本申请要求2015年6月9日提交的美国临时申请no.62/173,330的权益，该专利的内容由此全文以引用方式并入本文。
政府支持
由纪念斯隆·凯特琳小动物成像核心设施和分子细胞学核心设施(memorialsloanketteringsmall-animalimagingcorefacilityandmolecularcytologycorefacility)提供的技术服务部分地由nih癌症中心补助金p30ca008748支持。
背景技术：
基于t细胞的免疫疗法对于癌症治疗是高度有效的，如由使用嵌合抗原受体、双特异性抗体和检查点阻断抗体的最近报道所证明的。嵌合抗原受体和双特异性抗体都依赖于表面抗原的基于抗体的靶向。然而，基于t细胞受体(tcr)的方法部分地由于肿瘤特异性t细胞的克隆频率不足或克隆缺失而发展较慢，并且由于抗体文库和平台技术的快速推进而变得相形失色。不幸的是，临床批准的治疗性单克隆抗体识别细胞表面蛋白的结构。此外，基于抗体的可靶向抗原的数量是有限的。在美国国家癌症研究所(nci)癌症抗原优先顺序列表的候选者之中，大多数存在于细胞质隔室中。靶向此类候选物的抗体药剂的开发仍然是一项挑战。
技术实现要素：
本发明除了别的以外提供了在人mhc(例如，i类)分子的环境中结合艾普斯登－巴尔病毒(ebv)潜伏膜蛋白2(lmp2)肽的人抗体药剂(及其亲和力成熟版本)。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂在肽-mhci类(例如，hla-a02)结合口袋中表现出对ebv-lmp2肽的中心部分(例如，中心肽位置)的高特异性。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂在肽-mhci类结合口袋中表现出对ebv-lmp2肽的末端部分(例如，末端肽位置)的高特异性。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂有效地对在表面上通过hla-a02分子携带ebv-lmp2肽的靶细胞进行抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂克服了与对在mhc分子(例如，mhci类分子)的结合口袋中呈递的肽的一个或多个中心部分具有特异性的抗体相关的次优亲和力。
在一些实施方案中，本发明还提供了结合ebv-lmp2/hla-a02复合物的人抗体药剂。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂结合ebv-lmp2/hla-a02复合物中的ebv-lmp2肽中的中心部分(例如，位置5)。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂结合ebv-lmp2/hla-a02复合物中ebv-lmp2肽的位置1(p1)、位置5(p5)、位置8(p8)和/或它们的组合。在一些实施方案中，所提供的抗体药剂结合ebv-lmp2/hla-a02复合物中ebv-lmp2肽的位置1至5(p1至p5)、位置4至7(p4至p7)或位置4至8(p4至p8)。
本发明还提供了多特异性结合剂，所述多特异性结合剂包括与特定靶标相互作用的结合部分。在许多实施方案中，这种结合部分是或包含抗体组分。在一些实施方案中，多特异性结合剂是双特异性结合剂(例如，双特异性抗体)。在一些实施方案中，本发明的多特异性结合剂包括在肽-mhc(例如mhci类)结合口袋中对ebv-lmp2肽的中心和/或末端部分具有高特异性的抗体组分。在一些实施方案中，本发明的多特异性结合剂包含基于在肽-mhci类结合口袋(例如，hla-a02结合口袋)中对ebv-lmp2肽具有高特异性的抗体组分的第一结合部分和与免疫效应细胞(例如，t细胞)相互作用的第二结合部分。在一些实施方案中，所提供的多特异性结合剂在针对ebv+和肿瘤细胞系的细胞毒性测定中具有高效力。在一些实施方案中，所提供的多特异性结合剂克服了与tcr样单克隆抗体相关的低亲和力障碍。与缺乏本文所述组分的亲本结合剂相比，如此提供的药剂具有改善的功能特征。
本发明还提供了产生、选择和/或鉴定在肽-mhc结合口袋(例如，mhci类结合口袋)中结合ebv-lmp2肽的抗体药剂和/或多特异性结合剂的方法。在许多实施方案中，本发明的方法包括产生、选择和/或鉴定结合由人mhci类分子(例如，hla-a02分子)呈递的ebv-lmp2肽的中心和/或末端部分的抗体药剂和/或多特异性结合剂。
在一些实施方案中，方法包括基于在由mhci类分子呈递的肽的一个或多个中心和/或末端部分处具有非天然氨基酸取代的结合(或没有结合)肽来选择抗体药剂。在一些实施方案中，方法包括基于缺乏在中心和/或末端部分处具有非天然氨基酸取代并且进一步在由mhci类分子呈递的肽的n末端和/或c末端处具有额外的天然侧接残基的结合肽来选择抗体药剂。在一些实施方案中，方法包括基于在肽的中心部分之外的一个或多个位置(例如，位置5)处结合肽来阴性选择抗体药剂。在一些实施方案中，肽的中心部分外的肽位置突变。在一些实施方案中，肽是九聚体肽或十聚体肽。在许多实施方案中，mhci类分子是人hla-a02分子。
在一些实施方案中，本发明提供了结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，其中人抗体药剂与ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，该一个或多个位置选自由位置1、位置5、位置8以及它们的组合组成的组。
在一些实施方案中，本发明提供了结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，其中人抗体药剂的kd为约2.0至约170nm。
在一些实施方案中，ebv-lmp2肽具有是或包含clgglltmv(seqidno:1)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，人抗体药剂与ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，该一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。
在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:31的重链cdr1、seqidno:33的cdr2和seqidno:35的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:73的轻链cdr1、seqidno:75的cdr2和seqidno:77的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:37的重链cdr1、seqidno:39的cdr2和seqidno:41的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:79的轻链cdr1、seqidno:81的cdr2和seqidno:83的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:43的重链cdr1、seqidno:45的cdr2和seqidno:47的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:85的轻链cdr1、seqidno:87的cdr2和seqidno:89的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:49的重链cdr1、seqidno:51的cdr2和seqidno:53的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:91的轻链cdr1、seqidno:93的cdr2和seqidno:95的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:55的重链cdr1、seqidno:57的cdr2和seqidno:59的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:97的轻链cdr1、seqidno:99的cdr2和seqidno:101的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:61的重链cdr1、seqidno:63的cdr2和seqidno:65的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:103的轻链cdr1、seqidno:105的cdr2和seqidno:107的cdr3。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:67的重链cdr1、seqidno:69的cdr2和seqidno:71的cdr3；并且其中人抗体药剂包含seqidno:109的轻链cdr1、seqidno:111的cdr2和seqidno:113的cdr3。
在一些实施方案中，人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的一个或多个氨基酸取代。在某些实施方案中，人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的至少一个或至多五个氨基酸取代。在某些实施方案中，人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的至少一个或至多三个氨基酸取代。
在一些实施方案中，人抗体药剂包含具有与表3中出现的重链可变区序列至少95％同一的序列的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含具有与表3中出现的轻链可变区序列至少95％同一的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含(a)具有与表3中出现的重链可变区序列至少95％同一的序列的重链可变区，和(b)具有与表3中出现的轻链可变区序列至少95％同一的序列的轻链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含选自表3的重链可变区或轻链可变区。
在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:3的轻链可变区和seqidno:5的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:7的轻链可变区和seqidno:9的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:11的轻链可变区和seqidno:13的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:15的轻链可变区和seqidno:17的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:19的轻链可变区和seqidno:21的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:23的轻链可变区和seqidno:25的重链可变区。在一些实施方案中，人抗体药剂包含seqidno:27的轻链可变区和seqidno:29的重链可变区。
在一些实施方案中，人抗体药剂是去岩藻糖基化和/或用末端甘露糖、n-乙酰葡萄糖或葡萄糖糖基化的人单克隆抗体。
在一些实施方案中，本发明提供了结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，该人抗体药剂包含增加对ebv-lmp2/hla肽复合物的亲和力的一个或多个氨基酸取代，并且其中该人抗体药剂的特征在于(a)比对参考肽/hla复合物的亲和力高至少约1.6的ka，和/或(b)对参考肽/hla复合物没有交叉反应性。在一些实施方案中，人抗体药剂的特征在于(a)比对参考肽/hla复合物的亲和力高至少约1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或至少约9.0的ka，和/或(b)与参考肽/hla复合物没有交叉反应性。
在某些实施方案中，人抗体药剂包含在氨基酸位置48、52、55、66、95以及它们的组合中的任一者处包含一个或多个氨基酸取代的轻链可变区。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是i48v/s52g、p55h、k66r或n95i。
在某些实施方案中，人抗体药剂包含在氨基酸位置5、10、26、51、78以及它们的组合中的任一者处包含一个或多个氨基酸取代的重链可变区。在一些实施方案中，一个或多个氨基酸取代是v5e、e10d、g26e/i51v或v78a。
在各种实施方案中，人抗体药剂是人单克隆抗体或其片段。在一些实施方案中，人单克隆抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。在某些实施方案中，人单克隆抗体是igg1。在一些实施方案中，人单克隆抗体片段是scfv。
在一些实施方案中，本发明提供了包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的双特异性抗体，该第一抗原结合位点结合ebv-lmp2/hla肽复合物。
在一些实施方案中，双特异性抗体的特征在于在用ebv-lmp2肽clgglltmv(seqidno:1)脉冲的t2细胞中约0.2至约135pm的ec50。在一些实施方案中，双特异性抗体的kd为约10至约130nm。
在一些实施方案中，第一和/或第二抗原结合位点选自由免疫球蛋白分子、scfv、scfab、fab、fv或它们的组合组成的组。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合位点被配置为使得它们形成单个多肽链。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合位点各自为scfv。在一些实施方案中，第一和第二抗原结合位点通过肽接头连接。在一些实施方案中，第二抗原结合位点连接到第一抗原结合位点的c末端。
在一些实施方案中，第二抗原结合位点结合选自由t细胞、b细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、间充质干细胞和神经干细胞组成的组的免疫细胞。在某些实施方案中，第二抗原结合位点结合t细胞上的cd3。在一些实施方案中，第二抗原结合位点是或包含seqidno:124。
在一些实施方案中，本发明提供双特异性抗体，该双特异性抗体包含结合由hla-a02分子呈递的ebv-lmp2肽clgglltmv(seqidno:1)的第一scfv，以及结合t细胞上cd3的第二scfv，其中该双特异性抗体的特征在于用ebv-lmp2肽脉冲的t2细胞中的ec50为约0.2至约135pm。
在一些实施方案中，第一scfv包含(a)seqidno:3的轻链可变区和seqidno:5的重链可变区；(b)seqidno:7的轻链可变区和seqidno:9的重链可变区；(c)seqidno:11的轻链可变区和seqidno:13的重链可变区；(d)seqidno:15的轻链可变区和seqidno:17的重链可变区；(e)seqidno:19的轻链可变区和seqidno:21的重链可变区；(f)seqidno:23的轻链可变区和seqidno:25的重链可变区；或(g)seqidno:27的轻链可变区和seqidno:29的重链可变区。
在一些实施方案中，第二scfv连接到第一scfv的c末端。在某些实施方案中，第二scfv是或包含seqidno:124。
在一些实施方案中，双特异性抗体的第一scfv与ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，该一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一scfv与ebv-lmp2肽的至少位置1、至少位置5或至少位置8直接相互作用。
在一些实施方案中，本发明提供了包含结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂的抗原结合位点的嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，抗原结合位点是scfv。在一些实施方案中，抗原结合位点由免疫效应细胞表达。在一些实施方案中，免疫效应细胞是t细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了全部或部分地编码如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体的分离核酸分子。
在一些实施方案中，本发明提供了编码如本文所述的核酸分子的重组载体。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的重组载体或如本文所述的核酸分子的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，宿主细胞选自由大肠杆菌(e.coli)、毕赤酵母属(p.pastoris)、sf9、cos、hek293、cho和哺乳动物淋巴细胞组成的组。在某些实施方案中，哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于产生如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体的方法，该方法包括在适于表达人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体的条件下在培养基中培养如本文所述的宿主细胞，以及从培养基中回收人抗体药剂、双特异性抗体、或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的宿主细胞)。
在一些实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包含如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体或如本文所述的组合物，并且进一步包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，该试剂盒包含如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的以ebv-lmp2/hla肽复合物的表达为特征的医学病症的方法，该方法包括施用治疗有效量的如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体、嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)、如本文所述的组合物、或如本文所述的药物组合物的步骤。
在一些实施方案中，医学病症是霍奇金病、非霍奇金病或传染性单核细胞增多症。在一些实施方案中，医学病症选自伯基特淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌，以及免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。
在一些实施方案中，本发明提供了人抗体药剂作为如本文所述的双特异性抗体或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)来治疗或检测与ebv感染相关的病症的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了一种指导t细胞杀伤表达ebv-lmp2/hla肽复合物的靶细胞的方法，该方法包括使表达ebv-lmp2/hla肽复合物的一个或多个靶细胞与如本文所述的双特异性抗体接触的步骤，该接触是在足以使双特异性抗体已经结合的t细胞介导对靶细胞的杀伤的条件和时间下进行的。在一些实施方案中，双特异性抗体包含结合ebv-lmp2/hla肽复合物的第一抗原结合位点和结合t细胞上的cd3的第二抗原结合位点。
在一些实施方案中，ebv-lmp2肽是或包含clgglltmv(seqidno:1)。在一些实施方案中，双特异性抗体的第一抗原结合位点与ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，该一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。
在一些实施方案中，本发明提供了一种从群体中选择结合由所关注的人hlai类分子所呈递的肽的中心残基的抗体药剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)从群体中选择结合所关注的肽-hlai类复合物的一种或多种抗体药剂；以及(b)针对与包含在选自由位置1、位置5、位置8以及它们的组合组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸取代的肽的肽-hlai类复合物的结合，筛选来自(a)的该一种或多种抗体药剂；其中抗体药剂与包含在位置5处具有取代的肽的肽-hlai类复合物的结合的丧失指示结合由人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂。
在一些实施方案中，本发明提供了一种从群体中选择结合由所关注的人hlai类分子所呈递的肽的中心残基的抗体药剂的方法，该方法包括以下步骤：(a)从群体中选择不结合第一肽-hlai类复合物的一种或多种抗体药剂，该第一肽-hlai类复合物包含在位置5处具有氨基酸取代的肽和/或在该肽的n末端和/或c末端处具有一个或多个附加氨基酸的肽；以及(b)针对与第二肽-hlai类复合物的结合，筛选来自(a)的该一种或多种抗体药剂，该第二肽-hlai类复合物包含具有所关注的野生型序列的肽；其中抗体药剂与第二肽-hlai类复合物的结合指示结合由人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂。
在一些实施方案中，肽/hlai类复合物的肽是艾普斯登－巴尔病毒(ebv)相关肽。在一些实施方案中，肽/hlai类复合物是ebv-lmp2/hla-a02复合物。
在一些实施方案中，抗体药剂是人单克隆抗体。在一些实施方案中，抗体药剂是人单克隆抗体片段。
在一些实施方案中，在提供结合肽/hla复合物的高亲和力人单克隆抗体的方法中，本发明提供了改进，该改进包括提供与肽/hla复合物中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用或偏向该一个或多个氨基酸的人单克隆抗体。
在一些实施方案中，在提供结合肽/hla复合物的高亲和力人单克隆抗体的方法中，本发明提供了改进，该改进包括提供在hla结合口袋中与肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用或偏向该一个或多个氨基酸的人单克隆抗体，其中肽/hla复合物不是使用计算机模拟预测方法产生的。
在一些实施方案中，在提供包含包括第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的双特异性抗体的高亲和力双特异性抗体组合物的方法中，该第一抗原结合位点结合肽/hla复合物，本发明提供了改进，该改进包括提供至少一个此类第一抗原结合位点作为人单克隆抗体或其片段，来与肽/hla复合物中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用。
在一些实施方案中，在提供包含一个或多个抗原结合位点的嵌合抗原受体组合物的方法中，其中该一个或多个抗原结合位点中的至少一个结合肽/hla复合物，本发明提供了改进，该改进包括提供在hla结合口袋中与肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用的人抗体药剂的抗原结合位点。在一些某些实施方案中，嵌合抗原受体组合物由免疫效应细胞表达。在一些实施方案中，免疫效应细胞是t细胞。
在各种实施方案中，hla是i类hla分子。
在各种实施方案中，肽是九聚体肽。
在各种实施方案中，肽是十聚体肽。
在各种实施方案中，肽是艾普斯登－巴尔病毒(ebv)相关肽。
在各种实施方案中，肽/hla复合物是ebv-lmp2/hla-a02复合物。
在各种实施方案中，ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。在各种实施方案中，hlai类分子是hla-a02。在各种实施方案中，hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)在用于医学中的药物制造中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)在用于诊断测试或测定中的药物制造中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)在用于癌症诊断或治疗中的药物制造中的用途。
在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的人抗体药剂、双特异性抗体或嵌合抗原受体(或表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞)在用于以ebv-lmp2/hla肽复合物的表达为特征的医学病症的诊断或治疗中的药物制造中的用途。
附图说明
本文包括的图由以下附图组成，仅用于说明目的而不是限制。
图1示出了描绘t细胞受体:九聚体-肽/mhci类复合物的平均每残基范德瓦尔斯相互作用能量的坐标图。肽位置(p1、p2等)在坐标图的x轴上指示。
图2示出了描绘t细胞受体:十聚体-肽/mhci类复合物的平均每残基范德瓦尔斯相互作用能量的坐标图。肽位置(p1、p2等)在坐标图的x轴上指示。
图3示出了描述在单体ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物的纯化期间观察到的各种物质的尺寸排阻色谱图。
图4示出了在还原性(左)和非还原性(右)条件下单体ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物的sds-page的图像。每个柱以及单体(ebv-lmp2/hla-a*02:01)、mhc分子(hla-a*02:01)和β2微球蛋白(β2m)的位置指示每个样品的身份。对照a和b：不相关的肽/hla-a02肽复合物。
图5示出了在实施例2中描述的噬菌体elisa测定中，针对可溶性ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物选择的人scfv克隆在450nm处的光密度(od450)的示例性坐标图。ext005：ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01复合物；ext007：对照肽/hla-a*02:01复合物；ext002对照ab：阳性对照抗hla-a*02:01抗体；68-72:抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01抗体噬菌体克隆。对照肽：不相关的肽。
图6示出了通过流式细胞术进行的负载有ebv-lmp2肽的t2细胞和负载有对照肽的t2细胞的示例性噬菌体结合。对照肽：不相关的肽；ext005-57：抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01抗体噬菌体克隆；k07：辅助噬菌体，噬菌体阴性对照；仅细胞：小鼠抗m13单克隆抗体，以及r-pe缀合的马抗小鼠igg。
图7示出了在还原条件下由特异于ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物的scfv制备的所选全长人igg1抗体的sds-page的示例性图像。
图8示出了在还原条件下所选的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02双特异性分子的sds-page的示例性图像。在凝胶图像的每个泳道上指示出了双特异性抗体分子。
图9示出了示例性facs直方图(在每个配对中的左边)，示出了对t2细胞表面上的ebv-lmp2肽的hla-a02呈递的阳性染色和用对照(ymldlqpet；seqidno:120)或ebv-lmp2肽(clgglltmv；seqidno:1)脉冲的t2细胞的抗体依赖性细胞毒性(adcc；特异性裂解％，在每个配对中的右边)。对照ab：人igg1同型匹配对照；将nk92效应细胞用fcγriiia176v/v变体等位基因(cd16176v/v)以20:1的效应物比靶标(e:t)比率转染；mab：单克隆抗体。
图10示出了在用不同浓度的肽脉冲的t2细胞上所选的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02抗体与ebv-lmp2肽的示例性结合。
图11示出了由所选的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg1抗体介导的ebv转化的b淋巴母细胞(blcl)的示例性特异性裂解百分比。mab：单克隆抗体。
图12示出了使用具有结合ebv-lmp2(clg)/hla-a02的第一抗原结合位点和结合cd3的第二抗原结合位点的所选双特异性抗体(bsab)对用ebv-lmp2肽(实线；clgglltmv，seqidno:1)或对照肽(虚线；ymldlqpet，seqidno:120)脉冲的t2细胞的示例性t细胞细胞毒性。对照bsab：抗her2xcd3双特异性抗体。
图13示出了使用所选的lmp2xcd3双特异性抗体(bsab)的ebv转化的hla-a02+(右侧小图)和hla-a02–(左侧小图)细胞的示例性t细胞细胞毒性。图13a：lmp2-38xcd3(顶部)和lmp2-63xcd3(底部)；图13b:lmp2-40xcd3(顶部)和lmp2-61xcd3(底部)；图13c：lmp2-21xcd3(顶部)和lmp2-26xcd3(底部)；图13d：lmp2-77xcd3。kbab：hla-a02–；900d：hla-a02–；ak：hla-a02–；ks：hla-a02–；oko：hla-a02+；bv：hla-a02+；6/28：hla-a02+。
图14示出了使用pdb3rew产生的分辨率为
图15示出了通过流式细胞术测定的所选抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01特异性igg1抗体的示例性肽结合(左小图)和相应双特异性抗体对blcl的细胞毒性(右小图)。对照：人igg1同型匹配对照。
图16示出了通过流式细胞术测定的所选ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01特异性igg1抗体与具有(虚线)和不具有(实线)的外源ebv-lmp2肽的hla-a*02:01+blcloko细胞的示例性结合。实线表示igg1抗体与没有外源肽的细胞的结合，而虚线表示与100μg/ml肽一起温育过夜后的相同oko细胞。
图17示出了双特异性抗体对表达不同hla-a02亚等位基因的肽脉冲抗原呈递细胞的示例性细胞毒性(在每个配对中的左边)和通过流式细胞术测定的全长igg1抗体与所述细胞的结合(在每个配对中的右边)。双特异性抗体被标记为例如对应于lmp2-38×cd3双特异性抗体的ext005-38bsab，等等；igg1抗体被标记为例如对应于lmp2-21igg1抗体的ext005-21，等等。
图18示出了通过流式细胞术测定的所选全长igg1抗体针与表达不同hla-a02亚等位基因的肽脉冲抗原呈递细胞的示例性结合。igg1抗体被标记为例如对应于lmp2-21igg1抗体的ext005-21，等等。
图19示出了使用在肽的位置1、5和8处具有丙氨酸取代的九聚体肽产生ii型tcr样单克隆抗体的选择策略的图式(未按比例绘制)。
图20示出了使用在肽的位置5处具有丙氨酸取代并且在肽的n末端或c末端具有天然残基的九聚体肽产生ii型tcr样单克隆抗体的选择策略的图式(未按比例绘制)。
图21示出了使用在肽的位置1、5和8处具有丙氨酸取代的十聚体肽产生ii型tcr样单克隆抗体的选择策略的图式(未按比例绘制)。
图22示出了使用在肽的位置5处具有丙氨酸取代并且在肽的n末端或c末端具有额外的天然残基的十聚体肽产生ii型tcr样单克隆抗体的选择策略的图式(未按比例绘制)。
图23示出了通过流式细胞术检测的ala取代的clg肽对hla-a*02:01的示例性肽负载效率。
图24示出了抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01igg抗体克隆与在位置p3至p8处负载有野生型clg肽或ala取代的clg肽的hla-a*02:01的示例性肽结合。图24a示出了通过流式细胞术检测的结合数据。图24b示出了来自图24a的结合数据，其中与ala取代的肽/hla*02:01复合物的结合被针对野生型clg肽归一化。
图25示出了来自lmp2克隆38(左上)、38-2(右上)、26(左中)、61(右中)和40(左下)的二聚体双特异性抗体的示例性色谱图，以作为对这些样品纯度的指示。
图26示出了使用脐带血t细胞作为效应物(et比为10:1)时，二聚体双特异性抗体对hla-a*02(+)ebv(+)肿瘤细胞系的示例性细胞毒性。来自克隆26、28、28-2、40、61和对照的二聚双特异性抗体各自进行测试，并且示出了在以下肿瘤细胞系的每一者中的特异性裂解％：rpmi-6666(左上)，dtblcl(右上)，fblcl(左下)和hone-1-a2(右下)。
图27示出了来自小鼠异种移植研究的示例性肿瘤定量数据，其中将fblcl植入免疫缺陷小鼠中并将该免疫缺陷小鼠用lmp2二聚体双特异性抗体和人成体pbmc效应细胞处理。
