一种可载药聚乙烯醇洗脱微球的制备方法与流程

本发明涉及一种可永久栓塞的药物载体的制备方法，涉及生物医药领域，尤其涉及一种可载药聚乙烯醇洗脱微球的制备方法。

背景技术：

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率均较高，全球肝癌的发病率呈逐年上升的趋势。我国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家，肝癌的发病率成为死亡率仅次于胃癌、肺癌的第三大恶性肿瘤。该病严重威胁人们的身体健康,常见的治疗肿瘤方案是采用手术切除法，但是对于中晚期的肿瘤患者来说,介入疗法(ranscatheter arterial chemoembolization,TACE)是比较理想的治疗方案。介入治疗指的是经导管动脉化疗栓塞术，即经导管将含药微球输入靶组织,阻断肿瘤的供血动脉并缓慢释放药物,从而提高化疗药物的局部浓度,降低了全身的毒副作用。一系列临床分析显示TACE能有效地控制肿瘤生长，延长患者生存期。对于不能手术切除的中晚期肝癌患者，TACE是首选的非手术治疗方法。

聚乙烯醇(PVA)是一种水溶性高分子聚合物，携带官能基团单一(只有羟基)又可以大量人工合成，被广泛应用于生产生活中多个领域，是一种非常安全的大分子有机物。它对人体无毒、无副作用，且具有良好的生物相容性，在医疗领域有着广泛的应用，例如PVA水凝胶应用在伤口敷料、人工关节和眼科；PVA薄膜应用在人工肾膜、药用膜等方面；针对癌症的治疗，由PVA制备的血管栓塞剂已应用在医学临床上。目前，以PVA作为原料制备栓塞微球已有一些报道，但是PVA用来制备载药微球尚有缺陷:一是传统的PVA微球只能起着机械栓塞的作用，无法负载药物；二是虽然近些年有人对PVA微球进行表面改性，试图接枝上载药基团，但接枝率低，使得微球的载药率低，药物易突释。另外纯PVA分子中氢键较多，链段之间相互作用强，形成的微球由于高结晶性而溶胀差，弹性不足，作为血管栓塞剂的材料柔软性不够。

技术实现要素：

针对上述缺陷，本文首先将2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸(AMPS)加入到聚乙烯醇溶液中，在引发剂作用下，对聚乙烯醇进行改性，使其接枝上大量的磺酸基团，同时，以N,N-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)做交联剂，在反相微悬浮条件下，制备出含有磺酸基团的聚乙烯微球。由于2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸分子中的磺酸基是强电离基团，亲水性极强，将该基团引入到聚乙烯醇分子上，可以大大提高聚乙烯醇糖微球对药物阿霉素的负载率；另一方面聚乙烯醇进行改性后，链段结构规整性破坏，减弱了结晶性，可以改善聚乙烯醇微球的溶胀性和柔顺性，更有利于微球在血管中的靶向栓塞。且含有磺酸基团的聚乙烯醇微球具有无细胞毒性、生物相容性好、原料来源广泛等优点。

本发明提供制备一种可载药聚乙烯醇洗脱微球作为药物载体的技术方案，依次包括以下步骤：

1)配制聚乙烯醇混合液，将聚乙烯醇、2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸按一定比例溶解在蒸馏水中，完全溶解后，加入N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶液，常温下磁力搅拌，混合均匀；然后再加入计量的过硫酸钾，搅拌数分钟。

2)改性聚乙烯醇微球的制备，将上述聚乙烯醇混合液滴入到油相里，完成乳化后，加入计量的的亚硫酸氢钠，采用反相微悬浮交联方法，在40℃条件下搅拌反应8小时后，加入少量盐酸和戊二醛，反应2小时，固化成球，最后用大量乙醇清洗数次、蒸馏水浸泡洗涤数次，真空干燥，得到粒径在100～700um含有磺酸基团的改性聚乙烯醇微球，即可载药聚乙烯醇洗脱微球。

具体的，所述步骤1)中，聚乙烯醇规格为1788型，聚乙烯醇混合液的质量分数为5％～15％，2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸的用量占聚乙烯醇质量的1～2倍，N,N-亚甲基双丙烯酰胺占聚乙烯醇质量的1％～10％，其方法是先将N,N-亚甲基双丙烯酰胺溶解在其质量6倍的N,N-二甲基乙酰胺中形成溶液，再将此溶液加入到聚乙烯醇溶液中。

具体的，所述步骤1)中，引发剂为过硫酸钾与亚硫酸氢钠的氧化-还原引发体系，过硫酸钾的用量占聚乙烯醇质量的1％，亚硫酸氢钠的用量是过硫酸钾质量的五分之一。

具体的，所述步骤2)中,油相为正庚烷、正辛烷、石蜡油或大豆油，油相与水相的体积比为4:1～8:1。

具体的，所述步骤2)中，乳化剂为司班80与吐温60按重量比4:1的复配物，其总用量占油相质量的1％～5％。

具体的，所述步骤2)中，将上述聚乙烯醇混合液逐渐滴入到油相里，通氮气保护，完成乳化后，加入计量的亚硫酸氢钠水溶液，接着升温至40℃，并控制搅拌速度为300～500rad/min，反应8h后，加入戊二醛，在浓度36％的盐酸催化下，固化成球，盐酸用量占聚乙烯醇质量的10％，戊二醛用量占聚乙烯醇质量的5％～20％。

本发明还提供一种可载药聚乙烯醇洗脱微球在制备药物载体中的应用方法，其特征是首先根据权利要求1所述的方法制备可载药聚乙烯醇洗脱微球，选择其中任何一微球品种0.5g，经过真空干燥，浸泡在饱和浓度的盐酸阿霉素水溶液中,在8℃温度下搅拌3小时，过滤出载药微球，用去离子水冲洗微球表面残留药物，真空干燥微球后密封保存，可在pH 7.4的磷酸缓冲液介质中释放药物。

