本发明涉及用于调节毛发生长的组合物和方法。具体而言，本发明涉及鉴定受试者例如具有雄激素性脱发或秃发或毛发损失的那些，其对前列腺素d2(pgd2)的毛发生长抑制易感并响应于pgd2受体、dp-2(又名crth2或gpr44)拮抗剂以刺激毛发生长。
背景技术：
百分之八十的高加索男性在70岁之前经历一定程度的雄激素性脱发(aga)。睾酮对于aga发展是必需的，雄激素受体中的遗传易感性基因座存在于少数具有aga的男性中；然而，造成这种疾病的其它因素仍然未知。对aga的研究有可能产生其它雄激素介导的疾病，例如良性前列腺肥大和前列腺癌。目前对aga的合法治疗包括非那甾胺、米诺地尔和毛发移植。非那甾胺抑制5-α还原酶2(srd5a2)，其将睾酮转化为更有效的雄激素二氢睾酮。米诺地尔在aga治疗中的活性靶点尚未被确定。
在aga中，形成粗毛干的大“末端”毛囊随着时间推移而小型化为产生细微柔弱毛发的小毛囊。毛囊小型化伴随着毛囊生长期(毛发生长期)的持续时间减少，其通常持续数年以产生超过1米长的毛发，但在aga中减少为仅数天或数周。这导致在秃发头皮中含有细微毛发的静息(毛发休止期)毛囊的百分比增加。
除了这些毛囊的内在变化之外，在小型化毛囊周围已经确定了浸润的淋巴细胞和肥大细胞，特别是在富含干细胞的隆起区域的区域中。附着在每个毛囊上的皮脂腺在秃发头皮中肥大。在秃发头皮中，毛囊干细胞的数量保持完整，而更活跃增殖的祖细胞的数量显著减少。这表明秃发头皮缺乏激活剂或具有毛囊生长抑制剂。
前列腺素d2(pgd2)及其合成酶pgd2合酶在具有雄激素性脱发的男性中以较高水平存在于秃发头皮相对于非秃发头皮。在小鼠模型中，pgd2通过两种pgd2受体之一的crth2/dp-2抑制毛发生长，表明dp-2是介导人毛囊中pgd2的毛发生长抑制活性的关键受体(garza等(2012)sci.transl.med.4,126ra34)。
因此，需要用于刺激毛发生长的组合物和方法以及确定谁可能响应于它们。
技术实现要素：
一方面，本文提供用于刺激受试者的毛发生长的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的dp-2拮抗剂。
另一方面，本文提供鉴定具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失的受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(i)对从受试者获得的基因组dna样品中的dp-2基因内或侧翼的单核苷酸多态性基因座进行基因型分型；以及(ii)基于在基因座处检测到的基因型，确定受试者是否可能响应于dp-2拮抗剂的施用。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者获得基因组dna的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括扩增基因组dna(例如通过pcr)的步骤。在一些实施方式中，通过测序含有基因座的dna区域来对基因组dna或扩增的基因组dna进行基因型分型。在一些实施方式中，基因组dna或扩增的基因组dna通过(i)使其与可检测标记的与基因座处的等位基因互补的寡核苷酸接触；以及(ii)检测存在或不存在基因座处(单核苷酸多态性)snp，以进行基因型分型。在一些实施方式中，所述基因座包含来自rs545659、rs634681和rs7167的一个或多个，优选全部的snp。
另一方面，本文提供鉴定和治疗具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失并且可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的受试者的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(i)如本文所述鉴定受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长；以及(ii)如果已确定受试者可能响应于dp-2拮抗剂，则向受试者施用治疗有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供鉴定和刺激可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的受试者的毛发生长的非治疗(即美容)方法。在一些实施方式中，所述方法包括(i)如本文所述鉴定受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长；以及(ii)如果已确定受试者可能响应于dp-2拮抗剂，则向受试者施用有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供治疗具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失并且具有表明受试者可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的一个或多个等位基因的受试者的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，snp的一个或多个，优选全部等位基因来自rs545659、rs634681和rs7167。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供刺激具有表明受试者可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的一个或多个等位基因的受试者的毛发生长的非治疗(即美容)方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，snp的一个或多个，优选全部等位基因来自rs545659、rs634681和rs7167。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供用于本文所述方法的dp-2拮抗剂及其组合物。