图28示出了来自小鼠异种移植研究的示例性存活数据，其中将fblcl植入免疫缺陷小鼠中并将该免疫缺陷小鼠用lmp2二聚体双特异性抗体和人成体pbmc效应细胞处理。
图29示出了来自小鼠异种移植研究的示例性肿瘤定量数据，其中将fblcl植入免疫缺陷小鼠中并将该免疫缺陷小鼠用lmp2二聚体双特异性抗体和人脐带血pbmc效应细胞处理。
图30示出了来自小鼠异种移植研究的示例性存活数据，其中将fblcl植入免疫缺陷小鼠中并将该免疫缺陷小鼠用lmp2二聚体双特异性抗体和人脐带血pbmc效应细胞处理。
定义
本发明的范围由本文所附权利要求书限定，并且不受本文所描述的特定实施方案的限制；本领域的技术人员在阅读本公开内容后将认识到可以等同于这些所描述的实施方案或者以其他方式在权利要求书的范围内的各种修改。
一般而言，本文使用的术语是根据该术语在本领域中所理解的含义，除非另外明确指出。下面提供了某些术语的明确定义；对于本领域中的技术人员，这些和其他术语在整个说明书中的特定实例中的含义将从上下文清楚。
本说明书中引用的参考文献或其相关部分以引用方式并入本文。
为了使本发明更容易理解，下面首先定义某些术语。以下术语和其他术语的附加定义在整个说明书中陈述。
施用：如本文所用，术语“施用”是指将组合物施用于受试者或系统(例如施用于细胞、器官、组织、生物体，或它们的相关组分或它们的一组组分)。本领域中的普通技术人员将理解，施用途径可以取决于例如组合物所施用于的受试者或系统、组合物的性质、施用目的等而变化。例如，在某些实施方案中，至动物受试者(例如至人)的施用可以是支气管的(包括通过支气管灌注)、颊的、经肠的、皮内的、动脉内的、真皮内的、胃内的、髓内的、肌内的、鼻内的、腹膜内的、鞘内的、静脉内的、心室内的、黏膜的、鼻腔的、口服的、直肠的、皮下的、舌下的、局部的、气管的(包括通过气管滴注)、透皮的、阴道的和/或玻璃体的。在一些实施方案中，施用可以涉及间歇投配。在一些实施方案中，施用可以涉及连续投配(例如，灌注)达至少一段选定的时间。
亲和力：如本领域中所公知的，“亲和力”是特定配体与其伴侣结合的紧密程度的量度。亲和力可以以不同的方式测量。在一些实施方案中，通过定量测定来测量亲和力。在一些此类实施方案中，结合伴侣浓度可以固定为超过配体浓度，以便模拟生理条件。替代地或另外，在一些实施方案中，可以改变结合伴侣浓度和/或配体浓度。在一些此类实施方案中，可以在可比的条件(例如，浓度)下将亲和力与参考进行比较。
成熟的亲和力(或亲和力成熟的抗体)：如本文所用，是指在一个或多个cdr(或在一些实施方案中，框架区)中具有一个或多个改变的抗体，该一个或多个改变导致相较于不具有这些一个或多个改变的亲本抗体，抗体对抗原的亲和力获得改善。在一些实施方案中，亲和力成熟的抗体将对靶抗原具有纳摩尔或甚至皮摩尔亲和力。亲和力成熟的抗体可以通过本领域中已知的多种方法中的任一种来产生。marks等人，1992，biotechnology[生物技术]，10:779-783描述了通过vh和vl结构域替换进行的亲和力成熟。cdr和/或框架残基的随机诱变由以下文献描述：barbasetal.,1994,proc.nat.acad.sci,u.s.a.91:3809-3813[barbas等人，1994，美国科学院院刊，91:3809-3813]；schieretal.,1995,gene169:147-155[schier等人，1995，基因，169:147-155]；yeltonetal.,1995.j.immunol.155:1994-2004[yelton等人，1995，免疫学期刊，155:1994-2004]；jacksonetal.,1995,j.immunol.154(7):3310-9[jackson等人，1995，免疫学期刊，154(7):3310-9]；以及hawkinsetal.,1992,j.mol.biol.226:889-896[hawkins等人，1992，分子生物学杂志，226:889-896]。
药剂：如本文所用，可以指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或它们的组合。在一些实施方案中，药剂是或包含天然产物，因为药剂存在于和/或从自然中获得。在一些实施方案中，药剂是或包含一个或多个实体，该药剂是人造的，因为它是通过人手的动作设计、工程化和/或产生的和/或在自然中不存在的。在一些实施方案中，药剂可以以分离或纯形式利用；在一些实施方案中，药剂可以以粗制形式利用。在一些实施方案中，可能的药剂作为集合或文库提供，这些集合或文库例如可以经筛选以鉴定或表征它们中的活性剂。可以根据本发明利用的药剂的一些特定实施方案包括小分子、抗体、抗体片段、核酸配体、核酸(例如sirna、shrna、dna/rna杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、模拟肽等。在一些实施方案中，药剂是或包含聚合物。在一些实施方案中，药剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，药剂含有至少一个聚合物部分。在一些实施方案中，药剂缺乏或基本上不含任何聚合物部分。
改善：如本文所用，是指预防、减少或缓解受试者的病情，或改善受试者的病情。改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、障碍或病症(例如，辐射损伤)。
动物：如本文所用是指动物王国的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指任何性别和处于任何发育阶段的人。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方案中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、羊、牛、灵长类动物和/或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在某些实施方案中，动物易受ebv感染。在一些实施方案中，动物可以是转基因动物、遗传工程动物和/或克隆体。
抗体：如本文所用，具有其在本领域中所被理解的含义，并且是指特异性结合特定抗原的免疫球蛋白(ig)。如本领域的普通技术人员所已知，天然产生的抗体通常由四条多肽链，即两条重链(h)和两条轻链(l)组成。每条重链和轻链由可变区(在本文分别缩写为hcvr或vh和lcvr或vl)和恒定区组成。重链的恒定区包含ch1、ch2和ch3结构域(以及在igm和ige的情况下任选地包含ch4结构域)。轻链的恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区进一步包含被称为互补性决定区(cdr)的高变区，其间插有被称为框架区(fr)的更保守的区域。每个vh和vl由从氨基端至羧基端按以下顺序排列的3个cdr和4个fr的组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，igm、igd、igg、iga和ige)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或亚型。
抗体药剂：如本文所用，术语“抗体药剂”是指特异性结合特定抗原的药剂。在一些实施方案中，该术语涵盖具有足以赋予特异性结合的免疫球蛋白结构元件的任何多肽。在各种实施方案中，合适的抗体药剂可以包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、灵长类化抗体、嵌合抗体，人抗体、双特异性或多特异性抗体、单结构域抗体(例如鲨鱼单结构域抗体(例如，ignar或其片段))、缀合抗体(即，缀合或融合至其他蛋白、放射性标记、细胞毒素的抗体)、小型模块化免疫药物(“smipstm”)、单链抗体、驼科动物(cameloid)抗体、抗体片段等。在一些实施方案中，该术语可以指订书肽(stapledpeptide)。在一些实施方案中，该术语可以指抗体样结合拟肽。在一些实施方案中，该术语可以指抗体样结合支架蛋白。在一些实施方案中，该术语可以指单抗体(monobody)或adnectin。在许多实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包含本领域的技术人员认识的一个或多个结构元件作为互补性决定区(cdr)；在一些实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包含与在参考抗体中存在的cdr基本上相同的至少一个cdr(例如，至少一个重链cdr和/或至少一个轻链cdr)。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为与参考cdr相比，它在序列方面相同或者包含在1至5个之间的氨基酸取代。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为它表现出与参考cdr至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为它表现出与参考cdr至少96％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为与参考cdr相比所包含的cdr内的至少一个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包含的cdr具有在其他方面与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为与参考cdr相比所包含的cdr内的1至5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包含的cdr具有在其他方面与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为与参考cdr相比所包含的cdr内的至少一个氨基酸被取代，但所包含的cdr具有在其他方面与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，所包含的cdr与参考cdr基本上相同，因为与参考cdr相比所包含的cdr内的1至5个氨基酸被缺失、添加或取代，但所包含的cdr具有在其他方面与参考cdr相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：其氨基酸序列包括被本领域的技术人员认识为免疫球蛋白可变结构域的结构元件。在一些实施方案中，抗体药剂是具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的多肽蛋白。在一些实施方案中，抗体药剂是或包含这样的多肽：该多肽包含在一条或多条特定参考抗体链(例如重链和/或轻链)中存在的所有cdr。
抗体组分：如本文所用，是指与表位或抗原特异性结合并包含一个或多个免疫球蛋白结构特征的多肽元件(其可以是完整多肽，或较大多肽的一部分，诸如如本文所述的融合多肽)。通常，抗体组分是氨基酸序列包含抗体结合区的特征性元件(例如任选地在一个或多个框架区存在下，抗体轻链或可变区，或抗体轻链或可变区的一个多个互补性决定区(“cdr”)，或抗体重链或可变区，或抗体重链或可变区的一个或多个cdr，)的任何多肽。在一些实施方案中，抗体组分是或包含全长抗体。在一些实施方案中，抗体组分小于全长，但包含至少一个结合位点(包含至少一个，优选至少两个具有已知抗体“可变区”结构的序列)。在一些实施方案中，术语“抗体组分”涵盖具有与免疫球蛋白结合结构域同源或在很大程度上同源的结合结构域的任何蛋白质。在具体实施方案中，所包含的“抗体组分”涵盖具有表现出与免疫球蛋白结合结构域至少99％同一性的结合结构域的多肽。在一些实施方案中，所包含的“抗体组分”是具有表现出与免疫球蛋白结合结构域(例如参考免疫球蛋白结合结构域)至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％同一性的结合结构域的任何多肽。所包含的“抗体组分”可以具有与在天然来源中存在的抗体(或其部分，例如其抗原结合部分)相同的氨基酸序列。抗体组分可以是单特异性、双特异性或多特异性的。抗体组分可以包含任何免疫球蛋白类别的结构元件，包括以下人类别中的任一者：igg、igm、iga、igd和ige。已经显示，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。这样的抗体实施方案也可以是双特异性、双重特异性或多特异性形式；特异性地结合两种或更多种不同的抗原。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vh、vl、ch1和cl结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，包含在铰链区由二硫键连接的两个fab片段的二价片段；(iii)fd片段，由vh和ch1结构域组成；(iv)fv片段，由抗体单臂的vh和vl结构域组成，(v)dab片段(wardetal,1989,nature341:544-546[ward等人，1989，自然，341:544-546])，包含单个可变结构域；以及(vi)分离的互补性决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vh和vl由分开的基因编码，但是可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，以使得它们可以制成单一蛋白质链，在所述单一蛋白质链中vh和vl区配对形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如birdetal.,1988,science242:423-426[bird等人，1988，科学，242:423-426]；和hustonetal.,1988,proc.natl.acad.sci.u.s.a.85:5879-5883[huston等人，1988，美国科学院院刊，85:5879-5883])。在一些实施方案中，如本文所述的“抗体组分”是或包含这样的单链抗体。在一些实施方案中，“抗体组分”是或包含双抗体。双抗体是二价双特异性抗体，其中vh和vl结构域在单个多肽链上表达，但使用太短而不允许在相同链上的两个结构域之间配对的接头，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点(参见例如holliger,p.,etal.,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448[holliger,p.等人，1993，美国科学院院刊，90:6444-6448]；poljak,r.j.,etal.,1994,structure2:1121-1123[poljak,r.j.等人，1994，结构，2:1121-1123])。此类抗体结合部分是本领域中已知的(kontermannanddubeleds.,antibodyengineering,2001,springer-verlag.newyork.790pp.isbn3-540-41354-5[kontermann和dubel编辑，抗体工程，2001，施普林格出版公司，纽约，790，第isbn3-540-41354-5页])。在一些实施方案中，抗体组分是或包含单链“直链抗体”，该单链直链抗体包含一对串联的fv区段(vh-ch1-vh-ch1)，该对串联的fv区段与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(zapataetal.,1995,proteineng.8(10):1057-1062[zapata等人，1995，蛋白工程，8(10):1057-1062]；和美国专利no.5,641,870)。在一些实施方案中，抗体组分可以具有嵌合、人源化或人抗体的特征性结构元件。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补性决定区(cdr)的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的cdr的具有所需特异性、亲和力和能力的残基替代。在一些实施方案中，抗体组分可以具有人抗体的特征性结构元件。
抗体片段：如本文所用，“抗体片段”包含完整抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的示例包括fab、fab'、f(ab’)2和fv片段；三链抗体；四链抗体；直链抗体；单链抗体分子；以及包含在由抗体片段形成的多特异性抗体中的含cdr部分。本领域的技术人员将会理解，术语“抗体片段”并不暗示且不限于任何特定的生成模式。抗体片段可以通过使用任何适当的方法来产生，所述适当的方法包括但不限于切割完整抗体、化学合成、重组生产等。
生物活性：如本文所用，是指由所关注的药剂或实体实现的可观察的生物效应或结果。例如，在一些实施方案中，特异性结合相互作用是生物活性。在一些实施方案中，对生物学途径或事件的调节(例如诱导、增强或抑制)是生物学活性。在一些实施方案中，通过检测由所关注的生物学途径或事件产生的直接或间接产物来评估生物学活性的存在或程度。
双特异性抗体：如本文所用，是指其中至少一个，以及典型地两个结合部分是或包含抗体组分的双特异性结合剂。多种不同的双特异性抗体结构是在本领域中已知的。在一些实施方案中，双特异性抗体中是或包含抗体组分的每个结合部分包含vh和/或vl区；在一些此类实施方案中，vh和/或vl区是在特定单克隆抗体中存在的那些。在双特异性抗体含有两个抗体组分结合部分的一些实施方案中，各个抗体组分结合部分包含来自不同单克隆抗体的vh和/或vl区。在一些实施方案中，双特异性抗体是二聚双特异性抗体。
双特异性结合剂：如本文所用，是指具有各自结合不同靶标的两个离散结合部分的多肽药剂。在一些实施方案中，双特异性结合剂是单一多肽；在一些实施方案中，双特异性结合剂是或包含多个肽，所述多个肽在一些此类实施方案中可以例如通过交联彼此共价缔合。在一些实施方案中，双特异性结合剂的两个结合部分识别相同靶标(例如抗原)的不同位点(例如表位)；在一些实施方案中，它们识别不同的靶标。在一些实施方案中，双特异性结合剂能够同时结合两个具有不同结构的靶标。
载剂：如本文所用，是指与组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。在一些示例性实施方案中，载剂可以包括无菌的液体，诸如水和油，包括石油，动物油、植物油或合成来源的油，例如花生油、大豆油，矿物油，芝麻油等等。在一些实施方案中，载剂是或包含一种或多种固体组分。
cdr：如本文所用，是指抗体可变区内的互补性决定区。在重链和轻链的每个可变区中有三个cdr，这三个cdr被针对每个可变区命名为cdr1、cdr2和cdr3。“一组cdr”或“cdr组”是指存在于能够结合抗原的单个可变区中或能够结合抗原的多个同源重链和轻链可变区的多个cdr中的一组三个或六个cdr。cdr的界限已经根据系统(该系统中的若干种在本领域中是已知的(例如，kabat、chothia等))被不同地定义。
cdr接枝抗体：如本文所用，是指氨基酸序列包含来自一个物种的重链和轻链可变区序列，但其中vh和/或vl的一个或多个cdr区的序列被另一物种的cdr序列替代的抗体，诸如具有其中一个或多个鼠cdr(例如，cdr3)已被人cdr序列替代的鼠vh和vl区的抗体。同样，“cdr接枝抗体”还可以指具有其中一个或多个人cdr(例如，cdr3)已被小鼠cdr序列替代的人vh和vl区的抗体。
嵌合抗体：如本文所用，是指氨基酸序列包含在第一物种中存在的vh和vl区序列和在不同于第一物种的第二物种中存在的恒定区序列的抗体。在许多实施方案中，嵌合抗体具有与人恒定区连接的鼠vh和vl区。在一些实施方案中，将具有与非人恒定区(例如，小鼠恒定区)连接的人vh和vl区的抗体称为“反向嵌合抗体”。
可比：如本文所用，是指两个或更多个药剂、实体、情况、条件集等，它们可以彼此不相同但是足够相似以允许在其间进行比较，从而可以基于所观察到的差异或相似处來合理地得出结论。本领域的普通技术人员将理解，在上下文中，在任何给定的情况下对于两个或更多个此类药剂、实体、情况、条件集合等需要什么程度的一致性来被认为是可比的。
对照：如本文所用，是指在本领域中所理解的“对照”的含义，所述对照是与结果进行比较的标准品。通常，对照被用于通过分离变量来增强实验的完整性，以便得出关于这些变量的结论。在一些实施方案中，对照是与测试反应或测定同时进行以提供比较物的反应或测定。如本文所用，“对照”可以指“对照抗体”。“对照抗体”可以是如本文所述的人、非人(例如鼠)、嵌合、人源化、cdr接枝、多特异性或双特异性抗体，如本文所述不同的抗体，抗体片段或抗体组分，或亲本抗体。在一个实验中，施加“测试”(即被测试的变量)。在第二个实验中，施加“对照”，而不施加被测试的变量。在一些实施方案中，对照是历史对照(即，先前进行的测试或测定，或先前已知的量或结果)。在一些实施方案中，对照是或包括打印的或以其他方式保存的记录。对照可以是阳性对照或阴性对照。
对应于：如本文关于多肽序列内的氨基酸所使用的，表示氨基酸残基在所关注多肽中的位置/同一性。本领域的普通技术人员将理解，为了简单起见，通常使用基于参考的相关多肽的规范编号系统来指定多肽中的残基，使得“对应于”在位置190处的残基的氨基酸，例如不必实际上是特定氨基酸链中的第190个氨基酸，而是对应于参考多肽中的190处存在的残基；本领域的普通技术人员很容易理解如何鉴定“相应的”氨基酸。
效应物功能：如本文所用，是指由抗体fc区与fc受体或配体相互作用而产生的生物化学事件。效应物功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(adcp)，以及补体介导的细胞毒性(cmc)。在一些实施方案中，效应物功能是在抗原结合之后起作用的功能，独立于抗原结合而起作用的功能，或两者。
效应细胞：如本文所用，是指表达一种或多种fc受体并介导一种或多种效应物功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、郎格罕氏细胞、自然杀伤(nk)细胞、t淋巴细胞，b淋巴细胞中的一种或多种，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔子和猴子。
经工程化的：如本文所用，一般是指已经由人工操纵过的方面。例如，在一些实施方案中，当两个或更多个在自然中不以所述顺序连接在一起的序列被人工操作以在经工程化的多核苷酸中彼此直接连接时，可以认为该多核苷酸是“经工程化的”。在一些具体的此类实施方案中，经工程化的多核苷酸可以包含自然界中存在的与第一编码序列可操作地缔合但不与第二编码序列可操作地缔合的调控序列，该调控序列通过人工连接而使得其与第二编码序列可操作地缔合。替代地或另外地，在一些实施方案中，各自编码自然中不彼此连接的多肽元件或结构域的第一和第二核酸序列可以在单个经工程化的多核苷酸中彼此连接。相比之下，在一些实施方案中，如果细胞或生物体已被操纵而使得其遗传信息被改变(例如，先前不存在的新的遗传物质已经被引入，或者先前存在的遗传物质已被改变或去除)，则该细胞或生物体可以被视为“经工程化的”。如通常实践并且由本领域的技术人员所理解的，即使实际的操作是对先前的实体进行的，经工程化的多核苷酸或细胞的子代通常仍然被称为“经工程化的”。此外，如本领域技术人员将认识到的，可以通过多种方法来实现如本文所述的“工程化”。例如，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及通过使用计算机系统进行选择或设计(例如，核酸序列、多肽序列、细胞、组织和/或生物体)，所述计算机系统经编程以执行分析或比较，或以其他方式分析、推荐和/或选择序列、改变等)。替代地或另外地，在一些实施方案中，“工程化”可以涉及使用体外化学合成方法学和/或重组核酸技术，例如核酸扩增(例如通过聚合酶链式反应)杂交、突变、转化、转染等，和/或多种受控交配方法中的任一种。如本领域技术人员将理解的，多种确立的此类技术(例如，用于重组dna、寡核苷酸合成和组织培养与转化(例如电穿孔、脂质转染等))是本领域中熟知的并且描述于本说明书全文中所引用和/或讨论的各种一般和更具体的参考文献中。参见例如sambrooketal.,molecularcloning:alaboratorymanual(2ded.,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1989)[sambrook等人，分子克隆：实验室手册(第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)]。
表位：如本文所用，包含由免疫球蛋白(例如抗体或受体)结合组分特异性识别的任何部分。在一些实施方案中，表位由抗原上的多个化学原子或基团组成。在一些实施方案中，当抗原采取相关的三维构象时，这种化学原子或基团是表面暴露的。在一些实施方案中，当抗原采取这种构象时，这种化学原子或基团在空间中物理上彼此接近。在一些实施方案中，当抗原采取替代构象(例如是直链的)时，至少一些这种化学原子或基团彼此物理分离。
赋形剂：如本文所用，是指可以包含在药物组合物中，例如以提供或有助于所需的稠度或稳定作用的非治疗剂。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶，麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、水、乙醇等。
fc配体：如本文所用，是指来自任何生物体的结合抗体的fc区以形成fc配体复合物的分子，优选多肽。fc配体包括但不限于fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)、fcγri(cd64)、fcεrii(cd23)、fcrn、clq、c3、葡萄球菌蛋白a、链球菌蛋白g和病毒fcγr。fc配体可以包括结合fc的未被发现的分子。
框架或框架区：如本文所用，是指可变区减去cdr的序列。由于cdr序列可以由不同的系统确定，同样框架序列也经受相应不同的解释。六个cdr将重链和轻链上的框架区分成每个链上四个亚区(fr1、fr2、fr3和fr4)，其中cdr1位于fr1与fr2之间，cdr2位于fr2与fr3之间，并且cdr3位于fr3与fr4之间。在不将具体的亚区域指定为fr1、fr2、fr3或fr4的情况下，以其他方式所提及的框架区代表单个天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合fr。如本文所用，一个fr表示四个亚区中的一个，fr1，例如代表最靠近关于cdr1的可变区和5'的氨基末端的第一框架区，并且多个fr代表构成框架区域的亚区中的两个或更多个亚区。
宿主细胞：如本文所用，是指引入外源dna(重组或以其他方式)的细胞。技术人员在阅读本公开内容后将会理解，这种术语不仅指特定的受试者细胞，而且也指这种细胞的子代。因为某些修饰可能由于突变或环境影响而在下一代中发生，所以这样的子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然包括在如本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。在一些实施方案中，宿主细胞包括选自适于表达外源dna(例如，重组核酸序列)的任何生命王国的原核和真核细胞。示例性细胞包括原核生物和真核生物的那些细胞(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(e.coli)、芽孢杆菌属(bacillusspp.)、链霉菌属(streptomycesspp.)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如，酿酒酵母(s.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(s.pombe)、巴斯德毕赤酵母(p.pastoris)、甲醇毕赤酵母(p.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如，sf-9、sf-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(trichoplusiani)等)、非人动物细胞，人细胞，或细胞融合物，例如杂交瘤或四重杂交瘤(quadromas)。在一些实施方案中，宿主细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核的并且选自以下细胞：cho(例如，chok1、dxb-11cho、veggie-cho)、cos(例如，cos-7)、视网膜细胞、绿猴肾细胞、cv1、肾细胞(例如，hek293、293ebna、msr293、mdck、hak、bhk)、hela、hepg2、wi38、mrc5、colo205、hb8065、hl-60、(例如，bhk21)、白血病细胞、daudi、a431(表皮)、cv-1、u937、3t3、l细胞、c127细胞、sp2/0、ns-0、mmt060562、塞尔托利氏细胞、brl3a细胞、ht1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞，以及源自上述细胞的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞包含一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如，per.c6tm细胞)。
人抗体：如本文所用，旨在包括具有从人免疫球蛋白序列产生(或组装)的可变区和恒定区的抗体。在一些实施方案中，尽管抗体(或抗体组分)的氨基酸序列例如在一个或多个cdr中，特别是在cdr3中包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的残基或元件(例如，包括例如可能(最初)已经通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变被引入的序列变化)，但是该抗体(或抗体组分)可以被视为“人的”。
人源化的：如本领域中所公知的，术语“人源化”通常用于指这样的抗体(或抗体组分)：其氨基酸序列包括来自在非人物种(例如小鼠)中产生的参照抗体的vh和vl区序列，但是还包括这些序列中相对于参考抗体的修饰，这些修饰旨在使它们更“人样”，即更类似于人种系可变序列。在一些实施方案中，“人源化”抗体(或抗体组分)是这样的抗体(或抗体组分)：其与所关注的抗原免疫特异性结合并且具有含有与人抗体基本上相同的氨基酸序列的框架(fr)区，以及具有与非人抗体基本上相同的氨基酸序列的互补性决定区(cdr)。人源化抗体包含基本上全部的至少一个，以及典型地两个可变结构域(fab、fab'、f(ab')2、fabc、fv)，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白(即，供体免疫球蛋白)的那些cdr区，并且全部或基本上全部的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。在一些实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，典型地是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体含有轻链以及至少重链可变结构域两者。所述抗体还可以包含ch1、铰链、ch2、ch3，以及任选地重链恒定区的ch4区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化vl区。在一些实施方案中，人源化抗体仅含有人源化vh区。在某些实施方案中，人源化抗体含有人源化vh和vl区。
改善、增加或减少：如本文所用，或它们在语法上的等同物指示相对于基线测量的值，基线测量为诸如在本文所述的处理开始之前在同一个体中的测量或在没有在此描述的处理的情况下一个对照个体(或多个对照个体)中的测量。“对照个体”是患有与被处理个体相同形式的疾病或损伤的个体。
体外：如本文所用，是指在人造环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物等中，而不是在多细胞生物体内发生的事件。
体内：如本文所用，是指在多细胞生物体(诸如人和非人动物)内发生的事件。在基于细胞的系统的情况下，该术语可以用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统不同)。
分离的：如本文所用，是指已经(1)在最初产生时(无论在自然中和/或在实验环境中)与其所缔合的组分中的至少一些组分分离的物质和/或实体，和/或(2)经人手设计、生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与它们最初所缔合的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％的其他组分分离。在一些实施方案中，分离的药剂为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％纯。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。在一些实施方案中，如本领域的技术人员将理解的，在与某些其他组分(例如一种或多种载剂或赋形剂(例如缓冲液、溶剂、水等))组合后，物质仍可被认为是“分离的”或甚至是“纯的”；在此类实施方案中，计算不包括此类载剂或赋形剂的物质的分离百分比或纯度。仅举一个示例来说，在一些实施方案中，当a)由于其衍生起源或来源未与在自然中其天然状态下伴随其的一些或全部组分缔合；b)其基本上不含来自与在自然中产生其的物种相同的物种的其他多肽或核酸；c)由来自不是在自然中产生其的物种的细胞或其他表达系统的组分表达或以其他方式与所述组分缔合时，则自然中存在的生物聚合物如多肽或多核苷酸被认为是“分离的”。因此，例如，在一些实施方案中，化学合成或在与天然产生多肽的细胞系统不同的细胞系统中合成的多肽被认为是“分离的”多肽。替代地或另外地，在一些实施方案中，已经经历一种或多种纯化技术的多肽可被认为是“分离的”多肽，分离的程度达到多肽已经与a)其在自然界中与之缔合的其他组分分离；和/或b)其在最初生产时与之缔合的其他组分分离。