可载药的洗脱微球在靶向导向肿瘤组织的动脉中，不仅阻断对肿瘤组织的营养供给，还可以释放抗肿瘤药物，随着肿瘤组织中抗癌药物浓度的升高，对病变部位起到抑制的作用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

1.使用一种新的制备方法，先在聚乙烯醇分子接枝上磺酸基团，再形成微球，使得微球中含有大量的磺酸基团，从而提高微球的载药率；

2.改善了微球的内部结构，提高了微球的溶胀性和柔软性，更有利于微球在血管中的靶向栓塞；

3.由于该微球含有磺酸基团，通过电荷吸附药物分子，大大消除了微球表面物理吸附而引起的突释，起到了缓释药物的目的；

4.制备出的洗脱微球无毒、细胞相容性较好，符合人体使用的安全性标准；在人体内可永久栓塞；

5.通过反相微悬浮聚合方法合成的洗脱微球，方法简单、条件温和，无副产物产生，反应完全，产物纯净。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下是本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

附图说明

图1为可载药聚乙烯醇洗脱微球的合成路线。

图2为改性前后聚乙烯醇的红外谱图，其中a：未改性聚乙烯醇；b：改性后聚乙烯醇微球。

图3为本发明中可载药聚乙烯醇洗脱微球的超景深显微镜照片。

图4为本发明中可载药聚乙烯醇洗脱微球在pH 7.4的磷酸缓冲液中的累计释放率曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

1)可载药聚乙烯醇洗脱微球的制备：

实施例1.

将1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.9g蒸馏水中，常温下，磁力搅拌至完全溶解，然后加入0.314g,14％MBA溶液，混合均匀后，再加入计量0.275g,4％过硫酸钾溶液，搅拌数分钟。量取50ml正庚烷，放入到250ml三口烧瓶中，加入0.68g(占油相质量的2％)乳化剂，其中司班80为0.544g，吐温60为0.134g(司班80与吐温60质量比为4:1)，常温下机械搅拌，转速为350rad/min，通氮气保护。完成乳化后，用微量注射器逐滴加入0.22g,1％亚硫酸氢钠溶液，然后升温至40℃，反应8h后，加入0.3ml盐酸和0.5g,25％戊二醛溶液，2h后，用大量乙醇破乳、清洗微球，反复洗涤数次，最后将微球放入35℃真空干燥箱中干燥24小时，得到粒径在100～700um的改性聚乙烯醇微球。

实施例2.

将1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.06g蒸馏水中，常温下，磁力搅拌至完全溶解。其他合成过程和实施例1相同。

实施例3.

将1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到9.90g蒸馏水中，常温下，磁力搅拌至完全溶解。其他合成过程和实施例1相同。

实施例4

将1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到11.12g蒸馏水中，常温下，磁力搅拌至完全溶解。其他合成过程和实施例1相同。

表1不同浓度的聚乙烯醇浓度对制备微球的影响

实施例5

将1.1g聚乙烯醇和2.2g,2-丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸加入到8.9g蒸馏水中，常温下，磁力搅拌至完全溶解，然后加入0.314g,14％MBA溶液，混合均匀后，再加入计量0.275g,4％过硫酸钾溶液，搅拌数分钟。量取50ml石蜡油，放入到250ml三口烧瓶中，加入0.80g司班80(占油相质量2％)，常温下机械搅拌，转速为400rad/min，通氮气保护。完成乳化后，用微量注射器逐滴加入0.22g,1％亚硫酸氢钠溶液，然后升温至40℃，反应8h后，加入0.3ml盐酸和0.5g,25％戊二醛溶液，2h后，用大量正己烷、异丙醇清洗微球，反复洗涤数次，最后将微球放入35℃真空干燥箱中干燥24小时，得到粒径在100～700um的改性聚乙烯醇微球。

实施例6

称取上述实施例1改性聚乙烯醇微球25mg,放入10ml,2mg/ml的阿霉素溶液中。室温下，缓慢震荡,通过使用紫外分光光度计，在不同时间段，检测波长在483nm处阿霉素溶液的浓度，计算微球的载药率，按照下列公式计算微球的载药率(LR)：

LR(％)＝W_D/W_S×100

式中W_D——微球中药物的质量，mg

W_S——投入微球的质量，mg

通过计算，改性后聚乙烯醇微球载药率达到23.5％。

实施例7

表面功能化可载药洗脱微球的合成路线图。如图1。

实施例8

分别取少量未改性聚乙烯醇和改性后的聚乙烯醇微球，使用全反射傅里叶红外光谱仪，在4000～500cm^-1的波数范围内进行红外吸收扫描，得到红外谱图。图2为改性前后聚乙烯醇的红外谱图，其中a：未改性聚乙烯醇；b：改性后的聚乙烯醇微球。

实施例9

选取粒径在400～500um的改性后聚乙烯醇微球,分别在超景深显微镜下观察微球形貌。图3为本发明中可载药聚乙烯醇洗脱微球的超景深显微镜照片。

实施例10

选取粒径均在400～500um的改性载药微球和未改性载药微球，各称取25mg,放入PBS(pH 7.4)缓冲溶液中，然后将其置于恒温水浴振荡器中，温度控制在37±0.5℃，定点量取5mL上清液，并及时补充相同体积的新鲜介质，通过紫外分光光度计检测缓冲液中药物含量，重复操作3次取平均值，计算不同时间段在PBS(pH 7.4)介质中的累计释放率，并绘制相应曲线。

图4为本发明中载药微球在PBS(pH 7.4)介质中的累计释放率曲线。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。