从以下详细描述的示例和附图中，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。然而，应该理解的是，在表明本发明的优选实施方式时的详细描述和具体示例仅仅是以示例的方式给出的，因为在本发明的精神和范围内的各种变化和修改从该详细描述中对于本领域技术人员是显而易见的。
附图说明
本专利申请文件至少包含一张彩色图纸。本专利申请公开的彩色照片复印件将由办公室根据要求提供并支付必要的费用。
图1.pgd2以剂量依赖性方式抑制外植体培养物中人毛囊的生长。a.在生长介质中培养7天的毛囊显示显著的生长。通过向培养介质中加入pgd2(10μm)严重抑制生长。10nm的dp-2拮抗剂am211的存在挽救了毛囊免受pgd2的抑制。b.pgd2以剂量依赖性方式对毛发生长发挥其抑制作用。c.培养7天后收获的毛囊的代表性组织学图像。d.在人头皮中，介导pgd2和拮抗剂作用的受体crth2/dp-2在表皮、毛囊角质形成细胞和皮脂腺(sg)中表达，但在真皮乳头(dp)中不表达。其表达水平在秃发(左)中相对于正常者(右)升高。
图2.crth2/dp-2的拮抗剂延长毛发生长期，即小鼠毛发周期的生长阶段，并增加毛干的长度。a.为了测试dp-2拮抗剂对体内毛发生长的作用，将am211以指定的剂量(每天一次，两周)局部施用于脱毛后8天的6-7周龄小鼠的背部皮肤。在脱毛后第22天收获处理小鼠的毛干和皮肤以分别进行长度测量和毛发周期阶段分析。b.来自处理小鼠的皮肤组织切片的代表性图像。根据形态学评估，将切片中的毛囊分为毛发周期阶段之一并计数。c.在对照组(仅用载体处理)中，几乎所有的毛囊都进入了毛发退化期和休止期，而am211处理组显示出毛囊进入退化期的剂量依赖性延迟。d和e.由于生长期延长，am211处理小鼠的皮肤具有更大的面积，毛囊继续生长并产生更长的毛干。
图3.由pgd2抑制crth2/dp-2逆转毛囊生长的拮抗剂。a.在外植体培养中，人类男性和女性毛囊对pgd2的抑制活性以及dp-2拮抗剂的抗pgd2活性具有同样的响应。在高剂量的am211中观察到的抗pgd2作用的降低可能是由于在am211制剂中未被识别的污染物，其被纯化至95％均一性，因为在高剂量下使用99.5％纯度的am211制剂导致持续的抗-pgd2活性(参见b)。*p<0.001。c.培养的毛囊对于增殖标记物(ki67，以红色显示)和细胞凋亡标记物(活性半胱氨酸蛋白酶3，以绿色显示)的免疫荧光染色显示pgd2抑制毛囊角质形成细胞的增殖并促进细胞凋亡。dp-2拮抗剂逆转毛囊中这两种pgd2引发的细胞事件。
图4.鉴定与在外植体培养中通过pgd2抑制毛发生长相关的人crth2/dp-2基因中的snp。a.人crth2/dp-2snp的位置最初被确定为pgd2活性易感性标志物的潜在候选者。人crth2/dp-2基因位于第11号染色体上。在35例测试患者中，21例患者的毛囊表现出pgd2介导的生长抑制，而其余14例患者的毛囊生长不受pgd2的影响。crth2/dp-2基因的dna测序以及snppcr显示大约70％的pgd2-敏感个体携带全部三种snp：rs545659、rs634681和rs7167(以红色显示)。c.费舍尔精确检验显示这三种snp很可能与这些患者对pgd2抑制的敏感性有关。
具体实施方式
本发明涉及用于调节毛发生长的组合物和方法。具体而言，本发明涉及鉴定受试者，例如具有雄激素性脱发或秃发或毛发损失的那些，其对前列腺素d2(pgd2)的毛发生长抑制易感并响应于pgd2受体、dp-2(又名crth2或gpr44)拮抗剂以刺激毛发生长。
在患有aga的男性的秃发头皮相对于毛发头皮中，发现消化和蛋白水平的前列腺素d2合酶(ptgds)水平升高。前列腺素d2(pgd2)的酶产物ptgds也被发现在秃发的人头皮组织中升高。在正常毛囊循环期间毛囊退化的小鼠中的ptgdsmrna和pgd2水平的升高之间显示了紧密的时间关系。此外，功能数据还显示，pgd2及其非酶促代谢物15-脱氧-d12,14-前列腺素j2(15-dpgj2)抑制小鼠和人毛囊中的毛发生长。在小鼠和人中，pgd2介导的毛发生长抑制需要g蛋白(异三聚体鸟嘌呤核苷酸结合蛋白)偶联受体44(gpr44或dp-2)，而不是前列腺素d2受体1(ptgdr或dp-1)。此外，在人aga皮肤拟表型中具有提高的pgd2水平的小鼠模型(k14-ptgs2)。这些结果表明pgd2和dp-2在毛发治疗的aga发病中的作用。
令人惊讶的是，脱发症患者子集的毛囊表现出pgd2没有生长抑制，表明存在pgd2响应和未响应个体。另外，在与pgd2抑制毛发生长的敏感性相关的crth2/dp-2基因中鉴定snp。在dp-2基因中具有不同基因型的pgd2响应和未响应个体的存在表明前者对dp-2拮抗剂刺激毛发生长的治疗更敏感，并且dp-2拮抗剂的敏感性可能不同。
