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相关申请
本申请要求2015年12月15日提交的美国临时专利申请号62/267,723的优先权权益，该临时专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景
反义技术提供一种调节包括可变剪接产物的一种或多种特定基因产物的表达的手段，并且唯一地适用于许多治疗、诊断以及研究应用。反义技术背后的原理为杂交至靶核酸的反义化合物(例如寡核苷酸)通过许多反义机制中的任一种调节基因表达活性，诸如转录、剪接或翻译。反义化合物的序列特异性使其作为用于靶标验证和基因官能化的工具以及用于选择性调节参与疾病的基因的表达的治疗剂为有吸引力的。
虽然在反义技术领域已取得显著进展，但在本领域中对具有改善的反义或反基因性能的寡核苷酸以及肽-寡核苷酸-缀合物仍存在需要。此类改善的反义或反基因性能至少包括例如：毒性较低、在不损害序列选择性的情况下对dna和rna的亲和力更强、改善的药代动力学和组织分布、改善的细胞递送以及既可靠又可控的体内分布。
概述
本文提供肽-寡聚物-缀合物。本文还提供治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的肽-寡聚物-缀合物。
因此，在一个方面中，本文提供一种式i的肽-寡核苷酸-缀合：
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r4以及z如本文中所定义。
在一个实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ia的肽-寡聚物-缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中r2、r5、r7、r8、r12以及z如本文中所定义。
在另一实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ib的肽-寡聚物-缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中r2、r4、r7、r8、r12以及z如本文中所定义。
在另一实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ic的肽-寡聚物-缀合物：
或其药学上可接受的盐，其中r1、r2、r3、r12以及z如本文中所定义。
在另一方面中，本文提供一种治疗有需要的受试者的中枢神经系统病症、肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，所述方法包括向受试者施用式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物。
附图简述
图1示出了用于制备ppmo-5和ppmo-1的一般合成方案。
图2示出了用于制备ppmo-4的一般合成方案。
图3示出了当与本文所描述的其他接头相比较时peg-3接头的外显子23跳跃％具有改善的功效(qc＝四头肌，ht＝心脏，dp＝隔膜)。
图4示出了apa接头或全d氨基酸的外显子23跳跃％当与ppmo-8相比较时具有改善的功效。
图5将peg-3接头化合物功效与ppmo-2和ppmo-8相比较。
图6示出了在本公开的肽-寡聚物-缀合物的各种给药水平下的bun(血液尿素氮)水平。当与ppmo-8相比时bun水平增加。
图7示出了alt(丙氨酸转氨酶)、碱性磷酸酶、三酸甘油酯、肌酐以及ast(天冬氨酸转氨酶)在本公开的肽-寡聚物-缀合物的各种给药水平下的血清化学水平(虚线/阴影区分别表示来自内部未处理数据库的平均值和sd)。
图8示出了氯化物、磷、钾以及钠在本公开的肽-寡聚物-缀合物的各种给药水平下的血清化学水平(虚线/阴影区分别表示来自内部未处理数据库的平均值和sd)。
图9示出了在本公开的肽-寡聚物-缀合物的各种给药水平下的kim-1水平(虚线/阴影区分别表示来自内部未处理数据库的平均值和sd)。
图10比较了ppmo-4、ppmo-2以及ppmo-8的外显子23跳跃％和kim-1水平。
发明详述
本文提供肽-寡聚物-缀合物。本文还提供治疗有需要的受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的肽-寡核苷酸-缀合物。本文所描述的寡聚物以及由此肽-寡聚物-缀合物相对于天然或未修饰的寡核苷酸在不损害序列选择性的情况下对dna和rna展示更强的亲和力。在一些实施方案中，本公开的寡聚物使由rna酶h裂解减到最少或预防由rna酶h裂解。在一些实施方案中，本公开的反义寡聚物不活化rna酶h。
本文所描述的肽使得其对应肽-寡聚物-缀合物毒性较低，增强寡聚物的活性，改善药代动力学和组织分布，改善细胞递送，并且赋予既可靠又可控的体内分布。
定义
以下列举用于描述本公开的各种术语的定义。除非在特定情况下个别地或作为更大的组的一部分以其他方式加以限制，否则这些定义在其用于整个本说明书和权利要求书中时适用于所述术语。
术语“约”将由本领域一般技术人员理解并且将根据其使用背景在某种程度上变化。如本文所用，当提到诸如量、时距等可测量值时，术语“约”意指涵盖相较于指定值±20％或±10％，包括±5％、±1％以及±0.1％的偏差，因为此类偏差对进行所公开的方法来说为适当的。
术语“烷基”是指在某些实施方案中分别含有一至六或一至八个碳原子的饱和直链或分枝链烃部分。c1-6-烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基部分；并且c1-8-烷基部分的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、新戊基、正己基、庚基以及辛基部分。
烷基取代基中的碳原子数目可由前缀“cx-y”指示，其中x为取代基中碳原子的最小数目并且y为最大数目。同样地，cx链意指含有x个碳原子的烷基链。
除非另外说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合意指由所陈述数目的碳原子和一个或两个选自由o、n以及s组成的组的杂原子组成的稳定直链或分枝链烷基，并且其中氮原子和硫原子可任选被氧化，并且氮杂原子可任选被季铵化。杂原子可位于杂烷基的任何位置，包括位于杂烷基的其余部分与和其连接的片段之间，以及连接至杂烷基中的最远端碳原子。实例包括：-o-ch2-ch2-ch3、-ch2-ch2-ch2-oh、-ch2-ch2-nh-ch3、-ch2-s-ch2-ch3以及-ch2-ch2-s(＝o)-ch3。最多两个杂原子可为连续的，诸如-ch2-nh-och3或-ch2-ch2-s-s-ch3。
除非另外说明，否则单独或与其他术语组合采用的术语“芳基”意指含有一个或多个环(典型地为一个、两个或三个环)的碳环芳族系统，其中此类环可以悬垂方式连接在一起，诸如联苯，或可为融合的，诸如萘。芳基的实例包括苯基、蒽基以及萘基。在各个实施方案中，芳基的实例可包括苯基(例如c6-芳基)和联苯(例如c12-芳基)。在一些实施方案中，芳基具有六至十六个碳原子。在一些实施方案中，芳基具有六至十二个碳原子(例如c6-12-芳基)。在一些实施方案中，芳基具有六个碳原子(例如c6-芳基)。
如本文所用，术语“杂芳基”或“杂芳族”是指具有芳族特征的杂环。杂芳基取代基可根据碳原子数目来定义，例如c1-9-杂芳基指示杂芳基中所含的碳原子数目，而不包括杂原子数目。举例来说，c1-9-杂芳基将包括额外的一至四个杂原子。多环杂芳基可包括部分饱和的一个或多个环。杂芳基的非限制性实例包括吡啶基、吡嗪基、嘧啶基(包括例如2-嘧啶基和4-嘧啶基)、哒嗪基、噻吩基、呋喃基、吡咯基(包括例如2-吡咯基)、咪唑基、噻唑基、噁唑基、吡唑基(包括例如3-吡唑基和5-吡唑基)、异噻唑基、1，2，3-三唑基、1，2，4-三唑基、1，3，4-三唑基、四唑基、1，2，3-噻二唑基、1，2，3-噁二唑基、1，3，4-噻二唑基以及1，3，4-噁二唑基。
多环杂环和杂芳基的非限制性实例包括吲哚基(包括例如3-吲哚基、4-吲哚基、5-吲哚基、6-吲哚基以及7-吲哚基)、吲哚啉基、喹啉基、四氢喹啉基、异喹啉基(包括例如1-异喹啉基和5-异喹啉基)、1，2，3，4-四氢异喹啉基、噌啉基、喹噁啉基(包括例如2-喹噁啉基和5-喹噁啉基)、喹唑啉基、酞嗪基、1，8-萘啶基、1，4-苯并二噁烷基、香豆素、二氢香豆素、1，5-萘啶基、苯并呋喃基(包括例如3-苯并呋喃基、4-苯并呋喃基、5-苯并呋喃基、6-苯并呋喃基以及7-苯并呋喃基)、2，3-二氢苯并呋喃基、1，2-苯并异噁唑基、苯并噻吩基(包括例如3-苯并噻吩基、4-苯并噻吩基、5-苯并噻吩基、6-苯并噻吩基以及7-苯并噻吩基)、苯并噁唑基、苯并噻唑基(包括例如2-苯并噻唑基和5-苯并噻唑基)、嘌呤基、苯并咪唑基(包括例如2-苯并咪唑基)、苯并三唑基、硫代黄嘌呤基、咔唑基、咔啉基、吖啶基、吡咯里西啶基以及喹诺里西啶基。