ka：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其伴侣(例如抗体药剂或其结合组分所结合的表位)的复合物的缔合(或亲和力)常数。
kd：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其伴侣(例如抗体药剂或其结合组分所结合的表位)的复合物的解离常数。
koff：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其伴侣(例如抗体药剂或其结合组分所结合的表位)的复合物解离的解离速率常数。
kon：如本文所用，是指结合剂(例如，抗体药剂或其结合组分)从与其伴侣(例如抗体药剂或其结合组分所结合的表位)缔合的结合速率常数。
接头：如本文所用，用于指多元件多肽的将不同元件相互连接的部分。例如，本领域的普通技术人员认识到，结构包括两个或更多个功能或组织结构域的多肽通常包含在这些结构域之间使这些结构域彼此连接的一段氨基酸。在一些实施方案中，包含接头元件的多肽具有通式s1-l-s2的总体结构，其中s1和s2可以相同或不同，并且代表通过接头相互缔合的两个结构域。在一些实施方案中，接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽提供柔性。当工程化本领域中已知的多肽(例如融合多肽)时，可以适当地使用各种不同的接头元件(参见例如holliger,p.,etal.,1993,proc.natl.acad.sci.u.s.a.90:6444-6448[holliger,p.等人，1993，美国科学院院刊，90:6444-6448]；poljak,r.j.etal.,1994,structure2:1121-1123[poljak,r.j.等人，1994，结构，2:1121-1123])。
多价结合剂(或多特异性结合剂)：如本文所用，是指能够结合两种或更多种抗原的结合剂，所述抗原可以在同一分子上或在不同的分子上。在一些实施方案中，本文所述的多价结合剂被工程化为具有两个或更多个抗原结合位点，并且通常不是天然存在的蛋白质。如本文所述的多价结合剂是指能够结合两个或更多个相关或不相关的靶标的结合剂。多价结合剂可以由单个抗体组分的多个拷贝或不同抗体组分的多个拷贝组成。这样的结合剂能够与两种或更多种抗原结合，并且是四价或多价结合剂。多价结合剂可另外包含治疗剂，例如免疫调节剂、毒素或rna酶。本文所述的多价结合剂在一些实施方案中能够同时结合至少两个具有不同结构的靶，例如两种不同的抗原、同一抗原上的两个不同表位，或半抗原和/或抗原或表位。在许多实施方案中，本发明的多价结合剂是经工程化为具有如本文所述的多价结合剂特征的蛋白质。本发明的多价结合剂可以是单特异性的(能够结合一种抗原)或多特异性的(能够结合两种或更多种抗原)，并且可以由两个重链多肽和两个轻链多肽组成。在一些实施方案中，每个结合位点由重链可变结构域和轻链可变结构域组成，其中总共有6个cdr参与每个抗原结合位点的抗原结合。
核酸：如本文所用，从其最广的含义上讲，是指为寡核苷酸链或可以并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是为寡核苷酸链或可以通过磷酸二酯键并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单独的核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含rna；在一些实施方案中，“核酸”是或包含dna。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基，包含一个或多个天然核酸残基，或由一个或多个天然核酸残基组成。在一些实施方案中，核酸是一种或多种核酸类似物，包含一种或多种核酸类似物，或由一种或多种核酸类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物不同于核酸，因为核酸类似物不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个“肽核酸”组成，这些肽核酸在本领域中已知并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，被视为在本发明的范围内。替代地或另外地，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸酯和/或5'-n-亚磷酰胺键，而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个天然核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。在一些实施方案中，核酸是、包含或由一个或多个核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、c-5丙炔基-胞苷、c-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、c5-溴尿苷、c5-氟尿苷、c5-碘尿苷、c5-丙炔基-尿苷、c5-丙炔基-胞苷、c5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧腺苷、8-氧鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化的碱基，插入的碱基，以及它们的组合)组成。在一些实施方案中，核酸包含一种或多种与天然核酸中的那些糖相比被修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物(例如rna或蛋白质)的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸通过以下方式中的一种或多种来制备：从天然来源分离，通过基于互补模板的聚合酶促合成(体内或体外)，在重组细胞或系统中复制，以及化学合成。在一些实施方案中，核酸为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000个或更多个残基长。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个编码多肽或者是编码该多肽的序列的互补序列的元件的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。
可操作连接的：如本文所用，是指其中所描述的组分处于允许它们以它们的预期方式发挥功能的关系中的并置。与编码序列“可操作连接的”控制序列以这样的方式连接，使得在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。“可操作连接的”序列包括与所关注的基因连续的表达控制序列和以反式或相距一定距离起作用来控制所述所关注的基因的表达控制序列。如本文所用的术语“表达控制序列”是指实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的rna加工信号，诸如剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mrna的序列；增强翻译效率的序列(即，kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及当需要时，增加蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质取决于宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，这样的控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，通常这种控制序列包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括存在对于表达和加工必不可少的组分，并且还可以包括存在是有利的附加组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
肽：如本文所用，肽是指通常相对较短的多肽，例如具有小于约100个氨基酸、小于约50个氨基酸、小于20个氨基酸或小于10个氨基酸的长度。在一些实施方案中，肽的长度是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸。
生理条件：如本文所用，具有其在本领域理解的含义，是指细胞或生物体生活和/或繁殖的条件。在一些实施方案中，该术语是指在自然中对于生物体或细胞系统可能发生的外部或内部环境的条件。在一些实施方案中，生理条件是存在于人或非人动物体内的那些条件，尤其是存在于手术部位处和/或手术部位内的那些条件。生理条件通常包括例如20-40℃的温度范围、为1的大气压、6-8的ph、1-20mm的葡萄糖浓度、大气水平的氧浓度，以及在地球上遇到的重力。在一些实施方案中，实验室中的条件在生理条件下被操纵和/或维持。在一些实施方案中，生理条件在生物体中遇到。
多肽：如本文所用，是指任何氨基酸聚合链。在一些实施方案中，多肽具有在自然中存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有在自然中不存在的氨基酸序列。在一些实施方案中，多肽具有经过工程化的氨基酸序列，因为所述氨基酸序列是通过人手的动作来设计和/或产生的。在一些实施方案中，多肽可以包含或由天然氨基酸、非天然氨基酸或两者组成。在一些实施方案中，多肽可以包含或仅由天然氨基酸组成，或者包含或仅由非天然氨基酸组成。在一些实施方案中，多肽可以包含d-氨基酸、l-氨基酸，或两者。在一些实施方案中，多肽可以仅包含d-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以仅包含l-氨基酸。在一些实施方案中，多肽可以在多肽的n末端、在多肽的c末端，或其任何组合处包括一个或多个侧基或其他修饰，例如修饰或连接至一个或多个氨基酸侧链。在一些实施方案中，此类侧基或修饰可选自由乙酰化、酰胺化、脂化、甲基化、聚乙二醇化等组成的组(包括它们的组合)。在一些实施方案中，多肽可以是环状的，和/或可以包含环状部分。在一些实施方案中，多肽不是环状的和/或不包含任何环状部分。在一些实施方案中，多肽是直链的。在一些实施方案中，多肽可以是或包含订书肽。在一些实施方案中，可以将术语“多肽”附加至参考多肽的名称、活性或结构；在这种情况下，其在本文中用于指代共享相关活性或结构的多肽，因此可被认为是同一类别或多肽家族的成员。对于每个此种类别，本说明书提供和/或本领域技术人员将知晓氨基酸序列和/或功能已知的这种类别内的示例性多肽；在一些实施方案中，这种示例性多肽是该多肽类别的参考多肽。在一些实施方案中，一多肽类别或家族的成员显示出与该类别的参考多肽显著的序列同源性或同一性，与该类别的参考多肽共享共有序列基序(例如，特征序列元件)，和/或与该类别的参考多肽共享共同活性(在一些实施方案中以可比较的水平或在指定的范围内)；在一些实施方式中，是与该类别内的所有多肽如此)。例如，在一些实施方案中，成员多肽显示出与参考多肽的总体序列同源性或同一性程度为至少约30％至40％，并且通常大于约50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大和/或包括至少一个显示出非常高的序列同一性，通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区域(即，可以在一些实施方案中可以是或包含特征序列元件的保守区)。这种保守区通常包含至少三至四个且往往至多20个或更多的氨基酸；在一些实施方案中，保守区涵盖至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个连续氨基酸的至少一个区段。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含或由亲本多肽的片段组成。在一些实施方案中，有用的多肽可以包含或由多个片段组成，每个片段在相同的亲本多肽中相对于彼此以与所关注多肽中存在的不同的空间排列存在(例如，在亲本中直接连接的片段可以在所关注的多肽中空间上分离，或者反之亦然，和/或片段可以在所关注的多肽中以不同于亲本的顺序存在)，使得所关注的多肽是其亲本多肽的衍生物。
预防(prevent或prevention)：当在本文中与疾病、障碍和/或病症的发生一起使用时，是指降低发展疾病、障碍和/或病症的风险和/或延迟疾病、障碍或病症一种或多种特征或症状的发作。当疾病、障碍或病症的发作延迟预定的时间段时，可以认为预防完全。
重组的：如本文中所使用的，旨在指代通过重组手段设计、工程化、制备、表达、产生或分离的多肽(例如，本文所述的抗体或抗体组分，或多特异性结合剂)，诸如使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的多肽，分离从重组、组合的人多肽文库分离的多肽(hoogenboomh.r.,1997,tibtech.15:62-70[hoogenboomh.r.，1997，tib技术，15:62-70]；azzazyh.,andhighsmithw.e.,2002,clin.biochem.35:425-445[azzazyh.和highsmithw.e.，2002，临床生物化学，35:425-445]；gavilondoj.v.,andlarrickj.w.,2002,biotechniques29:128-145[gavilondoj.v.和larrickj.w.，2002，生物技术，29:128-145]；hoogenboomh.,andchamesp.,2000,immunol.today21:371-378[hoogenboomh.和chamesp.，2000，今日免疫学，21:371-378])，从对人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠)分离的抗体(参见例如taylor,l.d.,etal.,1992,nucl.acidsres.20:6287-6295[taylor,l.d.等人，1992，核酸研究，20:6287-6295]；kellermanns-a.,andgreenl.l.,2002,curr.opin.biotech.13:593-597[kellermanns-a.和greenl.l.，2002，生物技术当前述评，13:593-597]；little,m.etal.,2000,immunol.today21:364-370[little,m.等人，2000，今日免疫学，21:364-370]；murphy,a.j.etal.,2014,proc.natl.acad.sci.u.s.a.111(14):5153-5158[murphy,a.j.等人，2014，美国科学院院刊，111(14):5153-5158])或通过涉及将所选的序列元件剪接至彼此的任何其他手段制备、表达、产生或分离的多肽。在一些实施方案中，在自然中存在一个或多个这样的所选序列元件。在一些实施方案中，此类所选择的序列元件中的一个或多个以计算机模拟来设计。在一些实施方案中，一个或多个此类所选择的序列元件产生自(例如来自天然或合成来源的)已知序列元件的诱变(例如体内或体外)。例如，在一些实施方案中，重组抗体多肽由在所关注的来源生物体(例如人、小鼠等)的种系中存在的序列组成。在一些实施方案中，重组抗体具有由诱变(例如在体外或体内，例如在转基因动物中)产生的氨基酸序列，使得重组抗体的vh和vl区的氨基酸序列是虽然源自并与种系vh和vl序列相关，但可能在体内种系抗体库中不天然存在的序列。
回收：如本文所用，是指例如通过例如使用本领域中已知的纯化技术进行分离，使得药剂或实体基本上不含其他先前缔合的组分的过程。在一些实施方案中，从天然来源和/或包含细胞的来源回收药剂或实体。
参考：如本文所用，描述了如本文所述进行比较所针对的标准品、对照或其他合适的参考。例如，在一些实施方案中，参考是所关注的药剂、动物、个体、群体、样品、序列、一系列步骤、一组条件或值比较所针对的标准或对照药剂、动物、个体、群体、样品、序列、一系列步骤、一组条件或值。在一些实施方案中，参考被与所关注的测试或测定基本上同时地测试和/或测定。在一些实施方案中，参考是历史参考，任选地在有形介质中呈现。通常，如本领域的技术人员将理解的，参考在与所关注的评估中所利用的那些条件相当的条件下测定或表征。
风险：如从上下文中将理解的，疾病、障碍和/或病症的“风险”包括特定个体将发展疾病、障碍和/或病症(例如放射损伤)的可能性。在一些实施方案中，风险以百分比表示。在一些实施方案中，风险为0％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％以及至多100％。在一些实施方案中，风险表示为相对于与参考样品或参考样品组相关联的风险的风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组具有已知的疾病、障碍、病症和/或事件(例如放射损伤)风险。在一些实施方案中，参考样品或参考样品组来自与特定个体相当的个体。在一些实施方案中，相对风险是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大。
特异性结合：如本文所用，是指结合剂在结合将发生的环境中在可能的伴侣之间进行区分的能力。当存在其他潜在靶标时与一个特定靶标相互作用的结合剂被称为与其相互作用的靶标“特异性结合”。在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂与其伴侣之间的缔合程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂-伴侣复合物的解离程度来评估特异性结合；在一些实施方案中，通过检测或测定结合剂竞争在其伴侣与另一个实体之间的替代相互作用的能力来评估特异性结合。在一些实施方案中，通过在一定浓度范围内进行此类检测或测定来评估特异性结合。
受试者：如本文所用，意指任何哺乳动物，包括人。在本发明的某些实施方案中，受试者是成人、青少年或婴儿。在一些实施方案中，使用术语“个体”或“患者”，并且旨在与“受试者”互换。本发明还涵盖子宫内药物组合物的施用和/或治疗方法的执行。
基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出所关注的特征或性质的总体或接近总体范围或程度的定性条件。生物领域的普通技术人员将会理解，生物和化学现象很少(如果有的话)会达到完成和/或进行到完全或实现或避免绝对结果。因此，术语“基本上”用于捕捉许多生物和化学现象固有的潜在完全性缺乏。
基本序列同源性：如本文所用，短语“基本同源性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域的普通技术人员将理解的，如果两个序列在相应的位置含有同源残基，则它们通常被认为是“基本同源的”。同源残基可以是相同的残基。或者，同源残基可以是不相同的残基，具有适当相似的结构和/或功能特征。例如，如本领域普通技术人员所熟知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水性”或“亲水性”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性”侧链。一个氨基酸对另一个相同类型的氨基酸的取代通常可以被认为是“同源”取代。典型的氨基酸分类总结如下：
如本领域众所周知的，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，例如用于核苷酸序列的blastn和用于氨基酸序列的blastp、带缺口blast和psi-blast。示例性的此类程序描述于以下文献中：altschuletal.,1990,j.mol.biol.,215(3):403-410[altschul等人，1990，分子生物学杂志，215(3):403-410]；altschuletal.,1996,meth.enzymology266:460-480[altschul等人，1996，酶学方法，266:460-480]；altschuletal.,1997,nucleicacidsres.25:3389-3402[altschul等人，1997，核酸研究，25:3389-3402]；baxevanisetal,bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley,1998[baxevanis等人，生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南，威立出版社，1998]；以及misener,etal,(eds.),bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,vol.132),humanapress,1999[misener等人(编辑)，生物信息学方法和协议(分子生物学方法，第132卷)，胡马纳出版社，1999]。除了鉴定同源序列之外，上述程序通常提供对同源性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的相应残基中的至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更多与相关的一段残基是同源的，则该两个序列被视为基本上同源。在一些实施方案中，相关段是完整的序列。在一些实施方案中，相关段为至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少65个、至少70个、至少75个、至少80个、至少85个、至少90个、至少95个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个或更多个残基。
基本同一性：如本文所用，短语“基本同一性”是指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域的普通技术人员将理解的，如果两个序列在相应的位置含有相同残基，则它们通常被认为是“基本上同一的”。如本领域众所周知的，可以使用多种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，所述算法包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，例如用于核苷酸序列的blastn和用于氨基酸序列的blastp、带缺口blast和psi-blast。示例性的此类程序描述于以下文献中altschul,etal,1990,j.mol.biol,215(3):403-410,1990[altschul等人，1990，分子生物学杂志，215(3):403-410，1990]；altschuletal,1996,methodsinenzymology266:460-480[altschul等人，1996，酶学方法，266:460-480]；altschuletal,1997,nucleicacidsres.25:3389-3402[altschul等人，1997，核酸研究，25:3389-3402]；baxevanisetal,bioinformatics:apracticalguidetotheanalysisofgenesandproteins,wiley,1998[baxevanis等人，生物信息学：基因和蛋白质分析实用指南，威立出版社，1998]；以及misener,etal,(eds.),bioinformaticsmethodsandprotocols(methodsinmolecularbiology,vol.132),humanapress,1999[misener等人(编辑)，生物信息学方法和协议(分子生物学方法，第132卷)，胡马纳出版社，1999]。除了鉴定同一序列之外，上述程序通常提供对同一性程度的指示。在一些实施方案中，如果两个序列的相应残基中的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多与相关的一段残基是相同的，则该两个序列被视为基本上同一。在一些实施方案中，相关段是完整的序列。在一些实施方案中，相关段为至少10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个或更多个残基。在cdr的语境中，对“基本同一性”的提及通常是指具有与参考cdr的氨基酸序列至少80％、优选至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的cdr。
表面等离振子共振：如本文所用，是指允许实时分析特异性结合相互作用的光学现象，例如通过检测生物传感器基质内的蛋白质浓度的变化，例如通过使用biacore系统(pharmaciabiosensorab公司，瑞典乌普萨拉和新泽西州皮斯卡塔韦)。关于进一步的描述，请参见jonsson,u.etal.,1993,ann.biol.clin.51:19-26[jonsson,u.等人，1993，临床生物学纪事，51:19-26]；jonsson,u.etal.,1991,biotechniques11:620-627[jonsson,u.等人，1991，生物技术，11:620-627]；johnsson,b.etal.,1995,j.mol.recognit.8:125-131[johnsson,b.等人，1995，分子识别杂志，8:125-131]；以及johnnson,b.etal.,1991,anal.biochem.198:268-277[johnnson,b.等人，1991，分析生物化学，198:268-277]。
治疗有效量：如本文所用，是指施用以产生所需效果的量。在一些实施方案中，该术语是指当根据治疗投配方案施用于患有或易患疾病、障碍和/或病症的群体时，足以治疗该疾病、障碍和/或病症的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、障碍和/或病症的一种或多种症状的发生率和/或严重程度，和/或延迟其发作的量。本领域的普通技术人员将会理解，术语“治疗有效量”事实上不需要在特定个体中实现成功的治疗。相反，治疗有效量可以是在施用于需要这种治疗的患者时在相当多数目的受试者中提供特定的所需药理学应答的量。在一些实施方案中，提及治疗有效量可以是指在一种或多种特定组织(例如，受疾病、障碍或病症影响的组织)或流体(例如，血液、唾液、血清、汗水、眼泪、尿液等)中所测量到的量。本领域的普通技术人员将会理解，在一些实施方案中，治疗有效量的特定药剂或疗法可以以单剂量配制和/或施用。在一些实施方案中，可以以多个剂量配制和/或施用治疗有效的药剂，例如以作为投配方案的一部分。
转化：如本文所用，是指将外源dna引入宿主细胞的任何过程。可以使用本领域中熟知的各种方法在自然或人工条件下进行转化。转化可以依赖于任何已知的将外源核酸序列插入原核或真核宿主细胞的方法。在一些实施方案中，具体的转化方法基于被转化的宿主细胞来选择，并且可以包括但不限于病毒感染、电穿孔、交配、脂质转染。在一些实施方案中，“转化的”细胞被稳定转化，因为插入的dna能够作为自主复制质粒或作为宿主染色体的一部分复制。在一些实施方案中，转化的细胞在限定的时间段内瞬时表达引入的核酸。
载体：如本文所用，是指一种核酸分子，这种核酸分子能够转运其已经连接至的另一种核酸。一种类型的载体是“质粒”，其是指附加dna区段可以连接到其中的环状双链dna环。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加dna区段可以连接到该病毒基因组中。某些载体能够在它们被引入到的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和附加型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在引入到宿主细胞时整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们被操作性地连接到的基因的表达。这种载体在本文中被称为“表达载体”。
具体实施方式
本发明部分基于以下认识：可以使模拟与由mhc分子(例如i类分子)呈递的肽的tcr相互作用的高亲和力人抗体药剂(例如，人单克隆抗体)具有与mhc结合袋中的肽的末端部分(即，抗原性肽的n末端或c末端；例如位置1和位置8)的优先结合(在本文中称为i型抗体)。此外，具有与mhc结合袋中的肽的中间或中心部分(例如，位置5)的优先结合的抗体药剂(在本文中称为ii型抗体)通常表现出较低的亲和力，并且不容易亲和力成熟。本发明还基于这样的认识：肿瘤细胞系上天然加工的肽可以不同于计算机预测，并且这种天然加工的肽由ii型抗体识别，而不是由i型抗体识别。仅举一个示例，本公开证明，当人抗体药剂用于结合(1)由人mhci类分子(例如，hla-a02)呈递的ebv潜伏膜2肽和(2)非特异性免疫效应细胞(例如，t细胞)的多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)的情况中时，艾普斯登-巴尔病毒(ebv)感染的细胞系优先被ii型抗体杀伤，而不是被i型抗体杀伤。
本发明尤其展示了结合呈递于人mhc分子结合口袋中的艾普斯登-巴尔病毒(ebv)相关抗原的中心部分的ii型人单克隆抗体的成功产生和选择。本发明部分基于以下认识：在hla-a02(例如，hla-a*02:01)环境下，特异于ebv相关抗原的t细胞受体(tcr)优先与抗原肽的位置5相互作用。因此，本发明尤其提供了模拟与ebv相关抗原的tcr相互作用的人抗体药剂，因为本文所述的人抗体药剂结合在hla-a02结合口袋中呈递的ebv潜伏膜蛋白2(lmp2)肽的中心部分(例如，位置5)。本发明特别地提供了在人hla-a02(例如，hla-a*02:01)分子的环境中靶向来源于ebv-lmp2(clgglltmv；seqidno:1)的肽的人抗体药剂。lmp2在ebv感染的b细胞和鼻咽和胃上皮细胞中均有表达，因此这种人抗体药剂可用于治疗和诊断ebv相关疾病和恶性肿瘤。
此外，本发明还显示了结合在人mhc分子结合口袋中呈递的ebv-lmp2肽的多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)的成功产生。具体地，本发明特别地提供结合在hla-a02结合口袋中呈递的ebv-lmp2肽的中心部分(例如，位置5)的多特异性结合剂。这种多特异性结合剂的特征在于在包括ebv+b淋巴母细胞系(blcl)和肿瘤细胞系的细胞毒性测定中具有高特异性和效力。
不希望受任何特定理论束缚，我们注意到唯一已知的接触细胞质抗原的方法是通过在细胞表面上呈递的细胞质抗原的肽-hla复合物，该肽-hla复合物首先通过与tcr相互作用而被发现。已经报道了称为tcr模拟物的特异性抗体，但是很少(如果有的话)已经实现了它们的临床潜能。基于对已知的tcr-肽-hla结构的晶体结构和使用ebv-lmp2肽的实验数据的详细荟萃分析，本公开内容尤其显示(1)tcr始终表现出对hla口袋中肽的中心位置(位置4至7)，而不是末端位置的优先结合，(2)对肽-hla复合物的位置4至7(p4至p7)具有特异性的抗体药剂(即，ii型tcr模拟物)是高度特异性的，但通常与低亲和力相关，这与天然tcr类似，(3)优先结合hla口袋中肽的末端位置的抗体(即，i型tcr模拟物)与高亲和力相关，但当肽末端被天然氨基酸阻断时丧失亲和力，(4)针对九聚体肽制备的i型tcr模拟物不能识别转化细胞中天然呈递的肽-hla复合物，因为在这些细胞上呈递的肽可能不呈现具有自由末端的九聚体肽，而是呈现十聚体、十一聚体或十二聚体肽，以及(5)对肽-hla复合物中的肽的末端部分具有特异性的tcr模拟物显示出与包含hla-a02等位基因的无关肽-hla复合物交叉反应的更高可能性。此外，天然tcr和ii型tcr模拟物的低亲和力特征是与残基被锚定的末端位置相比，肽的中间(或中心)位置的熵自由的结果。这种低亲和力确保t细胞从靶标上解离以继续连续杀伤，并且通过在细胞表面上自由移动的tcr的多个拷贝的存在而抵消。因此，在至少一些实施方案中，本公开内容包括基于以下认识而开发ii型tcr模拟物用于癌症诊断和治疗：这种药剂更特异和类似于天然tcr，并且这种药剂的二价和四价形式应该增强亲和力和临床实用性，而不会遭受交叉反应。
艾普斯登-巴尔病毒感染和癌症
已经报道了艾普斯登-巴尔病毒(ebv)与恶性肿瘤的关联(例如，在coghill,a.e.anda.hildesheim,2014,am.j.epidemiol.180:687-95[coghill,a.e.和a.hildesheim，2014，美国流行病学杂志，180:687-95]中所综述)。ebv是首先被鉴定为致癌的病毒之一。ebv通过其与cd21和mhcii类的相互作用而极其有效地感染b细胞。(hislop,a.d.,g.s.taylor,andd.sauceetal.,2007,ann.rev.immunol.25:587-617[hislop,a.d.、g.s.taylor和d.sauce等人，2007，免疫学年评，25:587-617])。然而，ebv也可以感染并保留在上皮细胞中，这个过程效率较低并且不太了解。
世界上几乎所有的成年人都已经暴露于ebv。在没有免疫损害的情况下，儿童时期的初始暴露导致由细胞免疫应答控制的自限性疾病(hislop,a.d.,g.s.taylor,andd.sauceetal.,2007,ann.rev.immunol.25:587-617[hislop,a.d.、g.s.taylor和d.sauce等人，2007，免疫学年评，25:587-617])。针对艾普斯登-巴尔病毒(ebv)和ebv相关疾病的免疫防御的存在是众所周知的(hislop,a.d.etal.,2007,ann.rev.immunol.25:587-617[hislop,a.d.等人，2007，免疫学年评，25:587-617]；long,h.m.etal.,2011,j.immunol.187:92-101[long,h.m.等人，2011，免疫学期刊，187:92-101])。宿主的抗病毒蛋白的抗原特异性t细胞的产生对抗病毒非常有效的。然而，ebv可以持续存在于上皮细胞或b细胞中，而不被完全消除(long,h.m.etal.,2011,j.immunol.187:92-101[long,h.m.等人，2011，免疫学期刊，187:92-101])。宿主免疫状态的任何改变都可能会导致重新激活，并且根据免疫损害的程度，这种重新激活可能导致恶性肿瘤。