另一方面，本文提供了鉴定具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失的受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的方法。在一些实施方式中，该方法包括：(i)对从受试者获得的基因组dna样品中dp-2基因内或侧翼的单核苷酸多态性基因座进行基因型分型；以及(ii)基于在基因座处检测到的基因型，确定受试者是否可能响应于dp-2拮抗剂的施用。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者获得基因组dna的步骤。在一些实施方式中，所述方法包括扩增基因组dna(例如通过pcr)的步骤。在一些实施方式中，通过测序含有基因座的dna区域而对基因组dna或扩增的基因组dna进行基因型分型。在一些实施方式中，基因组dna或扩增的基因组dna通过(i)使其与可检测标记的与基因座处等位基因互补的寡核苷酸接触；以及(ii)检测存在或不存在基因座处(单核苷酸多态性)snp，以进行基因型分型。在一些实施方式中，所述基因座包含来自rs545659、rs634681和rs7167的一个或多个，优选全部的snp。
另一方面，本文提供鉴定和治疗具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失并且可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的受试者的方法。在一些实施方式中，所述方法包括(i)如本文所述鉴定受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长；以及(ii)如果已确定受试者可能响应于dp-2拮抗剂，则向受试者施用治疗有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供鉴定和刺激可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的受试者的毛发生长的非治疗(即美容)方法。在一些实施方式中，所述方法包括(i)如本文所述鉴定受试者是否可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长；以及(ii)如果已确定受试者可能响应于dp-2拮抗剂，则向受试者施用有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供治疗具有雄激素性脱发、秃发或毛发损失并且具有表明受试者可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的一个或多个等位基因的受试者的方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，snp的一个或多个，优选全部等位基因来自rs545659、rs634681和rs7167。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供刺激具有表明受试者可能响应于施用dp-2拮抗剂以刺激毛发生长的一个或多个等位基因的受试者的毛发生长的非治疗(即美容)方法。在一些实施方式中，所述方法包括向受试者施用有效量的dp-2拮抗剂。在一些实施方式中，snp的一个或多个，优选全部等位基因来自rs545659、rs634681和rs7167。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是局部施用的。在一些实施方式中，dp-2拮抗剂是口服施用的。在一些实施方式中，所述方法还包括向受试者施用非那甾胺或米诺地尔。在一些实施方式中，所述方法还包括将毛囊移植到受试者。在一些实施方式中，所述方法还包括从受试者的皮肤去除真皮或表皮。
另一方面，本文提供了用于本文所述方法的dp-2拮抗剂及其组合物。
如本文所用，“dp-2拮抗剂”是能够降低细胞内或生理系统内的dp-2的量或活性的分子。例如，dp-2拮抗剂是可以选择性结合dp-2受体并抑制dp-2受体的生理作用的物质。
dp-2拮抗剂是本领域已知的。表1中显示了一些dp-2拮抗剂的实例：
表1
dp-2拮抗剂可以分成许多种类。一类是雷马曲班(ramatroban)及其类似物，其实例示于表1和2(tm30642-3-{3-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基}-丙酸；tm30643-[3-(4-氟-苯磺酰基-氨基)-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基]-乙酸；tm30089-{3-[(4-氟-苯磺酰基)-甲基-氨基]-1,2,3,4-四氢-咔唑-9-基}-乙酸)。
表2
另一类dp-2拮抗剂是吲哚乙酸衍生物。这类化合物的实例是表1的化合物6-9。
另一类dp-2拮抗剂是苯基乙酸衍生物。基于芬氯酸的这类化合物的实例是表1的化合物11。
另一类dp-2拮抗剂是四氢喹啉衍生物。这类化合物的实例是表1的化合物12、k117和k-104。
用于本文提供的方法和组合物中的某些优选的dp-2拮抗剂是已经为至少一项临床试验对象的dp-2拮抗剂。已经为至少一个临床试验对象的dp-2拮抗剂的实例包括但不限于以下表3中列出的那些：
表3临床阶段dp-2拮抗剂
anct数可以在网站：www.clinicaltrials.gov处查找。
