具有酶可裂解基团的抗体药物缀合物（ADC）和抗体前药缀合物（APDC）的制作方法

引言和

背景技术：

本发明涉及其中结合体(binder)与纺锤体驱动蛋白抑制剂的无活性前体化合物缀合的新型结合体-前药缀合物(adc)，并且涉及结合体-药物缀合物adc，涉及这些结合体-前药缀合物和结合体-药物缀合物的活性代谢物，涉及用于制备这些apdc和adc的方法，涉及这些缀合物用于治疗和/或预防疾病的用途，以及涉及这些缀合物用于制备治疗和/或预防疾病(特别是过度增殖性疾病和/或血管生成性疾病如癌症的用途。这样的治疗可以作为单一疗法进行，或者也与其他药物或其他治疗措施组合进行。根据本发明，所述结合体优选地是抗体。

癌症是大多数不同组织不受控制的细胞生长的结果。在许多情况下，新细胞渗入现有组织(侵入性生长)，或者新细胞转移到远端器官。癌症发生在各种各样的器官中，并且经常具有组织特异性过程。因此，术语“癌症”作为上位概念描述了不同器官、组织和细胞类型的大量确定的疾病。

早期的一些肿瘤可以通过外科手术和放射疗法措施去除。一般来说，转移性肿瘤只能通过化学疗法来姑息治疗。这样做的目标是实现改善生活质量和延长寿命的最佳组合。

结合蛋白与一种或多种药物分子的缀合物是已知的，特别是以抗体药物缀合物(adc)的形式，其中针对肿瘤相关抗原的内化抗体通过接头共价连接至细胞毒性剂。在将adc引入肿瘤细胞并随后解离缀合物之后，细胞毒性剂本身或由其形成的细胞毒性代谢物在肿瘤细胞内释放，并且可以直接地及选择性地在其中展现其作用。以这种方式，与常规化学疗法相反，对正常组织的损伤被限制在明显更窄的限度内[参见，例如，j.m.lambert,curr.opin.pharmacol.5,543-549(2005)；a.m.wuandp.d.senter,nat.biotechnol.23,1137-1146(2005)；p.d.senter,curr.opin.13,235-244(2009)；l.ducryandb.stump,bioconjugatechem]。因此，wo2012/171020描述了其中多个毒性基团分子通过聚合的接头连接至抗体的adc。作为可能的毒性基团，wo2012/171020尤其提及物质sb743921、sb715992(伊匹尼塞)、mk-0371、azd8477、az3146和arry-520。

最后提到的物质是纺锤体驱动蛋白抑制剂。纺锤体驱动蛋白(ksp，也称为eg5、hseg5、knsl1或kif11)是一种驱动蛋白样动力蛋白，其对于双极有丝分裂纺锤体发挥功能是必不可少的。对ksp的抑制导致有丝分裂停止，并在相对较长时期内导致细胞凋亡(taoetal.,cancercell2005jul8(1),39-59)。在发现第一种穿透细胞的ksp抑制剂monastrol后，ksp抑制剂已经被确认为一类新型化学治疗剂(mayeretal.,science286:971-974,1999)，并且它们是许多专利申请(例如wo2006/044825；wo2006/002236；wo2005/051922；wo2006/060737；wo03/060064；wo03/040979；和wo03/049527)的主题。然而，由于ksp仅在有丝分裂期中的相对较短的时期内有活性，所以ksp抑制剂在该阶段中必须以足够高的浓度存在。wo2014/151030公开了包括某些ksp抑制剂的adc。

豆荚蛋白酶(legumain)是与肿瘤相关的天冬酰胺酰内肽酶(s.ishii,methodsenzymol.1994,244,604；j.m.chenetal.j.biol.chem.1997,272,8090)，并且已被用于处理小细胞毒性分子的前药，例如多柔比星和依托泊苷衍生物等(w.wuetal.cancerres.2006,66,970；l.sternetal.bioconjugatechem.2009,20,500；k.m.bajjurietal.chemmedchem2011,6,54)。

其他溶酶体酶为例如组织蛋白酶或糖苷酶，例如β-葡糖醛酸糖苷酶，其也已经被用于通过酶促裂解前药而释放活性成分。在体内酶促可裂解的基团尤其是2-8-寡肽基团或糖苷类。肽裂解位点公开于bioconjugatechem.2002,13,855-869和bioorganic&medicinalchemistryletters8(1998)3341-3346以及bioconjugatechem.1998,9,618-626。这些包括例如缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸和苯丙氨酸-赖氨酸(任选地具有额外的酰胺基)。