术语“保护基”或“化学保护基”是指阻断化合物的一些或全部反应性部分并且防止此类反应性部分参与化学反应直至保护基被移除的化学部分，例如t.w.greene，p.g.m.wuts，protectivegroupsinorganicsynthesis，第3版johnwiley&sons(1999)中列举和描述的那些部分。在采用不同保护基的情况下，每种(不同)保护基为通过不同手段可移除的可为有利的。在完全不同的反应条件下裂解的保护基允许有差别地移除此类保护基。举例来说，可通过酸、碱以及氢解移除保护基。诸如三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、乙缩醛以及叔丁基二甲基硅烷基等基团为酸不稳定的并且可用于在用cbz基团(其可通过氢解移除)和fmoc基团(其为碱不稳定的)保护的氨基存在下保护羧基和羟基反应性部分。在用诸如氨基甲酸叔丁酯等酸不稳定基团或用酸与碱均稳定但水解可移除的氨基甲酸酯阻断的胺存在下，可用诸如但不限于甲基或乙基等碱不稳定性基团来阻断羧酸部分，并且可用诸如乙酰基等碱不稳定基团来阻断羟基反应性部分。
还可用诸如苯甲基等水解可移除的保护基来阻断羧酸和羟基反应性部分，同时可用诸如fmoc等碱不稳定基团来阻断氨基。对于式(i)化合物的合成特别适用的胺保护基为三氟乙酰胺。可用诸如2，4-二甲氧基苯甲基等氧化可移除的保护基来阻断羧酸反应性部分，同时可用氟化物不稳定性氨基甲酸硅烷酯来阻断共存的氨基。
烯丙基阻断基在存在酸保护基和碱保护基的情况下为适用的，因为前者为稳定的，并且随后用金属或π酸催化剂移除。举例来说，在存在酸不稳定性氨基甲酸叔丁酯或碱不稳定性乙酸酯胺保护基的情况下可用钯(0)催化的反应使烯丙基阻断的羧酸脱保护。保护基的另一种形式为可连接至化合物或中间物的树脂。只要残基连接至树脂上，所述官能团就被阻断并且不能反应。一旦从树脂释放，官能团就可以用来反应。
术语“核碱基”、“碱基配对部分”、“核碱基配对部分”或“碱基”是指核苷、核苷酸和/或吗啉基亚单位的杂环部分。核碱基可为天然存在的，或可为修饰的或为这些天然存在的核碱基的类似物，例如核碱基的一个或多个氮原子可在每次出现时独立地由碳置换。示例性类似物包括次黄嘌呤(核苷肌苷的基本组分)；2，6-二氨基嘌呤；5-甲基胞嘧啶；c5-丙炔基修饰的嘧啶；10-(9-(氨基乙氧基)啡噁嗪基)(g-钳(g-clamp))等。
碱基配对部分的其他实例包括但不限于尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤以及次黄嘌呤(肌苷)，其各别氨基由以下基因保护：酰基保护基、2-氟尿嘧啶、2-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、2，6-二氨基嘌呤、氮杂胞嘧啶、嘧啶类似物(诸如假异胞嘧啶和假尿嘧啶)以及其他修饰的核碱基，诸如8-取代的嘌呤、黄嘌呤或次黄嘌呤(后两种为天然降解产物)。还涵盖chiu和rana，rna，2003，9，1034-1048；limbach等nucleicacidsresearch，1994，22，2183-2196以及revankar和rao，comprehensivenaturalproductschemistry，第7卷，313中所公开的修饰的核碱基，这些参考文献的内容以引用的方式并入本文中。
碱基配对部分的其他实例包括但不限于尺寸扩大的核碱基，其中已添加一个或多个苯环。涵盖格伦研究目录(glenresearchcatalog)(www.glenresearch.com)；kruegerat等，acc.chem.res.，2007，40，141-150；kool，et，acc.chem.res.，2002，35，936-943；renners.a.等，nat.rev.genet.，2005，6，553-543；romesberg，f.e.等，curr.opin.chem.biol.，2003，7，723-733；hirao，i.，curr.opin.chem.biol.，2006，10，622-627(这些参考文献的内容以引用的方式并入本文中)中所描述的核酸碱基置换，因为适合用于合成本文所描述的寡聚物。以下示出了尺寸扩大的核碱基的实例：
术语“寡核苷酸”或“寡聚物”是指包含多个键联的核苷、核苷酸或核苷与核苷酸的组合的化合物。在本文所提供的特定实施方案中，寡核苷酸为吗啉基寡核苷酸。
短语“吗啉基寡核苷酸”或“pmo”是指修饰的寡核苷酸，其中的吗啉基亚单位通过氨基磷酸酯或二氨基磷酸酯键联而键联在一起，从而将一个亚单位的吗啉基氮与相邻亚单位的5′-环外碳连接。每个吗啉基亚单位包含通过核碱基-特异性氢键合有效结合至靶标中的核碱基的核碱基-配对部分。
术语“反义寡聚物”、“反义化合物”以及“反义寡核苷酸”为可互换使用的并且是指各自带有碱基配对部分的亚单位的序列，所述亚单位通过亚单位间键联而键联，从而允许碱基配对部分通过沃森-克里克碱基配对(watson-crickbasepairing)杂交至核酸中的靶序列(典型地为rna)，以在靶序列内形成核酸：寡聚物异源双链体。寡聚物可与靶序列具有准确的(完美的)或接近的(足够的)序列互补性；靠近寡聚物末端的序列变异通常优于内部的变异。
可将此类反义寡聚物设计成阻断或抑制mrna的翻译或抑制/改变天然或异常前体mrna剪接加工，并且可将其说成是“针对于”或“靶向于”与其杂交的靶序列。靶序列典型地为一个区，该区包括mrna的aug起始密码子、翻译抑制寡聚物或预加工的mrna的剪接位点、剪接抑制寡聚物(sso)。剪接位点的靶序列可包括mrna序列，所述mrna序列在其5′末端在预加工的mrna中具有在正常剪接受体接点下游的1至约25个碱基对。在各个实施方案中，靶序列可为预加工的mrna的任何区，所述任何区包括剪接位点，或完全含于外显子编码序列内，或跨越剪接受体或供体位点。当以上文所描述的方式使寡聚物靶向于靶标的核酸时，更通常将其说成是“靶向于”生物相关靶标，诸如蛋白质、病毒或细菌。
当反义寡核苷酸和靶rna分子中足够数目的对应位置由可彼此氢键合的核苷酸占据，使得寡核苷酸与靶标之间发生稳定且特异性的结合时，反义寡核苷酸和靶rna为彼此互补的。因此，“可特异性杂交”和“互补”为用于指示足够程度的互补性或精确配对使得寡核苷酸与靶标之间发生稳定且特异性的结合的术语。在本领域中应理解，寡核苷酸的序列不需要与其要可特异性杂交的靶序列100％互补。当寡核苷酸与靶分子的结合干扰靶rna的正常功能，并且存在足够程度的互补性以在需要特异性结合的条件下(即，在体内分析或治疗性治疗的情况下为在生理条件下，而在体外分析的情况下为在进行分析的条件下)避免反义寡核苷酸非特异性结合于非靶序列时，寡核苷酸为可特异性杂交的。
寡核苷酸还可包括核碱基(在本领域中常常简称为“碱基”)修饰或取代。含有被修饰或取代的碱基的寡核苷酸包括其中最常存在于核酸中的一个或多个嘌呤或嘧啶碱基用较不常见或非天然碱基置换的寡核苷酸。在一些实施方案中，核碱基是在嘌呤碱基的n9原子处或在嘧啶碱基的n1原子处共价键联至核苷酸或核苷的吗啉环。
嘌呤碱基如由以下通式所描述包含融合至咪唑环的嘧啶环：
腺嘌呤和鸟嘌呤为最常存在于核酸中的两种嘌呤核碱基。这些核碱基可用其他天然存在的嘌呤取代，包括但不限于n6-甲基腺嘌呤、n2-甲基鸟嘌呤、次黄嘌呤以及7-甲基鸟嘌呤。
嘧啶碱基包含如由以下通式所描述的六元嘧啶环：
胞嘧啶、尿嘧啶以及胸腺嘧啶为最常存在于核酸中的嘧啶碱基。这些嘧啶碱基可用其他天然存在的嘧啶取代，包括但不限于5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶、假尿嘧啶以及4-硫尿嘧啶。在一个实施方案中，本文所描述的寡核苷酸含有胸腺嘧啶碱基替代尿嘧啶。
其他修饰或取代的碱基包括但不限于2，6-二氨基嘌呤、乳清酸、2-胍丁胺胞苷(agmatidine)、赖西丁(lysidine)、2-硫代嘧啶(例如2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶)、g-钳和其衍生物、5-取代嘧啶(例如5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲基尿嘧啶、5-羟基甲基尿嘧啶、5-氨基甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶，超级t(supert))、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤、7-氮杂-2，6-二氨基嘌呤、8-氮杂-7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2，6-二氨基嘌呤、超级g(superg)、超级a(supera)以及n4-乙基胞嘧啶或其衍生物；n2-环戊基鸟嘌呤(cpent-g)、n2-环戊基-2-氨基嘌呤(cpent-ap)以及n2-丙基-2-氨基嘌呤(pr-ap)、假尿嘧啶或其衍生物；以及简并或通用碱基，如2，6-二氟甲苯或不存在碱基，如无碱基位点(例如1-脱氧核糖、1，2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-o-甲基核糖；或吡咯烷衍生物，其中环氧已用氮置换(氮杂核糖(azaribose)))。假尿嘧啶为天然存在的异构化型式的尿嘧啶，在尿苷中具有c-糖苷，而非常规n-糖苷。