病毒复制可以通过两种机制发生：裂解性复制或通过潜伏期复制。前者需要直链病毒基因组，产生活性病毒颗粒并破坏宿主细胞。另一方面，当病毒基因组产生由宿主的细胞dna聚合酶复制的附加体时，发生通过潜伏期进行的复制。这种复制保持细胞的复制以及ebv感染的复制。通过潜伏期进行的复制可以产生三种不同的潜伏期程序，每种潜伏期程序表达的ebv基因库不同。
ebv已经在实体器官和造血细胞移植(hsct)的环境中被最好的研究，其中t细胞的数量减少或者不存在可能会导致携带ebv的b细胞的无限制增殖(rasche,l.etal.,2014,bonemarrowtransplant49:163-7[rasche,l.等人，2014，骨髓移植，49:163-7])。这种不受控制的扩增可导致移植后淋巴增殖性疾病(ptld)，ptld是最常见的移植后恶性肿瘤。这种综合征的频率和强度在每个患者中不同，并且它们的免疫抑制对它们的t细胞群体的影响也不同(bollard,c.m.etal.,2012,nat.rev.clin.oncol.9:510-9[bollard,c.m.等人，2012，自然综述：临床肿瘤学，9:510-9])。
然而，ebv也参与其他恶性肿瘤。若干系列的研究已经暗示ebv在各种上皮和淋巴恶性肿瘤的发病机制中。例如，众所周知的是，霍奇金(glaser,s.l.etal.,1997,int.j.cancer70:375-82[glaser,s.l.等人，1997，国际癌症期刊，70:375-82])和非霍奇金淋巴瘤与ebv有关，但ebv在这些疾病的发展中的作用不完全了解。同样，尽管ebv与鼻咽癌之间存在明确的因果关系(npc；shanmugaratnam,k.,1978,iarcsci.publ:3-12[shanmugaratnam,k.，1978，国际肿瘤研究机构科学出版物:3-12])，但是ebv在这种肿瘤发病机理中的作用还不完全清楚。患有霍奇金淋巴瘤和npc的患者的肿瘤样品表达ebv衍生的蛋白，包括潜伏膜蛋白2(lmp2)。40％的ebv相关胃癌中也已经发现了lmp-2。因为这些蛋白是非自体的并且也是抗ebv的细胞免疫应答的主要靶标，所以这些蛋白代表了免疫治疗方法的理想靶标。
与ebv相关的lmp2(+)人恶性肿瘤的列表包括伯基特淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌，以及免疫缺陷相关平滑肌肉瘤(ok,cyetal.,2015,exp.mol.med.47:e132[ok,cy等人，2015，实验与分子医学，47:e132]；grywalska,e.andj.rolinski,2015,semin.oncol.42:291-303[grywalska,e.和j.rolinski，2015，肿瘤学论文集，42:291-303]；petersson,f,2015,semin.diagn.pathol.32:54-73[petersson,f，2015，诊断病理学论文集，32:54-73]；tsao,s.w.etal.,2015,j.pathol.235(2):323-33[tsao,s.w.等人，2015，病理学杂志，235(2):323-33])。
ebv潜伏蛋白的表达
静息b细胞的ebv感染/转化产生潜伏的淋巴母细胞瘤细胞系(lcl)。这种过程已经通过使用存在于狨猴b淋巴母细胞系b95-8中的ebv的b95-8菌株而在体外准确复制(menezes,j.etal.,1975,biomedicine22:276-84[menezes,j.等人，1975，生物医学，22:276-84])。在实验室中产生blcl对理解和表征ebv感染以及对ebv感染的免疫应答是非常有价值的。相比之下，上皮细胞的体外感染是无效的，并且目前还没有模型来理解这种相互作用。
lcl以潜在复制形式存在，并携带病毒基因组的多个拷贝作为附加体。它们表达了许多病毒基因产物，这些病毒基因产物被命名为根据潜伏期不同而变化的潜伏蛋白。
已经描述了总共十种潜伏蛋白：六种艾普斯登病毒核抗原(ebna1、2、3a、3b、3c和lp)、三种潜在膜蛋白(lmp1、2a和2b)和barf1。当表达ebna1、ebna2、ebna3、lmp1、lmp2和barf1时，初始ebv感染激活b细胞并诱导潜伏期iii(bollardetal.,nat.rev.clin.oncol.9:510,2012[bollard等人，自然综述：临床肿瘤学，9:510,2012])。这之后是病毒产物的更有限表达以及被感染的b细胞转化成记忆b细胞，被称为潜伏期ii，其中ebna1、lmp1和lmp2被表达。这些抗原表达的进一步限制导致潜伏期i，其中仅表达ebna-1、lmp2和barf1。
b细胞可以具有i到iii的潜伏期程序。然而，上皮细胞仅呈现潜伏期i和ii。lmp-2a在潜伏期i、ii和iii中表达(bollard,c.m.etal.,2012,nat.rev.clin.oncol.9(9):510-9[bollard,c.m.等人，2012，自然综述：临床肿瘤学，9(9):510-9])，因此是多种实体和非实体恶性肿瘤的有吸引力的靶标。
针对ebv和过继性t细胞治疗的免疫应答
身体中几乎所有的有核细胞都表达人白细胞抗原-i类(hlai类)分子。这些分子具有呈递衍生自由细胞表达的任何蛋白质的肽的能力，无论该蛋白质是存在于细胞表面上还是存在于细胞质内。本发明基于这样的认识：针对这些肽-hla复合物的免疫应答形成了能够区分自体与非自体的成功的细胞免疫的基础。仅举一个示例，霍奇金淋巴瘤(hl)和鼻咽癌(npc)细胞组成性地表达ebv衍生的蛋白质，并且从在hla分子的环境中呈递的这些蛋白质衍生的免疫原性肽为在针对这些ebv相关的恶性肿瘤的治疗策略中利用细胞免疫提供了独特的机会。
t细胞通过它们的克隆t细胞受体(tcr；haigh,t.a.etal.,2008,j.immunol.180:1643-54.[haigh,t.a.等人，2008，免疫学期刊，180:1643-54])识别这些肽-hla复合物。事实上，对在异源骨髓或干细胞移植(hsct)或实体器官移植的受体中的ebv复发的高效治疗是过继性t细胞治疗。更重要的是，移植后淋巴组织增生性疾病(ptld)，尤其是具有t耗尽接枝的ptld，是ebv感染的b细胞的t细胞控制缺失的结果，并且现在在70％的情况下可以通过供体t细胞输注或ebv特异性异源t细胞输注来成功地治疗(bollard,c.m.etal.,2012,nat.rev.clin.oncol.9:510-9[bollard,c.m.等人，2012，自然综述：临床肿瘤学，9:510-9])。
针对艾普斯登-巴尔病毒(ebv)和ebv相关疾病的免疫防御是众所周知的(hislop,a.d.etal.,2007,ann.rev.immunol.25:587-617[hislop,a.d.等人，2007，免疫学年评，25:587-617]；long,h.m.etal.,2011,curr.opin.immunol.23:258-64,2011[long,h.m.等人，2011，免疫学年评，23:258-64，2011]。ebv载剂产生ebv特异性cd4+和cd8+多功能t细胞应答，这显示了ebv蛋白的免疫显性分级：(对于cd4+t细胞，ebna1>ebna3/lmp2，并且对于cd8+t细胞，ebna3>lmp2>ebna1；ning,r.j.etal.,2011,immunology134:161-71.[ning,r.j.等人，2011，免疫学，134:161-71])。ebv潜伏膜蛋白(lmp)1和2连同ebna1是在ebv相关的霍奇金淋巴瘤(hl)和鼻咽癌(npc)中表达的三种病毒蛋白。由于这些肿瘤是hlai类和ii类阳性的，所以lmp和ebna1可以充当cd8和cd4t细胞靶标两者(haigh,t.a.etal.,2008,j.immunol.180:1643-54[haigh,t.a.等人，2008，免疫学期刊，180:1643-54])。尽管有特异于衍生自这些潜在基因产物的表位的ctl的亚优势频率(0.05％–1％)，它们参与对体内ebv感染的控制(hislop,a.d.etal.,2007,ann.rev.immunol.25:587-617[hislop,a.d.等人，2007，免疫学年评，25:587-617])。靶向这三种抗原的dna疫苗已经在npc患者中进行了测试(lutzky,v.p.etal.,2010,j.virol.84:407-17[lutzky,v.p.等人，2010，病毒学杂志，84:407-17])。a11的lmp2ssc肽(sscsscplsk；seqidno:121)在大多数npc患者中引起应答。b55(亚洲群体中的高频等位基因)的肽apyl(apylfwlaa；seqidno:122)也是所关注的。对npc的过继t细胞治疗也已经被证实是安全的并且具有临床潜力(louis,c.u.etal.,2010,j.immunother.33:983-90[louis,c.u.等人，2010，免疫疗法杂志，33:983-90])。lmp2和ebna3特异性t细胞比ebna1或lmp1特异性t细胞更常见。hla-a02的lmp-2肽clgglltmv(340-349；seqidno:1)和hla-a11的sscsscplsk(426-434；seqidno:121)是高度相关的t细胞表位(tce)。
为了改善特异于ebv衍生蛋白的t细胞的产生和活化，靶向lmp2的疫苗已经在npc患者中进行了测试。lutzky等人(2010，同上)使用包含ebna1、lmp1和lmp2的序列的乱序肽以及腺病毒，从而在正常供体和npc患者中产生lmp2特异性应答(lutzky,v.p.etal.,2010,j.virol.84:407-17[lutzky,v.p.等人，2010，病毒学杂志，84:407-17])。cheung等人证实了当在具有金纳米颗粒的构建体中使用lmp2衍生的肽(sscsscplsk；seqidno:121)时针对ebv转化细胞的应答(cheung,w.h.etal.,2009,bioconjug.chem.20:24-31[cheung,w.h.等人，2009，生物共轭化学，20:24-31])。同样，含有来自ebna1、lmp1和lmp2的序列的apyl肽(seqidno:122)的使用也已经显示出一些应答。此外，对npc的过继性t细胞治疗已被证明是安全的并且具有临床活性的迹象(louis,c.u.etal.,2010,j.immunother.33:983-90[louis,c.u.等人，2010，免疫疗法杂志，33:983-90])。已经报道特异于hla-a*02:01的lmp-2肽clgglltmv(340-349；seqidno:1)对于具有ii期潜伏期的ebv相关的实体和非实体恶性肿瘤有效。实际上，这种肽是lmp2a全长序列中对hla-a*02:01供体最具免疫原性的。
尽管有这些临床前和临床上的成功，但是关于ebv相关恶性肿瘤中ebv潜伏期表位的表达还存在不确定性。尽管质谱可以在群体水平上评估这些表位的存在或不存在(weidanz,j.a.etal.,2011,int.rev.immunol.30:328-40[weidanz,j.a.等人，2011，国际免疫学评论，30:328-40])，但肿瘤内和肿瘤之间的细胞间异质性难以评估。特异于肽-hla复合物的抗体(称为tcr模拟物)的发现为重新检查这些问题提供了新的机会(sim,a.c.etal.,2013,sci.rep.3:3232[sim,a.c.等人，2013，科学报告，3:3232])。最近描述了靶向与hla-a*02:01缔合的潜在表位lmp1(125-133)、lmp2a(340-349)或ebna1(562-570)的三种tcr样鼠类单克隆抗体，以映射内源性产生的ebv表位的表达分级。在细胞系和ebv相关的肿瘤活检中一致地观察到了ebna(1562-570)与hla-a*02:01缔合的优势。
t细胞受体样单克隆抗体
大多数细胞质蛋白缺乏表面表达使得它们几乎不可能被常规抗体靶向。然而，从这些蛋白质衍生的抗原肽呈递在mhci类分子内的细胞表面，并且可以用类似于或复制tcr结合的抗体靶向(dahan,r.andy.reiter,2012,expertrev.mol.med.14:e6[dahan,r.和y.reiter，2012，分子医学专家评论，14:e6]；denkberg,g.etal.,2002,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99:9421-6[denkberg,g.等人，2002，美国科学院院刊，99:9421-6]；sergeeva,a.etal.,2011,blood117:4262-72[sergeeva,a.等人，2011，血液，117:4262-72]；tassev,d.v.etal.,2012,cancergenether.19:84-100[tassev,d.v.等人，2012，癌症基因疗法，19:84-100]；dao,t.etal.,2013,sci.transl.med.5:176ra33[dao,t.等人，2013，科学转化医学杂志，5:176ra33])。这些肽-hla复合物含有短肽序列，该短肽序列长度可变，但是通常是关于i类等位基因的9个氨基酸(townsend,a.andh.bodmer,1989,ann.rev.immunol.7:601-24[townsend,a.和h.bodmer，1989，免疫学年评，7:601-24]；rudolph,m.g.etal.,2005,ann.rev.immunol.24:419-466[rudolph,m.g.等人，2005，免疫学年评，24:419-466])。在这些九聚体内，通常有两个锚定残基位于hla-a*02:01等位基因的位置2和9(p2和p9)(parker,k.c.etal.,1992,j.immunol.149:3580-7[parker,k.c.等人，1992，免疫学期刊，149:3580-7])。若干种tcr-肽-hla复合物的共结晶结构已经允许更好地理解复合物的这三个成员(肽、hla、tcr)在免疫突触处的相互作用。
例如，cd8+t细胞中的tcr以35度的平均角度斜向地结合肽-hla复合物，其中复合物的这三个成员携带若干个相互作用位点。然而，t细胞活化本身仅取决于对于建立成功的免疫应答不可或缺的少数接触氨基酸。这些主要和次要接触位点由位于抗原肽中间部分的具有两个至五个氨基酸残基的侧链确定(rudolph,mgandwilsonia,curr.opin.immunol.14(1):52-65,2002[rudolph,mg和wilsonia，当代免疫学新见，14(1):52-65，2002])，为所谓的功能性热点(massimo,d.etal.,2000,immunity12:251-261[massimo,d.等人，2000，免疫，12:251-261])。在九聚体肽的情况下，i类等位基因中呈递的最常见肽长度，对于tcr相互作用最重要的残基位于抗原肽的位置5(p5)，其中p6、p7和p8起次要作用(rudolph,m.g.etal.,2005,ann.rev.immunol.24:419-466[rudolph,m.g.等人，2005，免疫学年评，24:419-466]；rudolph,mgandwilsonia,curr.opin.immunol.14(1):52-65,2002[rudolph,mg和wilsonia，当代免疫学新见，14(1):52-65，2002]；massimo,d.etal.,2000,immunity12:251-261[massimo,d.等人，2000，免疫，12:251-261])。在八聚体肽中，最相关的残基是p4、p6和p7(rudolph,m.g.etal.,2005,ann.rev.immunol.24:419-466[rudolph,m.g.等人，2005，免疫学年评，24:419-466]；rudolph,mgandwilsonia,curr.opin.immunol.14(1):52-65,2002[[rudolph,mg和wilsonia，当代免疫学新见，14(1):52-65，2002]；massimo,d.etal.,2000,immunity12:251-261[massimo,d.等人，2000，免疫，12:251-261]])。除了结构性证据之外，这些区域在抗原肽内的功能重要性已经得到了一致地证实。例如，ebv特异性记忆t细胞活化可以在少至一个氨基酸的情况下发生，只要此残基是主要接触位点之一即可(reali,e.etal.,1999,j.immunol.162:106-113[reali,e.等人，1999，免疫学期刊，162:106-113])。
靶向肽-mhc复合物的抗体被宽松地称为“tcr模拟物”，因为它们结合肽-mhc复合物并被认为复制tcr结合。尽管最初难以产生，但可溶性肽-mhc单体和噬菌体展示技术的可用性已经极大地促进了它们的产生(dahan,r.andy.reitery,2011,expertrev.mol.med.14[dahan,r.和y.reitery，2011，分子医学专家评论，14])。可溶性tcr已成功产生并亲和力成熟(liddy,n.etal.,2012,nat.med.18:980-987[liddy,n.等人，2012，自然-医学，18:980-987])。然而，由于以下原因，tcr模拟抗体试剂相较于这些抗体药剂具有明显的优势：(1)比tcr文库更大的文库来供筛选，(2)可以使用天然和人工文库两者，后者对于在免疫系统成熟过程中发现缺失的克隆是理想的，(3)通过选择针对肽中的各个氨基酸位置的抗体来对表位偏好进行微调，(4)使用标准噬菌体或酵母展示技术进行亲和力成熟，(5)通过使用fab、scfv或igg或者甚至多聚体形式来控制化合价，以及(6)易于针对基于抗体的平台对照基于tcr的平台来进行制造和基因工程化。通过工程化，诊断和治疗候选药物都可以来源于此类tcr模拟物，包括但不限于抗体-药物缀合物、放射性缀合物、毒素缀合物和双特异性抗体，以人工产生t细胞应答。
由于andersen等人首先产生了具有tcr特异性的单克隆抗体(andersen,p.s.etal.,1996,proc.natl.acad.sci.u.s.a.93:1820-4[andersen,p.s.等人，1996，美国科学院院刊，93:1820-4])，已经有针对人肽-hlai类复合物产生的超过60种tcr模拟单克隆抗体。这种单克隆抗体已被成功用于表征抗原呈递和在临床前模型中作为治疗剂。然而，缺乏关于这些试剂对抗原肽的特定部分的特异性的信息，并且这些药剂均不是被产生为特异性靶向主要和次要接触残基(townsend,a.andh.bodmer,1989,ann.rev.immunol.7:601-24[townsend,a.和h.bodmer，1989，免疫学年评，7:601-24]；willemsen,raetal.,2001,genether.8(21):1601-8,2001[willemsen,ra等人，2001，基因疗法，8(21):1601-8，2001]；low,jletal.,2012,plosone7(12):e51397[low,jl等人，2012，plosone，7(12):e51397]；miller,kretal.,2012,plosone7(8):e43746[miller,kr等人，2012，plosone，7(8):e43746]；biddison,weetal.,2003,j.immunol.171(6):3064-74[biddison,we等人，2003，免疫学期刊，171(6):3064-74]；cohen,cjetal.,2002,cancerres.62(20):5835-44[cohen,cj等人，2002，癌症研究，62(20):5835-44]；cohen,cjetal.2003,j.immunol.170(8):4349-61[cohen,cj等人，2003，免疫学期刊，170(8):4349-61]；dao,tetal.,2013,sci.transl.med.5(176):176ra33[dao,t等人，2013，科学转化医学杂志，5(176):176ra33]；denkberg,getal.,2002,proc.natl.acad.sci.u.s.a.99(14):9421-6[denkberg,g等人，2002，美国科学院院刊，99(14):9421-6]；epel,metal.,2008,eur.j.immunol.38:1706-20[epel,m等人，2008，欧洲免疫学期刊，38:1706-20]；zhang,getal.,2014,scientificreports4:3571[zhang,g等人，2014，科学报告，4:3571]；klechevsky,eetal.,2008,cancerres.68(15):6360-7[klechevsky,e等人，2008，癌症研究，68(15):6360-7]；oren,retal.,2014,j.immunol.193(11):5733-43[oren,r等人，2014，免疫学期刊，193(11):5733-43]；sergeeva,aetal.,2011,blood117(16):4262-72[sergeeva,a等人，2011，血液，117(16):4262-72]；stewart-jones,getal.,2009,proc.natl.acad.sci.u.s.a.106(14):5784-8[stewart-jones,g等人，2009，美国科学院院刊，106(14):5784-8]；verma,betal.,2011,j.immunol.186(5):3265-76[verma,b等人，2011，免疫学期刊，186(5):3265-76]；weidanz,jaetal.,2006,j.immunol.177(8):5088-97[weidanz,ja等人，2006，免疫学期刊，177(8):5088-97]；ziegler,aetal.,2007,recentresultscancerres.176:229-41[ziegler,a等人，2007，癌症研究的近期结果，176:229-41])。因此，即使这样的单克隆抗体结合肽-hla复合物，它们也不一定复制tcr与肽-hla的结合。
不靶向对于抗原识别最重要的残基具有深远的影响，这在开发tcr模拟物作为治疗剂时特别重要。通过不靶向功能性热点，这种试剂倾向于非特异性相互作用或表位散布，特别是当引入多价接合(例如作为嵌合抗原受体)时(oren,r.etal.,2014,j.immunol.193:5733-43[oren,r.等人，2014，免疫学期刊，193:5733-43])。此外，tcr单克隆抗体模拟物的产生通常采用计算机模拟产生的肽序列，这可能与体内呈递的抗原肽不同(scott,r.b.etal.,2006,trendsimmunol.27:11-16[scott,r.b.等人，2006，免疫学趋势，27:11-16])，从而产生可能会损害相关性的选择偏差。
真正的第二代t细胞受体单克隆抗体模拟物的产生
为了产生真正的tcr样单克隆抗体，本发明人首先确定了tcr如何天然地结合肽-hla复合物。本发明人从蛋白质数据库中鉴定出了14种独特的tcr:九聚体肽/hlai类共晶体结构(表1；stewart-jones,g.b.etal.,2003；nat.immunol.4:657-63[stewart-jones,g.b.等人，2003，自然-免疫学，4:657-63]；garboczi,d.n.etal.,1996,nature384:134-41[garboczi,d.n.等人，1996，自然，384:134-41]；ding,y.h.etal.,1998,immunity8:403-11[ding,y.h.等人，1998，免疫，8:403-11]；chen,j.l.etal.,2005,j.exp.med.201:1243-55[chen,j.l.等人，2005，实验医学杂志，201:1243-55]；borbulevych,o.y.etal.,2009,immunity31:885-96[borbulevych,o.y.等人，2009，免疫，31:885-96]；borbulevych,o.y.etal.,2011,j.immunol.186:2950-8[borbulevych,o.y.等人，2011，免疫学期刊，186:2950-8]；gras,s.etal.2009,j.immunol.183:430-7[gras,s.等人，2009，免疫学期刊，183:430-7])。只考虑了天然人tcr:hla相互作用，而排除非人tcr、非天然肽变体和人工亲和力增强的tcr。本发明人还从蛋白质数据库鉴定出了5种独特的tcr:十聚体-肽/hlai类共晶体结构(表2)。由于十聚体数据集的较小尺寸，本发明人收录了具有不规则(heteroclitic)肽的两种结构。所有这些结构证明tcr共享共同的结合几何结构，其中tcr与hla结合口袋(或裂隙)中的肽对角地结合。然后，本发明人通过使用charmm力场模拟计算具有结合的tcr的肽的每残基相互作用能量，来对这种相互作用进行更详细的分子分析。
使用discoverystudio4.1(accelrys公司，美国加利福尼亚州圣地亚哥市)完成分子建模和相互作用能量计算。使用charmm(chemistryatharvardmolecularmechanics(哈佛分子力学化学))力场模拟将tcr-肽-hla复合物的晶体结构能量最小化，然后将原子相互作用能计算为范德瓦尔斯力和静电能的总和。
表1
表2
为了理解在tcr-肽-hla界面处的短期分子接触，分析九聚体肽和十聚体肽的每个残基的范德瓦尔斯相互作用能。每残基的范德瓦尔斯相互作用能在图1中针对tcr:九聚体肽/hla结构阐述并且在图2中针对tcr:十聚体肽/hla结构阐述(越负的值表示越有利的相互作用)。九聚体结构的范德瓦尔斯相互作用能显示出涉及残基p4至p7的相互作用的占优势簇(dominantcluster)，其中与残基p5发生最高的相互作用。如本发明人预期的那样，与tcr的最少相互作用在肽锚定残基p2和p9处发生。对于十聚体结构，观察到类似的模式，其中与tcr的最大的相互作用簇存在于残基p4至p7处，其中最高的相互作用在p5处。在其中最后一个锚定残基位于p10而不是p9的十聚体的情况下，与九聚体结构相比，由于存在额外的残基，p5和p6位置处存在高相互作用能的更宽分布。基于对大量天然人tcr-肽-hla复合物的这种独特结构分析，本发明人产生了模拟tcr的精确肽-mhc结合模式的人抗体药剂(例如，人单克隆抗体)。
本发明的人抗体药剂是基于这样的认识，当与通过b细胞受体和抗体进行的抗原识别相比时，通过tcr进行的抗原识别是不同的。具体地，b细胞受体和抗体识别抗原的表面，通常接触以折叠的蛋白质结构结合在一起的不连续氨基酸。通常，往往基于对特定抗原的亲和力来选择抗体，其中具有最高亲和力的结合剂被选择作为“最佳”疗法。相反，tcr识别经常被掩埋在折叠蛋白质结构内的短连续氨基酸(肽)，否则如果未通过mhc分子将这种肽呈递在细胞表面上，则这种肽将不可识别。tcr以相对较低的亲和力结合在mhc结合口袋中呈递的肽(通常在微摩尔范围内；例如参见donermeyer,dletal.,2006,j.immunol.177(10):6911-9[donermeyer,dl等人，2006，免疫学期刊，177(10):6911-9])。此外，多种tcr中的大部分存在于cdr3中，cdr3直接与肽相互作用，而其他cdr(例如，cdr1、cdr2)较少变化并与mhc氨基酸直接相互作用。这种低亲和力尤其对于从肽-mhc复合物脱离以重新连续杀伤呈递这种肽的细胞以及其他t细胞功能是重要的。因此，本发明的人抗体药剂涵盖以下认识：在产生特异于由mhc分子呈递的肽的抗体药剂时过度依赖于亲和力和计算机模拟预测作为中心标准代表有缺陷和误导的方法。这种方法已经导致产生了具有高亲和力但主要与由mhc分子呈递的肽的末端部分相互作用，并且遭受与不相关的肽-mhc复合物的交叉反应性的若干种抗体。
此外，本发明特别提供了开发识别由mhc分子呈递的肽的人抗体药剂的改进方法。具体地，本发明提供了使用聚焦于与由mhc分子体内呈递的肽的中心位置处的氨基酸的相互作用的方法学产生的人抗体药剂，并进一步提供了以对表达肽-mhc复合物的细胞的高特异性和细胞毒性效力为特征的人抗体药剂。因此，在至少一些实施方案中，本公开包括开发使用体内抗体药剂-肽相互作用的位置作为中心标准来开发人抗体药剂，以实现天然tcr样相互作用，而没有不希望的交叉反应性的改进方法。
如本文所述，本发明人采用噬菌体展示技术来在hla-a*02:01等位基因的环境中产生特异于lmp2衍生的抗原肽(clgglltmv，340-349；seqidno:1)的高亲和力人抗体药剂(例如，人单克隆抗体)。本发明提供了允许推广到其他hla等位基因和抗原的独特优点：(1)结构性证据表明，ebv-lmp2-hla-a*02:01复合物对抗原肽内的重要中心定位区域具有原型行为(simpson,aaetal.,2011,proc.natl.acad.sci.u.s.a.108(52):21176-81[simpson,aa等人，2011，美国科学院院刊，108(52):21176-81])，并且(2)已经完全基因分型为hla并且在体外转化为ebv阳性的若干种细胞系的可用性。本文描述的人单克隆抗体不仅已经因为其对肽-hla复合物的亲和力和特异性而被选择，而且还已经因为其对这种复合物中存在的肽中的特定氨基酸残基进行结合的能力而被表征。本公开中呈现的数据表明，靶向不同氨基酸位置对于tcr模拟物的特异性和亲和力具有重大影响，这证实了它们不仅用于诊断和治疗ebv相关的恶性肿瘤，而且还提供了对这种方法可以如何应用于其他肽-hlai类复合物的重要洞察。
抗ebv-lmp2/hlai类抗体药剂
本发明提供了基于抗ebv-lmp2/hla-a02抗体药剂(例如，单克隆抗体)的施用以及在一些实施方案中具有结合ebv-lmp2/hla-a02复合物的第一抗原结合位点和结合免疫效应细胞(例如，t细胞)的第二抗原结合位点的多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)的施用，来治疗ebv相关疾病、障碍和病症以及相关恶性肿瘤的方法和组合物。
结合ebv-lmp2/hla-a02复合物的示例性人抗体药剂(例如，人单克隆抗体)列于表3中(lcvr：轻链可变区；hcvr：重链可变区；scfv：单链可变片段)。
表3
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有表3中出现的重链可变区中存在的cdr中的至少一个cdr，并且轻链可变区含有表3中出现的轻链可变区中存在的cdr中的至少一个cdr。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有表3中出现的重链可变区中存在的cdr中的至少两个cdr，并且轻链可变区含有表3中出现的轻链可变区中存在的cdr中的至少两个cdr。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有表3中出现的重链可变区中存在的cdr中的三个cdr，并且轻链可变区含有表3中出现的轻链可变区中存在的cdr中的三个cdr。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有三个cdr，所述cdr各自具有与表5中出现的重链cdr至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有三个cdr，所述cdr各自具有与表5中出现的重链cdr基本上同一或同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中轻链可变区含有三个cdr，所述cdr各自具有与表6中出现的轻链cdr至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中轻链可变区含有三个cdr，所述cdr各自具有与表6中出现的轻链cdr基本上同一或同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区含有表5中出现的三个cdr，并且轻链可变区含有表6中出现的三个cdr。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区具有与表3中出现的重链可变区至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中重链可变区具有与表3中出现的重链可变区基本上同一或同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中轻链可变区具有与表3中出现的轻链可变区至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链和轻链可变区组成，其中轻链可变区具有与表3中出现的轻链可变区基本上同一或同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区具有与表3中出现的重链可变区至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列，并且所述轻链可变区具有与表3中出现的轻链可变区至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由重链可变区和轻链可变区组成，所述重链可变区具有与表3中出现的重链可变区基本上同一或同一的序列，并且所述轻链可变区具有与表3中出现的轻链可变区基本上同一或同一的序列。
在各种实施方案中，根据本发明的人抗ebv-lmp2/hla-a02单克隆抗体由选自表3中出现的重链和轻链可变区的重链和轻链可变区组成。
本文描述的ebv-lmp2肽或其片段可以用于通过本领域的技术人员已知的方法产生抗体。如本文所用，抗ebv-lmp2/hla-a02抗体包括在hla-a02的环境中特异性结合ebv-lmp2肽clgglltmv(seqidno:1)的任何残基的任何抗体或抗体片段。