技术实现要素：

为了进一步改善adc及其代谢物的肿瘤选择性，已经为结合体缀合物提供了可以被肿瘤相关酶(如豆荚蛋白酶或组织蛋白酶)释放的肽衍生物。因此肿瘤选择性不仅由抗体的选择决定，而且还由肽衍生物的酶促裂解(例如通过肿瘤相关酶豆荚蛋白酶)决定。

根据本发明，肽衍生物可以存在于连接结合体与ksp抑制剂的接头中。这些是根据本发明的结合体-药物缀合物(adc)。

根据本发明使用的纺锤体驱动蛋白抑制剂具有氨基，这对于该作用是必需的。通过用肽衍生物修饰该氨基，对纺锤体驱动蛋白的作用被阻断，因此细胞毒性作用的发生也受到抑制。然而，如果这种肽残基可以被肿瘤相关酶(如豆荚蛋白酶)释放，则该作用可以在肿瘤组织中以受控的方式重建。在这种情况下氨基的修饰不是接头的一部分。因此，本发明涉及具有纺锤体驱动蛋白抑制剂的无活性前体分子的结合体缀合物，所述纺锤体驱动蛋白抑制剂在肿瘤中仅通过肿瘤相关的溶酶体内肽酶豆荚蛋白酶进行处理以得到活性代谢物，因此以便能够在肿瘤中再次以受控的方式显示它们的细胞毒素活性。根据本发明，与ksp抑制剂的结合缀合物(其中它的游离氨基被相应地阻断)也称为apdc。apdc是特别优选的。

因此，本发明提供了结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其一种或多种前药的具有下式i的缀合物，以及其盐、溶剂合物，所述溶剂合物的盐和差向异构体，

其中binder代表结合体或其衍生物(优选抗体)，l代表接头，n代表1至50、优选1.2至20、更优选2至8的数字，ksp表示纺锤体驱动蛋白抑制剂或其前药，其中l-ksp具有下式(iia)：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或

x1代表n，x2代表c且x3代表n；或

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；或

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

(优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)；

r¹代表h、–l-#1、–mod或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-nhy³、-oy³、-sy³、卤素、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2、

-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘(例如-(ch2)0-3z‘)或

-ch(ch2w)z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，

其中z‘代表-h、-nh2、-so3h、-cooh、

-nh-co-ch2-ch2-ch(nh2)cooh或

-(co-nh-chy⁴)1-3cooh；其中w代表-h或-oh，

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基；

r²代表–l-#1、h、-mod、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

r⁴代表–l-#1、-h、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y5代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

或r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-或r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cooh)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸(当存在多于一个的p3时，p3因此可以具有不同的含义)；

或r²和r⁴一起代表(形成吡咯烷环)–ch2-chr¹⁰-或-chr¹⁰-ch2-，其中r¹⁰代表h、-nh2、-so3h、-cooh、-sh、卤素(尤其是f或cl)、c1-4-烷基、c1-4-卤代烷基、c1-4-烷氧基、羟基取代的c1-4-烷基、coo(c1-4-烷基)、-oh，并且其中吡咯烷环中的仲氨基的氢原子可被r²¹-co-p3(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-sig-替代，其中sig代表在co-sig键裂解后释放仲胺的自消性基团；

a代表-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2nh-或-c(＝n-nh2)-；

r³代表–l-#1、-mod，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–l-#1或c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基或c5-10-杂环烷基，

其可被以下基团取代：1-3个–oh基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个o-烷基、1-3个–sh基团、1-3个-s-烷基、1-3个-o-c(＝o)-烷基、1-3个-o-c(＝o)-nh-烷基、1-3个-nh-c(＝o)-烷基、1-3个-nh-c(＝o)-nh-烷基、1-3个-s(＝o)n-烷基、1-3个-s(＝o)2-nh-烷基、1-3个-nh-烷基、1-3个-n(烷基)2基团、1-3个-nh2基团或1-3个-(ch2)0-3z基团，其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，n代表0、1或2，y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘并且y³代表-h、-(ch2)0-3-ch(nhc(＝o)ch3)z‘、-(ch2)0-3-ch(nh2)z‘或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh，(其中“烷基”优选地代表c1-10-烷基)；

r⁵代表-h、-nh2、-no2、卤素(特别是-f、-cl、-br)、-cn、-cf3、-ocf3、-ch2f、-ch2f、-sh或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、-oy³、-sy³、卤素、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且

y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

代表，

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、氰基、(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、羟基、-no2、nh2、-cooh或卤素(特别是-f、-cl、-br)，