某些修饰或取代的核碱基特别适合用于增加本公开的反义寡核苷酸的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及n-2、n-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。在各个实施方案中，核碱基可包括5-甲基胞嘧啶取代，所述5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃。
在一些实施方案中，修饰或取代的核碱基适用于促进反义寡核苷酸的纯化。举例来说，在某些实施方案中，反义寡核苷酸可含有三个或更多个(例如3、4、5、6或更多个)连续鸟嘌呤碱基。在某些反义寡核苷酸中，一串三个或更多个连续鸟嘌呤碱基可产生寡核苷酸的聚集，从而使纯化复杂化。在此类反义寡核苷酸中，连续鸟嘌呤中的一个或多个可用肌苷取代。肌苷取代一串三个或更多个连续鸟嘌呤碱基中的一个或多个鸟嘌呤可减少反义寡核苷酸的聚集，由此有助于纯化。
合成了本文所提供的寡核苷酸并且不包括生物来源的反义组合物。还可将本公开的分子与其他分子、分子结构或化合物混合物(如例如脂质体、受体靶向分子、口服、经直肠、经表面或其他制剂)混合、封装、缀合或以其他方式缔合，以帮助摄入、分布或吸收或其组合。
术语“互补”和“互补性”是指根据沃森-克里克碱基配对规则相关的寡核苷酸(即核苷酸序列)。举例来说，序列“t-g-a(5′-3′)”与序列“t-c-a(5′-3′)”互补。互补性可为“部分的”，其中根据碱基配对规则仅一些核酸碱基匹配。或者，在核酸之间可存在“完全”、“总体”或“完美”(100％)互补性。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度有显著影响。虽然常常需要完美互补性，但一些实施方案可相对于靶rna包括一个或多个，但优选为6、5、4、3、2或1个错配。反义寡聚物与靶序列具有“接近”或“基本”互补性的情况下以及具有准确互补性的情况下，可发生此类杂交。在一些实施方案中，寡聚物可以约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的互补性杂交至靶序列。包括寡聚物内的任何位置的变异。在某些实施方案中，靠近寡聚物末端的序列变异通常优于内部的变异，并且如果存在，那么典型地位于5′-端、3′-端或两个末端的约6、5、4、3、2、或1个核苷酸内。
术语“teg”、“eg3”或“三乙二醇尾部”是指例如在3′-或5′-末端缀合至寡聚物的三乙二醇部分。举例来说，在一些实施方案中，“teg”包括例如其中式(i)或(ic)的肽-寡聚物-缀合物的r3具有以下结构式：
术语“肽”是指包含多个键联氨基酸的化合物。本文所提供的肽可被视为细胞穿透肽。
术语“细胞穿透肽”和“cpp”为可互换使用的并且是指阳离子细胞穿透肽，也称为转运肽、载体肽或肽转导结构域。本文所提供的肽具有诱导细胞穿透至给定细胞培养群体的100％的细胞中的能力并且在全身性施用后允许在体内在多个组织内的大分子转位。在各个实施方案中，本公开的cpp实施方案可包括如下文进一步描述的富含精氨酸的肽。
术语“治疗”是指应用用于改善疾病的一个或多个特定程序。在某些实施方案中，特定程序为施用一种或多种药剂。个体(例如哺乳动物，诸如人)或细胞的“治疗”为试图改变个体或细胞的天然过程时所用的任何类型的干预。治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可预防性地或在病理性事件开始或与病原接触之后进行。在某些实施方案中，治疗包括但不限于施用药物组合物，并且可在病理性事件开始或与病原接触之后进行。治疗包括对疾病或病状的症状或病变的任何所需作用，并且可包括例如所治疗的疾病或病状的一种或多种可测量标记物的最小改变或改善。还包括“预防性”治疗，所述预防性治疗可以是有关于降低所治疗疾病或病状的进展速率，延迟所述疾病或病状的发作，或降低其发作的严重程度。“有效量”或“治疗有效量”是指以单一剂量或作为一系列剂量的一部分向哺乳动物受试者施用的有效产生所需治疗作用的治疗性化合物(诸如反义寡聚物)的量。
术语“改善”意指病状或疾病的至少一种指示的严重程度的减轻。在某些实施方案中，改善包括病状或疾病的一种或多种指示的进展的延迟或减慢。指示的严重程度可通过本领域技术人员已知的主观或客观测量来确定。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指所公开的寡核苷酸的衍生物，其中通过将现有的酸或碱部分转化成其盐形式对本发明寡核苷酸进行修饰。在remington′spharmaceuticalsciences，第17版，mackpublishingcompany，easton，pa.，1985，第1418页以及journalofpharmaceuticalscience，66，2(1977)中可找到适合的盐的列表，所述参考文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。
肽-寡聚物-缀合物
本文提供化学键联至一个或多个部分，诸如细胞穿透肽，从而增强寡聚物的活性、细胞分布或细胞摄入的寡聚物(例如反义化合物)。寡聚物可另外化学键联至一个或多个杂烷基部分(例如聚乙二醇)，从而进一步增强寡聚物的活性、细胞分布或细胞摄入。在一个示例性实施方案中，富含精氨酸的多肽在其n端或c端残基处共价偶联至反义化合物的任一末端，或在内部偶联至反义化合物。
因此，在一个方面中，本文提供一种式i的肽-寡聚物-缀合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
r3是选自oh、-n(h)ch2c(o)nh2、-n(c1-6-烷基)ch2c(o)nh2、
r5为-c(o)(o-烷基)xoh，其中x为3-10且每个烷基在每次出现时独立地为c2-6-烷基，或r5是选自由以下各项组成的组：-c(o)c1-6烷基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、-(c1-6-烷基)r6、-(c1-6杂烷基)-r6、芳基-r6、杂芳基-r6、-c(o)o-(c1-6烷基)-r6、-c(o)o-芳基-r6、-c(o)o-杂芳基-r6以及r12；
r6是选自oh、sh以及nh2，或r6为共价键联至固体载体的o、s或nh；
r1在每次出现时独立地为oh、-nr7r12或-nr7r8；
每个r7和r8在每次出现时独立地为h或-c1-6烷基；
r2在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：h、核碱基以及用化学保护基团官能化的核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自以下的c3-6杂环：吡啶、嘧啶、三嗪烷(triazinane)、嘌呤以及脱氮-嘌呤；
z为8-40；
r4是选自h、-c1-6烷基、-c(o)c1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、
r9为-c(o)(ch2)6c(o)-或-c(o)(ch2)2s2(ch2)2c(o)-；
r10为-(ch2)2oc(o)n((ch2)6n(h)c(＝nh)nh2)2；
r11是选自oh和-nr7r8；
r12是选自由以下各项组成的组：
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
p为2、3、4或5；
r13为键，或r13是选自由以下各项组成的组：
r15和r19在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：h、-c1-4烷基、-ch(-c1-4烷基)2以及-(ch2)3nh-c(＝nh)-nh2；
t和w在每次出现时独立地为2、3、4或5；
r14是选自由以下各项组成的组：
r17为h或-c1-4烷基；
r20是选自由以下各项组成的组：h、-c1-4烷基、-ch(-c1-4烷基)2以及-(ch2)3nh-c(＝nh)-nh2；
v和q在每次出现时独立地为2、3、4或5；
r16是选自由以下各项组成的组：
r21和r22在每次出现时独立地为h或-c1-4烷基；
r18是选自由以下各项组成的组：h、-c(o)c1-6烷基、苯甲酰基以及硬脂酰基；
