用于在微反应器中连续病毒灭活的方法与流程

本发明涉及用于在保留时间区段中连续病毒灭活的方法。

生物医药生产方法需要各种病毒减少的正交步骤。常用于灭活(涂覆的)病毒的方法是与酸性介质接触。

以批次模式在低ph值的病毒灭活是已知的且常用于活性成分，例如抗体的生物医药生产(sofer2003,virusinactivationinthe1990s-andintothe21stcentury.part4.biopharminternational)。在该情况下，将待灭活的材料，潜在含有活性病毒的液体，引入合适的容器中，使用酸性溶液调节至ph值≤4，如果需要进行均化，且使其静置所需的时间。在特定的依赖产品和方法的时间内通过病毒与酸性溶液的接触发生病毒的灭活。袋的整个内容物因此经历具有几乎相同保留时间的灭活，且因此所实现的病毒减少在容器的各个流体单元中同样是几乎相同的。

如果目前生物医药和生物产品(特别是药物抗体)的生产方法以连续操作模式进行，则必须实现用于病毒灭活所需的保持时间(=保留时间)。

在本申请的上下文中，连续病毒灭活意指进料流进料至病毒灭活模块中和从该病毒灭活模块不停地移除产物流。

对于进行连续病毒灭活的可能性是用uv-c光照射。wo2002038191、ep1339643b1、ep1464342b1、ep1914202a1和ep1916224a1描述了使用螺旋状保留回路，其中待灭活的材料用uv-c光照射且存在的病毒因此被灭活。如果流体流过螺旋卷绕的管时，离心力作用在流体上。这些离心力诱导二次流动(所谓的dean涡流)，其导致改进的径向充分混合且因此待灭活的材料的更均匀的照射。所述来源中使用的螺旋结构是直式螺旋卷绕而不改变螺旋轴的方向。对于低ph值下的连续病毒灭活的应用，因为，尽管保留时间分布相比于层状流通的直管的情况更窄，但它仍太宽，所以使用如在uv-c照射中所用的直式螺旋结构不是可行的。由于仍相当宽的保留时间分布，该几何形状额外需要大型设施用于ph-病毒灭活。

在层状管流中形成拋物线速度轮廓，由此出现宽保留时间分布(图1)。因为在管流中心的最大速度是中值速度的两倍，但在管壁处速度等于零(粘合条件)，在这些情况下出现非常宽的保留时间分布。所得保留时间在平均保留时间的一半(由在管中心的快速流动流体单元引起)和无限长保留时间(由在壁附近的粘附流体单元引起)之间。因为一方面对于病毒的有效灭活需要最小保留时间，但另一方面在低ph值下的长保留时间可能破坏产品(诸如，例如，蛋白质)，所以以连续操作达到窄保留时间分布是很重要的。从层状流动情况变成具有均一保留时间的湍塞流动在该情况下不是可接受的替代方案。湍流以高流速为前提。如果达到常见于低ph值下的病毒灭活的长保留时间(例如60至120分钟)时，不利地需要还具有大量压力损失的大型设施。

wo1998/02237描述了通过应用分段的程序(分段流方法)在连续操作的管状反应器中用于沉淀液体反应混合物的产物的拋物线速度轮廓的问题的解决方案，其中将不连续体积的反应混合物与不连续体积的与反应混合物不能混溶的分离液体分离，其中在管状反应器中的反应混合物的保留时间足以用于沉淀。在塞流条件（所谓的“塞流（plugflow）”）下产生不连续体积，且对于各个体积，反应条件基本上相同，以使得对于各个体积获得均匀产物。

tuercke等人描述了在微结构化反应器中以连续操作用于微粒产物(诸如，例如多种乳液和纳米粒子)的有机合成和生产以及聚合的分段传导—液体/液体或液体/气体(organicprocessresearch&development2009,13,1007–1013)。弗劳恩霍夫化学工艺研究所ict还使用分段相的方法用于分离细胞。此外，在用于取样和分析的baychromat®系统中在样品输送中使用分段相的技术(us2009/0178495)。

至今尚未研究或提及塞流条件或分段流对于同时需要长保留时间及窄保留时间分布的方法，例如在低ph值下的病毒灭活的适用性。

从现有技术出发，本发明的目的在于提供一种新型、简单且便宜的解决方案，其特别是在低的ph值和窄的保留时间分布的情况下实现在连续流通的保留时间区段中用于连续病毒灭活的所需保留时间。

本发明通过在具有0.01mm至6mm(优选0.5mm至3mm)的低水力直径的反应器1中的待灭活的产物流的连续病毒灭活的方法来实现该目的，所述方法包括下述步骤：

a)提供待灭活的产物流，

b)设定病毒灭活条件，

c)将与产物流不能混溶的分离介质引入产物流中以将产物流分段，

d)在由反应器1形成的保留区段中在病毒灭活条件下使来自c)的分段的产物流进料和通过，

e)从保留区段流出，

f)优选地连续分离出分离介质。

优选地，反应器，还有用于将产物流分段的与产物流接触的模块单元，是可灭菌的，优选可高压灭菌的、可伽马照射的或可用环氧乙烷(eto)气体处理的，这允许贫病菌或甚至无菌的操作。