r⁸代表(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、(任选地氟代的)c4-10-环烷基或–(ch2)0-2-(hz²)，其中hz²代表具有至多两个选自n、o和s的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–oh、-co2h、-nh2或–l-#1取代；

r⁹代表-h、-f、-ch3、-cf3、-ch2f或-chf2；

其中取代基r¹、r²、r³、r⁴和r⁸中的一个代表或(在r⁸的情况下)含有–l-#1，

–l代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，

其中–mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-g3，其中

r¹⁰代表h、卤素或c1-c3-烷基；

g1代表–nhco-、-conh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被–nhc(＝o)nh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-(ch＝n-nh2)、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-co-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)基团，其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，以及

g3代表-h或-cooh；

其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团；

其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：

(i)–l-#1包含式-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-的基团，

其中x代表–nh2或–cooh，优选–nh2；p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

(ii)r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

(iii)r²和r⁴一起代表(形成吡咯烷环)–ch2-chr¹⁰-或-chr¹⁰-ch2-，其中吡咯烷环的仲氨基的仲氢原子可被r²¹-co-p3(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-sig-替代，其中sig代表在co-sig键裂解后释放仲胺的自消性基团。

在本发明的adc中，–l-#1-包含或为式

-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-的基团。特别优选的是已被发现在实验部分中所描述的豆荚蛋白酶测定中是可裂解的式

-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团。更优选地，r¹、r³或r⁴取代基中的一个为–l-#1。当r⁴代表–l-#1时，天冬酰胺或天冬氨酸的羰基直接结合至上式中的与r⁴结合的氮原子。

在本发明的apdc中，r⁴为

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，或吡咯烷环中的nh的氢原子被r²¹-co-p3(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-sig-替代。

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-和r²¹-co-p3-p2-nh-ch(ch2cox)-co-sig-基团在体内可能被豆荚蛋白酶裂解。因此这些基团在下文中也被称为“豆荚蛋白酶可裂解基团”。豆荚蛋白酶可裂解基团具有式-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conx)-co-。在本发明的apdc中，所述基团优选地具有式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-#，意味着豆荚蛋白酶可裂解基团在一端具有r²¹基团，而在另一端(-#)其与对应于式iia中的r4位的氨基结合。

在这种情况下，nh-ch(ch2cox)-co-(即天冬酰胺或天冬氨酸)以天然l构型存在。特别优选的是已被发现在实验部分中所描述的豆荚蛋白酶测定中是可裂解的那些基团。除豆荚蛋白酶-或组织蛋白酶-可裂解的r⁴基团之外，本发明的apdc可具有含有豆荚蛋白酶-或组织蛋白酶-可裂解基团的接头–l-#1。

豆荚蛋白酶可裂解基团中的-nh-ch(ch2conh2)-co-是天冬酰胺；豆荚蛋白酶可裂解基团中的-nh-ch(ch2cooh)-co-是天冬氨酸。天冬酰胺和天冬氨酸分别以l(-)-天冬酰胺和l-天冬氨酸的形式存在。除了天冬酰胺或天冬氨酸外，豆荚蛋白酶可裂解基团还具有1至3个其他氨基酸(即在天冬酰胺的情况下，为

-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-；-p3-p2-nh-ch(ch2conh2)-co；

-(p3)(2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-)，并且因此为二肽、三肽或四肽或其衍生物(二肽：-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-；三肽：

-p3-p2-nh-ch(ch2conh2)-co；四肽：

-(p3)2-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-(其中两个氨基酸p3可以不同)。

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选地选自ala、gly、val、leu、ile、pro、ser、thr、瓜氨酸和asn。p2通常为天然的l构型。特别优选的是l-ala。

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸，或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸。p3优选地选自his、pro、ala、val、leu、ile、gly、ser、phe、瓜氨酸和gln。p3通常为天然的l构型。特别优选的是l-ala。当存在多于一个氨基酸p3时，这些氨基酸在上述定义的范围内可以不同。

更优选地，豆荚蛋白酶可裂解基团为-l-ala-l-ala-l-asn-(即在apdc的情况下为r²¹-l-ala-l-ala-l-asn-#)。

r²¹优选地代表-h、c1-5-烷基-、c5-10-芳烷基-、c1-5-烷氧基-、c6-10-芳氧基、c5-10-杂烷基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c5-10-杂烷氧基或c5-10-杂环烷氧基，其每一个均可被以下基团取代：--cooh、coo烷基、coonh2、nh2或n(烷基)2，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r²²为–h、–烷基、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)。在此处“烷基”是指具有至多20个碳原子的烷基基团，优选c1-12-烷基。