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9；并且
y和u在每次出现时独立地为2、3、4或5；
前提条件为仅存在以下条件中的一种：1)r1为nr7r12；2)r4为r12；或3)r3为
在式i的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r4是选自h、-c1-6烷基、-c(o)c1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基以及r12。
在另一实施方案中，r3为
r4为r12。
在另一实施方案中，r3是选自-oh、-n(c1-6-烷基)ch2c(o)nh2、
在另一实施方案中，r4是选自h、-c(o)ch3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基、硬脂酰基以及r12。
在另一实施方案中，r3是选自-oh、-n(c1-6-烷基)ch2c(o)nh2以及
r4为r12。
在另一实施方案中，r3为
在另一实施方案中，r4是选自h、-c(o)ch3、三苯甲基、4-甲氧基三苯甲基、苯甲酰基以及硬脂酰基。
在另一实施方案中，r4是选自h和-c(o)ch3。
在另一实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ia的肽-寡聚物-缀合物：
其中r5为-c(o)(o-烷基)xoh，其中x为3-10且每个烷基在每次出现时独立地为c2-6-烷基，或r5是选自由以下各项组成的组：-c(o)c1-6烷基、三苯甲基以及单甲氧基三苯甲基。
在式i或式ia的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r5为-c(o)(o-烷基)xoh，其中每个烷基在每次出现时独立地为c2-6-烷基。
在式i或式ia的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r5为-c(o)(o-ch2ch2)3oh。
在另一实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ib的肽-寡聚物-缀合物：
其中r4是选自h、-c1-6烷基、-c(o)c1-6烷基、苯甲酰基、硬脂酰基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基以及三甲氧基三苯甲基。
在式i或式ib的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r4是选自h、c1-6烷基、-c(o)ch3、苯甲酰基以及硬脂酰基。
在式ib的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r4是选自h和-c(o)ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r16是选自由以下各项组成的组：
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r16为
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r14是选自由以下各项组成的组：
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r12为
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r为3、4、5、6、7或8。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r为5、6或7。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r为6。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r13为键。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，z为8-25。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，z为15-25。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，z为10-20。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r1独立地为nr7r8，其中每个r7和r8在每次出现时独立地为c1-3-烷基。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r1为n(ch3)2。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r2为核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自以下的c4-6-杂环：吡啶、嘧啶、三嗪烷、嘌呤以及脱氮-嘌呤。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r2为核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地包含选自以下的c4-6-杂环：嘧啶、嘌呤以及脱氮-嘌呤。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r2为核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r2为核碱基，其中核碱基在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及次黄嘌呤。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r15是选自由以下各项组成的组：h、ch3、-ch(ch3)2以及-(ch2)3nh-c(＝nh)-nh2。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r19是选自由以下各项组成的组：h、ch3、-ch(ch3)2以及-(ch2)3nh-c(＝nh)-nh2。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r20是选自由以下各项组成的组：h、ch3、-ch(ch3)2以及-(ch2)3nh-c(＝nh)-nh2。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r17为h或ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r17为h。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r21为h或ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r21为h。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r22为h或ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r22为h。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r6是选自oh、sh以及nh2。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r7和r8在每次出现时独立地为h或ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，每个r7和r8为ch3。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，n为2、3、4、5、6或7。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，p为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，t为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，w为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，v为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，x为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，y为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，u为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，q为3或4。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r18是选自h、-c(o)c1-c3烷基、苯甲酰基以及硬脂酰基。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r18为h或-c(o)c1-c3烷基。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r18为h或-c(o)ch3。