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂setipiprant。其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂fevipiprant(qaw039)。其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂am211，其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂bi671800。其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂雷马曲班。其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂，其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂azd1981。其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂，其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂，其结构提供如下：
考虑用于本文提供的方法和组合物中的一种dp-2拮抗剂是dp-2拮抗剂amg853。其结构提供如下：
另外的dp-2拮抗剂可见于以下公开：ep1,170,594、ep1,435,356、wo2003/066046、wo2003/066047、wo2003/097042、wo2003/101961、wo2003/101981、wo2004/007451、wo2004/032848、wo2004/035543、wo2004/106302、wo2005/019171、wo2005/054232、wo2005/018529、wo2005/040112、gb2,407,318、wo2005/040114、wo2005/044260、wo2005/095397、wo2005/100321、wo2005/102338、wo2006/095183、wo2007/107772、us7,405,215，其中的每一个通过引用整体并入本文。
本文所述的组合物可以包含“有效量”。“有效量”是指在必要的剂量和时间内有效达到所需结果的量。有效量的分子可以根据诸如个体的状态、年龄、性别和体重以及分子在个体中引起期望响应的能力等因素而变化。有效量也是有益效果超过分子的任何毒性或有害效果的量。
本文提供包含dp-2拮抗剂的组合物。例如，本文提供用于刺激受试者的毛发生长的组合物，所述组合物包含：有效量的dp-2拮抗剂，以增强受试者的毛发生长。在另一个实例中，本文提供用于治疗受试者的雄激素性脱发或秃发或毛发损失的组合物，所述组合物包含：有效治疗所述受试者的所述雄激素性脱发或秃发或发毛损失的量的dp-2拮抗剂。在另一个实例中，本文提供包含dp-2拮抗剂和至少一种药学上可接受的赋形剂或载体的药物组合物。
“药学上可接受的载体”包括对暴露于所使用的剂量和浓度的细胞或受试者无毒的任何赋形剂。药物组合物还可以包含一种或多种另外的治疗剂。药学上可接受的载体包括溶剂、分散介质、缓冲剂、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、润湿剂、防腐剂、臭虫剂、螯合剂、抗氧化剂、等渗剂和吸收延迟剂。药学上可接受的载体包括水；盐水；磷酸盐缓冲盐水；葡萄糖；甘油；醇例如乙醇和异丙醇；磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；edta；成盐抗衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如吐温、聚乙二醇(peg)和pluronics；等渗剂例如糖、多元醇例如甘露醇和山梨糖醇、以及氯化钠；以及它们的组合。抗菌剂和抗真菌剂包括对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞。
本文提供的药物组合物可以以多种方式配制，包括例如固体、半固体(例如乳膏、软膏和凝胶)和液体剂型，例如液体溶液(例如局部洗剂或喷雾剂)、分散液或混悬液、片剂、丸剂、散剂、脂质体和栓剂。在一些实施方式中，组合物呈可注射或不可溶解的溶液形式。组合物可以是适于口服、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、经粘膜、透皮或局部施用的形式。优选地，组合物配制用于口服或局部施用。该组合物可以配制成立即、控制、延长或延迟释放的组合物。
更具体地，适合使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中水溶性的)或分散体以及用于临时制备无菌溶液或分散体的无菌粉末。它们在制造和储存条件下应该是稳定的，并且优选防止微生物例如细菌和真菌的污染作用。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)的溶剂或分散介质，以及它们的合适混合物。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣、通过在分散的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。用于本文公开的治疗方法的合适制剂描述于remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.，第16版，(1980年)。
组合物还可以包含等渗剂，例如糖、多元醇，例如甘露糖醇、山梨糖醇或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