组织蛋白酶可裂解基团具有式-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-。在本发明的apdc中，所述基团具有式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-#，这意味着组织蛋白酶可裂解基团在一端具有r²¹基团，而在另一端(-#)其与对应于式iia中的r4位的氨基结合。在这种情况下，r²¹、p2和p3如对于豆荚蛋白酶可裂解基团所定义。式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2--#的基团是否可以被组织蛋白酶裂解，可以基于实验部分中所描述的组织蛋白酶测定来确定。特别优选的组织蛋白酶可裂解基团为其中p2选自丙氨酸、赖氨酸和瓜氨酸并且p3选自缬氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸的那些基团，尤其是式r²¹-(co)(0-1)-p3-p2-的基团。

附图说明

图1：各种物种的tweakr富含半胱氨酸的结构域(氨基酸34至68)的比对。(数字示出包含信号序列的全长构建体中的氨基酸位置；seqidno:169)。

图2：a–tweakr(seqidno:169)的结构的示意图。该图示出包含富含半胱氨酸的结构域(36-67)的胞外结构域(氨基酸28-80)(seqidno:168)、跨膜结构域-tm(81-101)和胞内结构域(102-129)。tpp-2202-完整的胞外结构域(28-80)，higg1的fc结构域融合于其上。tpp-2203-具有n-和c-末端截短的胞外结构域(34-68)，其与higg1的fc结构域融合。二硫桥cys36-cys49、cys52-cys67和cys55-cys64用黑条表示。为了确保可观的折叠，与纯的富含半胱氨酸的结构域相比，tpp-2203在n-末端多接受两个氨基酸，而在c-末端多接受一个氨基酸。tpp-1984-具有c-末端截短的胞外结构域(28-68)，其与his6标签融合。所有这三种构建体均显示与本发明的抗体和pdl-192(tpp-1104)的相当的结合。p4a8(tpp-1324)仅结合全长胞外结构域(tpp-2202)。

b–胞外结构域的氨基酸序列：已经公开了氨基酸64对于tweak配体结合是必需的，并且氨基酸47对于本发明的抗体的结合是必需的，这在本文中已经确定。

图3：非糖基化抗体的转谷氨酰胺酶催化的缀合位点特异性功能化的示意图。

图4：根据nat.commun.,2013,4,2735，通过组蛋白脱乙酰酶和组织蛋白酶l的药物释放的连续酶促步骤的图。

具体实施方式

本发明提供了结合体或其衍生物与一种或多种药物分子或其前药的缀合物，所述药物分子是纺锤体驱动蛋白抑制剂(ksp抑制剂)。

接下来描述可根据本发明使用的结合体、可根据本发明使用的ksp抑制剂或其前药以及可根据本发明使用的接头，其可不受限制地组合使用。更特别地，可以使用在每种情况下描述为优选或特别优选的结合体，其与在每种情况下描述为优选或特别优选的ksp抑制剂或前药组合，任选地与在每种情况下描述为优选或特别优选的接头组合。

ksp抑制剂及其结合体缀合物，

根据本发明，式i中的ksp-l具有下式(iia)，以及其盐、溶剂合物，所述溶剂合物的盐和差向异构体：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或

x1代表n，x2代表c且x3代表n；或

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；或

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

(优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)；

r¹代表h、–l-#1、–mod或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-nhy³、-oy³、-sy³、卤素、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2、

-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘(例如-(ch2)0-3z‘)或

-ch(ch2w)z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、nh2、so3h、-cooh、-nh-co-ch2-ch2-ch(nh2)cooh或-(co-nh-chy⁴)1-3cooh；其中w代表-h或-oh，

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基；

r²代表–l-#1、-h、-mod、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

r⁴代表–l-#1、h、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

或r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-或r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cooh)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

或r²和r⁴一起代表(形成吡咯烷环)–ch2-chr¹⁰-或-chr¹⁰-ch2-，其中r¹⁰代表h、nh2、so3h、cooh、sh、卤素(尤其是f或cl)、c1-4-烷基、c1-4-卤代烷基、c1-4-烷氧基、羟基取代的c1-4-烷基、coo(c1-4-烷基)、-oh，或r²¹-co-p3-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-sig-，其中sig代表在co-sig键裂解后释放仲胺的自消性基团；

a代表-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2nh-或-c(＝n-nh2)-；

r³代表–l-#1、-mod，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选–l-#1或c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基或c5-10-杂环烷基，