在另一实施方案中，式i的肽-寡聚物-缀合物为式ic的肽-寡聚物-缀合物：
或其药学上可接受的盐，
其中：
r3为oh、
r5为-c(o)(o-烷基)xoh，其中x为3-10且每个烷基在每次出现时独立地为c2-6-烷基，或r5为-c(o)c1-6烷基；
r1在每次出现时独立地为oh或-nr7r8；
每个r7和r8在每次出现时独立地为-c1-6烷基；
r2在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：h、腺嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、鸟嘌呤、7-脱氮-鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶；
z为8-40；
r12是选自由以下各项组成的组：
n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；
p为2、3、4或5；
r13为键；
r14是选自由以下各项组成的组：
r17为h或-c1-4烷基；
r16是选自由以下各项组成的组：
r21为h或-c1-4烷基；
r18属于h或-c(o)c1-6烷基；并且
r为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物的一个实施方案中，r3为
r5为-c(o)(o-c2-6-烷基)3oh或-c(o)c1-6烷基。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r1在每次出现时独立地为oh或-n(c1-6烷基)2。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r2在每次出现时独立地选自由以下各项组成的组：腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基-胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶以及次黄嘌呤。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r14为
r17为h。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r16为
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r为5、6或7。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物或其药学上可接受的盐的另一实施方案中，肽-寡聚物-缀合物是选自由以下各项组成的组：
其中r18是选自h和-c(o)ch3。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r18为h。
在式ic的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，r18为-c(o)ch3。
在式i的肽-寡聚物-缀合物的一个替代实施方案中，存在以下条件中的至少一种：1)r1为nr7r12；2)r4为r12；或3)r3为
(即，存在条件1、2以及3中的任何一种、任何两种或全部三种)。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，寡核苷酸包含与rna靶标具有序列互补性的靶向序列。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，rna靶标为细胞rna靶标。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，靶向序列具有足够的序列互补性以结合于rna靶标。
在本公开的肽-寡聚物-缀合物的另一实施方案中，靶向序列与rna靶标具有完美的序列互补性。
在一些实施方案中，本公开的肽-寡聚物-缀合物为非溶剂合物。在其他实施方案中，肽-寡聚物-缀合物中的一种或多种是呈溶剂合物形式。如本领域中已知的，溶剂合物可为药学上可接受的溶剂中的任一种，诸如水、乙醇等。
虽然式i、式ia、式ib以及式ic的肽-寡聚物-缀合物是以其中性形式展示，但在一些实施方案中，这些肽-寡核苷酸-缀合物是以药学上可接受的盐形式使用。
寡聚物
基于吗啉基的亚单位的重要性质包括：1)通过稳定的不带电荷或带正电荷的主链键联而键联在寡聚形式中的能力；2)支持核苷酸碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸苷、尿嘧啶、5-甲基-胞嘧啶以及次黄嘌呤)以使得所形成的聚合物可在相对短的寡聚物(例如10-15个碱基)中以超过约45℃的tm值与互补碱基靶核酸(包括靶rna)杂交的能力；3)寡聚物主动或被动转运至哺乳动物细胞中的能力；以及4)寡聚物和寡聚物：rna异源双链体分别抵抗rna酶和rna酶h降解的能力。
寡聚物与靶序列之间形成的双链体的稳定性随结合tm和双链体对细胞酶促裂解的敏感性而变化。寡聚物相对于互补序列rna的tm可通过常规方法来测量，诸如由hames等，nucleicacidhybridization，irlpress，1985，第107-108页所描述或如miyadac.g.和wallacer.b.，1987，oligomerhybridizationtechniques，methodsenzymol.第154卷第94-107页中所描述的那些方法。在某些实施方案中，反义寡聚物可相对于互补序列rna具有高于体温，并且在一些实施方案中，高于约45℃或50℃的结合tm。还包括在60-80℃范围内或更高的tm。根据熟知原理，可通过增加双链体中c∶g配对碱基的比率或通过增加异源双链体的长度(以碱基对计)或两者来增加寡聚物相对于基于互补序列的rna杂交体的tm。同时，出于优化细胞摄入的目的，限制寡聚物的尺寸可为有利的。出于此原因，本公开的化合物包括在25个碱基或更短的长度下显示高tm(45-50℃或更高)的化合物。
寡聚物的长度可变化，只要它能够选择性结合于前体mrna分子内的预期位置即可。此类序列的长度可根据本文所描述的选择程序来测定。通常，寡聚物将为长度为约8个核苷酸至长度为约50个核苷酸。举例来说，寡聚物的长度(z)可为8-40、8-25、15-25、10-20或约18。然而，应了解，在此范围内的任何长度的核苷酸均可用于本文所描述的方法中。
在一些实施方案中，反义寡聚物含有碱基修饰或取代。举例来说，可选择某些核碱基来增加本文所描述的反义寡核苷酸的结合亲和力。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮杂嘧啶以及n-2、n-6以及o-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶以及2，6-二氨基嘌呤。5-甲基胞嘧啶取代已显示使核酸双链体稳定性增加0.6-1.2℃，并且可合并至本文所描述的反义寡聚物中。在一个实施方案中，寡聚物的至少一个嘧啶碱基包含5-取代的嘧啶碱基，其中嘧啶碱基是选自由以下各项组成的组：胞嘧啶、胸腺嘧啶以及尿嘧啶。在一个实施方案中，5-取代的嘧啶碱基为5-甲基胞嘧啶。在另一实施方案中，寡核苷酸的至少一个嘌呤碱基包含n-2、n-6取代的嘌呤碱基。在一个实施方案中，n-2、n-6取代的嘌呤碱基为2，6-二氨基嘌呤。
例如美国专利号5,698,685；5,217,866；5,142,047；5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,521,063；5,506,337，8,299,206；以及8,076,476；pct公布号wo2009/064471和wo2012/043730；以及summerton等1997，antisenseandnucleicaciddrugdevelopment，7，187-195中详细描述了基于吗啉基的寡聚物(包括反义寡聚物)，这些专利和参考文献以全文引用的方式并入本文中。
表1中提供了如本文所描述的核苷酸部分的各个实施方案。
表1：核苷酸部分的各个实施方案.