无菌溶液能够通过将分子单独或与其它活性剂组合，以所需的量掺入本文列举的一种成分或成分组合的适当溶剂中，然后根据需要过滤除菌。通常而言，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和上面列举的所需其它成分的无菌载体中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，一种制备方法是真空干燥和冷冻干燥，以从其先前的无菌过滤溶液产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。加工注射剂的制剂，将其填充到诸如安瓿、袋子、瓶子、注射器或小瓶的容器中，并根据本领域已知的方法在无菌条件下密封。此外，制剂可以以试剂盒的形式包装和销售，例如在us2002/0102208中描述的那样，其全部内容通过引用并入本文。这种制品优选具有标签或包装说明书，以表明相关组合物可用于治疗患有或易患雄激素性脱发、秃发或毛发损失的受试者。
本文描述的组合物的有效剂量对于本文所述的方法而异，取决于许多不同的因素，包括所使用的特异性拮抗剂、受试者对该拮抗剂的敏感性、施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、是否给予其它药物、以及治疗是预防性还是治疗性的。通常而言，患者是人，但也能够治疗包括转基因哺乳动物的非人哺乳动物。治疗剂量可使用本领域技术人员已知的常规方法进行滴定以优化安全性和功效。
本发明的药物组合物可以包含“治疗有效量”。“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间内有效达到所需治疗结果的量。分子的治疗有效量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及分子在个体中引起期望响应的能力等因素而变化。治疗有效量也是治疗有益效果超过分子的毒性或有害效果的量。
本文还提供包含治疗有效量的dp-2拮抗剂的试剂盒。本文还提供治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用治疗有效量的dp-2拮抗剂。
如本文所用，关于抑制或刺激的术语“选择性”分别意指第一活性相对于第二活性的优先抑制或刺激(例如一种途径相对另一种途径的优选抑制；相对于其它受体优先抑制；或突变体相对野生型的优先抑制，反之亦然)。在一些实施方式中，期望的分子靶标或途径相对于不期望的分子靶点或途径，抑制剂的选择性大于5倍以上，选择性大于10倍以上，选择性大于50倍以上，选择性大于100倍以上，或者选择性大于1000倍以上。在一些实施方式中，拮抗剂或激动剂将分别抑制或刺激分子靶标或途径的第一活性，在相同条件下相对于第二活性为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍。应该理解的是，在优选的实施方式中，dp-2拮抗剂将通过前述任何量对dp-1具有选择性。分子靶标或途径的活性可以通过任何可重现的手段来测量，并且可以在体外或体内测量。
如本文所用，“调节”是指“刺激”或“抑制”分子靶标或途径的活性。例如，如果组合物刺激或抑制分子靶标或途径的活性，在相同条件但仅缺乏组合物的存在下，相对于分子靶标或途径的活性为至少10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约99％或更多。在另一个实例中，如果组合物刺激或抑制分子靶标或途径的活性，在相同条件但仅缺乏组合物的存在下，相对于分子靶标或途径的活性为至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍，则组合物调节分子靶标或途径的活性。分子靶标或途径的活性可以通过任何可重现的手段来测量。分子靶标或途径的活性可以通过本领域已知的适当测定在体外或体内测量。对照样品(未用组合物处理)可以被赋予100％的相对活性值。可以在测定中测量由组合物引起的活性变化。
应该理解的是，本文所述的许多拮抗剂是其靶标的强抑制剂。例如，拮抗剂的对于其期望分子靶标(即dp-2)的结合抑制活性(ic50值)可以为1000μm以下、1000nm以下、100nm以下、10nm以下、或特别是1nm以下。在另一个实例中，抑制剂的对于其期望分子靶标的结合抑制活性(ic50值)在1000μm与1nm之间、1000μm与10nm之间、1000μm与100nm之间、1000μm与1000nm之间、1000nm与1nm之间、1000nm与10nm之间、1000nm与100nm之间、100nm与10nm之间、100nm与1nm之间或10nm与1nm之间。
在一些实施方式中，本文公开的拮抗剂抑制其分子靶标或途径至少约10％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或约99％或更多。
预期各种剂量范围，并且可以基于所使用的拮抗剂和受试者对该拮抗剂的敏感性而变化。例如，拮抗剂的剂量在约0.1-1000mg/天，约1-1000mg/天、约5-500mg/天、约10-300mg/天、约20-200mg/天、约40-150mg/天、约60-100mg/天、约0.1-100mg/天、约0.1-50mg/天、约0.1-20mg/天、约0.1-10mg/天、约0.1-5mg/天或约0.5-5mg/天之间。
如本文所用，术语“治疗”和“治疗”是指治疗性治疗，包括防护性或预防性措施，其中目的是预防或减缓(减轻)与疾病或病症相关的不期望的生理变化。有益的或期望的临床结果包括但不限于缓解症状、减少疾病或病症的程度、稳定疾病或病症(即疾病或病症不恶化)、延缓或减缓疾病或病症的进展、疾病或病症的改善或减轻、以及疾病或病症的缓解(不论是部分或全部)，无论是可检测的还是不可检测的。如果不接受治疗，“治疗”也意味着与预期的生存期相比延长生存期。需要治疗的人包括那些已经患有疾病或病症的人，以及那些容易患有疾病或病症的人，或那些需要预防疾病或病症的人。