如本文所用，“抗ebv-lmp2/hla-a02抗体”、“抗ebv-lmp2/hla-a02抗体部分”或“抗ebv-lmp2/hla-a02抗体片段”和/或“抗ebv-lmp2/hla-a02抗体变体”等包含含有包含免疫球蛋白分子的至少一部分的分子，含有衍生自本文所述的任何单克隆抗体的重链或轻链的至少一个互补性决定区(cdr)或其配体结合部分，以及可以掺入本发明的抗体中的非鼠来源(优选人来源)的重链或轻链可变区、重链或轻链恒定区、框架区或其任何部分的任何含蛋白质或肽。或者，术语“抗ebv-lmp2/hla-a02抗体”应共同或分别指代lmp2-21、lmp2-21igg1、lmp2-26、lmp2-26igg1、lmp2-38、lmp2-38igg1、lmp2-40、lmp2-40igg1、lmp2-61、lmp2-61igg1、lmp2-63、lmp2-63igg1、lmp2-77、lmp2-77igg1以及它们的组合，以及它们的片段和区域，诸如本发明的单链可变片段，包括lmp2-21scfv、lmp2-26scfv、lmp2-38scfv、lmp2-40scfv、lmp2-61scfv、lmp2-63scfv、lmp2-77scfv以及它们的组合。这种人单克隆抗体能够在体外、原位和/或体内调节、减少、拮抗、缓解、减轻、阻断、抑制、消除和/或干扰至少一种细胞功能，其中所述细胞表达ebv-lmp2/hla-a02复合物。作为非限制性示例，本发明的合适的抗ebv-lmp2/hla-a02抗体、指定部分或变体可以高亲和力结合由人hlai类分子呈递的ebv-lmp2肽的表位，特别是肽表位。
可以使用本领域已知的方法产生抗ebv-lmp2/hla-a02抗体。例如，抗体生产方案由harlowandlane,antibodies:alaboratorymanual,(1988)[harlow和lane，抗体：实验室手册，(1988)]描述。通常，抗体可以在小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、骆驼、美洲驼、鲨鱼或其他合适的宿主中产生。或者，可以在鸡中制备抗体，从而产生igy分子(schadeetal.,1996,altex13(5):80-85[schade等人，1996，动物实验的替代试验，13(5):80-85])。在一些实施方案中，适用于本发明的抗体是类人的灵长类动物抗体。例如，用于在狒狒中提高治疗上有用的抗体的一般技术可见于例如wo91/11465和losmanetal.,1990,int.j.cancer46:310[losman等人，1990，国际癌症期刊，46:310]中。在一些实施方案中，可以使用杂交瘤方法来制备单克隆抗体(milsteinandcuello,1983,nature305(5934):537-40[milstein和cuello，1983，自然，305(5934):537-40])。在一些实施方案中，单克隆抗体也可以通过重组方法制备(参见例如，美国专利no.4,166,452)。
许多与通过b细胞永生化产生单克隆抗体相关的困难可以通过使用噬菌体展示在大肠杆菌中工程化和表达抗体片段来克服。为了确保回收高亲和力单克隆抗体，组合免疫球蛋白文库通常必须包含大的库大小。典型的策略利用从经免疫的小鼠的淋巴细胞或脾脏细胞获得的mrna，以使用逆转录酶合成cdna。将重链和轻链基因分别通过pcr扩增并连接到噬菌体克隆载体中。产生两个不同的文库，一个含有重链基因，而另一个含有轻链基因。从每个文库中分离噬菌体dna，并将重链和轻链序列连接在一起且包装形成组合文库。每个噬菌体含有随机的一对重链和轻链cdna，并且在大肠杆菌感染后指导感染细胞中的抗体链表达。为了鉴定识别所关注的抗原的抗体，将噬菌体文库接种，并将存在于菌斑中的抗体分子转移至过滤器。将过滤器与放射性标记的抗原一起温育，然后洗涤以去除过量的未结合配体。放射自显影图上的放射性斑点标识含有结合抗原的抗体的菌斑。可用于生产人免疫球蛋白噬菌体文库的克隆和表达载体可以例如从stratagenecloningsystems(stratagene克隆系统公司)(加利福尼亚州拉荷亚)获得。
可以采用类似的策略来获得高亲和力的scfv(参见例如vaughnetal.,1996,nat.biotechnol.,14:309-314[vaughn等人，1996，自然-生物技术，14:309-314])。可以通过使用对应于所有已知的vh、vκ和vλ基因家族的pcr引物从未经免疫的人供体分离v基因来构建具有大的所有组成成分的scfv文库。在扩增后，vκ和vλ池合并以形成一个池。将这些片段连接到噬菌粒载体中。然后将scfv接头(例如，[g4s]3)连接到vl片段上游的噬菌粒中。将vh和接头-vl片段扩增并组装到jh区域上。将所得的vh-接头-vl片段连接到噬菌粒载体中。可以如上所述使用过滤器或使用免疫管(nunc公司；maxisorp)来淘选噬菌粒文库。类似的结果可以通过从经免疫的兔子的淋巴细胞或脾细胞构建组合免疫球蛋白文库并通过在毕赤酵母(p.pastoris)中表达scfv构建体来实现(参见例如，ridderetal.,1995,biotechnology,13:255-260[ridder等人，1995，生物技术，13:255-260])。此外，在分离适当的scfv后，可以通过亲和力成熟过程(诸如cdr3诱变和链替换)获得具有更高结合亲和力和更慢解离速率的抗体片段(参见例如，jacksonetal.,1998,br.j.cancer,78:181-188[jackson等人，1998，英国癌症期刊，78:181-188])；osbournetal.,1996,immunotechnology,2:181-196[osbourn等人，1996，免疫技术，2:181-196])。
抗体片段的另一种形式是编码单个cdr的肽。cdr肽(“最小识别单位”)可以通过构建编码所关注的抗体的cdr的基因来获得。例如，通过使用聚合酶链式反应从抗体产生细胞的rna合成可变区来制备这样的基因(参见例如，larricketal.,1991,methods:acompaniontomethodsinenzymology2:106[larrick等人，1991，方法：酶学方法指南，2:106]；courtenay-luck,"geneticmanipulationofmonoclonalantibodies,"inmonoclonalantibodies:production,engineeringandclinicalapplication，ritteretal.,eds.,p.166-179,cambridgeuniversitypress1995[courtenay-luck，单克隆抗体：生产、工程化与临床应用中的“单克隆抗体的遗传操纵”，ritter等人编辑，第166-179页，剑桥大学出版社，1995]；以及wardetal.,"geneticmanipulationandexpressionofantibodies,"inmonoclonalantibodies:principlesandapplications,birchetal.,eds.,p.137-185,wiley-liss,inc.1995[ward等人，单克隆抗体：原理与应用中的“抗体的遗传操纵和表达”，birch等人编辑，第137-185页，威立利斯出版公司，1995])。
在一些实施方案中，适用于本发明的抗体可以包括人源化抗体或人抗体。非人抗体的人源化形式是含有来源于非人ig的最小序列的嵌合免疫球蛋白(ig)、ig链或片段(诸如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其他抗原结合子序列)。通常，人源化抗体具有从非人来源导入的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入”残基，这些残基通常取自“输入”可变区。通过用啮齿动物互补性决定区(cdr)或cdr序列取代人抗体的相应序列来完成人源化(riechmannetal.,1988,nature332(6162):323-7[riechmann等人，1988，自然，332(6162):323-7]；verhoeyenetal.,1988,science239(4847):1534-6[verhoeyen等人，1988，科学，239(4847):1534-6])。这种“人源化”抗体是嵌合抗体(参见例如，美国专利no.4,816,567；no.5,693,762；以及no.5,225,539)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的相应序列取代。在一些实施方案中，人源化抗体通常是其中一些cdr残基和可能的一些框架(fr)残基由来自啮齿动物ab中类似位点的残基取代的人抗体。人源化抗体包括人ig(受体抗体)，其中来自受体的cdr的残基被来自非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠或兔子)的cdr的具有所需的特异性、亲和力和能力的残基替换。在一些情况下，相应的非人残基替代人ig的fv框架残基。人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体也不存在于导入的cdr或框架序列中的残基。通常，人源化抗体包含基本上全部的至少一个，以及典型地两个可变结构域，其中大部分(如果不是全部)cdr区对应于非人ig的那些cdr区，并且大部分(如果不是全部)fr区是人ig共有序列的那些fr区。人源化抗体最佳地还包含ig恒定区(fc)的至少一部分，通常是人ig的恒定区的至少一部分(riechmannetal.,1988,nature332(6162):323-7[riechmann等人，1988，自然，332(6162):323-7]；verhoeyenetal.,1988,science239(4847):1534-6[verhoeyen等人，1988，科学，239(4847):1534-6])。
可以使用各种技术来产生人抗体，包括噬菌体展示文库(hoogenboometal.,1991,mol.immunol.28(9):1027-37[hoogenboom等人，1991，分子免疫学，28(9):1027-37]；marksetal.,1991,j.mol.biol.222(3):581-97[marks等人，1991，分子生物学杂志，222(3):581-97])和人单克隆抗体制备(reisfeldandsell,1985,cancersurv.4(l):271-90[reisfeld和sell，1985，癌症研究，4(l):271-90])。类似地，将人ig基因引入其中内源ig基因已经部分或完全失活的转基因动物中可用于合成人抗体(参见例如，fishwildetal.,1996,nat.biotechnol.14(7):845-51[fishwild等人，1996，自然-生物技术，14(7):845-51]；lonbergetal.,1994,nature368(6474):856-9[lonberg等人，1994，自然，368(6474):856-9]；lonbergandhuszar,1995,int.rev.immunol.13:65-93[lonberg和huszar，1995，国际免疫学评论，13:65-93]；taylor,l.d.,etal.,1992,nucl.acidsres.20:6287-6295[taylor,l.d.等人，1992，核酸研究，20:6287-6295]；kellermanns-a.,andgreenl.l.,2002,curr.opin.biotechnol.13:593-597[kellermanns-a.和greenl.l.，2002，生物技术当前述评，13:593-597]；little,m.etal.,2000,immunol.today21:364-370[little,m.等人，2000，今日免疫学，21:364-370]；murphy,a.j.etal.,2014,proc.natl.acad.sci.u.s.a.111(14):5153-5158[murphy,a.j.等人，2014，美国科学院院刊，111(14):5153-5158])。在攻击后，观察到人抗体产生。在一些实施方案中，抗ebv-lmp2/hla-a02人抗体通过以下方式制备：使经工程化的非人动物免疫以响应于用具有是或包含clgglltmv(seqidno:1)的氨基酸序列的ebv-lmp2肽的抗原攻击而产生人抗体。
在一些实施方案中，根据本发明使用的抗ebv-lmp2/hla-a02人单克隆抗体包含变体fc区，其中所述变体fc区包含相对于野生型fc区(或亲本fc区)的至少一个氨基酸修饰，使得所述分子对fc受体(例如，fcγr)具有改变的亲和力，前提条件是基于对fc-fc受体相互作用的结晶和结构分析(诸如由sondermannetal.,2000,nature,406:267-273[sondermann等人，2000，自然，406:267-273]公开的那些)，所述变体fc区在与fc受体直接接触的位置处不具有取代。与fc受体(诸如fcγr)直接接触的fc区内位置的示例是氨基酸234-239(铰链区)、氨基酸265-269(b/c环)、氨基酸297-299(c'/e环)和氨基酸327-332(f/g环)。在一些实施方案中，基于结构和结晶分析，包含变体fc区的本发明的抗ebv-lmp2/hla-a02人单克隆抗体包含对与fcγr直接接触的至少一个残基的修饰。
在一些实施方案中，根据本发明使用的抗ebv-lmp2/hla-a02人单克隆抗体是具有用于激活和/或抑制性受体的改变亲和力、具有带有一个或多个氨基酸修饰的变体fc区的抗ebv-lmp2/hla-a02人单克隆抗体，其中所述一个或多个氨基酸修饰是在位置297处用丙氨酸进行的取代；在一些实施方案中，在239d、330l、332e处进行取代以增强fcr亲和力；在一些实施方案中，在322k处进行取代以减少或消除fcr结合。在一些实施方案中，根据本发明使用的抗ebv-lmp2/hla-a02人单克隆抗体具有与亲本fc区相比具有变化的糖基化的fc区；在一些实施方案中，变化的糖基化包括不存在岩藻糖；在一些实施方案中，变化的糖基化因gnt1缺陷型cho细胞中的表达而产生。在一些实施方案中，本发明提供了多特异性结合剂，这些多特异性结合剂具有人抗ebv-lmp2/hla-a02抗体组分，该人抗ebv-lmp2/hla-a02抗体组分包含特征在于k322a取代的变体fc区。在一些实施方案中，所提供的多特异性结合剂包括与组分可衍生自的亲本抗体相比显示出变化的糖基化(例如，无糖基化的(aglycosylated))的抗体组分；在一些此类实施方案中，这种变体可以是或包含以k322a取代为特征的变体fc区。
在一些实施方案中，本发明提供和/或利用包含变体fc区(即，fc区包含相对于合适的参考fc的一个或多个添加、缺失和/或取代)的抗体或抗体药剂，该抗体或抗体药剂的特征在于改变效应物功能和/或对fcr的亲和力相对于参考fc增强或减弱。这些变化在本领域的技术人员的技能范围内。
因此，本发明尤其提供包含与一个或多个fcγr以更大亲和力结合的变体fc区的抗体药剂和多特异性结合剂(例如，抗体药剂)。此类药剂优选如下文所述更有效地介导效应物功能。在一些实施方案中，本发明提供了包含以较弱亲和力与一个或多个fcγr结合的变体fc区的抗体药剂和多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)。在某些情况下，例如在抗体的作用机制涉及阻断或拮抗但不杀伤携带靶抗原的细胞的情况下，需要减少或消除效应物功能。此外，在一些实施方案中，在如下文讨论地制备双特异性抗体时，需要消除效应物功能。在应阻断效应细胞中的fcγr激活受体(这种类型的功能将存在于宿主细胞中)的自体免疫疾病的情况下，需要减少或消除效应功能。通常，增加的效应物功能可以针对肿瘤和外来细胞；在一些实施方案中，效应物功能可以被引导远离肿瘤细胞。
根据本发明使用的fc变体可以与其他fc修饰(包括但不限于改变效应物功能的修饰)组合。本发明涵盖将如本文所述的fc变体与其他fc修饰组合以在抗体或fc融合体中提供添加性、协同性或新颖性质。在一些此类实施方案中，fc变体可以增强与它们结合的修饰的表型。例如，如果fc变体与已知以比包含野生型fc区的可比分子更高的亲和力与fcγriiia结合的突变体组合，则与突变体的该组合导致fcγriiia亲和力的更大倍增。
在一些实施方案中，根据本发明，将如本文所述的fc变体掺入抗体或fc融合体中以产生将一种或多种fc糖型(即，一种或多种碳水化合物所共价附接至的一种或多种fc多肽)包含至包含fc区的分子中的工程化药剂，其中该糖型的碳水化合物组成在化学上不同于包含fc区的亲本分子的碳水化合物组成。
在一些实施方案中，如本文所述的多特异性结合剂(例如，抗体药剂)可以包含显示出变化的糖基化和/或可以在糖基化缺陷型细胞系(例如，gnt1缺陷型cho细胞)中表达的fc区，与合适的参考fc区(例如，野生型)或在非糖基化缺陷型细胞系中表达的fc区相比，该药剂的这种fc区被产生为缺乏糖基化。
在一些实施方案中，根据本发明利用的抗体，可以相对于与所关注的抗原(例如，ebv-lmp2肽)结合的合适参考抗体具有经修饰的糖基化位点，优选不改变该抗体的功能性，例如与抗原的结合活性。如本文所用，“糖基化位点”包括抗体中寡糖(即，含有两个或更多个连接在一起的单糖的碳水化合物)将特异性且共价附接至的任何特定氨基酸序列。寡糖侧链通常通过n键或o键与抗体的主链连接。n键连接的糖基化是指寡糖部分至天冬酰胺残基侧链的附接。o键连接的糖基化是指寡糖部分至羟基氨基酸(例如，丝氨酸、苏氨酸)的附接。例如，缺乏某些寡糖(包括岩藻糖和末端n-乙酰葡糖胺)的fc糖型可以在特定的cho细胞中产生，并表现出增强的adcc效应物功能。
在一些实施方案中，本发明涵盖通过添加或缺失糖基化位点来改变如本文所述的抗体的碳水化合物含量的方法。用于改变抗体的碳水化合物含量的方法在本领域中是熟知的并且包括在本发明内(参见例如，美国专利no.6,218,149；ep0359096b1；美国专利公开no.us2002/0028486；国际专利申请公开wo03/035835；美国专利公开no.2003/0115614；美国专利no.6,218,149；美国专利no.6,472,511)。在一些实施方案中，本发明包括通过使抗体的一个或多个内源性碳水化物部分缺失来改变抗体(或其相关部分或组分)的碳水化合物含量的方法。在某些实施方案中，本发明包括通过将位置297从天冬酰胺修饰为丙氨酸来使抗体的fc区的糖基化位点缺失。
工程化的糖型可用于多种目的，包括但不限于增强或减弱效应物功能。工程化的糖型可以通过本领域的技术人员已知的任何方法产生，例如通过使用经工程化的或变体表达菌株，通过与一种或多种酶(例如，din-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii))共表达，通过在各种生物体或来自各种生物体的细胞系中表达包含fc区的分子，或者通过在包含fc区的分子已被表达后修饰一种或多种碳水化合物。用于产生经工程化的糖型的方法是本领域中已知的，并且包括但不限于在以下文献中描述的那些：umanaetal.,1999,nat.biotechnol.17:176-180[umana等人，1999，自然-生物技术，17:176-180]；daviesetal.,2001,biotechnol.bioeng.74:288-294[davies等人，2001，生物技术和生物工程，74:288-294]；shieldsetal.,2002,j.biol.chem.277:26733-26740[shields等人，2002，生物化学杂志，277:26733-26740]；shinkawaetal.,2003,j.biol.chem.278:3466-3473[shinkawa等人，2003，生物化学杂志，278:3466-3473]；美国专利no.6,602,684；美国专利申请序列号no.10/277,370；美国专利申请序列号no.10/113,929；国际专利申请公开wo00/61739a1；wo01/292246a1；wo02/311140a1；wo02/30954a1；potillegenttm技术(biowa公司，新泽西州普林斯顿)；glycomabtm糖基化工程技术(glycartbiotechnologyag(glycart生物技术ag公司)，瑞士苏黎世)。参见例如国际专利申请公开wo00/061739；ea01229125；美国专利申请公开no.2003/0115614；okazakietal.,2004,jmb,336:1239-49[okazaki等人，2004，分子生物学杂志，336:1239-49]。
多价结合剂
如本领域的技术人员所知，多价结合剂是包括特异性结合两个或更多个靶标(例如表位)的结合组分的分子实体或复合物。这种多价结合剂在本领域中有多种用途，包括治疗用途。仅举一个示例，如本领域的技术人员所知，多价结合剂已被工程化为通过引导(或募集)细胞毒性t细胞到肿瘤部位来促进对肿瘤细胞的杀伤。肿瘤抗原的示例包括但不限于甲胎蛋白(afp)、ca15-3、ca27-29、ca19-9、ca-125、钙网膜蛋白、癌胚抗原、cd34、cd99、cd117、嗜铬粒蛋白、细胞角蛋白、肌间线蛋白、上皮膜蛋白(ema)、因子viii、cd31fl1、胶原纤维酸性蛋白(gfap)、巨囊性病的液状蛋(gcdfp-15)、hmb-45、人绒毛膜促性腺激素(hcg)、抑制素、角蛋白、cd45、淋巴细胞标记、mart-1(黑色素a)、myod1、肌肉特异性肌动蛋白(msa)、神经丝、神经元特异性烯醇化酶(nse)、胎盘碱性磷酸酶(plap)、前列腺特异性抗原、s100蛋白、平滑肌肌动蛋白(sma)、突触素、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子-1，肿瘤m2-pk，以及波形蛋白。
在一些实施方案中，根据本发明使用的多价结合剂是双特异性结合剂。在许多实施方案中，此类双特异性结合剂能够结合肿瘤细胞。在许多实施方案中，此类双特异性结合剂能够结合经艾普斯登-巴尔病毒(ebv)感染的ebv+细胞，或经由mhc分子(例如，hlai类分子)在肿瘤细胞表面上表达ebv相关肽的细胞。
在一些实施方案中，本发明提供的多价结合剂(例如，双特异性结合剂)是或包含抗体组分。用于设计、构建和/或产生包含抗体组分的多特异性结合剂的各种技术是在本领域中已知的。
例如，已经构建了利用完整免疫球蛋白框架(例如，igg)、单链可变片段(scfv)或其组合的多价结合剂。由两个串联的scfv单元组成的双特异性结合剂已经显示为是临床上成功的双特异性抗体形式。在抗肿瘤免疫治疗的情况下，已经设计了包含两个串联的单链可变片段(scfv)的双特异性结合剂，使得结合肿瘤抗原的scfv与通过结合cd3而与t细胞接合的scfv连接。以这种方式，t细胞被募集到肿瘤部位，以希望它们能够通过某些t细胞具有的细胞毒性性质来介导杀伤肿瘤细胞。已经制备了这种双特异性结合剂的示例，其靶向淋巴瘤的cd19和cd3(被称为双特异性t细胞接合，或bite；例如参见dreieretal.,2003,j.immunol.170:4397-4402[dreier等人，2003，免疫学期刊，170:4397-4402]；bargouetal.,2008,science321:974-977[bargou等人，2008，科学，321:974-977])，其已经在动物异种移植研究中成功地预防了肿瘤生长。在人研究中，这种双特异性结合剂表现出客观的肿瘤反应，包括5例部分缓解和2例完全缓解。
示例性双特异性结合剂包括具有特异于肿瘤抗原(例如，mhc分子的结合口袋中的ebv相关肽)的第一抗体组分和特异于免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞等)的第二抗体组分的那些双特异性结合剂。双特异性结合剂可以例如通过组合识别相同或不同抗原的不同表位的重链和/或轻链来制备。在一些实施方案中，通过分子功能，双特异性结合剂在其两个结合臂中的一个(一个vh/vl对)上结合一个抗原(或表位)，并在其第二臂(一不同的vh/vl对)上结合不同的抗原(或表位)。按照此定义，双特异性结合剂具有两个不同的抗原结合臂(在特异性和cdr序列两方面不同)，并且对于其结合的每种抗原是单价的。
在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂的特征在于同时结合两种具有不同结构的靶标的能力。在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂具有特异性结合例如b细胞、t细胞、骨髓、血浆或肥大细胞抗原或表位的至少一种组分，以及特异性结合肽-hla复合物(所述肽-hla复合体的肽源自ebv蛋白)的至少一种其他组分。
本发明的双特异性结合剂(例如，双特异性抗体)基于以下特定的洞察：当用于诊断和/或治疗ebv相关疾病和恶性肿瘤时，某些形式可能对某些靶标(例如，肿瘤抗原)更有益。例如，本文提供的双特异性抗体利用具有不同结合特征的scfv的组合。此类双特异性抗体表现出经由第一scfv对ebv-肽/hla复合物的特异性，以及经由第二scfv(例如，抗cd3)对t细胞的特异性。如本文所述，具有该形式的双特异性抗体首先经由第一scfv(例如，抗ebv-lmp2/hla-a02)与表达ebv-lmp2肽/hla复合物的细胞结合，然后经由第二scfvt与细胞上的cd3结合。这种双特异性结合剂通过同时结合ebv-lmp2肽/hla复合物和cd3来促进t细胞对ebv+细胞的细胞毒性。此外，本发明的双特异性抗体提供诊断和治疗性肿瘤靶向特征。
在各种实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂(例如，双特异性抗体)由第一结合组分和第二结合组分组成。在许多实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第一和第二结合组分各自由以不同特异性为特征的抗体组分组成。在许多实施方案中，抗体组分选自表3。
在各种实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂包含第一结合组分和第二结合组分。在各种实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂包含第一结合组分、第二结合组分和连接至第一和第二结合组分两者的接头(例如，位于第一和第二结合组分之间)。
在各种实施方案中，如本文所述的第一和/或第二结合组分包含或者是抗体组分。在各种实施方案中，如本文所述的第一和/或第二结合组分包含接头序列。
在一些实施方案中，接头的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，接头的特征在于其倾向于不采用刚性三维结构，而是为多肽(例如第一和/或第二结合组分)提供柔性。在一些实施方案中，基于赋予双特异性结合剂的特定性质(例如，减少聚集和/或增加稳定性)，来在本文所述的双特异性结合剂中采用接头。在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂包含g4s接头。在某些实施方案中，本发明的双特异性结合剂包含(g4s)n接头，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更大。
在一些实施方案中，如本文所述的第一和/或第二结合组分包含或者是免疫球蛋白(例如，igg)。在一些实施方案中，如本文所述的第一和/或第二结合组分结合组分包含或是抗体片段(例如，scfv)。在一些实施方案中，如本文所述的第一结合组分包含或者是免疫球蛋白，并且第二结合组分包含或者是抗体片段。在某些实施方案中，第一结合组分是免疫球蛋白，并且第二结合组分是抗体片段。在某些实施方案中，第一结合组分是igg，并且第二结合组分是scfv。
在某些实施方案中，根据本发明的双特异性结合剂包含第一和第二scfv。在某些实施方案中，第一scfv连接至第二scfv的c末端。在某些实施方案中，第二scfv连接到第一scfv的c末端。在某些实施方案中，scfv经由接头序列彼此连接。
在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂包含与在表3中出现的一个或多个序列至少约50％(例如，至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)同一的一个或多个序列。
在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂包含与表3中出现的一个或多个序列基本上同一或同一的一个或多个序列。
在一些实施方案中，本发明的双特异性结合剂选自表3中出现的一个或多个序列。在某些实施方案中，本发明的双特异性结合剂选自表3中出现的两个序列，例如一重链序列和一轻链序列。在某些实施方案中，本发明的双特异性结合剂选自表3中出现的三个序列，例如一重链序列、一轻链序列和一scfv序列。
在各种实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第一结合组分包含具有与表3中出现的抗体组分至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一的序列的抗体组分。
在各种实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第一结合组分包含具有与表3中出现的抗体组分基本上同一或同一的序列的抗体组分。
在各种实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分包含结合t细胞的抗体组分。可用作本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分的靶标的示例性t细胞标记物包括cd3、cd4、cd8、cd28等。在一些实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分包含结合cd3的抗体组分。在某些实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分包含结合cd3ε的抗体组分。
在各种实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分包含具有与表3中出现的抗体组分至少50％(例如，50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)同一的序列的抗体组分。
在各种实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分包含具有与表3中出现的抗体组分基本上同一或同一的序列的抗体组分。在某些实施方案中，如本文所述的双特异性结合剂的第二结合组分是或包含seqidno:124。
如本文所述，本发明人提供了靶向在hlai类结合口袋中呈递的ebv相关肽的改善的单特异性和多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)。在一些实施方案中，这种多特异性结合剂包含模拟与在hlai类结合口袋中呈递的肽的tcr相互作用的结合成分。因此，本发明的多特异性结合剂的结合组分可被描述为更特异，并且类似于特异于hlai类结合口袋中呈递的ebv相关肽的天然tcr。如本文所述，与不含这种结合组分的多特异性结合剂相比，这种多特异性结合剂表现出增强的亲和力和临床应用性，而不会遭受交叉反应性。因此，本发明特别地展示了二价和多价lmp2(clg)/hla-a02特异性ii型抗体的合成，所述抗体的特征在于增强的体外和体内效力。此外，本发明特别地展示了用于开发ii型tcr抗体模拟物的选择方法学，该ii型tcr抗体模拟物在一些实施方案中的特征在于对ebv相关肽的靶肽位置4至7的特异性，这提供了允许推广至其他hla等位基因和抗原的明显优点。
嵌合抗原受体(car)
本发明还提供了包含如本文所述的人抗体药剂和/或多特异性结合剂的嵌合抗原受体。car可以通过本领域已知的方法构建(参见例如wo2012/079000、美国专利申请公开no.2012/0213783、wo2013/126726、wo2015/177789和wo2015/080981；所有这些专利由此以引用方式并入)。可以将免疫效应细胞(例如，t细胞、nk细胞等)工程化以表达含有如本文所述的抗体组分的嵌合抗原受体，从而产生克服由癌细胞用来逃脱检测的免疫系统监视机制的抗肿瘤免疫效应细胞。在一些实施方案中，本发明提供了表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞，该嵌合抗原受体包含如本文所述的人抗体药剂或多特异性结合剂的一个或多个抗原结合位点。在一些实施方案中，免疫效应细胞包含经工程化以表达本文所述的抗体组分的抗原结合位点的t细胞。在一些实施方案中，抗原结合位点是或包含如本文所述的抗体组分。
在一些实施方案中，免疫效应细胞包含嵌合的、人源化的、人的和/或由人工构建的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含一种、两种、三种、四种、五种或更多种组分(例如抗体组分、结合组分，信号传导组分等)。在一些实施方案中，如本文所述的嵌合抗原受体的组分促进免疫效应细胞与ebv+或ebv感染的细胞的结合。在一些实施方案中，如本文所述的嵌合抗原受体包含结合ebv-lmp2/hla-a复合物(例如，ebv-lmp2(clg)/hla-a02复合物)的抗体组分，并且还包含一个或多个全部或部分的细胞质信号传导结构域，以及一个或多个全部或部分的共刺激分子。在一些实施方案中，如本文所述的嵌合抗原受体的抗体组分是或包含scfv；在某些实施方案中，scfv选自表3。
靶标
本发明尤其涵盖以下认识：多特异性结合剂(和/或嵌合抗原受体)，特别是双特异性结合剂(诸如双特异性抗体)对于促进细胞杀伤特别有用和/或有效。具体地，本发明展示，多价结合剂的特异性结合靶细胞相关表位(例如，ebv相关肽抗原)和淋巴细胞相关表位(例如，t细胞表面蛋白)两者的活性可以是ebv相关疾病和恶性肿瘤的有效免疫疗法。