在一些实施方案中，本文所描述的寡聚物为非溶剂合物。在其他实施方案中，寡聚物中的一种或多种是呈溶剂合物形式。如本领域中已知的，溶剂合物可为药学上可接受的溶剂中的任一种，诸如水、乙醇等。
肽
本文所提供的寡聚物包括缀合至cpp的寡聚物部分。在一些实施方案中，cpp可为有效增强化合物转运至细胞中的富含精氨酸的肽转运部分。在一些实施方案中，转运部分连接至寡聚物的末端。肽具有在给定细胞培养群体的30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％(包括其间的所有整数)的细胞内诱导细胞穿透的能力，并且在全身性施用后允许在体内在多个组织内的大分子转位。在一个实施方案中，细胞穿透肽可为富含精氨酸的肽转运体。在各个实施方案中，本公开的肽-寡聚物-缀合物可利用甘氨酸作为cpp与反义寡核苷酸之间的接头。
相对于在不存在连接的运送部分的情况下的寡聚物摄入，如上文所描述的转运部分已显示使连接的寡聚物进入细胞极大地增强。相对于未缀合的化合物，摄入可增强至少十倍，并且，在一些实施方案中，为二十倍。
使用富含精氨酸的肽转运体(即细胞穿透肽)特别适合用于实践本公开。某些肽转运体已显示对将反义化合物递送至包括肌细胞的原代细胞中高度有效。
方法
本文提供治疗有需要的受试者的中枢神经系统病症、肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，所述方法包括向受试者施用式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物。
因此，在一个方面中，本文提供一种治疗有需要的受试者的肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的方法，所述方法包括向受试者施用本公开的肽-寡聚物-缀合物。
在一个实施方案中，肌肉疾病为杜兴氏肌肉萎缩(duchennemusculardystrophy)。
在另一实施方案中，病毒感染是由选自以下的病毒引起：马尔堡病毒(marburgvirus)、埃博拉病毒(ebolavirus)、流感病毒以及登革热病毒(denguevirus)。
在另一实施方案中，细菌感染是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)引起。
在其他实施方案中，中枢神经系统病症为脊髓性肌肉萎缩。
本文中考虑的受试者典型地为人。然而，受试者可为需要治疗的任何哺乳动物。因此，本文所描述的方法可适用于人与兽医学应用两者。
施用/剂量
治疗剂组合物的配制和其后续施用(给药)在本领域技术人员的技术范围内。给药取决于所要治疗的疾病状态的严重程度和反应性，治疗过程持续若干天至若干个月，或者直到实现足够的疾病状态减轻。最佳给药时间表可由患者体内的药物累积的测量来计算。
普通技术人员可容易地确定最佳剂量、给药方法以及重复率。最佳剂量可视个别寡聚物的相对功效而变化，并且通常可基于被认为在体外和体内动物模型中有效的ec50来估计。一般来说，剂量为每千克体重0.01μg至100g，并且可每天、每周、每月或每年一次或多次，或甚至每2至20年一次地给予。本领域一般技术人员可基于所测量的药物在人体流体或组织中的滞留时间和浓度容易地估计给药重复率。在成功治疗之后，可能需要使患者经历维持疗法以防止疾病状态复发，其中寡聚物是以在每千克体重0.01μg至100g范围内的维持剂量每天一次或多次至每20年一次地施用。
在一些实施方案中，单独施用肽-寡聚物-缀合物(式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物)。
在一些实施方案中，以治疗有效量或剂量施用肽-寡聚物-缀合物。“治疗有效量”为当单独向患者施用时有效治疗肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的肽-寡聚物-缀合物(式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡核苷酸-缀合物)的量。在给定情况下对于特定受试者证实为“治疗有效量”的量可能并不对针对在考虑之中的疾病或病状进行类似治疗的100％的受试者有效，即使此类剂量被熟练从业者认为是“治疗有效量”。对应于治疗有效量的肽-寡聚物-缀合物的量很大程度取决于疾病的类型、疾病的阶段、所治疗患者的年龄以及其他事实。
在不同实施方案中，视所用的肽-寡聚物-缀合物(式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物)和有效量而定，肽-寡聚物-缀合物可调节参与肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的基因的表达。
虽然所述量的肽-寡聚物-缀合物(式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物)应产生中枢神经系统病症、肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的有效治疗，但所述量优选不对患者过分地具毒性(即，所述量优选在如通过医学准则所确定的毒性限制以内)。在一些实施方案中，为了防止过度毒性或提供对中枢神经系统病症、肌肉疾病、病毒感染或细菌感染的更有效的治疗或两者，提供对总施用剂量的限制。典型地，本文中所考虑的量为每天的量；然而，本文中还考虑半天和两天或三天的周期。
可使用不同给药方案来治疗中枢神经系统病症、肌肉疾病、病毒感染或细菌感染。在一些实施方案中，每天一次、两次、三次或四次地施用日剂量，诸如上文所描述的示例性剂量中的任一种，持续三、四、五、六、七、八、九或十天。视所治疗疾病的阶段和严重程度而定，可采用更短的治疗时间(例如最多五天)以及高剂量，或可采用更长的治疗时间(例如十天或更多天，或数周，或一个月，或更久)以及低剂量。在一些实施方案中，每隔一天施用每天一次或两次的剂量。
可经由本领域中已知的所接收的施用模式或媒介中的任一种来施用呈纯形式或呈适当的药物组合物形式的肽-寡聚物-缀合物(式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物)或其药学上可接受的盐或溶剂合物形式。可例如经口、经鼻、经肠胃外(经静脉内、经肌肉内或经皮下)、经表面、经皮、经阴道内、经膀胱内、经脑池内或经直肠施用肽-寡聚物-缀合物。剂型可为例如固体、半固体、冻干粉末或液体剂型，诸如片剂、丸剂、软弹性胶囊或硬明胶胶囊、粉末、溶液、悬浮液、栓剂、气溶胶等，例如呈适合用于简单施用精确剂量的单位剂型形式。特定施用途径为口服，特别是方便的日剂量方案可根据所要治疗的疾病的严重程度加以调整的口服。
助剂和佐剂药剂可包括例如保藏剂、润湿剂、悬浮剂、增甜剂、调味剂、芳香剂、乳化剂以及分配剂。防止微生物作用通常是由各种抗细菌和抗真菌剂提供，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。还可包括等张剂，诸如糖、氯化钠等。可通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)来引起可注射药物形式的延迟吸收。助剂还可包括润湿剂、乳化剂、ph缓冲剂以及抗氧化剂，诸如柠檬酸、单月桂酸脱水山梨醇酯、三乙醇胺油酸酯、丁基化羟基甲苯等。