其可被以下基团取代：1-3个–oh基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个o-烷基、1-3个–sh基团、1-3个-s-烷基、1-3个-o-co-烷基、1-3个-o-co-nh-烷基、1-3个-nh-co-烷基、1-3个-nh-co-nh-烷基、1-3个-s(o)n-烷基、1-3个-so2-nh-烷基、1-3个-nh-烷基、1-3个-n(烷基)2基团、1-3个-nh2基团或1-3个-(ch2)0-3z基团，其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，n代表0、1或2，y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘并且y³代表-h、-(ch2)0-3-ch(nhcoch3)z‘、-(ch2)0-3-ch(nh2)z‘或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或cooh(其中“烷基”优选地代表c1-10-烷基)；

r⁵代表-h、-nh2、-no2、卤素(特别是f、cl、br)、-cn、-cf3、-ocf3、-ch2f、-ch2f、-sh或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、-oy³、-sy³、卤素、nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh；代表，

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、氰基、(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、羟基、-no2、nh2、-cooh或卤素(特别是-f、-cl、-br)，

r⁸代表(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、(任选地氟代的)c4-10-环烷基或–(ch2)0-2-(hz²)，其中hz²代表具有至多两个选自n、o和s的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–oh、-co2h、-nh2或–l-#1取代；

r⁹代表-h、-f、-ch3、-cf3、-ch2f或-chf2；

其中取代基r¹、r²、r³、r⁴和r⁸中的一个代表或(在r⁸的情况下)含有–l-#1，

–l代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，

其中–mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-g3，其中

r¹⁰代表-h或c1-c3-烷基；

g1代表–nhco-、-conh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、-conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被nhc(＝o)nh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-c(＝o)-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)基团，其中包括任何侧链的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-c(＝nnh2)、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，

g3代表-h或-cooh；

其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团；

其中满足以下条件(i)至(iii)中的一个或多个：

(i)–l-#1包含式-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co-的基团，

其中x代表–nh2或–cooh，优选–nh2；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

(ii)r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

(iii)r²和r⁴一起代表(形成吡咯烷环)–ch2-chr¹⁰-或-chr¹⁰-ch2-，其中吡咯烷环的仲氨基的仲氢原子可被r²¹-co-p3-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-sig-替代，其中sig代表在co-sig键裂解后释放仲胺的自消性基团。

定义

术语“取代的”意指在指定原子或指定基团上的一个或多个氢原子已被选自指定基团的基团所替代，条件是在所讨论情况下不超过指定原子的正常化合价。取代基和/或变量的组合是允许的。

术语“任选地取代的”意指取代基的数目可以等于或不等于零。除非另有说明，否则任选地取代的基团可以被所能容纳的多个任选的取代基取代，其是通过在任何可用的碳或氮或硫原子上用非氢取代基替代氢原子来进行。通常，任选的取代基(如果存在的话)的数目可以是1、2、3、4或5，特别是1、2或3。

如本文所用，表述“单-或多-”，例如在本发明的通式化合物的取代基的定义中，意指“1、2、3、4或5，优选1、2、3或4，更优选1、2或3，最优选1或2”。

如果本发明的化合物中的基团被取代，则除非另有说明，否则所述基团可以是单取代的或多取代的。在本发明的保护范围内，出现不止一次的所有基团的定义彼此独立。优选用一个、两个或三个相同或不同的取代基的取代。特别优选用一个取代基的取代。

烷基

烷基是具有1至10个碳原子(c1-c10-烷基)，通常1至6个(c1-c6-烷基)，优选1至4个(c1-c4-烷基)并且更优选1至3个碳原子(c1-c3-烷基)的直链或支链的饱和一价烃基。

优选的实例包括：

甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基以及1,2-二甲基丁基。

特别优选的是甲基、乙基、丙基、异丙基或叔丁基。

杂烷基

杂烷基是具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-nr^y-、-nr^yc(＝o)-、-c(＝o)-nr^y-、-nr^ynr^y-、-s(＝o)2-nr^ynr^y-、-c(＝o)-nr^ynr^y-、-cr^x＝n-o-，并且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–nh-c(＝o)-nh2、-c(＝o)-oh、-oh、-nh2、-nh-c(＝nnh2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在本上下文中，r^y在每种情况下为-h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其在每种情况下又可被–nh-c(＝o)-nh2、-c(＝o)-oh、-oh、-nh2、-nh-c(＝nnh2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在本申请的上下文中，rx为-h、c1-c3-烷基或苯基。