优选地，反应器是管状反应器。特别优选地，使用由一次性材料制成的管状反应器，例如软管，其在使用后被丢弃以能够不用清洁。对于该特性，优选使用符合相关质量要求、例如医疗质量(uspvi类)的软管。例如，该管状反应器是由硅酮制成的软管。作为实例，可提及软管pharmed®-bpt(硅酮软管)、c-flex-374®(热塑性软管)或来自saint-gobainperformanceplastics的sanipure®，但本发明不限于此。在试验设施中，使用具有1.6mm的内径的sanipure®的市购软管。

管状反应器在其长度上的几何构型是任意的：直式的、卷绕的或弯曲的，条件是其不会折断。优选管状反应器的节省空间的布置。通常，管状反应器由支撑结构所支撑。例如，管状反应器围绕着彼此之上固定在底座上的框架卷绕，其中该框架可以是圆形或有棱角的。围绕着一个或多个柱的螺旋式卷绕也是可能的。对于uv灭活，该柱则可具有uv灯且该管状反应器对uv可以是透明的。此外，可建立经由加热管状反应器中的支撑结构的热病毒灭活条件。对于热灭活，该卷绕的结构还可被引入液体浴内以因此引起急剧的温度变化。

或者，可使用管状反应器，其由彼此之上堆叠的一个或多个板、特别是塑料板所形成，在板中并入具有引入口和引出口的通道。如果该板反应器包含多个板时，中心板的引入口和引出口如此定位，以使得通过该堆叠形成期望长度的连续通道。此外，该通道在其长度上的几何构型是任意的：直式的、卷绕的或弯曲的。

反应器1的横截面通常是圆形或椭圆形，但也可以是有棱角的。

在步骤a)中，提供液体的产物流，其可含有产物和潜在待灭活的病毒两者。

作为用于步骤b)的可能的病毒灭活条件，可提及低ph(优选≤4)、清洁剂、uv-或热处理。

优选地，在步骤b)中，产物流的ph值被设为≤4的值，条件是待灭活的材料的ph值并不已具有所需的值。产物流的ph值通常在进入病毒灭活的装置中之前通过传感器测定(图8)。通常，该ph-传感器不具有控制任务。记录ph-信号仅仅用作过程监控。待灭活的溶液的ph值例如可以通过添加hcl溶液而设定至≤4。通常在该装置用于病毒灭活的前部中添加。在步骤e)或f)之后，通常使用碱，例如氢氧化钠溶液(naoh)，将ph值设定至>4，以终止病毒灭活。中和作用可作为批次操作或作为连续生产方法进行，且因此可被整合至批次方法或连续方法中。

在根据本发明的方法中，使用与产物流不能混溶的相作为分离剂。优选地，该分离剂是油或气体诸如，例如空气、co2或氮气，优选气体，特别优选氮气，这是由于其就产物流而言的反应惰性以及在水性产物流中的低溶解度。

对于在步骤c)中引入分离剂和将产物流分段，反应器通常除了入口4之外还具有通常呈t型件形式的用于分离剂的入口6，与其连接的是用于脉冲引入分离剂的装置—具有连接的压力管线的致动开启阀或泵(图3)。分段例如使用每分钟0.1至200脉动的泵实现。

通常，反应器料流以1至1000l/min(优选10至100ml/min)的体积流速流过。

作为脉冲引入的替代方案，分离剂可经由膜连续进料。在该实施方案中，使用用于将产物流分段的模块，其包含一个或多个具有疏水壁的中空纤维，分离剂通过所述中空纤维被引入产物流中。还可以采用具有亲水壁的中空纤维模块，其中在中空纤维的内径中，分离剂被连续地输送且通过产物流的壁引入。该第二实施方案的前提是中空纤维的孔可以使产物通过。膜分段的使用的前提通常是病毒灭活条件不损害所需的膜性质。当使用清洁剂时，t型件的采用因此是优选的。

化学引入分离剂(例如co2)也是可能的，特别是如果病毒灭活条件耐受ph变化。

通过此类产物流的分段，通常形成0.1ml至100ml的产物流体积，在两个产物流体积之间的体积间隔为0.1ml至10ml。

通常，分段的最小长度，特别是分离剂分段的最小长度，是反应器的内径的三倍。分段的合理最大长度是保留区段的五分之一。

由于在反应器中的毛细作用和表面张力而获得相的分段，以使得一个相的两个分段通过另一相的一个分段分离。由此使在一个相的两个分段之间的反混（rueckvermischung）最小化且总体系的保留时间分布大大地变窄。