例如，在本发明的一些实施方案中，多价结合剂特异性结合肿瘤细胞相关表位和t细胞表位。根据此类实施方案，多价结合剂可以促进药剂与其靶表位中的一个或两个的结合和/或可以增强由靶t细胞介导的对靶肿瘤细胞的杀伤。仅举一个示例，在本发明的一些实施方案中，嵌合抗原受体结合ebv+或ebv感染细胞上的ebv相关表位。根据此类实施方案，免疫效应细胞可以在嵌合抗原受体与其靶表位接合后促进对ebv+或ebv感染细胞的杀伤。
在一些实施方案中，待杀伤的靶细胞包括例如表达病毒肽抗原(例如，ebv相关病毒肽抗原)的细胞。本领域的普通技术人员将知道此类细胞上与如在此所述的多价结合剂理想结合的合适靶表位。
在一些实施方案中，如本文所述可介导对靶细胞的杀伤的淋巴细胞包括t细胞(例如，cd8+t细胞)、天然杀伤细胞(nk)、巨噬细胞、粒细胞和抗体依赖性细胞毒性细胞。本领域的普通技术人员将知道此类淋巴细胞上与如在此所述的多价结合剂理想结合的合适靶表位。代表性的此类表位可以在抗原上存在，所述抗原为诸如igg的fc受体(例如，fcγriib)、cd1d、cd3、cd4、cd7、cd8、cd13、cd14、cd16、cd31、cd38、cd56、cd68、mac-l/mac-3、il-2ra、ox40、ly49，以及cd94。
核酸构建与表达
如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)和嵌合抗原受体可以使用本领域已知的分子生物学方法从核酸分子产生。将核酸分子插入载体中，该载体当导入合适宿主细胞时能够表达融合蛋白。适当的宿主细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。本领域的技术人员已知用于将dna片段插入到载体中的任何方法可用于在转录/翻译控制信号的控制下构建编码本发明的融合蛋白的表达载体。这些方法可以包括体外重组dna和合成技术以及体内重组(参见sambrooketal.,molecularcloning,alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory[sambrook等人，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室]；currentprotocolsinmolecularbiology,eds.ausubel,etal,greenepubl.assoc.,wiley-interscience,ny[分子生物学现行规范，ausubel等人编辑，格林出版协会，威立国际科学公司，纽约])。
根据本发明的核酸分子的表达可以由第二核酸序列来调节，使得分子在用重组dna分子转化的宿主中表达。例如，本发明的核酸分子的表达可以由本领域已知的启动子和/或增强子元件来控制。
核酸构建体包含编码从抗体和/或抗体组分产生的多特异性结合蛋白(或嵌合抗原受体)的区域。通常，这种多特异性结合蛋白(或嵌合抗原受体)将从vh和/或vl区产生。在鉴定和选择表现出期望的结合和/或功能特性的抗体之后，将每个抗体的可变区分离、扩增、克隆和测序。可以对vh和vl核苷酸序列进行修饰，包括编码氨基酸和/或携带限制性位点的核苷酸序列的添加、编码氨基酸的核苷酸序列的缺失，或编码氨基酸的核苷酸序列的取代。抗体和/或抗体组分可以从人抗体、非人(例如啮齿动物)抗体、人源化抗体或嵌合抗体产生。
通过本领域已知的方法将本发明的核酸构建体插入到表达载体或病毒载体中，并且将核酸分子与表达控制序列可操作地连接。
在适当的情况下，编码如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂和嵌合抗原受体的核酸序列可以经修饰以包含为了在特定细胞类型或生物体中表达而优化的密码子(例如，参见美国专利no.5,670,356和no.5,874,304)。密码子优化的序列是合成序列，并且优选编码由非密码子优化的亲本多核苷酸编码的相同多肽(或与全长多肽具有基本上相同活性的全长多肽的生物活性片段)。在一些实施方案中，编码抗体组分的遗传物质的编码区的全部或部分可以包含改变的序列以优化针对特定细胞类型(例如，真核或原核细胞)的密码子使用。例如，如本文所述的人或人源化重链(或轻链)可变区的编码序列可经优化以用于在细菌细胞中表达。或者，编码序列可以经优化以用于在哺乳动物细胞(例如cho)中表达。此类序列可以被描述为密码子优化的序列。
将含有核酸分子的表达载体转化到合适的宿主细胞中以允许产生由核酸构建体编码的蛋白质。示例性宿主细胞包括原核生物(例如，大肠杆菌)和真核生物(例如，cos或cho细胞)。将用表达载体转化的宿主细胞在允许产生本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体的条件下生长，接着回收所述人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体。
本发明的人单克隆抗体和/或多特异性结合剂可以通过允许随后形成稳定的抗体或结合剂分子的任何技术来纯化。例如，不希望被理论束缚，人单克隆抗体和/或多特异性结合剂可以从细胞中作为可溶性多肽或包涵体回收，人单克隆抗体和/或多特异性结合剂可以从所述可溶性多肽或包涵体中通过8m盐酸胍和透析定量提取。为了进一步纯化本发明的人单克隆抗体和/或多特异性结合剂，可以使用常规离子交换色谱、疏水相互作用色谱、反相色谱或凝胶过滤。本发明的人单克隆抗体和/或多特异性结合剂也可以在从真核或原核细胞分泌后从条件培养基中回收。
在免疫效应细胞表面上表达的嵌合抗原受体可以通过本领域已知的方法来实现。通常，将携带编码嵌合抗原受体多肽的核酸序列的表达载体转化到微生物中进行表达。如上所述，此类微生物可以是原核生物(细菌)或真核生物(例如，酵母)。表达载体还可以包括编码信号肽的序列，使得嵌合抗原受体的表达根据期望的结局而靶向细胞膜或亚细胞位置。此类信号肽是本领域的技术人员已知的。将编码嵌合抗原受体多肽的表达载体通过本领域已知的方法引入宿主细胞，所述方法包括例如dna转染、电穿孔、转染和感染(例如，使用病毒，诸如腺病毒或逆转录病毒)。
在一些实施方案中，编码如本文所述的嵌合抗原受体的核酸分子提供为在t细胞中的表达，从而产生嵌合抗原受体t细胞。编码嵌合抗原受体的核酸分子可以包含在用于在宿主免疫效应细胞(诸如t细胞)中表达的载体(例如，慢病毒载体或逆转录病毒载体)中。示例性免疫效应细胞包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)和调节性t细胞。产生编码嵌合抗原受体的核酸分子和包含这种嵌合抗原受体的t细胞的方法是本领域已知的(参见例如，till,b.g.etal.,2008,blood112(6):2261-71[till,b.g.等人，2008，血液，112(6):2261-71]；brentjens,r.etal.,2010,moleculartherapy18(4):666-8[brentjens,r.等人，2010，分子治疗，18(4):666-8]；morgan,r.a.etal.,2010,moleculartherapy18(4):843-51[morgan,r.a.等人，2010，分子治疗，18(4):843-51]；park,t.s.etal.,2011,trendsbiotechnol.29(11):550-7[park,t.s.等人，2011，生物技术趋势，29(11):550-7]；grupp,s.a.etal.,2013,n.engl.j.med.368(16):1509-18[grupp,s.a.等人，2013，新英格兰医学杂志，368(16):1509-18]；han,e.q.etal.,2013,j.hematol.oncol.6:47[han,e.q.等人，2013，血液学与肿瘤学杂志，6:47]；wo2012/079000、wo2013/126726；以及美国专利申请公开no.2012/0213783，所有这些文献由此以引用方式并入)。
筛选和检测方法
本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂和/或嵌合抗原受体还可以用于希望检测和/或测量一个或多个细胞的一种或多种活性(例如，细胞凋亡或细胞生长)的体外或体内筛选方法。筛选方法是本领域熟知的，包括无细胞的、基于细胞的和动物测定。体外测定可以是固态或可溶性的，靶分子检测可以以本领域已知的许多方式来实现，包括使用能够鉴定与靶分子(例如，细胞表面抗原)结合的人单克隆抗体或多特异性结合剂的标记或可检测基团。可检测标记可以与使用本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体的测定结合使用。
治疗方法
本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂和/或嵌合抗原受体表现出对靶抗原中的一个靶抗原的高亲和力结合的能力使它们在治疗上可用于有效靶向表达靶抗原(例如，ebv相关肽)的细胞。因此，在一些实施方案中，可能需要增加人单克隆抗体或多特异性结合剂对一种靶抗原的亲和力，而不增加对也由多特异性结合剂结合的另一种靶抗原(或在人单克隆抗体的情况下为fc受体)的亲和力。例如，在肿瘤杀伤的情况下，某些病症可能受益于对肿瘤抗原，而不是对能够介导肿瘤杀伤的细胞(例如，t细胞)的表面上的抗原的亲和力增加。因此，可能有益的是，通过使用如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体来增加人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体对具有表达肿瘤抗原的肿瘤的患者中的肿瘤抗原的结合亲和力。
本发明提供如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂和/或嵌合抗原受体作为治疗具有表达能够由这种多特异性结合剂结合的抗原的肿瘤的患者的治疗剂。这种人单克隆抗体、多特异性结合剂和/或嵌合抗原受体可以用于治疗人体或动物体的方法中或诊断方法中。
在一些实施方案中，所提供的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体可用于医学中。在一些实施方案中，所提供的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体可用作ebv相关疾病或恶性肿瘤的治疗或预防中或与ebv相关或关联的不利衍生物(negativeramification)的治疗或预防中的预防剂。在一些实施方案中，所提供的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体可用于例如患有或易患ebv相关疾病或恶性肿瘤的个体中的治疗性应用。
施用
本发明提供了将有效量的本文所述治疗活性物质(例如，人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体)施用给需要治疗的受试者的方法。
如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体可以通过本领域已知的各种方法施用以用于治疗性递送药剂，诸如蛋白质或核酸可以用于治疗性递送人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体或编码本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体的核酸，以杀伤或抑制受试者中靶细胞的生长，所述方法为例如细胞转染、基因治疗、用递送媒介物或药学上可接受的载剂直接施用，通过提供包含编码本发明的多特异性结合剂的核酸的重组细胞来间接递送。
各种递送系统是已知的并且可以用于施用本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体，所述递送系统为例如封装在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达所述化合物的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见例如wuandwu,1987,j.biol.chem.262:4429-4432[wu和wu，1987，生物化学杂志，262:4429-4432])，构建作为逆转录病毒或其他载体的一部分的核酸，等等。施用途径可以肠内或肠胃外的，并且包括但不限于静脉内、皮下、肌内、肠胃外、透皮或经粘膜(例如，口服或经鼻)。在一些实施方案中，本发明的多特异性结合剂是静脉内施用的。在一些实施方案中，本发明的多特异性结合剂是皮下施用的。在一些实施方案中，多特异性结合剂与其他生物活性药剂一起施用。
药物组合物
本发明进一步提供了包含本发明的人单克隆抗体、多特异性结合剂或嵌合抗原受体以及药学上可接受的载剂或赋形剂的药物组合物。如果需要的话，组合物还可以含有一种或多种附加的治疗活性物质。
在一些实施方案中，包含嵌合抗原受体的药物组合物可以被提供作为用于感染从受试者分离的自体t细胞的病毒(例如，逆转录病毒)。在此类实施方案中，自体t细胞被已工程化以表达如本文所述的嵌合抗原受体的病毒感染，由此产生嵌合抗原受体t细胞以供回输到受试者(例如，人患者)体内。
虽然对本文提供的药物组合物的描述主要涉及适用于按处方施用(ethicaladministration)给人的药物组合物，但是本领域的技术人员应理解，此类组合物通常适于施用给各种动物。为了使组合物适于施用给各种动物，对适于施用给人的药物组合物进行修饰是很好理解的，并且普通技术的兽医药理学家可以仅用普通的(如果有的话)实验来设计和/或进行这种修饰。
例如，本文提供的药物组合物可以以无菌可注射形式(例如，适于皮下注射或静脉内输注的形式)提供。例如，在一些实施方案中，药物组合物以适于注射的液体剂型提供。在一些实施方案中，药物组合物作为粉末(例如，经冻干和/或灭菌的)提供，所述粉末在注射之前任选地在真空下用含水稀释剂(例如，水、缓冲液、盐溶液等)重构。在一些实施方案中，将药物组合物在水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等中稀释和/或重构。在一些实施方案中，应将粉末与含水稀释剂轻柔混合(例如，不振荡)。
本文所述的药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或今后开发的任何方法来制备。通常，这种制备方法包括以下步骤：使活性成分与稀释剂或另一种赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分缔合，然后如果需要和/或期望的话，将产物塑形和/或包装成所需的单剂量或多剂量单位。
根据本发明的药物组合物可以被制备、包装和/或散装销售，作为一个单一单位剂量，和/或作为多个单一单位剂量。如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的离散量的药物组合物。活性成分的量通常等于将施用给受试者的活性成分的剂量和/或此类剂量的便利分数，诸如此类剂量的一半或三分之一。
根据本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何附加成分的相对量将根据所治疗的受试者的身份、体型和/或病症，并且进一步根据将施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可包含在0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。
药物制剂可以另外包含药学上可接受的赋形剂，该药学上可接受的赋形剂如本文所用包括适合于所需特定剂型的任何和所有溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。remington'sthescienceandpracticeofpharmacy,21stedition,a.r.gennaro(lippincott,williams&wilkins,baltimore,md,2006)[remington的药学科学与实践，第21版，a.r.gennaro编辑(利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司，马里兰州巴尔的摩，2006)]公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于其制备的已知技术。除了任何常规的赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，诸如通过产生任何不希望的生物效应或以有害的方式与药物组合物的一种或多种任何其他组分相互作用的情况下，赋形剂的应用被认为是在本发明的范围内。
在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂是至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％纯的。在一些实施方案中，赋形剂被批准用于人和兽医用途。在一些实施方案中，赋形剂由美国食品和药物管理局批准。在一些实施方案中，赋形剂是药品等级的。在一些实施方案中，赋形剂符合美国药典(usp)、欧洲药典(ep)、英国药典和/或国际药典的标准。
用于制备药物组合物的药学上可接受的赋形剂包括但不限于惰性稀释剂、分散剂和/或成粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、粘合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂、和/或油。这种赋形剂可以任选地包含在药物制剂中。根据配制人员的判断，诸如可可油和栓剂蜡、着色剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和/或芳香剂的赋形剂可以存在于组合物中。
在一些实施方案中，所提供的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(例如，防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等)。在一些实施方案中，药物组合物包含一种或多种防腐剂。在一些实施方案中，药物组合物不包含防腐剂。
在一些实施方案中，药物组合物以能够冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方案中，药物组合物以不能够冷藏和/或冷冻的形式提供。在一些实施方案中，重构溶液和/或液体剂型可以在重构后贮藏一定时间段(例如，2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、一个月、两个月或更长时间)。在一些实施方案中，储存抗体组合物达长于指定时间导致抗体降解。
液体剂型和/或重构溶液可以在施用之前包含颗粒物质和/或变色。在一些实施方案中，如果溶液变色或浑浊和/或如果在过滤之后留下颗粒物质，则不应该使用该溶液。
对药物制剂的配制和/或制造的一般考虑可以见于例如remington:thescienceandpracticeofpharmacy21sted.,lippincottwilliams&wilkins,2005[remington：药学科学与实践，第21版，利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司，2005]。
试剂盒
本发明进一步提供了一种药物包或试剂盒，该药物包或试剂盒包含填充有至少一种如本文所述的人单克隆抗体、多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)或嵌合抗原受体(或嵌合抗原免疫效应细胞)的一个或多个容器。试剂盒可用于任何适用的方法，包括例如诊断。任选地与一个或多个此类容器相关联的可以是由政府机构规定形式的注意事项，该注意事项规定药物或生物产品的制造、使用或销售，该注意事项反映了(a)由政府机构批准生产、使用或销售用于人类施用，(b)使用说明，或两者。
本发明的其他特征将在以下对示例性实施方案的描述的过程中变得清楚，所述示例性实施方案是为了说明本发明而给出的，而并非旨在限制本发明。
示例性实施方案
1.一种结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂与所述ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，所述一个或多个位置选自由位置1、位置5、位置8以及它们的组合组成的组。
2.一种结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂的kd为约2.0至约170nm。
3.根据示例性实施方案1或2所述的人抗体药剂，其中所述ebv-lmp2肽具有是或包含clgglltmv(seqidno:1)的氨基酸序列。
4.根据示例性实施方案3所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂与所述ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，所述一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。
5.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:31的重链cdr1、seqidno:33的cdr2和seqidno:35的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:73的轻链cdr1、seqidno:75的cdr2和seqidno:77的cdr3。
6.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:37的重链cdr1、seqidno:39的cdr2和seqidno:41的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:79的轻链cdr1、seqidno:81的cdr2和seqidno:83的cdr3。
7.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:43的重链cdr1、seqidno:45的cdr2和seqidno:47的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:85的轻链cdr1、seqidno:87的cdr2和seqidno:89的cdr3。
8.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:49的重链cdr1、seqidno:51的cdr2和seqidno:53的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:91的轻链cdr1、seqidno:93的cdr2和seqidno:95的cdr3。
9.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:55的重链cdr1、seqidno:57的cdr2和seqidno:59的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:97的轻链cdr1、seqidno:99的cdr2和seqidno:101的cdr3。
10.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:61的重链cdr1、seqidno:63的cdr2和seqidno:65的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:103的轻链cdr1、seqidno:105的cdr2和seqidno:107的cdr3。
11.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:67的重链cdr1、seqidno:69的cdr2和seqidno:71的cdr3；并且其中所述人抗体药剂包含seqidno:109的轻链cdr1、seqidno:111的cdr2和seqidno:113的cdr3。
12.根据示例性实施方案5至11中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的一个或多个氨基酸取代。
13.根据示例性实施方案12所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的至少一个或至多五个氨基酸取代。
14.根据示例性实施方案12所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含在重链cdr和/或轻链cdr中的至少一个或至多三个氨基酸取代。
15.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含具有与表3中出现的重链可变区序列至少95％同一的序列的重链可变区。
16.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含具有与表3中出现的轻链可变区序列至少95％同一的序列的轻链可变区。
17.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含
(a)具有与表3中出现的重链可变区序列至少95％同一的序列的重链可变区，以及
(b)具有与表3中出现的轻链可变区序列至少95％同一的序列的轻链可变区。
18.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含选自表3的重链可变区。
19.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含选自表3的轻链可变区。
20.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:3的轻链可变区和seqidno:5的重链可变区。
21.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:7的轻链可变区和seqidno:9的重链可变区。
22.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:11的轻链可变区和seqidno:13的重链可变区。
23.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:15的轻链可变区和seqidno:17的重链可变区。
24.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:19的轻链可变区和seqidno:21的重链可变区。
25.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:23的轻链可变区和seqidno:25的重链可变区。
26.根据示例性实施方案1至4中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含seqidno:27的轻链可变区和seqidno:29的重链可变区。
27.根据前述示例性实施方案中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂是去岩藻糖基化和/或用末端甘露糖、n-乙酰葡萄糖或葡萄糖糖基化的人单克隆抗体。
28.一种结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂，所述人抗体药剂包含增加对ebv-lmp2/hla肽复合物的亲和力的一个或多个氨基酸取代，并且其中所述人抗体药剂的特征在于
(a)比对参考肽/hla复合物的亲和力高至少约1.6的ka，和/或
(b)对参考肽/hla复合物没有交叉反应性。
29.根据示例性实施方案28所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含在氨基酸位置48、52、55、66、95以及它们的组合中的任一者处包含一个或多个氨基酸取代的轻链可变区。
30.根据示例性实施方案29所述的人抗体药剂，其中所述一个或多个氨基酸取代是i48v/s52g、p55h、k66r或n95i。
31.根据示例性实施方案28至30中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂包含重链可变区，所述重链可变区在氨基酸位置5、10、26、51、78以及它们的组合中的任一者处包含一个或多个氨基酸取代。
32.根据示例性实施方案31所述的人抗体药剂，其中所述一个或多个氨基酸取代是v5e、e10d、g26e/i51v或v78a。
33.根据前述示例性实施方案中任一项所述的人抗体药剂，其中所述人抗体药剂是人单克隆抗体或其片段。
34.根据示例性实施方案33所述的人抗体药剂，其中所述人单克隆抗体是igg1、igg2、igg3或igg4抗体。
35.根据示例性实施方案34所述的人抗体药剂，其中所述人单克隆抗体是igg1。
36.根据示例性实施方案33所述的人抗体药剂，其中所述人单克隆抗体是scfv。
37.根据前述示例性实施方案中任一项所述的人抗体药剂，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
38.根据示例性实施方案37所述的人抗体药剂，其中所述hlai类分子是hla-a02。
39.根据示例性实施方案38所述的人抗体药剂，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
40.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子全部或部分地编码根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂。
41.一种重组载体，所述重组载体包含根据示例性实施方案40所述的核酸分子。
42.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据示例性实施方案41所述的重组载体或根据示例性实施方案40所述的核酸分子。
43.根据示例性实施方案42所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
44.根据示例性实施方案43所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下项组成的组：大肠杆菌、毕赤酵母属、sf9、cos、hek293、cho和哺乳动物淋巴细胞。
45.根据示例性实施方案44所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。
46.一种用于产生根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂的方法，包括
在适合所述人抗体药剂表达的条件下，在培养基中培养根据权利要求42至45中任一项所述的宿主细胞，以及
从所述培养基中回收所述人抗体药剂。
47.一种组合物，所述组合物包含根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂。
48.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂或根据示例性实施方案47所述的组合物，并且还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
49.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂。
50.一种治疗受试者的以ebv-lmp2/hla肽复合物的表达为特征的医学病症的方法，包括以下步骤
施用治疗有效量的根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂、根据示例性实施方案47所述的组合物，或根据示例性实施方案48所述的药物组合物。
51.根据示例性实施方案50所述的方法，其中所述医学病症是霍奇金病、非霍奇金病或传染性单核细胞增多症。
52.根据示例性实施方案50所述的方法，其中所述医学病症选自伯基特淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌，以及免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。
53.根据示例性实施方案50至52中任一项所述的方法，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
54.根据示例性实施方案53所述的方法，其中所述hlai类分子是hla-a02。
55.根据示例性实施方案54所述的方法，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
56.根据示例性实施方案1至39中任一项所述的人抗体药剂用于治疗或检测与ebv感染有关的病症的用途。
57.一种包含第一抗原结合位点和第二抗原结合位点的双特异性抗体，所述第一抗原结合位点结合ebv-lmp2/hla肽复合物。
58.根据示例性实施方案57所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的特征在于用ebv-lmp2肽clgglltmv(seqidno:1)脉冲的t2细胞中约0.2至约135pm的ec50。
59.根据示例性实施方案57或58所述的双特异性抗体，其中所述第一和/或第二抗原结合位点选自由免疫球蛋白分子、scfv、scfab、fab、fv或它们的组合组成的组。
60.根据示例性实施方案57或58所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合位点被配置为使得它们形成单一多肽链。
61.根据示例性实施方案60所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合位点各自是scfv。