烯基

烯基为具有一个或两个双键和2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(c2-c10-烯基)，特别是2或3个碳原子(c2-c3-烯基)的直链或支链的一价烃链，其中显而易见的是，当烯基含有多于一个双键时，所述双键可以彼此分离或彼此共轭。烯基为例如乙烯基(ethenyl)(或乙烯基(vinyl))、丙-2-烯-1-基(“烯丙基”)、丙-1-烯-1-基、丁-3-烯基、丁-2-烯基、丁-1-烯基、戊-4-烯基、戊-3-烯基、戊-2-烯基、戊-1-烯基、己-5-烯基、己-4-烯基、己-3-烯基、己-2-烯基、己-1-烯基、丙-1-烯-2-基(或“异丙烯基”)、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、2-甲基丁-2-烯基、1-甲基丁-2-烯基、3-甲基丁-1-烯基、2-甲基丁-1-烯基、1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基、4-甲基戊-4-烯基、3-甲基戊-4-烯基、2-甲基戊-4-烯基、1-甲基戊-4-烯基、4-甲基戊-3-烯基、3-甲基戊-3-烯基、2-甲基戊-3-烯基、1-甲基戊-3-烯基、4-甲基戊-2-烯基、3-甲基戊-2-烯基、2-甲基戊-2-烯基、1-甲基戊-2-烯基、4-甲基戊-1-烯基、3-甲基戊-1-烯基、2-甲基戊-1-烯基、1-甲基戊-1-烯基、3-乙基丁-3-烯基、2-乙基丁-3-烯基、1-乙基丁-3-烯基、3-乙基丁-2-烯基、2-乙基丁-2-烯基、1-乙基丁-2-烯基、3-乙基丁-1-烯基、2-乙基丁-1-烯基、1-乙基丁-1-烯基、2-丙基丙-2-烯基、1-丙基丙-2-烯基、2-异丙基丙-2-烯基、1-异丙基丙-2-烯基、2-丙基丙-1-烯基、1-丙基丙-1-烯基、2-异丙基丙-1-烯基、1-异丙基丙-1-烯基、3,3-二甲基丙-1-烯基、1-(1,1-二甲基乙基)乙烯基、丁-1,3-二烯基、戊-1,4-二烯基或己-1,5-二烯基。更特别地，所述基团为乙烯基或烯丙基。

炔基

炔基为具有一个三键且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子(c2-c10-炔基)，尤其是2或3个碳原子(c2-c3-炔基)的直链或支链的一价烃链。c2-c6-炔基为例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。更特别地，所述炔基为乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。

环烷基

环烷基是具有3-12个碳原子的饱和一价单环或双环烃基(c3-c12-环烷基)。

在本申请的上下文中，单环烃基为通常具有3至10个碳原子(c3-c10-环烷基)，优选3至8个碳原子(c3-c8-环烷基)并且更优选3至7个碳原子(c3-c7-环烷基)的一价烃基。

单环烃基的优选实例包括：

环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。

特别优选的是环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。

在本申请的上下文中，双环烃基为通常具有3至12个碳原子的烃基(c3-c12-环烷基)，其在本文中应理解为意指一起共享两个直接相邻原子的两个饱和环体系的稠合。双环烃基的优选实例包括：双环[2.2.0]己基、双环[3.3.0]辛基、双环[4.4.0]癸基、双环[5.4.0]十一烷基、双环[3.2.0]庚基、双环[4.2.0]辛基、双环[5.2.0]壬基、双环[6.2.0]癸基、双环[4.3.0]壬基、双环[5.3.0]癸基和双环[6.3.0]十一烷基。

杂环烷基

杂环烷基为具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的非芳族单环或双环体系。所述杂原子可以是氮原子、氧原子或硫原子。

本发明的单环体系可具有3至8个，优选4至7个，且更优选5或6个环原子。

具有3个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

氮丙啶基。

具有4个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基。

具有5个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基、二氧戊环基和四氢呋喃基。

具有6个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

哌啶基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、四氢吡喃基和硫代吗啉基。

具有7个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

氮杂环庚烷基、氧杂环庚烷基、1,3-二氮杂环庚烷基、1,4-二氮杂环庚烷基。

具有8个环原子的杂环烷基的优选实例包括：

氧杂环辛烷基、氮杂环辛烷基。

在单环杂环烷基中，优选的是具有至多两个选自o、n和s的杂原子的4-至7元饱和杂环基。

特别优选的是吗啉基、哌啶基、吡咯烷基和四氢呋喃基。

根据本发明具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的双环体系可具有6至12个且优选6至10个环原子，其中一个、两个、三个或四个碳原子可被交换为相同或不同的选自o、n和s的杂原子。