如本文所用，“多态性基因座”是鉴定两个或更多个等位基因的基因组基因座。如本文所用，“等位基因”是特定多态性基因组基因座的两种或更多种现有遗传变体中的一种。如本文所用，“单核苷酸多态性”或“snp”是已知替代碱基的基因组中的特定碱基位置。
如本文所用，“基因型”是指给定细胞或生物体中给定遗传基因座或一组相关基因座的等位基因的二倍体组合。纯合子携带两个拷贝的同一等位基因，杂合子携带两个不同的等位基因。在具有两个等位基因“a”和“a”的基因座的最简单情况下，可以形成三种基因型：a/a、a/a和a/a。如本文所用，“基因型分型”是指用于区分在一个或多个明确定义的基因座处的个体基因型的实验、计算或观察方案。
在一个实施方式中，治疗脱发是指治疗包括秃发的疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗雄激素性脱发(aga)。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗男性型秃发的疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗女性型秃发的疾病或病症。在一个实施方式中，治疗脱发是指治疗或预防身体任何部位的任何类型的毛发损失，包括但不限于头皮和眉毛。
在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗与脱发相关的疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗与盘状红斑狼疮相关的脱发疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗与先天性毛发萎缩症相关的脱发疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗与扁平苔藓相关的脱发疾病或病症。在另一个实施方式中，治疗脱发是指治疗瘢痕性脱发。
dp-2拮抗剂可以单独施用，或者与一种或多种其它治疗有效剂(例如非那甾胺、米诺地尔或两者)或治疗组合施用。其它治疗有效剂可以与dp-2拮抗剂缀合，掺入与dp-2拮抗剂相同的组合物中，或者可以作为单独的组合物施用。其它治疗剂或治疗可以在施用dp-2拮抗剂之前、期间和/或之后施用。在另一个实施方式中，dp-2拮抗剂独立于施用毛发促进剂而施用。在一个实施方式中，首先施用dp-2拮抗剂，然后施用毛发促进剂。在另一个实施方式中，首先施用头发促进剂，然后施用dp-2拮抗剂。
用于增强毛发生长的组合疗法的其它治疗有效剂/治疗包括例如但不限于移植手术和去除真皮或表皮。
dp-2拮抗剂与其它药剂和/或治疗剂的施用可以在相同或不同的时间通过相同或不同的途径同时或分开进行。可以调整剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗性或预防性响应)。
在一个示例中，可以施用单次推注。在另一个示例中，可以随着时间施用几个分开的剂量。在又一个示例中，如治疗情况的紧急情况所示，可以按比例减少或增加剂量。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为治疗哺乳动物受试者的单位剂量的物理上分散的单位。每个单位可以含有预定量的活性化合物，其计算为产生所需的治疗效果。在一些实施方式中，本发明的剂量单位形式由活性化合物的独特特征和要达到的特定治疗或预防效果决定并且直接取决于活性化合物的独特特征和要达到的特定治疗或预防效果。
本文所述的组合物可以仅施用一次，或者可以多次施用。对于多次剂量，组合物可以例如一天三次、一天两次、一天一次、每两天一次、一周两次、每周一次、每两周一次或每月一次施用。
要注意的是，剂量值可以随待缓解的病症的类型和严重程度而变化。应当进一步理解的是，对于任何特定受试者，应根据个体需要以及施用或监督组合物施用的人员的专业判断随时间调整特定剂量方案，并且本文阐述的剂量范围只是示例性的而并不意图限制所要求保护的组合物的范围或实践。
对受试者的“施用”不限于任何特定的递送系统，并且可以包括但不限于局部、透皮、口服(例如胶囊、混悬剂或片剂)、肠胃外(包括皮下、静脉内、髓内、关节内、肌肉内或腹膜内注射)或直肠。对受试者的施用可以以单次剂量或重复施用，以各种生理学可接受的盐形式中的任一种和/或作为药物组合物的一部分(如前所述)与可接受的药物载体和/或添加剂而进行。再一次，生理上可接受的盐形式和标准药物制剂技术是本领域技术人员熟知的(参见例如remington'spharmaceuticalsciences，mackpublishingco.)。
术语“受试者”包括哺乳动物，例如人、伴侣动物(例如狗、猫、鸟等)、农场动物(例如牛、绵羊、猪、马、家禽等)和实验室动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠、鸟类等)。在一些实施方式中，所述受试者是男性或女性人类。
如本文所用，短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其它问题或并发症的那些化合物、材料、组合物、载体和/或剂型，与合理的利益/风险比相称。
“药学上可接受的赋形剂”意指可用于制备通常安全、无毒并且在生物学上或其它方面没有不合需要的药物组合物的赋形剂，并且包括可接受为兽用以及人药用途的赋形剂。如本文所用的“药学上可接受的赋形剂”包括一种和多于一种这样的赋形剂。