单个输送的产物流分段(=产物流体积)可被视为小的灭活容器，其总是完全清空且还仅最小程度地彼此混合。

通常，将在步骤d)中的产物流以0.1至1000、优选1至100、特别优选10至100ml/min的流速通常使用泵进料至反应器并输送。在该步骤中实现在病毒灭活条件、特别是酸性溶液和可能存在的病毒之间的期望接触时间(=保留时间)。保留时间长到足以灭活病毒而不太大地破坏产物。其在连续方法中的转化之前以批次方法通常通过实验测定，且通常为30min(对于ph-敏感的产物)至10h(对于低敏感的产物)。所需的保留时间以及最大保留时间是产物依赖性的。最大保留时间通常如此优化，以使得最少破坏产物，以尽可能不需要下游的纯化步骤。

作为根据本发明的方法的设计参数，可相应地提及：

•反应器的管内径di

•管长度l，其中管长度l和管的内径匹配于总设施的尺寸/设施的流通速率，以符合在各种应用情况下所要求的保留时间。

•所期望的体积流速、产物流体积、分离剂体积和脉冲重复频率。

分离剂通常通过经由重力、离心力或通过膜性质作用的分离器连续地分离出。

如果使用气体作为分离剂，通常将体积流连续地脱气。对于该目的，可使用吹泡阀(blasenfalle)、放气阀或优选膜脱气模块。

如果生产方法需要一次或多次ph值调节，则用于病毒灭活的装置通常连接至用于调节ph值的单元。通常，使用两个用于调节ph值的单元，第一个在灭活的上游用于将产物流调节至ph值≤4，另一个在灭活的下游用于中和产物流。

如果用于病毒灭活的装置被整合至连续生产方法中，则优选一个或多个用于调节ph值的单元，其中产物流流动通过再循环回路。图8通过实例的方式(但不限于此)描绘了病毒灭活和随后的中和。m0503将产物流输送至袋b0502中，在袋b0502中在离开病毒灭活之后将ph值调节至≥4的值。再循环泵m0504通过再循环回路输送袋b0502的内容物，在再循环回路中，ph传感器ph0502测量产物流的ph值。在传感器ph0502的料流工艺下游，计量添加用于调节ph值的调节剂（stellmittel）以控制ph值。这经由m0505的转速的预先设定进行。

在根据本发明的方法中，待灭活的产物流通常是来自生物反应器或色谱柱的溶液，特别是蛋白质-或肽溶液，例如抗体溶液。

根据本发明的连续病毒灭活相比于现有技术中常见的批次模式的病毒灭活的技术优点是其可整合至连续处理方法（也称为“下游处理”），而不需要改变方法程序。在该情况下，方法操作不用从批次转换为连续且再次转回，而是整个下游处理，任选地，整个生产方法(上游和下游)可连续地运行。此外，连续病毒灭活可更容易地与另外分批处理方法的连续分步骤组合。

本发明(包括优选的实施方案)与下文附图和实施例组合说明，但不限于此。所述实施方案可任意地彼此组合，条件是不能由上下文清楚地产生相反情况。

所用的附图标记是：

1=弯曲和/或螺旋状卷绕的管或软管

2=具有45°至180°的角度α的卷绕轴h的方向回转和/或转弯2

3=框架

4=入口

5=出口

6=支撑底座

7=脚

8=产物流管线。

图1显示具有层状通流的管的拋物线流动轮廓(上面：管的纵向截面)。在具有层状通流的管中的流动方向的等速度线(下面：管的横截面)。

a=管壁

b=在流动方向中管的轴方向

c=径向

d=在流动方向中等流速的线。

图2显示分段的原则。

图3显示用于脉冲引入分离剂的连接至管状反应器的替代装置。

图4显示具有后续ph值调节的病毒灭活的流程图，其中仅示意性显示用于病毒灭活的装置。

图5显示卷绕反应器管的有棱角的框架。

图6显示安装在底座上的多个框架。

实施例1：

对于实验研究，选择1.6mm的内径的软管。将管状反应器卷绕在具有下述尺寸的框架上-

框架直径为63mm；框架的外缘长度为195mm。框架根据图5制造，且安装在根据图6的底座上。

每臂始终进行11次具有最小距离的卷绕。每个框架所用的软管长度与框架直径成正比，前提是每个臂的卷绕数量恒定。

在该情况下，上部框架的出口与位于下部的框架的入口连接，以使得框架的软管卷绕从上部到下部连通。或者，还可能从下部至上部或以水平流通。

流通过试验设施的体积流速为约3ml/min。

在用于连续病毒灭活的装置中的用于保留时间测量的实验使用在系统出口的uv测量进行。

所用的追踪剂物质是具有0.25g/l的浓度的维生素b12溶液，因为维生素b12吸收在280nm波长的uv光且因此适合作为指示剂。

首先，该装置用蒸馏水冲洗。在时间点k，在病毒灭活的入口处，将系统切换至追踪剂溶液且开始记录uv传感器的测量信号(因此将追踪剂溶液的分级函数(stufenfunktion)输入系统。当在系统的出口处的uv信号对应于追踪剂溶液的uv信号时，可以终止实验，因为系统从该时间点完全地被追踪剂溶液填充且因此完全记录系统对分级函数的应答。

本申请的工作在欧洲区域发展基金(efre)的框架中的资金援助协议“bio.nrw:mobidik–modularebioproduktion–disposableundkontinuierlich”得到资助。