62.根据示例性实施方案60所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二抗原结合位点通过肽接头连接。
63.根据示例性实施方案61或62所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合位点连接至所述第一抗原结合位点的c末端。
64.根据示例性实施方案57至63中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合位点结合选自由t细胞、b细胞、nk细胞、树突细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、间充质干细胞和神经干细胞组成的组的免疫细胞。
65.根据示例性实施方案64所述的双特异性抗体，其中所述第二抗原结合位点结合t细胞上的cd3。
66.根据示例性实施方案57至65中任一项所述的双特异性抗体，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
67.根据示例性实施方案66所述的双特异性抗体，其中所述hlai类分子是hla-a02。
68.根据示例性实施方案67所述的双特异性抗体，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
69.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子全部或部分地编码根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体。
70.一种重组载体，所述重组载体包含根据示例性实施方案69所述的核酸分子。
71.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据示例性实施方案70所述的重组载体或根据示例性实施方案69所述的核酸分子。
72.根据示例性实施方案71所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
73.根据示例性实施方案72所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下项组成的组：大肠杆菌、毕赤酵母属、sf9、cos、hek293、cho和哺乳动物淋巴细胞。
74.根据示例性实施方案73所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。
75.一种组合物，所述组合物包含根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体。
76.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体或根据示例性实施方案75所述的组合物，并且还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
77.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体。
78.一种治疗受试者的以ebv-lmp2/hla肽复合物表达为特征的医学病症的方法，包括施用治疗有效量的根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体；根据示例性实施方案75所述的组合物，或根据示例性实施方案76所述的药物组合物的步骤。
79.根据示例性实施方案78所述的方法，其中所述医学病症是霍奇金病、非霍奇金病或传染性单核细胞增多症。
80.根据示例性实施方案78所述的方法，其中所述医学病症选自伯基特淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌，以及免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。
81.根据示例性实施方案78至80中任一项所述的方法，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
82.根据示例性实施方案81所述的方法，其中所述hlai类分子是hla-a02。
83.根据示例性实施方案82所述的方法，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
84.根据示例性实施方案57至68中任一项所述的双特异性抗体用于治疗或检测与ebv感染有关的病症的用途。
85.一种指导t细胞杀伤表达ebv-lmp2/hla肽复合物的靶细胞的方法，所述方法包括以下步骤
使表达ebv-lmp2/hla肽复合物的一个或多个靶细胞与双特异性抗体接触，所述双特异性抗体包含结合ebv-lmp2/hla肽复合物的第一抗原结合位点和结合t细胞上的cd3的第二抗原结合位点，
所述接触是在足以使所述双特异性抗体已经结合的t细胞介导对所述靶细胞的杀伤的条件和时间下进行的。
86.根据示例性实施方案85所述的方法，其中所述ebv-lmp2肽是或包含clgglltmv(seqidno:1)。
87.根据示例性实施方案85或86所述的方法，其中所述双特异性抗体的所述第一抗原结合位点与所述ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，所述一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。
88.根据示例性实施方案85至87中任一项所述的方法，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
89.根据示例性实施方案88所述的方法，其中所述hlai类分子是hla-a02。
90.根据示例性实施方案89所述的方法，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
91.一种双特异性抗体，包含
第一scfv，所述第一scfv与由hla-a02分子呈递的ebv-lmp2肽clgglltmv(seqidno:1)结合，以及
第二scfv，所述第二scfv与t细胞上的cd3结合，
其中所述双特异性抗体的特征在于用所述ebv-lmp2肽脉冲的t2细胞中约0.2至约135pm的ec50。
92.根据示例性实施方案91所述的双特异性抗体，其中所述第一scfv包含
(a)seqidno:3的轻链可变区和seqidno:5的重链可变区；
(b)seqidno:7的轻链可变区和seqidno:9的重链可变区；
(c)seqidno:11的轻链可变区和seqidno:13的重链可变区；
(d)seqidno:15的轻链可变区和seqidno:17的重链可变区；
(e)seqidno:19的轻链可变区和seqidno:21的重链可变区；
(f)seqidno:23的轻链可变区和seqidno:25的重链可变区；或者
(g)seqidno:27的轻链可变区和seqidno:29的重链可变区。
93.根据示例性实施方案91或92所述的双特异性抗体，其中所述第二scfv连接至所述第一scfv的c末端。
94.根据示例性实施方案91至93中任一项所述的双特异性抗体，其中所述hla-a02分子选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
95.根据示例性实施方案91至94中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的所述第一scfv与所述ebv-lmp2肽中的一个或多个位置处的氨基酸残基直接相互作用，所述一个或多个位置选自由位置1、2、3、4、5、6、7、8以及它们的组合组成的组。
96.根据示例性实施方案91至94中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的所述第一scfv与所述ebv-lmp2肽的至少位置5直接相互作用。
97.根据示例性实施方案91至94中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的所述第一scfv与所述ebv-lmp2肽的至少位置1直接相互作用。
98.根据示例性实施方案91至94中任一项所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体的所述第一scfv与所述ebv-lmp2肽的至少位置8直接相互作用。
99.一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含结合ebv-lmp2/hla肽复合物的人抗体药剂的抗原结合位点。
100.根据示例性实施方案99所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合位点是scfv。
101.根据示例性实施方案99或100所述的嵌合抗原受体，其中所述抗原结合位点由免疫效应细胞表达。
102.根据示例性实施方案101所述的嵌合抗原受体，其中所述免疫效应细胞是t细胞。
103.根据示例性实施方案99至102中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
104.根据示例性实施方案103所述的嵌合抗原受体，其中所述hlai类分子是hla-a*02。
105.根据示例性实施方案104所述的嵌合抗原受体，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
106.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子全部或部分地编码根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体。
107.一种重组载体，所述重组载体包含根据示例性实施方案106所述的核酸分子。
108.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据示例性实施方案107所述的重组载体或根据示例性实施方案106所述的核酸分子。
109.根据示例性实施方案108所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞。
110.根据示例性实施方案109所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自由以下项组成的组：大肠杆菌、毕赤酵母属、sf9、cos、hek293、cho和哺乳动物淋巴细胞。
111.根据示例性实施方案110所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物淋巴细胞是人淋巴细胞。
112.一种组合物，所述组合物包含根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体。
113.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体或根据示例性实施方案112所述的组合物，并且还包含药学上可接受的载剂或稀释剂。
114.一种试剂盒，所述试剂盒包含根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体。
115.一种治疗受试者的以ebv-lmp2/hla肽复合物的表达为特征的医学病症的方法，包括以下步骤
施用治疗有效量的根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体、根据示例性实施方案112所述的组合物，或根据示例性实施方案113所述的药物组合物。
116.根据示例性实施方案115所述的方法，其中所述医学病症是霍奇金病、非霍奇金病或传染性单核细胞增多症。
117.根据示例性实施方案115所述的方法，其中所述医学病症选自伯基特淋巴瘤、免疫抑制性淋巴瘤、弥漫性大b细胞淋巴瘤、与慢性炎症相关的弥漫性大b细胞淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、浆母细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、移植后淋巴增生性疾病、鼻咽癌、胃腺癌、淋巴上皮瘤相关癌，以及免疫缺陷相关平滑肌肉瘤。
118.根据示例性实施方案115至117中任一项所述的方法，其中所述ebv-lmp2/hla肽复合物的hla是hlai类分子。
119.根据示例性实施方案118所述的方法，其中所述hlai类分子是hla-a02。
120.根据示例性实施方案119所述的方法，其中所述hla-a02选自hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06。
121.根据示例性实施方案99至105中任一项所述的嵌合抗原受体用于治疗或检测与ebv感染有关的病症的用途。
122.一种从群体中选择结合由所关注的人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从群体中选择结合所关注的肽/hlai类复合物的一种或多种抗体药剂；以及(b)针对与包含在选自由位置1、位置5、位置8以及它们的组合组成的组的残基处具有一个或多个氨基酸取代的肽的肽/hlai类复合物的结合，筛选来自(a)的所述一种或多种抗体药剂；
其中抗体药剂与包含在位置5处具有取代的肽的肽/hlai类复合物的结合的丧失指示结合由人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂。
123.一种从群体中选择结合由所关注的人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从群体中选择不结合第一肽/hlai类复合物的一种或多种抗体药剂，所述第一肽/hlai类复合物包含在位置5处具有氨基酸取代和/或在所述肽的n末端和/或c末端处具有一个或多个附加氨基酸的肽；以及
(b)针对与第二肽-hlai类复合物的结合，筛选来自(a)的所述一种或多种抗体药剂，所述第二肽-hlai类复合物包含具有所关注的野生型序列的肽；
其中抗体药剂与所述第二肽-hlai类复合物的结合指示结合由人hlai类分子呈递的肽的中心残基的抗体药剂。
124.根据示例性实施方案122或123所述的方法，其中所述肽/hlai类复合物的所述肽是艾普斯登-巴尔病毒(ebv)相关肽。
125.根据示例性实施方案122或123所述的方法，其中所述肽/hlai类复合物是ebv-lmp2/hla-a02复合物。
126.根据示例性实施方案125所述的方法，其中所述hla-a02选自由hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06组成的组。
127.根据示例性实施方案125或126所述的方法，其中所述ebv-lmp2肽是或包含clgglltmv(seqidno:1)。
128.根据示例性实施方案122或123所述的方法，其中所述肽是九聚体肽。
129.根据示例性实施方案122或123所述的方法，其中所述肽是十聚体肽。
130.根据示例性实施方案122至129中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂是人单克隆抗体。
131.根据示例性实施方案122至129中任一项所述的方法，其中所述抗体药剂是人单克隆抗体片段。
132.在提供结合肽/hla复合物的高亲和力人单克隆抗体的方法中，改进包括：
提供与肽/hla复合物中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用或偏向所述一个或多个氨基酸的人单克隆抗体。
133.在提供结合肽/hla复合物的高亲和力人单克隆抗体的方法中，改进包括：
提供与hla结合口袋中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用或偏向该一个或多个氨基酸的人单克隆抗体，其中所述肽/hla复合物不是使用计算机模拟预测方法产生的。
134.在提供包含双特异性抗体(所述双特异性抗体包括第一和第二抗原结合位点，所述第一抗原结合位点结合肽/hla复合物)的高亲和力双特异性抗体组合物的方法中，所述改进包括：
提供至少一个此类第一抗原结合位点作为人单克隆抗体或其片段，来与肽/hla复合物中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用。
135.在提供包含一个或多个抗原结合位点的嵌合抗原受体组合物的方法中，其中所述一个或多个抗原结合位点中的至少一个结合肽/hla复合物，所述改进包括
提供与hla结合口袋中的肽中心处的一个或多个氨基酸直接相互作用的人抗体药剂的抗原结合位点。
136.根据示例性实施方案135所述的方法，其中所述嵌合抗原受体组合物由免疫效应细胞表达。
137.根据示例性实施方案136所述的方法，其中所述免疫效应细胞是t细胞。
138.根据示例性实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述hla是i类hla分子。
139.根据示例性实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述肽是九聚体肽。
140.根据示例性实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述肽是十聚体肽。
141.根据示例性实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述肽是艾普斯登-巴尔病毒(ebv)相关肽。
142.根据示例性实施方案132至137中任一项所述的方法，其中所述肽/hla复合物是ebv-lmp2/hla-a02复合物。
实施例
提供以下实施例是为了向本领域的普通技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。除非另有说明，温度以摄氏度表示，并且压力处于大气压或接近大气压。
实施例1.生物素化的肽/hla-a*02:01复合单体的产生
此实施例展示在识别由i类人mhc分子呈递的ebv相关肽的抗体和多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)的开发和鉴定中mhc-肽复合物的产生。具体地，此实施例具体描述了单体ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01复合物的产生，该复合物在用于产生识别由人类hla-a02呈递的ebv-lmp2肽的抗体(即，抗体药剂和全长igg)和双特异性抗体的以下实施例中采用。
简而言之，使用本领域已知的方法制备生物素化的肽/hla-a*02:01复合物单体(参见例如，altman,j.d.andm.m.davis,2003,mhc-peptidetetramerstovisualizeantigen-specifictcells.curr.protoc.immunol.chapter17:unit173[altman,j.d.和m.m.davis，2003，用于使抗原特异性t细胞可视化的mhc-肽四聚体，免疫学现代方法，第17章:第173单元])。将编码全长人β-2微球蛋白(β2m)的dna通过genewiz合成，并克隆到载体pet-27b中。将bira底物肽(bsp)添加到hla-a*02:01细胞外结构域(ecd)的c末端。将编码hla-a*02:01ecd-bsp的dna通过genewiz合成，并克隆到载体pet-27b中。将表达人β2m和hla-a*02:01ecd-bsp的载体单独转化到大肠杆菌bl21中，并从细菌培养物中作为包涵体分离。用人β2m和hla-a*02:01ecd-bsp复性肽配体ebv-lmp2a(clg)(全九聚体序列clgglltmv；seqidno:1)以形成单体ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物。将折叠的肽/hla-a*02:01单体通过超滤浓缩，并通过尺寸排阻色谱法进一步纯化(图3)。纯化的肽/hla-a*02:01单体还通过sds-page可视化(图4)，并通过bira介导的酶促反应进行生物素化，随后通过高分辨率阴离子交换色谱进行纯化。将生物素化的肽/hla-a*02:01单体贮藏在-80℃下的pbs中。
将hiprep26/60sephacryls-300hr用hyclonedulbecco的磷酸盐缓冲盐水溶液(赛默飞世尔科技公司，产品目录号sh3002802)以1.5倍柱体积平衡。将未纯化的样品负载并用一个柱体积洗脱。如图3所示，由错误折叠的聚集体组成的第一峰在负载后于大约102.24ml处洗脱。在201.24ml处观察到了对应于正确折叠的mhc复合物的峰。最后，在254.85ml处观察到了由游离β2m组成的峰。
上述纯化的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01复合物在以下实施例中用于产生在hla-a02情况下识别lmp2肽的人抗体组分。
实施例2.特异于ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01复合物的噬菌体scfv的筛选
此实施例展示在人mhci类分子的情况下特异于ebv-lmp2肽的人抗体药剂的构建。具体地，此实施例展示了人scfv的产生和全长人igg的随后产生，全长人igg结合具有由人hla-a02分子呈递的序列clgglltmv(seqidno:1)的ebv-lmp2九聚体肽。lmp2在ebv感染的b细胞和鼻咽和胃上皮细胞中均有表达。因此，这种人抗体药剂可用于ebv相关疾病和恶性肿瘤的治疗和诊断。
简而言之，由优瑞科生物科技公司(αtm噬菌体展示)构建的人scfv抗体噬菌体展示文库(10×1010个克隆)被用于选择特异于ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的人单克隆抗体。为了减少通过将mhci复合物固定在塑料表面上引入的该蛋白质复合物的任何构象变化，使用溶液淘选代替传统的平板淘选。在溶液淘选中，首先将生物素化的抗原在用pbs缓冲液进行延长洗涤后与人scfv噬菌体文库混合，然后通过磁力架用链霉抗生物素蛋白缀合的dynabeadsm-280将抗原-scfv抗体噬菌体复合物下拉。结合的克隆被洗脱，然后用于感染大肠杆菌xl1-blue。噬菌体克隆在细菌中表达，然后经纯化。进行3至4轮淘选以富集具有与ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的特异性结合的scfv噬菌体克隆。表4阐述了对针对ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的噬菌体淘选的概述。通过使用生物素化的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01复合物进行elisa测定来确定阳性克隆(参见例如，图5)。
表4
使用tap缺陷型hla-a*02:01+细胞系t2，通过流式细胞术进一步测试阳性克隆对活细胞表面上的肽/hla-a02复合物的结合。t2细胞仅呈递外源性肽并常规用于在hla-a02分子上呈递肽。简而言之，将t2细胞在含有20μg/ml的β2m的无血清rpmi-1640培养基中用50μg/ml的lmp2肽(clgglltmv；seqidno:1)脉冲过夜。然后将细胞用纯化的scfv噬菌体克隆进行染色，随后用小鼠抗m13单克隆抗体以及r-pe缀合的马抗小鼠igg(vectorlabs公司)进行染色。每个染色步骤在冰上使用约30至60分钟的孵育进行。在每个染色步骤之间将细胞洗涤两次。图6阐述了噬菌体克隆与负载有ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的t2细胞的示例性结合。
在使用elisa测定筛选的281个克隆中，鉴定出了125个elisa阳性克隆。在鉴定出的125个阳性克隆中，分离并鉴定出了80个独特克隆。在80个独特克隆中，54个通过elisa和facs被鉴定为在蛋白质水平和细胞表面水平上均特异性结合靶复合物。使用丙氨酸步移确认克隆对ebv-lmp2肽中的多个位置的特异性(参见例如，liu,zetal.,1999,j.mol.recognit.12(2):103-11[liu,z等人，1999，分子识别杂志，12(2):103-11]；weiss,gaetal.,2000,proc.nat.acad.sci.u.s.a.97(16):8950-4[weiss,ga等人，2000，美国科学院院刊，97(16):8950-4]；morrison,klandgaweiss,2001,curr.opin.chem.biol.5(3):302-7[morrison,kl和gaweiss，2001，化学生物学新见，5(3):302-7])。简而言之，lmp2肽(clgglltmv；seqidno:1)在位置1、5或8处用丙氨酸残基取代。用50μg/ml的丙氨酸突变肽脉冲t2细胞。通过流式细胞术测量结合。所选克隆的重链和轻链cdr的dna和氨基酸序列分别列于表5和表6中。
表5
表6
抗体克隆38和63展示了对肽位置5至肽位置8(p5-p8)的选择性结合并具有几乎相同的重链(约75％的氨基酸同一性)。此外，抗体克隆38和63展示了相同的重链cdr1和cdr2序列和相似的cdr3序列；并在轻链cdr内共享一些共同的残基。抗体克隆21和26展示了对肽位置8(p8)的选择性结合并具有相似的重链(约88％的氨基酸同一性)，而cdr1和cdr2相同，并且cdr3相似。抗体克隆21和26的轻链也是相似的。抗体克隆40和61展示了对肽位置1(p1)的选择性结合，并且具有约67％的同一性和总体上相似的cdr。抗体克隆77展示了对肽位置1到肽位置5(p1至p5)的选择性结合并且与抗体克隆63的轻链具有序列相似性(约40％的同一性)。将抗体克隆21、26、40和61命名为i型tcr模拟物，而将克隆38和63命名为ii型tcr模拟物。
总的来说，此实施例展示了与在人mhci类分子的情况下呈递的ebv相关肽结合的i型和ii型tcr样单克隆抗体的成功产生。具体地，此实施例描述了选择性靶向由人hla-a02分子呈递的肽的中心区域(例如，肽位置5)的抗体的产生。如下所述，此类抗体对ebv+细胞系具有高度特异性和细胞毒性效力，并且可用于构建多特异性结合剂(例如，双特异性抗体)。
实施例3.使用scfv片段构建全长单克隆抗体
此实施例展示了使用实施例2中所述的经选择的人scfv来构建全长抗体。具体地，此实施例特别地描述了使用在表5和表6中出现的经选择的人scfv克隆构建全长人igg(例如，igg1)。
简而言之，在hek293和中国仓鼠卵巢(cho)细胞系中产生所选噬菌体克隆的全长人igg1，如前所述(tomimatsu,k.etal.,2009,biosci.biotechnol.biochem.73:1465-9[tomimatsu,k.等人，2009，生物科学、生物技术和生物化学，73:1465-9])。将抗体可变区亚克隆到具有同源人λ(λ)或κ(κ)轻链恒定区和人igg1恒定区序列的哺乳动物表达载体中。
人cλdna(seqidno:114)
aagcctaaggccaaccctaccgtgaccctgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctcgtgtgcctgatctccgacttctaccctggcgccgtgaccgtggcctggaaggctgatggatctcctgtgaaggccggcgtggaaaccaccaagccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccctgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccaagtgacccacgagggctccaccgtggaaaagaccgtggctcctaccgagtgctcctag
人cλ氨基酸(seqidno:115)
qpkanptvtlfppsseelqankatlvclisdfypgavtvawkadgspvkagvettkpskqsnnkyaassylsltpeqwkshrsyscqvthegstvektvaptecs
人cκdna(seqidno:116)
accgtggccgctccctccgtgttcatcttcccaccttccgacgagcagctgaagtccggcaccgcttctgtcgtgtgcctgctgaacaacttctacccccgcgaggccaaggtgcagtggaaggtggacaacgccctgcagagcggcaactcccaggaatccgtgaccgagcaggactccaaggacagcacctactccctgtcctccaccctgaccctgtccaaggccgactacgagaagcacaaggtgtacgcctgcgaagtgacccaccagggcctgtctagccccgtgaccaagtctttcaaccggggcgagtgctag
人cκ氨基酸(seqidno:117)
tvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec
人igg1dna(seqidno:118)
gtctcctcagcttccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaggttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga
人igg1氨基酸(seqidno:119)
astkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
通过电泳在还原和非还原条件下测量纯化的全长igg1抗体的分子量(图7)。总的来说，此实施例展示了使用特异于ebv-lmp2(clg)/hla-a02的所选scfv的可变区成功构建和表达全长人igg1。
实施例4.使用单链抗体组分构建多特异性结合剂
此实施例展示了使用特异于由人mhci类分子呈递的ebv-lmp2肽的scfv片段构建多特异性结合剂。具体地，此实施例特别地展示了具有在人hla-a02分子的情况下与ebv-lmp2肽(clgglltmv；seqidno:1)结合的第一抗原结合位点和与t细胞上的cd3结合的第二抗原结合位点的双特异性抗体的构建。因此，此实施例说明，在一些实施方案中，使用包含如本文所述的抗体组分的多特异性结合剂，可以指导t细胞杀伤经由人mhci类分子(例如hla-a02；参见例如brischwein,k.etal.,2006,mol.immunol.43:1129-43[brischwein,k.等人，2006，分子免疫学，43:1129-43])在表面上呈递肽(例如，ebv-lmp2)的靶细胞。
简而言之，使用单链形式构建双特异性抗体构建体，使得特异于ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的scfv在其c末端与特异于人cd3(即，cd3ε；dna：seqidno:123；氨基酸：seqidno:124)的scfv连接。编码ebv-lmp2(clg)特异性scfv和人cd3特异性scfv的dna片段通过genewiz合成，并被亚克隆到哺乳动物表达载体pgsn-hyg(优瑞科生物科技公司)中。在双特异性构建体的c末端插入十六组胺标签以用于纯化和检测。用双特异性抗体表达载体转染hek293细胞以进行瞬时表达，并收集含有分泌的双特异性抗体分子的上清液。使用用双特异性抗体表达载体转染并在使用基于谷氨酰胺合成酶(gs)的系统的蛋氨酸亚砜酰亚胺(msx)药物选择中生长的中国仓鼠卵巢(cho)细胞实现双特异性抗体分子的稳定表达。收集含有分泌的抗ebv-lmp2(clg)双特异性抗体分子的cho细胞上清液，并使用fplcakta系统、使用histraphp柱(ge医疗公司)进行纯化。cho细胞培养物被澄清并负载到具有低咪唑浓度(20mm)的柱上，并用等度高咪唑浓度洗脱缓冲液(500mm)洗脱与柱结合的抗ebv-lmp2(clg)双特异性抗体分子。通过电泳在非还原条件下测量纯化的抗ebv-lmp2(clg)双特异性抗体分子的分子量(图8)。
总的来说，此实施例展示了具有特异于由hla-a02分子呈递的ebv-lmp2肽的第一抗原结合位点和特异于cd3的第二抗原结合位点的双特异性分子的成功构建。在下面的实施例中描述了这种双特异性分子的进一步表征。
实施例5.由tcr样抗ebv-lmp2(clg)igg1抗体介导的t2细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
此实施例展示，由抗ebv-lmp2(clg)特异性scfv制备的全长igg1抗体可以特异性识别靶细胞表面上呈递的ebv-lmp2肽并介导对经由人hla-a02分子呈递ebv-lmp2肽的靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)。淋巴母细胞t2细胞系是t1细胞系(atcccrl-1991)和hla-a*02:01+tap1-的变体。t2细胞不能呈递内源性肽，但当与t2细胞一起温育时可呈递外源性肽。由于t2细胞不能自然产生内源性肽，所以当与外源肽一起温育时可以加入β2m。因此，t2细胞适用于转染，并常规用于mhci类抗原的抗原加工和t细胞识别(参见例如，salter,r.d.etal.,1985,immunogenetics21:235-246[salter,r.d.等人，1985，免疫遗传学，21:235-246])。
简而言之，将t2细胞用100μg由hla-a*02:01呈递的对照肽(ymldlqpet，ic50＝7.5；seqidno:120)或ebv-lmp2肽(clgglltmv，ic50＝95.6；seqidno:1)以及外源性β2m在无血清imdm培养基中脉冲过夜。然后将细胞以5μg/ml与经选择的全长igg1抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01抗体在4℃温育1小时。使用pe标记的二抗抗人fc抗体，并通过流式细胞术分析细胞。