本文所述的化合物也可以制备成前药，例如药学上可接受的前药。术语“前-药”和“前药”在本文中可互换使用，并且可以指在体内释放活性母体药物的任何化合物。由于已知前药能增强药物的许多所需性质(例如溶解度、生物利用度、制造等)，所以本文所述的化合物可以以前药形式递送。
术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值。
在一些实施方式中，所述方法包括从受试者获得基因组dna样品。例如，可以首先获得来自个体的生物样品。这种生物样品包括但不限于体液(例如尿、唾液、血浆或血清)或组织样品(例如口腔组织样品或口腔细胞)。然后可以使用已知方法将生物样品用于获得或扩增基因组dna。
核酸突变可以通过许多已知方法中的任一种来确定。在一些实施方式中，dna阵列能够用于分析个体的至少一部分基因组序列。示例性的dna阵列包括基因芯片阵列、genflex标签阵列和全基因组人snp阵列6.0(可得自affymetrix，santaclara，ca)。
在某些实施方式中，全部或部分基因组序列信息是可以使用包括链终止(sanger双脱氧核苷酸)、染料终止子测序和solidtm测序(appliedbiosystems)的标准测序方法测定的这种序列。基因组序列可以通过限制性内切酶切割或剪切(机械)成较短的片段以用于测序。也能够使用已知方法例如pcr和基于载体的克隆方法(例如大肠杆菌)扩增dna序列。
在一些实施方式中，使用例如常规dna测序仪或基于芯片的技术对个体的遗传物质(例如dna、rna、mrna、cdna、其它核苷酸碱基或其衍生物)的至少一部分进行扫描或测序以鉴定存在或不存在一个或多个snp及其相应等位基因。
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呈现以下实施例是为了更全面地说明本发明的优选实施方式。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
crth2/dp-2拮抗剂逆转由pgp2引起的毛发生长抑制
雄激素性脱发(aga)是最常见的脱发类型，在50岁以前影响大约50％的男性和30％的女性。除了睾酮是男性发生aga的必要因素之外，其它促进因素仍然未知。通过施用药物非那甾胺(propecia)阻断睾酮转化为其更有效的形式二氢睾酮，使早期aga患者受益，但没有完全逆转毛发小型化。这表明发展更有效的治疗取决于确定也有助于aga发展的其它因素。
为了实现这一目标，我们以前使用全局基因表达方法来发现来自相同个体的秃发与非秃发头皮中差异表达的基因(garza等(2012)sci.transl.med.4,126ra34)。我们发现前列腺素d2合酶(ptgds)及其催化产物pgd2的水平在男性秃发期间升高。我们进一步提供了功能性数据，表明pgd2抑制毛发生长，抑制作用是通过gpr44敲除小鼠中的dp-2受体(akagpr44，crth2)介导的。pgd2水平升高导致脱发进一步在小鼠模型(k14-ptgs2)中得到验证，该模型设计为在皮肤中产生增加的pgd2水平。这些小鼠经受毛囊渐进性小型化和皮脂腺增生，均为人aga的特征。这些结果暗示pgd2在aga中起着致病作用，并为旨在预防脱发和促进毛发生长的药理干预提供新的靶点。
在该实施例中，在器官培养系统中测试了多种dp-2拮抗剂对人毛囊生长的影响，并研究了dp-2拮抗剂对小鼠体内毛发周期的影响。
材料和方法
组织：头皮从chtn和正在进行毛发移植的男性和女性中通常被丢弃的人皮肤样品获得(irb豁免研究方案*818053)。
所使用的dp-2拮抗剂：am211(amira)、setipirant(actelion；数据未显示)。
毛囊器官培养物：从毛发移植患者的废弃组织中显微解剖毛囊，如philpott等人所述(j.dermatol.sci.suppl：s55-72.(1994))在存在或不存在pgd2和/或dp-2拮抗剂的情况下培养七天，每两天更换一次培养介质。在培养期开始和结束时对毛囊进行照相。使用imagej软件从照片测量毛囊生长。
免疫染色：在固定在4％pfa中的培养毛囊或整个山羊毛囊的冷冻切片上进行抗ki67和抗半胱天冬酶-3的免疫荧光分析。用leica荧光显微镜拍摄图像。
动物研究：在6-7周时将c57bl小鼠的背部皮肤脱毛。将dp-2拮抗剂溶于95％etoh/2％甘油/3％peg中。将100μl每种化合物从脱毛后第8天开始每天一次涂抹在剃过的背部皮肤上2周。在脱毛后的第22天，摘取毛发杆来测量毛发长度，并收集皮肤用于毛发周期阶段的组织学评估。
snp分析：从35个捐献者(组1)中提取基因组dna，包括21个对毛囊器官培养物中的pgd2抑制敏感的捐献者和14个不敏感的捐献者。随后收集了88个新样本，其中65个捐献者(组2)有可用的培养数据。通过多重pcr扩增整个人dp-2基因(含有两个外显子和一个内含子)以及4kb侧翼区，并通过铁激序列测序法进行测序。通过费舍尔精确检验分析snp与pgd2敏感性的关联。
结果和讨论
pgd2以剂量依赖性方式抑制外植体培养物中人毛囊的生长(图1)。在生长介质中培养7天的毛囊显示显著的生长。但是通过向培养介质中加入pgd2(10μm)严重抑制了生长，而10nmdp-2拮抗剂am211的存在挽救了毛囊免受pgd2抑制(图1a)的影响。b.pgd2以剂量依赖性方式对毛发生长施加其抑制作用(图1b)。培养7天后收获的毛囊的代表性组织学图像示于图1c中。d.在人头皮中，介导pgd2和拮抗剂作用的受体crth2/dp-2在表皮、毛囊角质形成细胞和皮脂腺(sg)中表达，但不在真皮乳头(dp)中表达(图1d)。其表达水平在秃发(图1d，左)中相对于正常(图1d，右)升高。
