量浓度为5.0%，谷氨酰胺转移酶的质量为8U每克蛋白，置于-4℃冰箱交联反应48 h，于程序冷冻仪中以-8℃/min的速度冻至-80℃，并保持2 h，迅速转移至真空冷冻干燥机中冻干48 h，取出封装进行Co60辐照灭菌24 h，获得体内止血敷料。

实施例5

以下为本发明实施例1所制备的体内止血敷料的相关性能测试：

1.体内止血敷料外观观察

图1中，a为控制降温幅度预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的样品外观图，b为超低温冰箱自然预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的样品外观图。从图中可以看出相比于超低温冰箱直接预冻的体内止血敷料，采用程序降温预冻的体内止血敷料表面更加平整和均匀，褶皱也较少。

2. 体内止血敷料扫描电镜观察

图2中，a为控制降温幅度预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的表面扫描电镜图，b为超低温冰箱自然预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的表面扫描电镜图。从图中可以看出相比于超低温冰箱直接预冻的体内止血敷料，采用控制降温幅度预冻的体内止血敷料形成的孔比较完整，而且大小均匀，可以有效的增加敷料与创面的接触面积，提高止血效果。

3.体内止血敷料止血效果的测定

兔耳止血：以新西兰大白兔为动物止血模型，预先配好的2.5%戊巴比妥钠2mL缓慢注射于耳静脉，待兔子麻醉后将其固定在手术台上，使用弯剪剪去兔中央动脉出的兔毛，然后用安尔碘消毒液在兔耳部要做创面的地方进行消毒，用75%的酒精反复擦洗而脱掉碘液颜色，然后用手术刀片将耳部中央动脉切断，并将做的创面表皮撕下。动脉血大量流出时，快速用无菌医用纱布吸去，然后快速将提前准备好的一定大小海绵敷压于切好的创面，并用手按压止血。同时观察海绵在创面的粘附情况，记录完全止血时间，并对表面进行拍照。

兔肝脏止血：预先配好的2.5%戊巴比妥钠2mL缓慢注射于耳静脉，待麻醉后将其固定在手术台上，采用手术刀片将兔腹部打开，直到肝脏暴露出来，用刀片在肝叶上做一个同样大小的创面，大量的血液外流时，先用医用无菌纱布吸收，然后快速使用准备好的胶原蛋白海绵敷压创面，并用手按压止血，同时观察海绵在创面的粘附情况，记录完全止血时间，并对肝脏表面进行拍照。

图3中，a为控制降温幅度预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的兔耳止血图，b为超低温冰箱自然预冻的热交联类人胶原蛋白止血敷料的兔耳止血。图4中，a为控制降温幅度预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的兔子肝脏止血图， b为超低温冰箱自然预冻的酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的兔子肝脏止血图。经测定采用程序降温预冻的体内止血敷料的兔耳完全止血时间约为56s，肝脏完全止血时间为44s。从图中可以看出相比于超低温冰箱直接预冻的体内止血敷料，采用控制降温幅度预冻的体内止血敷料的兔耳创面止血以及肝脏的止血速度均更快，止血效果更好，这是因为其表面的光滑平整结构有利于其紧紧粘附于创面，内部大小均匀的孔状结构有利于其与血液中血小板和凝血因子之间的作用，增强了体内止血敷料的止血功效。

4. 体内止血敷料的细胞毒性检测

浸提液的制备方法：本实验的所有操作均在生物安全柜内完成。将灭菌过的海绵样品以0.1g/mL的比例浸入RPMI1640培养液中，用封口膜封住并放置在37ºC恒温条件下浸提72±2 h，取出样品后用0.2μm的无菌滤器过滤，以除去浸提液中的颗粒物质。

细胞培养：将传代后的BHK-21细胞经过胰蛋白酶消化后，加入新鲜培养液，反复吹打使细胞均匀分布在培养液中，使用血细胞计数板在倒置显微镜下计数，将细胞悬浮液稀释至10⁴~10⁵个细胞/mL，分别接种在96孔板上，每个孔100μL，并设置一组对照组。然后将接种好的96孔板置于37℃的CO₂培养箱中培养24h，待细胞贴壁后，将原有培养液吸出，加入样品浸提液，其中对照组和空白组中加入新鲜培养液，再放入生化培养箱中继续培养。

测定：分别于1, 3, 5和7天时取出一个孔板，每孔加入10μL的CCK-8液，37ºC下继续培养4h，使用酶标仪测在450nm时的吸收值，通过下列计算相对增殖率（relative growth rate，RGR）：

RGR=A1/A2×100%

式中：A1：实验组吸光度 A2：对照组吸光度

细胞毒性检测使用CCK-8试剂盒进行。细胞毒性检测试剂盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）是利用水溶性四唑盐能够被细胞内线粒体中的脱氢酶还原成橙黄色的水溶性物质Formazan的原理来检测细胞的增殖的，生成Formazan的量与细胞的数量成正关系，即活细胞数量越多，颜色就越深，越少颜色就越浅，也就是对细胞的毒性越大，通过酶标仪测定吸收值来间接分析细胞数量的变化。

图5中显示的是酶法交联类人胶原蛋白止血敷料、热交联类人胶原蛋白止血敷料、酶法交联动物胶原蛋白止血敷料和热交联动物胶原蛋白止血敷料浸提液对细胞生长的影响，从图中可以看出酶法交联动物胶原蛋白止血敷料和热交联动物胶原蛋白止血敷料的细胞毒性评价为2级，而酶法交联类人胶原蛋白止血敷料和热交联类人胶原蛋白止血敷料的细胞毒性评价为1级，并且随着细胞培养时间天数的增加，细胞存活率也随之升高，这说明本发明制备的体内止血敷料无病毒隐患，安全性高，生物相容性好，有促进细胞生长的作用，符合生物医用材料的要求。

5. 体内止血敷料的皮下植入

首先使用2.5%的麻醉剂在新西兰兔耳静脉注射2mL，然后将其固定在手术台上，四块手术布遮住其他地方只露出背部要植入的地方，用安尔碘对兔背部皮肤进行消毒，用75%酒精对手消毒。轻轻的用手夹起背部皮肤，然后用手术刀片轻轻的划开一个长约10mm的小口，切口时，需要小心观察兔子背部的毛细血管并避开，然后用镊子夹起预先准备好的样品止血材料，放入皮下，注意尽量与切口保持至少5mm，再进行切口缝合，缝合之后用安尔碘再次涂抹手术伤口消毒。一周后，将新西兰兔处死，观察兔内侧皮肤是否出现红肿、化脓以及溃烂等现象，来评价止血材料在生物体内的生物相容性。

图6中，a为1周后酶法交联类人胶原蛋白止血敷料的皮下植入图， b为酶法交联动物胶原蛋白止血敷料的皮下植入图。从图中可以看出，动物胶原蛋白体内止血敷料的皮下植入组织周围有明显的红肿及化脓现象，而类人胶原蛋白体内止血敷料的皮下植入组织周围没有出现红肿、化脓和溃烂等现象，说明本发明体内止血敷料无病毒隐患和生物排异性，安全性高，生物相容性好，是一种良好的生物医用止血材料。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。