可将固体剂型制备成具有包衣和外壳，诸如肠溶衣以及本领域中熟知的其他包衣。它们可含有平抚剂(pacifyingagent)并且可具有如此的组成，所述组成使得它们以延迟方式在肠道中的特定部分释放活性肽-寡聚物-缀合物。可使用的包埋的组合物的实例包括聚合物质和蜡。如果适当，那么活性肽-寡聚物-缀合物还可与上述赋形剂中的一种或多种一起呈微囊封装形式。
用于经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆以及酏剂。举例来说，通过将本文所描述的肽-寡聚物-缀合物或其药学上可接受的盐以及于诸如水、盐水、右旋糖水溶液、甘油、乙醇等载体中的任选药物佐剂；增溶剂和乳化剂，如例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油(具体地说为棉籽油、花生油、玉米胚芽油、橄榄油、蓖麻油以及芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇以及脱水山梨醇的脂肪酸酯；或这些物质的混合物等溶解、分散等，以由此形成溶液或悬浮液来制备此类剂型。
通常，视预期施用模式而定，药学上可接受的组合物将含有约1重量％至约99重量％的本公开的肽-寡聚物-缀合物或其药学上可接受的盐，以及99重量％至1重量％的药学上可接受的赋形剂。在一个实例中，组合物将为约5重量％至约75重量％的本公开的肽-寡聚物-缀合物或其药学上可接受的盐，并且其余为适合的药物赋形剂。
制备此类剂型的确切方法为已知的，或将为本领域技术人员显而易知的。参考例如remington′spharmaceuticalsciences，第18版(mackpublishingcompany，easton，pa.，1990)。
试剂盒
在其他实施方案中，提供试剂盒。根据本公开的试剂盒包括包含本公开的肽-寡聚物-缀合物或组合物的包装。在一些实施方案中，试剂盒包含根据式i、式ia、式ib或式ic的肽-寡聚物-缀合物或其药学上可接受的盐。
短语“包装”意指含有本文所呈现的肽-寡聚物-缀合物或组合物的任何容器。在一些实施方案中，包装可为盒子或包裹物。用于包装药物产品的包装材料为本领域技术人员熟知的。药物包装材料的实例包括但不限于瓶、管、吸入器、泵、袋、小瓶、容器、注射器、瓶以及适合用于所选制剂以及预期施用和治疗模式的任何包装材料。
试剂盒还可含有不含于包装内但附接至包装外部的项目，例如移液管。
试剂盒可进一步含有关于将本公开的肽-寡聚物-缀合物或组合物施用给患者的说明书。试剂盒还可包括关于本文中的肽-寡聚物-缀合物由诸如美国食品和药物管理局(unitedstatesfoodanddrugadministration)等管理机构批准使用的说明书。试剂盒还可含有关于肽-寡聚物-缀合物的标签或产品插页。包装或任何产品插页或两者本身可为管理机构批准的。试剂盒可在包装中包括于固相中或于液相(诸如提供的缓冲液)中的肽-寡聚物-缀合物。试剂盒还可包括用于制备用于进行所述方法的溶液的缓冲液，以及用于将液体从一个容器转移至另一个容器的移液管。
实施例
下文出于说明的目的并且为了描述本公开的某些特定实施方案已阐述了实施例。然而，权利要求书的范围不以任何方式受本文所阐述的实施例限制。对所公开的实施方案的各种变化和修改对本领域技术人员来说将为显而易见的，并且此类变化和修改包括但不限于如下的那些变化和修改，这些变化和修改可关于本公开的化学结构、取代基、衍生物、制剂或方法来进行而不会背离本公开的精神和随附权利要求书的范围。
本文的流程中的结构中的变量的定义是与本文所呈现的结构式中的对应位置的那些相称的。
实施例1：ppmo-5和ppmo-1的合成
如图1中所示，在室温下向下表1a中所描述的pmo(ppmo-3，1当量)、fmoc-氨基-pegm-丙酸(5当量)、hatu(5当量)于dmso中的混合物中添加dipea(10当量)。在搅拌4小时之后，添加过量4-甲基哌啶并且在室温下持续搅拌过夜。将粗产物用去离子水稀释并且然后通过spe(amberchromcg300m)纯化。通过冻干获得呈白色粉末状的产物并且通过lc/ms证实其结构。
在室温下向以上产物、ac-r6-gly(4当量；seqidno：1)以及hatu(4当量)于dmso中的混合物中添加dipea(10当量)并且搅拌4小时。将反应混合物用去离子水稀释并且通过isco色谱系统纯化(scx柱，source30s，流动相(ph＝7)：溶剂a：20mmnahpo4/25％acn(ph＝7)；溶剂b：1.5m盐酸胍，20mmnah2po4/25％acn，然后通过spe(amberchromcg300m)脱盐。通过冻干获得呈白色粉末状的产物并且通过lc/ms证实其结构。
表1a
实施例2：ppmo-4的合成
如图2中所示，在室温下向pmo(ppmo-3，1当量)和“p3p”接头(2.5当量)于dmso中的混合物中添加n-乙基吗啉(2.5当量)。在搅拌2小时之后，添加吗啉(3当量)并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加过量50mmcytfa溶液并且搅拌1h，然后通过添加1mna2hpo4溶液将溶液碱化。将粗产物用去离子水稀释并且通过spe(amberchromcg300m)纯化。通过冻干获得呈白色粉末状的产物并且通过lc/ms证实其结构。
在室温下向以上产物、ac-r6-gly(4当量；seqidno：1)以及hatu(4当量)于dmso中的混合物中添加dipea(10当量)并且搅拌4小时。将粗产物用去离子水稀释并且通过isco色谱系统纯化(scx柱，source30s，流动相(ph＝7)：溶剂a：20mmnahpo4/25％acn(ph＝7)；溶剂b：1.5m盐酸胍，20mmnah2po4/25％acn，然后通过spe(amberchromcg300m)脱盐。通过冻干获得呈白色粉末状的产物并且通过lc/ms证实其结构。
实施例3：关于接头修饰的化合物在mdx小鼠中的功效的剂量反应
此研究的目的为在小鼠中在剂量反应研究中比较本公开的肽-寡聚物-缀合物的功效。肽与pmo之间的间隔调节功效。因此，使用3、4以及8的peg长度来系统地增加ac-r6-gly(seqidno：1)与pmo之间的间隔。另外，使用全d氨基酸型式的ac-r6-g1y(seqidno：1)和ac-r6-apa(seqidno：4)(4-氨基苯基乙酸；芳族、疏水接头)(表2)。
按照以下动物卫生法规来进行研究：usda动物福利法案(usdaanimalwelfareact)9cfr部分1-3.federalregister39129，1993年7月22日。动物护理是根据研究方案来进行并且符合usda动物福利法案(9cfr部分1、2以及3)中所概述的法规以及实验室动物护理和使用指导(guideforthecareanduseoflaboratoryanimals)(ilar公布1996，nationalacademypress)中所规定的条件。
测试材料
表2中列出了所测试的所选肽-寡聚物-缀合物(在盐水中配制肽-寡聚物-缀合物并且储存在5℃下)。
表2.
*g＝gly，ac＝乙酰基，r＝arg，m23d＝5’-gctattaccttaacccag-3’(seqidno：2)
测试系统
表3中描述了用于研究的动物。
表3.