为了测试dp-2拮抗剂对体内毛发生长的作用，将am211以指定剂量(每天一次，两周)局部施用于脱毛后8天的6-7周龄小鼠的背部皮肤(图2a)。在脱毛后第22天收获处理小鼠的毛干和皮肤以分别进行长度测量和毛发周期阶段分析。图2b中示出处理小鼠的皮肤组织切片的代表性图像。根据形态学评估，将毛囊切片分为毛发周期阶段之一并计数。在对照组(仅用载体处理)中，几乎所有的毛囊都进入了退化期和休止期，而am211处理组在毛囊进入退化期时表现出剂量依赖性的延迟(图2c)。延长毛发生长的结果是am211处理的小鼠皮肤具有更大的面积，毛囊继续生长并且产生更长的毛干(图2d和2e)。
在外植体培养中，人类男性和女性毛囊对pgd2的抑制活性以及dp-2拮抗剂的抗pgd2活性具有同样的响应(图3a)。在高剂量的am211中观察到的抗pgd2作用的降低可能是由于在am211制剂中未被识别的污染物，其被纯化至95％的均一性，因为在高剂量下使用99.5％纯度的am211制剂导致持续的抗-pgd2活性(参见图3b)。培养的毛囊对于增殖标志物(ki67，以红色显示)和细胞凋亡标志物(活性半胱天冬酶3，以绿色显示)的免疫荧光染色显示pgd2抑制毛囊角质形成细胞的增殖并促进细胞凋亡(图3c)。dp-2拮抗剂逆转毛囊中这两种pgd2引发的细胞事件。
在位于第11号染色体上的人crth2/dp-2基因中鉴定出与在外植体培养物中通过pgd2抑制毛发生长相关的snp(图4)。图4a和c显示5个(61个中)人crth2/dp-2snp的位置，最初被鉴定为pgd2活性易感性标志物的潜在候选者。这5个潜在候选者是：(1)rs545659，其中t为参考碱基，c为次要等位基因频率(maf)为0.338的次要等位基因；(2)rs634681，其中g为参考碱基，a为maf为0.335的次要等位基因；(3)rs7167，其中a为参考碱基，g为maf为0.338的次要等位基因；(4)rs41465646，其中g为参考碱基，a为maf为0.083的次要等位基因；以及(5)rs41382844，其中g为参考碱基，a作为maf为0.105的次要等位基因(见表7)。
在最初测试的35例患者(组1)中，21例患者的毛囊显示出pgd2介导的生长抑制，而其余14例患者的毛囊不受pgd2生长的影响(表4，图4b)。crth2/dp-2基因的dna测序以及snppcr显示大约70％的pgd2-敏感个体携带全部三种snp：rs545659、rs634681和rs7167(以红色显示)。费舍尔精确检验显示，这三个snp很可能与这些患者对pgd2抑制的敏感性有关(图4c)。
随后收集了88个新样本，其中65个捐献者(组2)有可用的培养数据。在组2中测试的65例患者中，31例患者的毛囊显示pgd2介导的生长抑制，而其余34例患者的毛囊不受pgd2生长的影响(表5和6)。crth2/dp-2基因的dna测序以及snppcr显示：在组2中，22/31＝70.96％(相对于组1中的66.7％)的pgd2-敏感个体携带snp的所有三个次要等位基因：rs545659、rs634681和rs7167(表5)。在组2中，8/34＝23.53％(相对于组1中的28.57％)的pgd2-不敏感个体携带snp的所有三个次要等位基因：rs545659、rs634681和rs7167(表6)。费舍尔精确检验显示，这三个snp很可能与组2患者对pgd2抑制的敏感性相关(p<0.001)。
当将组1和组2的100个样品的结果结合时，52例患者的毛囊显示出pgd2介导的生长抑制，而其余48例患者的毛囊不受pgd2的生长影响。对于52个pgd2敏感个体，36/52(69.23％)携带三个snp的次要等位基因：rs545659、rs634681和rs7167，而其余16/52(30.77％)pgd2敏感个体对于这三个snp的主要等位基因是纯合的。对于48个pgd2-不敏感个体，仅有12/48(25.0％)携带三个snp的次要等位基因：rs545659、rs634681和rs7167，而其余36/48(75.0％)pgd2-不敏感个体对于这三个snp的主要等位基因是纯合的。费舍尔精确检验显示，这三个snp很可能与患者总人群对pgd2抑制的敏感性相关(p<0.001)。表7比较了一般人群中pgd2-敏感和pgd2-不敏感个体的次要等位基因频率。
表4：测试样品的捐献者信息
表5：pgd2敏感(31)
表6：pgd2不敏感(34)
表7：一般人群相对于捐献者中的次要等位基因频率
在本实施例中，我们已经证明pgd2通过抑制毛囊上皮细胞的增殖并诱导细胞凋亡以剂量依赖性方式抑制毛囊生长。crth2/dp-2拮抗剂有效逆转pgd2对男性和女性毛囊的抑制。在本实施例中，我们已经证明pgd2通过抑制毛囊上皮细胞的增殖并诱导细胞凋亡从而以剂量依赖性方式抑制毛囊生长。另外，crth2/dp-2拮抗剂有效逆转pgd2对男性和女性毛囊的抑制作用。更具体地说，当在生长期期间直接施用于小鼠皮肤时，酒店动物模型crth2/dp-2拮抗剂延长了生长期并促进了较长的毛干。
脱发症患者子集的毛囊表现出pgd2没有生长抑制，表明存在pgd2响应和未响应个体。另外，在与pgd2抑制毛发生长的敏感性相关的crth2/dp-2基因中鉴定snp。在dp-2基因中具有不同基因型的pgd2响应和未响应个体的存在表明前者对dp-2拮抗剂刺激毛发生长的治疗更敏感，并且dp-2拮抗剂的敏感性可能变动。
本领域技术人员应该理解，可以对上述实施方式进行改变而不背离其广泛的发明构思。因此，应该理解的是，本发明不限于所公开的特定实施方式，而是旨在覆盖在由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的修改。