实例包括：氮杂双环[3.3.0]辛基、氮杂双环[4.3.0]壬基、二氮杂双环[4.3.0]壬基、噁嗪双环[4.3.0]壬基、噻唑双环[4.3.0]或氮杂双环[4.4.0]癸基，以及根据定义源自其他可能的组合的基团。

特别优选的是全氢环戊烷并[c]吡咯基、全氢呋喃并[3,2-c]吡啶基、全氢吡咯并[1,2-a]吡嗪基、全氢吡咯并[3,4-c]吡咯基和3,4-亚甲二氧基苯基。

芳基

芳基是由碳原子组成的一价单环或双环芳族环体系。实例为萘基和苯基；优选的是苯基或苯基基团。

c6-c10-芳烷基

本发明上下文中的c6-10-芳烷基为单环芳族芳基，例如苯基，其上键合有c1-c4-烷基。

举例说明性的c6-10-芳烷基为苄基。

杂芳基

杂芳基为具有5、6、8、9、10、11、12、13或14个环原子(“5-至14元杂芳基”)，尤其是5、6、9或10个环原子的一价单环、双环或三环芳族环体系，并且含有至少一个环杂原子和任选地一个、两个或三个选自n、o和s的其他环杂原子，并且通过环碳原子或任选(当被化合价允许时)通过环氮原子键合。

杂芳基可为5元杂芳基，例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基或四唑基；或6元杂芳基，例如吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基；或三环杂芳基，例如咔唑基、吖啶基或吩嗪基；或9元杂芳基，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基、吲嗪基或嘌呤基；或10元杂芳基，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹喔啉基或蝶啶基。

一般而言，且除非另有说明，否则杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如与该分子的其余部分的连接点相关的互变异构体和位置异构体。因此，作为举例说明性的而非排他性实例，术语吡啶基包括吡啶-2-基、吡啶-3-基和吡啶-4-基；或术语噻吩基包括噻吩-2-基和噻吩-3-基。

c5-c10-杂芳基

本发明上下文中的c5-10-杂芳基为具有一个、两个、三个或四个可以相同或不同的杂原子的单环或双环芳族环体系。可以出现的杂原子为：n、o、s、s(＝o)和/或s(＝o)2。键合价可以在任何芳族碳原子上或在氮原子上。

本发明的单环杂芳基具有5或6个环原子。

优选的是具有一个或两个杂原子的杂芳基。本文特别优选的是一个或两个氮原子。

具有5个环原子的杂芳基包括例如以下环：

噻吩基、噻唑基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、恶二唑基、三唑基、四唑基和噻二唑基。

具有6个环原子的杂芳基包括例如以下环：

吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基和三嗪基。

根据本发明的双环杂芳基具有9或10个环原子。

具有9个环原子的杂芳基包括例如以下环：

苯酞基(phthalidyl)、硫代苯酞基(thiophthalidyl)、吲哚基、异吲哚基、吲唑基、苯并噻唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并咪唑基、苯并噁唑基、吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基、二氢吲哚基。

具有10个环原子的杂芳基包括例如以下环：

异喹啉基、喹啉基、喹嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、噌啉基、酞嗪基、1,7-和1,8-萘啶基、蝶啶基、苯并二氢吡喃基。

杂烷氧基

杂烷氧基为具有1至10个碳原子且通过-o-与分子的其余部分键合的直链和/或支链烃基链，并且还可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-nr^y-、-nr^yc(＝o)-、-c(＝o)-nr^y-、-nr^ynr^y-、-s(＝o)2-nr^ynr^y-、-c(＝o)-nr^ynr^y-、-cr^x＝n-o-，并且其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–nh-c(＝o)-nh2、-c(＝o)-oh、-oh、-nh2、-nh-c(＝nnh2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在本申请的上下文中，r^y在每种情况下为-h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其中在每种情况下又可被–nh-c(＝o)-nh2、-c(＝o)-oh、-oh、-nh2、-nh-c(＝nnh2)-、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在本申请的上下文中，r^x为-h、c1-c3-烷基或苯基。

本发明上下文中的卤素或卤素原子是氟(-f)、氯(-cl)、溴(-br)或碘(-i)。

氟代烷基、氟代烯基和氟代炔基意指烷基、烯基和炔基可被氟单取代或多取代。

纺锤体驱动蛋白抑制剂前药优选地具有下式(iii)，以及其盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或

x1代表n，x2代表c且x3代表n；或

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；或

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

(优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)；

r¹代表-h、–mod或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-nhy³、-oy³、-sy³、卤素、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2、