对于流式细胞术，将t2细胞洗涤一次以去除多余的肽，并在4℃与5μg/ml的给定抗体(或同型匹配的对照)一起温育。利用抗fcpe标记的二抗，并且使细胞在facscalibur流式细胞仪中运行，使同型对照处于为5的mfi处。数据和覆盖使用flowjo软件第6版进行制备。示例性结果示于图9中。
对于细胞毒性测定，将t2细胞如上所述温育，在早晨之后收集并用100μci的51cr标记一小时，然后以每孔5×103的密度接种在具有指定浓度的每种单克隆抗体的圆底96孔板中。将用cd16(fcγriiia)的158v/v纯合变体转染的nk92细胞用作效应细胞，其中e:t比率为20:1。将平板在37℃温育四小时，收集上清液，然后用闪烁计数器分析。使用prism-graphpad软件将结果绘制成图。使用以下公式计算细胞毒性：特异性裂解％＝((实验裂解-自发释放)/(最大裂解-自发释放))。通过在sds上温育靶细胞获得最大裂解；自发释放代表用单独的培养基温育的靶细胞。示例性结果示于图9中。
如图9所示，所选的全长igg1抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01抗体中的每一个均表现出与由t2细胞表面上的hla-a02分子呈递的ebv-lmp2肽的结合(直方图，每个配对的左侧)，而没有观察到所述抗体中的任何抗体与对照肽的结合。此外，adcc对于可比较水平的每种抗体是明显的(特异性裂解％，每个配对的右侧)，并与所观察到的每种抗体的肽结合相关
总的来说，这些数据证明了实施例3中描述的全长igg1抗体保留对亲本抗体组分(即scfv)的ebv-lmp2肽的特异性。此外，这些全长抗体能够有效介导对通过表面上的hla-a02分子呈递ebv-lmp2肽的靶细胞(例如，t2细胞)的adcc。
实施例6.tcr样抗ebv-lmp2(clg)igg1抗体的亲和力测量
此实施例证实实施例3中描述的全长igg1抗体结合由hla-a02分子在t2细胞表面上呈递的不同浓度的ebv-lmp2肽。
简而言之，将1×106个t2细胞在1ml无血清imdm培养基中重悬，负载不同浓度的ebv-lmp2肽(在0.0001至100μg/ml的范围内)和外源性β2m(25μg/ml)，并在37°℃下温育过夜。然后将细胞与5μg/ml的所选抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg1抗体一起温育，并使用流式细胞术分析。绘制使用所述抗体中的每种抗体获得的mfi对照肽浓度的图。示例性结果示于图10中。
如图10所示，所述抗体中的每种抗体以不同的亲和力与经由hla-a02在t2细胞表面上呈递的ebv-lmp2肽结合。将结果归一化以确定抗体结合的差异，抗体显示出了一致的结合。还使用biacore测定了每种抗体的亲和力(表7；nb：未结合)。
表7
实施例7.由抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg抗体介导的ebv转化细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)
此实施例描述了由抗ebv-lmp2(clg)特异性scfv制备的全长igg1抗体介导对用艾普斯登-巴尔病毒(ebv)转化的靶细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)的潜能。具体地，此实施例特别地描述了在实施例3中描述的所选抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg1抗体不介导对ebv转化细胞的adcc。
简而言之，通过用来自b95-8狨猴细胞的病毒上清液转化来自健康供体的pbmc产生hla-a*02:01+/ebv+b淋巴母细胞系(blcl)，bv-。此经工程化的blcl细胞系被用作使用不同浓度的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg1抗体和nk92细胞作为效应物(如上所述)的基于铬的细胞毒性测定中的靶标。因为ebv转化的blcl是cd20+，所以利用利妥昔单抗(抗cd20抗体；参见例如maloney,d.g.etal.,1997,blood90(6):2188–95[maloney,d.g.等人，1997，血液，90(6):2188-95])作为阳性对照。此测定中还包括同型匹配的阴性对照。示例性结果示出于图11中。
如图11所示，对
实施例8.使用肽脉冲的t2细胞进行t细胞细胞毒性测定
此实施例展示了为了确定负载肽的t2细胞对由具有结合ebv-lmp2/hla-a02肽复合物的第一抗原结合位点和结合t细胞的第二抗原结合位点的多特异性结合剂介导的t细胞细胞毒性的敏感性而进行的实验。具体地，此实施例特别地证明，具有结合ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物的第一抗原结合位点和结合cd3的第二抗原结合位点的双特异性抗体有效介导在飞摩尔范围内对负载肽的t2细胞的t细胞细胞毒性。
简而言之，通过使用实施例4中所述的不同浓度的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体构建体来测试负载肽的t2细胞(如上所述)对t细胞细胞毒性的敏感性。将靶t2细胞用100μg/ml的lmp2(clgglltmv；seqidno:1)或对照(ymldlqpet；seqidno:120)肽以及20μg/ml的人β2m脉冲过夜。测试每种双特异性抗体对lmp2肽的特异性和亲和力(表8)。使用biacore技术测量的每种双特异性抗体对ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01的示例性亲和力测量值列于表9中。使用ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体对用ebv-lmp2肽脉冲的t2细胞的示例性t细胞细胞毒性示于图12中。
表8
表9
如表8所示，每种双特异性抗体特异于lmp2肽，其中ec50在0.4至约133pm的范围内。此外，每种双特异性抗体具有相似的亲和力(表9)，并以肽特异性方式有效介导对t2细胞的t细胞杀伤(图12)。
实施例9.使用ebv转化的blcl进行t细胞细胞毒性测定
此实施例证实，本发明的多特异性结合剂可以使用多种不同的ebv转化细胞介导对呈递ebv肽的ebv转化靶细胞的t细胞细胞毒性。具体地，此实施例特别地描述了所选的ebv-lmp2(clg)/hla-a02xcd3双特异性抗体介导对一组hla-a02+ebv转化的blcl的t细胞细胞毒性。
在使用不同浓度的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体的细胞毒性测定中，使用由脐带血供体产生的激活的t细胞(atc)测试由b95-8绒猴细胞系体外产生并且预先通过流式细胞术和测序法对hla-a*02:01状态进行分型的一组七种不同blcl。使用脐带血细胞是因为它们对ebv来说是原始的，因此消除了来自培养物中存在的抗原特异性t细胞的交叉反应性的可能性。
简而言之，blcl由健康供体产生(如上所述)，然后在10％fbs中培养。对于细胞毒性测定，将1×106个blcl与100μci的51cr一起在37℃下温育60分钟，如别处所述(xu,h.etal.,2015,cancerimmunol.res.3(3):266-77[xu,h.等人，2015，癌症免疫学研究，3(3):266-77])。然后将blcl洗涤两次，并以每孔5×103的密度接种在圆底96孔板中。将每种双特异性抗体以e:t比为10:1的指定浓度加入，并在37℃下温育四小时。收集上清液并使用γ计数器读数。如上所述计算特异性裂解。为了产生效应细胞，从ny血库获得脐带血细胞并使用聚蔗糖梯度(ficollgradient)进行处理。通过使用cd3微珠(美天旎生物技术公司(miltenyibiotech))的磁性柱，富集所得的富含淋巴细胞的群体以用于cd3表达。然后将细胞用cd3/cd28磁珠(生命技术公司)接种7天(x2)以产生atc。示例性结果示出于图13a-d和表10中(双特异性抗体根据它们对ebv-lmp2肽的氨基酸的特异性分组)。
表10
如图13a-d所示，每种双特异性抗体对ebv转化细胞的细胞毒性变化，其中lmp2-38xcd3表现出最高的细胞毒性。lmp2-38xcd3和lmp2-63xcd3双特异性抗体显示出对hla-a*02:01+细胞的最高特异性，而若干种其他双特异性抗体(lmp2-21xcd3、lmp2-26xcd3、lmp2-40xcd3和lmp2-77xcd3)显示出与至少一个hla-a*02:01阴性细胞的交叉反应性。此外，靶向ebv-lmp2肽的残基5至8的双特异性抗体(表10)表现出对hla-a*02:01+ebv+细胞的最高特异性。
总的来说，此实施例证实了ebv-lmp2(clg)/hla-a02xcd3双特异性抗体有效介导对一组hla-a02+ebv转化的blcl的t细胞细胞毒性。
实施例10.在blcl中由hla-a02呈递的lmp-2肽的表征
此实施例展示了使用ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体在blcl中表征由hla-a*02:01呈递的lmp2肽(clgglltmv；seqidno:1)示例性结果示于图15和图16中。
如图15所示，靶向ebv-lmp2肽(例如lmp2-21、lmp2-26)的位置8的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01igg1抗体显示出对lmp2+hla-a*02:01+细胞的最小细胞毒性。有趣的是，当针对经t2肽脉冲的细胞进行测试(如上所述)时，这些相同的构建体显示出最低的ec50(最高亲和力)。为了确定这种关系的潜在原因，用靶向不同肽位置的所选抗体对hla-a*02:01+/ebv+blcloko细胞进行染色，以确定它们与hla-a*02:01+blcl的结合。通过流式细胞术，靶向ebv-lmp2肽的位置1的抗体显示出对blcl的最小结合至不结合，与在细胞毒性测定中观察到的结果相关。使用hla-a*02:01–细胞系kbab-1作为阴性对照(图15，下方小图)。
如图16所示，当将blcloko细胞用100μg/ml的ebv-lmp2肽脉冲过夜并用相同的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01特异性igg1抗体染色时，靶向ebv-lmp2肽的位置8的构建体的结合被重建。本发明人推断这种差异是由于blcl中clgglltmv肽的呈递差异所致。
实施例11.由不同的hla-a02亚等位基因呈递的ebv-lmp2肽的识别
此实施例证明，当ebv-lmp2肽由hla-a02分子的多个不同的亚等位基因呈递时，具有ebv-lmp2肽的特异性位置5至8的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体可以结合该ebv-lmp2肽。此实施例采用人造抗原呈递细胞(aapc)，aapc是3tc小鼠成纤维细胞，其已经被工程化以稳定地表达特定hlai类等位基因以及共刺激分子。
简而言之，将表达hla-a02的亚等位基因(hla-a*02:01、hla-a*02:02、hla-a*02:03、hla-a*02:04、hla-a*02:05和hla-a*02:06)的六种不同aapc用100μg/ml的ebv-lmp2肽在37℃下脉冲过夜，并用于使用靶向ebv-lmp2肽的位置5至8中的氨基酸的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体的细胞毒性测定(如上所述)中。在用这些相同的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体作为全长igg1抗体染色后，通过流式细胞术分析这些相同的细胞。为了确保细胞毒性的任何差异不是由于hla-i类分子的表达差异引起的，使用pan-hla抗体(w6/32)通过流式细胞术来表征aapc对hla分子的表达。示例性结果示于图17中。
如图17所示，若干种双特异性和igg1抗体结合由不同hla-a02等位基因呈递的肽。具体地，此实施例证明，结合ebv-lmp2肽的位置5至8的ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体对hla-a*02:02和hla-a*02:06也具有反应性。
为了证明这些细胞不与未负载外源肽的aapc交叉反应，将hla-a*02:01细胞aapc与低浓度(0.0001μg/ml)外源性肽一起温育或在没有外源性肽的情况下温育后，用作(上述)细胞毒性测定中的靶细胞，并使用hla-a*02：01细胞aapc作为靶细胞)或不含外源性肽，并使用与ebv-lmp2肽的不同位置结合的所选lmp2(clg)/hla-a*02:01双特异性抗体用atc进行测试。它们还使用所选的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01igg1抗体进行染色并通过流式细胞术进行分析。示例性结果示于图18中。
如图18所示，aapc需要比经肽脉冲的t2细胞更高的肽浓度以由双特异性或全长igg1抗体识别。此外，此实施例显示，在所测试的双特异性和igg1抗体之间观察到了类似的细胞毒性。
实施例12.i型tcr模拟抗体的亲和力成熟
此实施例显示了抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02抗体的亲和力成熟。具体地，此实例特别地展示了通过将随机突变掺入所选的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02抗体(lmp2-38)中以产生一系列抗体变体，随后使用单体ebv-lmp2(clg)/hla-a02筛选和表征这些抗体变体。
使用αtm噬菌体展示(如上所述)，将lmp2-38igg1抗体随机突变，并用单体ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01进行选择。共筛选出581个克隆，其中111个特异于肽-hla复合物。在特异于肽-hla复合物的111个克隆中，34个被确定为独特的结合物。十一个表现出与负载肽的t2细胞的强结合，即[负载p19肽的t2细胞噬菌体抗体facs信号]/[阴性对照facs信号]<5；十七个表现出t2细胞交叉结合：[负载p19肽的t2细胞噬菌体抗体facs信号]/[阴性对照facs信号]>5。总共9个克隆显示出相对于亲本抗体的改善，即[lmp2-38亲本ic50]/[突变的独特噬菌体抗体ic50]>2，并且24个克隆显示为没有改善，即[ext005-38亲本ic50]/[突变的独特噬菌体抗体ic50]<2。示例性结果示于表11(细胞表面结合：[特异性噬菌体抗体facs信号]/[阴性对照facs信号]<2；+：[特异性噬菌体抗体facs信号]/[阴性对照facs信号]＝2-10；++：[特异性噬菌体抗体facs信号]/[阴性对照facs信号]>10；nd：未测定；亲和力改善：[lmp2-38亲本ic50]/[突变的独特噬菌体抗体ic50]；p19肽：19种内源性对照肽的混合物)和表12(biacore公司；nd：未测定)中。
表11
表12
lmp2-38的亲和力改善伴随着特异性的牺牲，即当亲和力改善>1.0时，观察到许多抗体克隆与p19肽的交叉反应性。通过elisa，四个抗体克隆显示出相对于lmp2-38亲本抗体的边际结合改善(1.29、1.37、1.58、1.67)，同时保留特异性。当通过spr(biacore公司)详细分析这些克隆的结合动力学时，亲和力增长不是稳健的：kon的范围为1.05倍至3.44倍，并且koff的范围为1.36倍至2.07倍，从而导致ka提高1.62倍至6.2倍(表12)。所选的亲和力成熟的抗ebv-lmp2(clg)/hla-a02igg1抗体克隆的vh和vl区中的示例性突变示于表13中(氨基酸编号如kabat中；参见例如e.a.kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,fifthedition,1991,nih[e.a.kabat等人，受免疫学关注的蛋白质的序列，第五版，1991，nih])。
表13
本实施例中提供的数据表明，对于ii型tcr模拟抗体，ka的亲和力成熟，特别是koff的亲和力成熟可能是困难的。这类似于对肽的中心位置(即，在位置5周围)具有特异性并且通常即使进行重复的体外或体内攻击时也具有低亲和力(μm)的tcr。基于肽-hla-a02复合物的晶体结构，肽p4-6的中心(当锚定在p2和p9处时)与mhci类蛋白接触的次数最低(madden,d.r.etal.,1993,cell75:693-708[madden,d.r.等人，1993，细胞，75:693-708])。这将允许位于肽的位置p5附近的中心处具有高度构象灵活性，该中心通常是最少锚定的残基。对肽位置p5区域的tcr或抗体识别将导致此区域的熵显著损失。结构研究的报道已经证明，结合的高熵成本与蛋白质-配体相互作用的低亲和力有关(thorpe,i.f.andbrooks,c.l.,2007,proc.natl.acad.sci.u.s.a.104:8821-6[thorpe,i.f.和brooks,c.l.，2007，美国科学院院刊，104:8821-6])。本发明的发明人已经认识到，在一些实施方案中，基于本文提供的数据，存在对产生ii型tcr样单克隆抗体的固有亲和力障碍。
实施例13.产生tcr模拟单克隆抗体的选择策略
此实施例展示了用于开发tcr样单克隆抗体，特别是ii型tcr模拟物的多种选择策略。
可以使用两种选择策略有效地产生特异于中央表位(当锚定在p2和p9处时，在肽位置p5处；参见例如图19和图20)的ii型tcr样单克隆抗体。
在第一策略(图19)中，首先阴性选择候选抗体文库以结合不相关的肽-mhc复合物。然后阳性选择剩余的文库以结合所关注的肽/mhc复合物。然后利用第二筛选步骤，使用在位置p1、p5或p8处ala取代的肽来区分i型(与肽末端结合的抗体)对照ii型(在位于位置p5的肽中心附近结合的抗体)。仅失去与p1-ala或p8-ala取代的肽结合的抗体被分类为i型。失去与p5-ala肽的大部分结合的抗体被分类为ii型。
在第二策略(图20)中，首先阴性选择抗体文库以结合具有p5-ala取代的肽和在肽的n或c末端含有附加的天然侧接残基的肽。然后阳性选择剩余的抗体候选文库以结合野生型靶肽/mhc复合物。延伸肽的使用确保只有天然的中心表位(以p5位置为中心)将被最终抗体候选物结合。
也可以采用上述策略的组合。相同的策略也可以利用除ala以外的其他非天然氨基酸取代。在p1、p5或p8的原始序列是丙氨酸的情况下，可以使用不同的氨基酸。在锚定位点为p1和p8的情况下，中心位置将是p(1+3)＝p4，并且阳端基环末端(juxtaterminal)位置将是p(8-1)＝p7。可用于十肽的策略汇总于图21和图22中。
实施例14.抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01克隆的表位作图
此实施例记录了结合ebv-lmp2/hla肽复合物的某些如本文所述的抗体药剂的详细结合特征。此外，本实施例中提供的数据证实了与例如肽-mhci类(例如，hla-a02)结合口袋中的ebv-lmp2肽的中心部分内的位置的结合显著性。本文提供的数据还记载了模拟tcr结合的一种或多种属性的某些药剂的结合特征。不希望受任何特定理论束缚，本公开内容提出，显示出以与跨残基p3至p8的ala取代位置的结合丧失的倒钟形分布为特征的结合的抗体药剂可能是特别受关注的。
具体地，本实施例描述了用与ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01肽复合物结合的如本文所述的全长igg1抗体进行的详细的表位作图研究。首先，测试了在位置p1、p2、p3、p4、p5、p6、p7、p8或p9中的每一者处具有丙氨酸取代的ebv-lmp2(clg)肽对hla-a*02:01的负载效率(图23)。将t2细胞用clg野生型肽(seqidno:1)或p1至p9ala取代的肽中的每一种脉冲，然后染色以与抗体bb7.2结合，抗体bb7.2显示出与处于负载肽状态下的hla-a*02:01的增强结合。通过流式细胞术检测bb7.2的结合(图23)。图23中呈现的流式细胞术数据显示，位置p3至p9处的ala取代被良好接纳，并显示出与野生型clg肽相当的bb7.2结合，而位置p1或p2处的ala取代导致不能负载到hla-a*02:01上。
由于clg肽位置p1和p2处的ala取代导致到hla-a*02:01的负载的损失，并且因为位置p2和p9是远离t细胞受体或抗体被掩埋的锚定残基(如晶体结构pdb3rew中所例示)，所以使用位置p3、p4、p5、p6、p7和p8处的ala取代肽进行对克隆21、26、38、61、63和77的igg抗体的详细表位作图(图24)。图24a示出了抗ebv-lmp2(clg)/hla-a*02:01igg构建体与负载有野生型clg肽或在位置p3至p8处ala取代的clg肽的hla-a*02:01的结合，如通过流式细胞术检测的。在图24b中，将igg构建体与ala取代的肽/hla-a*02:01复合物的结合针对相应igg克隆与野生型clg/hla-a*02:01复合物的结合归一化。图24a和图24b中呈现的数据提供了详细的表位分析，包括通过评估与在实施例2和表10中未测试的位置处具有丙氨酸取代的肽的结合，其中初始表位作图使用仅在clg肽位置p1、p5和p8处的丙氨酸取代进行。
图23中的数据证明，肽位置p1处的ala取代禁止负载到hla-a*02:01上，并且图24a和图24b中呈现的数据提供了对所测试的lmp2克隆的结合特征的详细洞察。因此，本文提供的数据表明和/或证实，高亲和力的lmp2-21和lmp2-26(它们共享强序列同源性)主要结合clg肽的c末端，而lmp2-38和lmp2-63(它们也共享强序列同源性)主要结合clg肽的中心。
重要的是，lmp2-38和lmp2-63与跨所有残基p3至p8的ala取代位置的结合丧失的倒钟形分布与天然tcr与hlai类分子的接触能(范德瓦尔斯)的倒钟形分布(如图1所示)高度相似。因此，本公开文献记载了接近地模拟tcr的lmp2-38和lmp2-63的各种结合特征。不希望受任何具体理论束缚，本公开提出lmp2-38和lmp2-63可以以跨天然tcr的mhci类口袋的类似交叉角度结合。本文提供的表位作图数据记录，lmp2-40也主要结合clg肽的中心，但具有比观察到的lmp2-38和lmp2-63的分布更窄的分布，以残基p4至p8为中心。lmp2-61和lmp2-77也显示在clg肽中心附近的表位，但具有更平坦的分布(不是倒钟形状)并具有弱总体结合。
实施例15.二聚体双特异性抗体药剂的产生
此实施例展示了根据本公开内容提供的教导构建特异于由人mhci类分子呈递的ebv-lmp2肽和cd3的二聚体双特异性抗体。
不受理论束缚，可以设想，至少在一些实施方案中，二聚化形式可以稳定和/或以其他方式为双特异性(或其他多特异性)抗体药剂形式提供有用的属性。仅举几个示例，在一些实施方案中，二聚体双特异性形式可以改善和/或简化对一种或多种结合和/或药代动力学性质的分析，可能至少部分是由于其较大的尺寸。
基于抗体的结合特异性和总体亲和力，选择五种前导抗体lmp2克隆(26、38、38-2、40和61)以二聚体双特异性形式进行分析。基于在ahmedetal(2015)oncoimmunology4,e989776[ahmed等人(2015)，肿瘤免疫学，4，e989776]中所述的形式，将五种前导抗体lmp2克隆重新格式化为二聚双特异性抗体(dibsab)构建体。为了产生lmp2克隆26、38、38-2、40和61的二聚体bsab，对实施例4中描述的lmp2xcd3bsab进行了两种改变。首先，将抗cd3scfv(seqidno:124)中的游离半胱氨酸突变为丝氨酸(seqidno:125)，并且将基于转录因子hnf1α的二聚化标签加入到抗cd3scfv的c末端，随后加入6x-his标签(seqidno:126)。
具有游离半胱氨酸至丝氨酸突变的抗cd3scfv氨基酸序列(seqidno:125)
dvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftrytmhwvrqapgqglewigyinpsrgytnyadsvkgrftittdkststaymelsslrsedtatyycaryyddhysldywgqgttvtvssgegtstgsggsggsggaddivltqspatlslspgeratlscrasqsvsymnwyqqkpgkapkrwiydtskvasgvparfsgsgsgtdysltinsleaedaatyycqqwssnpltfgggtkveik
基于hnf1α的同型二聚化标签序列(seqidno:126)
rtplgdtthtsgmvsklsqlqtellaallesglskealiqalgegsggaphhhhhh
所得的dibsab是高度纯的(97-100％)，如图25中显示的尺寸排阻色谱数据所示。
实施例16.使用肿瘤细胞系对某些所提供的抗体药剂进行的t细胞细胞毒性测定
此实施例表明，本文提供的某些抗体药剂可介导对肿瘤细胞的t细胞细胞毒性。具体地，此实施例特别地描述，如实施例15中所述以二聚体形式利用的所选的ebv-lmp2(clg)/hla-a02xcd3二聚体双特异性抗体介导对一组hla-a*02(+)ebv(+)肿瘤细胞系的t细胞细胞毒性。
完成lmp2dibsab对hla-a*02:01(+)ebv(+)肿瘤细胞系(包括rpmi-6666(霍奇金淋巴瘤)、dtblcl、fblcl、hone-1-a2(用hla-a*02:01转染的鼻咽癌))的t细胞依赖性细胞毒性测定。使用激活的脐带血t细胞作为10:1的效应细胞比靶标比率的效应细胞，并在处理4小时后通过51cr释放测定细胞毒性(图26)。lmp2-38和lmp2-38-2dibsab对所有四种肿瘤细胞系显示最高水平的细胞毒性。与对照bsab相比，lmp2-26和lmp2-61显出为几乎没有细胞毒性。lmp-40dibsab显示对dtblcl的显著杀伤，而对fblcl、rpmi-6666或hone-1-a2无显著杀伤作用。基于非线性四参数变量斜率回归分析(graphpadprism)的ec50和最大杀伤数据显示在表14中。lmp2-38-2dibsab具有0.003-0.07μg/ml的ec50值和37-55％的最大杀伤率，并且lmp2-38dibsab具有0.02-0.04μg/ml的ec50值和17-40％的最大杀伤率。表14描述了用lmp2二聚体bsab获得的体外细胞毒性结果。“nd”表示由于不良的曲线拟合而“未通过非线性回归分析确定”。
表14
还使用脐带血t细胞作为效应物，进行了lmp2二聚体bsab对抗原阴性肿瘤细胞系(包括hla-a*02(-)ebv(+)肿瘤细胞系ksblcl和hla-a*02(+)ebv(-)肿瘤细胞系colo205(结肠直肠癌)、mcf-7(乳腺癌)和hepg2(肝细胞癌))的t细胞依赖性细胞毒性测定。没有观察到与对照bsab相比的实质性杀伤。
实施例17.本文所述的某些抗体药剂的小鼠异种移植研究
此实施例展示了如本文所述的两种示例性双特异性抗体药剂的体内功效。具体地，此实施例特别地证明，所选的ebv-lmp2(clg)/hla-a02xcd3双特异性抗体(以二聚体形式评估)在小鼠异种移植模型中对降低肿瘤生长和存活方面高度有效。
将如本文所记录显示有效的体外活性的lmp-38和lmp2-38-2候选物在小鼠异种移植研究中以本文所述的二聚双特异性形式测试。在第一项研究中，将免疫缺陷dko小鼠(每组5只小鼠)静脉内植入1×106个fblcl(具有萤光素酶报道基因)，然后在第7天(50％的t细胞)和第14天(50％的t细胞)用两次静脉内注射10×106百万个人成体pbmc进行处理。在第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天、第15天、第17天、第19天、第22天、第25天、第28天、第32天和第39天注射20μg的对照dibsab、lmp2-38dibsab或lmp2-38-2dibsab。通过生物发光监测肿瘤生长；结果如图27所示。可以看出，未处理组的发光信号在第28天后饱和。第28天的生物发光示出于表15中。lmp2-38和lmp2-38-2dibsab在降低肿瘤生长方面非常有效(分别比对照dibsab降低98.8％和99.8％)。表15包括植入fblcl并用人成体pbmc和lmp2dibsab处理的免疫缺陷小鼠在第28天的生物发光定量结果。
表15
存活数据示出于图28中。对于lmp2-38dibsab组(p＝0.04)和lmp2-38-2dibsab组(p＝0.03)两者均观察到了存活的显著改善。
在第二项研究中，将免疫缺陷dko小鼠(每组5只小鼠)静脉内植入1×106个fblcl(含萤光素酶报告基因)，然后在第7天(20％的t细胞)和第14天(50％的t细胞)用两次静脉内注射10×106百万个人脐带血pbmc进行处理。在第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第14天、第15天、第17天、第19天、第22天、第25天、第28天、第32天和第39天注射20μg的对照dibsab、lmp2-38dibsab或lmp2-38-2dibsab。肿瘤生长通过生物发光监测并示出于图29中。未处理组的发光信号在第28天后饱和，并且在第28天的生物发光显示在表16中。lmp2-38和lmp2-38-2dibsab在降低肿瘤生长方面非常有效(分别比对照dibsab降低91.2％和98.1％)。表16描述了植入fblcl并用人脐带血pbmc和lmp2dibsab处理的免疫缺陷小鼠在第28天的生物发光定量。
表16
存活数据示出于图30中。可以看出，对于lmp2-38dibsab组(p＝0.003)和lmp2-38-2dibsab组(p＝0.003)两者均观察到了存活的显著改善。
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maloneydg,grillo-lópezaj,whitecaetal.:idec-c2b8(rituximab)anti-cd20monoclonalantibodytherapyinpatientswithrelapsedlow-gradenon-hodgkin'slymphoma,blood90(6):2188–95,1997[maloneydg、grillo-lópezaj、whiteca等人：对复发性低度非霍奇金淋巴瘤患者的idec-c2b8(利妥昔单抗)抗cd20单克隆抗体治疗，血液，90(6):2188–95，1997]
donermeyerdl,weberks,kranzdm,allenpm,2006,thestudyofhigh-affinitytcrsrevealsdualityintcellrecognitionofantigen:specificityanddegeneracy,j.immunol.177(10):6911-9[donermeyerdl、weberks、kranzdm、allenpm，2006，对高亲和力tcr的研究揭示了t细胞识别抗原的双重性：特异性和简并性，免疫学期刊，177(10):6911-9]
xu,h,chengm,guoh,cheny,husem,andcheungnk,2015,retargetingtcellstogd2pentasaccharideonhumantumorsusingbispecifichumanizedantibody,cancerimmunol.res.3(3):266-77[xu,h、chengm、guoh、cheny、husem和cheungnk，2015，使用双特异性人源化抗体将t细胞重新靶向到人肿瘤上的gd2五糖，癌症免疫学研究，3(3):266-77]。
等效词
在权利要求书中使用诸如“第一”、“第二”、“第三”等序数术语来修饰权利要求要素本身并不意味着一个权利要求要素相对于另一个权利要求要素的任何优先权、优先顺序或次序，或方法的多个动作被执行的时间顺序，而是仅用作标记以将具有某一名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个要素(但是使用序数术语)区分开，以区分多个权利要求要素。
除非明确地有相反的指示，在本说明书和权利要求书中如本文所用的冠词“一”和“一个”应理解为包括复数个指示物。如果一个、多于一个或所有的组成员存在于、用于或以其他方式与给定的产物或过程有关，则在一个或多个组成员之间包括“或”的权利要求或描述被认为是满足的，除非指出相反或从上下文中明显看出。本发明包括这样的实施方案，其中该组的正好一个成员存在于、用于或以其他方式与给定的产物或过程有关。本发明还包括这样的实施方案，其中多于一个或整个组成员存在于、用于或以其他方式与给定的产物或过程相关。此外，应当理解的是，本发明涵盖所有的变化，组合和置换，其中来自一个或多个列出的权利要求的一个或多个限制、要素、从句、描述性术语等被引入到从属于相同的基础权利要求的另一个权利要求(或相关的任何其他权利要求)中，除非另外指出或者除非对于本领域的普通技术人员来说显而易见会出现矛盾或不一致。在要素以列表的形式呈现的情况下(例如以马库什组或类似形式)，应该理解的是，要素的每个子组也被公开，并且任何要素都可以从组中移除。应当理解，通常，在本发明或本发明的多个方面被称为包括特定要素、特征等的情况下，本发明的某些实施方案或本发明的多个方面由这些元素、特征等组成或基本上由这些元素、特征等组成。为了简单的目的，这些实施方案在每种情况中都没有在此用许多单词具体阐述。还应该理解的是，本发明的任何实施方案或方面可以明确地从权利要求书中排除，而不管在说明书中是否列举了特定的排除。为了描述本发明的背景并提供关于本发明实践的附加细节而在此引用的出版物、网站和其他参考材料由此以引入方式并入。
已经如此描述了本发明的至少一个实施方案的若干个方面，应当理解，对于本领域的技术人员来说，各种改变、修改和改进将是显而易见的。此类改变、修改和改进旨在成为本公开内容的一部分，并且旨在落入本发明的精神和范围内。因此，前面的描述和附图仅作为示例，并且通过以下权利要求书来详细描述本发明。