在收到后，将动物拆包并且放置于笼罩中。对每个动物进行视觉健康检查，包括评估皮毛、四肢以及官窍。检查每个动物在姿势或运动方面的任何异常迹象。在进行实验程序之前使小鼠适应最少八或九天(分别为组群1和2)。
使动物每笼最多5只居住在具有经核证的照射过的接触垫草的透明聚碳酸酯微型分隔笼罩中。笼罩符合动物福利法案(和全部修订)以及实验室动物护理和使用指导(nationalacademypress，washington，d.c.，1996)中所阐述的标准。不限量提供椭圆形球粒经核证picolab啮齿动物20膳食(pmifeedsinc.，richmond，indiana，usa)。在整个研究期内去离子水为动物不限量可获得的。提供enrich-o-cob垫草和消毒的圆顶小屋和/或通道作为丰富材料。在饲料、水、丰富材料或垫草中不存在预期将妨碍此研究的已知污染物。将环境对照设定为维持18℃至26℃(64°f至79°f)的温度以及30％至70％的相对湿度。每天至少一次记录这些参数。维持12∶12小时的明∶暗周期。
实验程序
如表4中所规定基于笼罩重量将动物随机化至处理组中。
表4.处理组
将研究时的给药当天指定为研究第1天。在给药之前将每种肽-寡聚物-缀合物涡旋约10秒，并且经由尾部静脉以缓慢推注(约5秒；200μl)的形式施用。历时两天进行给药。在同一天对接受相同肽-寡聚物-缀合物的全部动物进行给药。将分配至不能给药的处理组、注射失败或给药后立即死亡的动物用备用小鼠替换。对任何剩余备用动物进行尸检并且如下文所规定收集组织。
每天一次观测动物的垂死率和死亡率。根据numirabiosciences标准操作程序将显示痛苦迹象，特别是如果似乎即将死亡的任何动物人道地安乐死。在到达后当天、给药当天以及尸检当天记录体重。在0分钟、给药后15分钟以及2小时时进行详细临床观测并且记录以评估注射耐受性。
将不大可能活到下一次预定观测的动物称重并且安乐死。将发现死亡的动物称重并且尽可能接近地估计死亡时间。不收集血液和组织样品。
在第8天(给药后7天)，用二氧化碳将包括任何未处理或备用动物的全部动物人道地安乐死。根据所接受的2007年6月的美国兽医协会(americanveterinarymedicalassociation，avma)安乐死准则进行安乐死。
部分肉眼尸检包括检验和记录发现。评估所有外表面和官窍。详尽描述并且记录在收集下文列举的组织期间观测到的所有异常。未取得额外的组织。
在安乐死15分钟或更短时间内收集组织。在处理组之间更换所用的所有仪器和工具。在收集之后尽快将所有组织快速冷冻并储存在低于-70℃的温度下。收集以下组织：肝脏、肾脏、心脏、四头肌以及隔膜。
结果-动物健康和体重
动物#2407在到达后重量不足并且为病态的。不将其用于研究并且人道地安乐死。注意到tg(处理组)4(ppmo-4，40mg/kg)、tg5(ppmo-4，80mg/kg)以及tg20(ppmo-6，80mg/kg)中的动物全部在15分钟观测时恢复缓慢，但到2小时观测时恢复。在给药次日发现动物2356，tg14，(ppmo-540mg/kg)死亡。在尸检时，注意到动物2406，tg1(ppmo-4，5mg/kg)右眼闭合并且有白色物质从其中流出。同时在尸检时，注意到动物2422，tg18(ppmo-6，20mg/kg)在左肾中存在少量流体。表5中呈现了动物在整个研究中的体重。
表5.个别体重(g)
结果-pcr分析
使用geillustrarnaspin96孔提取试剂盒纯化来自小鼠四头肌、心脏以及隔膜组织的rna。简单来说，在具有氧化锆珠粒(biospec)的板中将400μl的溶解缓冲液(ra1+1％2-巯基乙醇)添加至约20-30mg的冷冻组织中并且使用genogrinder(spexsampleprep)在1750rpm下以4x8分钟进行均质化；在每次运行之间进行冷却。立即处理匀浆以根据gernaspinillustra96孔方案进行rna纯化。使用nanodrop2000分光光度计(thermoscientific)定量总rna。
通过经典嵌套pcr反应分析rna。除非另外指明，否则rt-pcr试剂是来自invitrogen。在cfx96或s1000热循环器(biorad)中进行pcr反应。在于200v下运行的nupage10％tbe凝胶(invitrogen)上分离最终cdna产物，在室温下进行1h。用使用670bp30cy5发射滤片的typhoontrio(gehealthcare)扫描凝胶并且用imagequant软件分析。
用于pcr分析的引物如下：抗肌萎缩蛋白外部正向(5’-caatgtttctggatgcagactttgtgg-3’；seqidno：9)、抗肌萎缩蛋白外部反向(5’-gttcagcttcactctttatcttctgcc-3’；seqidno：10)、抗肌萎缩蛋白内部正向(5’-cacatctttgatggtgtgagg-3’；seqidno：11)以及抗肌萎缩蛋白内部反向(5’-caacttcagccatccatttctg-3’；seqidno：12)。根据表6中描述的方案进行pcr反应，并且将结果概括于表7和图3-5中。
表6.pcr方法
表7.外显子23跳跃％的概述
实施例4：mdx小鼠中接头修饰的化合物的最大耐受剂量研究
根据表8中所示的方案在小鼠中测定本公开的所选肽-寡聚物-缀合物的最大耐受剂量(mtd)。将结果概括于表9中，表9表明除了ppmo-5，所有化合物均具有150与200mg/kg之间的mtd。ppmo-5具有＞200mg/kg的mtd。表10中概括了在mtd研究期间的存活观测。
表8.mtd研究
表9.mtd存活％
表10.mtd存活观测
概括地说，修改肽-寡聚物-缀合物的接头长度产生改善的效力，不过耐受性可能会降低。ppmo-4相较于ppmo-8展示改善的效力(ppmo-4的ed40约比ppmo-8大三倍)，并且在分析的所有组织类型中展示比ppmo-2更大的功效。毒性也似乎受接头长度影响，因为peg-3接头显示增加功效以及毒性(图10)。
所有化合物在50mg/kg下开始显示大于十倍的kim-1升高，此表明化合物不为良好耐受的(图9)。ppmo-1和ppmo-7200mg/kg剂量显示低于先前在ppmo-2情况下可见到的预期kim-1，并且可能是归因于肾脏的严重坏死。ppmo-7(全d-氨基酸)改善功效，但不为良好耐受的并且增加肝脏和肾脏血清化学标记物，特别是在高剂量下(图7)。ppmo-6也改善功效，但不为良好耐受的并且增加kim-1水平(图6-9)。
实施例5：治疗指数
可根据以下等式来确定治疗指数(ti)：
其中ed是指有效剂量。
重要地，可以两个阶段来描述肽-寡聚物-缀合物的毒性：t1和t2。t1是指快速死亡，或在48小时内死亡，很可能是归因于心肺衰竭。t2是指在肽-寡聚物-缀合物情况下在多个周剂量之后观测到的慢性肾脏毒性。本文所描述的mtd测量是指t1毒性(48小时终点)。
因此，如由四头肌样品所测量，ppmo-8的ti为16.6(400mg/kgmtd；24mg/kged40)。虽然ppmo-4与ppmo-8相比具有较低的mtd，但有效剂量为ppmo-8的一半，此产生14.6的较低ti。同样地，ppmo-2具有约60mg/kg的mtd，以及10mg/kg的ed40，此使得ti为6。
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