-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘(例如-(ch2)0-3z‘)或

-ch(ch2w)z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-nh2、-so3h、-cooh、

-nh-co-ch2-ch2-ch(nh2)cooh或

-(co-nh-chy⁴)1-3cooh，其中w代表-h或-oh，

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基；

r²代表-h、-mod、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被–nhc(＝o)nh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-或r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cooh)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

a代表-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2nh-或-c(＝nnh2)-；

r³代表-mod，或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基或c5-10-杂环烷基，

其可被以下基团取代：1-3个–oh基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(其每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个o-烷基、1-3个–sh基团、1-3个-s-烷基、1-3个-o-co-烷基、1-3个-o-co-nh-烷基、1-3个-nh-co-烷基、1-3个-nh-co-nh-烷基、1-3个-s(o)n-烷基、1-3个-so2-nh-烷基、1-3个-nh-烷基、1-3个-n(烷基)2基团、1-3个-nh2基团或1-3个-(ch2)0-3z基团，其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，n代表0、1或2，y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘并且y³代表-h、-(ch2)0-3-ch(nhcoch3)z‘、-(ch2)0-3-ch(nh2)z‘或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh，(其中“烷基”优选地代表c1-10-烷基)；

r⁵代表-h、-nh2、-no2、卤素(特别是f、cl、br)、-cn、-cf3、-ocf3、-ch2f、-ch2f、-sh或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、-oy³、-sy³、卤素、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、氰基、(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、羟基、-no2、nh2、-cooh或卤素(特别是-f、-cl、-br)，

r⁸代表(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、(任选地氟代的)c4-10-环烷基或–(ch2)0-2-(hz²)，其中hz²代表具有至多两个选自n、o和s的杂原子的4-至7元杂环，其中这些基团中的每一个均可被–oh、-co2h或-nh2取代；

r⁹代表-h、-f、-ch3、-cf3、-ch2f或-chf2；

其中–mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-g3，其中

r¹⁰代表-h或c1-c3-烷基；

g1代表–nhc(＝o)-、-c(＝o)nh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、-conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-co-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)基团，其中包括任何侧链的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，以及

g3代表h或cooh；

其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团。

通过以本领域普通技术人员已知的方式取代在r¹、r²、r³、r⁴、r⁵或r⁸处的氢原子或取代在由r²和r⁴形成的吡咯烷环(r¹⁰)处的氢原子，可将式(iii)的化合物连接到接头上。这得到式(iia)的缀合物，其中取代基r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁸或r¹⁰中的一个代表–l-#1，l代表接头，而#1代表键合至结合体或其衍生物的键。如果式(iia)的ksp抑制剂(或ksp-l)与结合体缀合，则取代基r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁸或r¹⁰中的一个因此代表–l-#1，其中l代表接头而#1代表键合至结合体或其衍生物的键。换言之，在缀合物的情况下，取代基r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁸和r¹⁰中的一个代表–l-#1，其中–l-#1连接至结合体，例如抗体。特别优选地，取代基r¹、r³或r⁴中的一个代表–l-#1。所述结合体优选地为人类、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗tweakr的抗体或其抗原结合片段，或抗egfr的抗体或其抗原结合片段或抗her2的抗体。特别优选的是特异性结合至tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)的抗tweakr的抗体，特别是抗tweakr的抗体tpp-2090和tpp-2658，或抗egfr的抗体西妥昔单抗(cetuximab)或尼妥珠单抗(nimotuzumab)或her-2抗体曲妥珠单抗(trastuzumab)。

代替–l-#1，在式iia中，基团–l-#3也可以存在于化合物中，其中l代表接头，而#3代表结合至结合体或其衍生物的反应性基团。包含–l-#3的化合物是与结合体或其衍生物反应的反应性化合物。#3优选地为与氨基或巯基反应形成共价键的基团，优选与蛋白质中的半胱氨酸残基反应的基团。蛋白质中的半胱氨酸残基可以天然存在于蛋白质中，可以通过生物化学方法引入，或优选地可通过事先还原结合体的二硫键来产生。

当r¹不为h时，与r¹结合的碳原子是立体中心，其可为l和/或d构型，优选l构型。

当r²不为h时，与r²结合的碳原子是立体中心，其可为l和/或d构型。

特别优选的是其中取代基r¹、r³和r⁴中的一个代表–l-#1的式(iia)的化合物，并且其中

x¹代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c，

尤其是其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或x1代表ch，x2代表c且x3代表n的那些化合物。特别优选的是其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n的化合物。

对于a，优选的是co(羰基)。

对于r¹优选的是–l-#1、-mod、-h、-cooh、-conhnh2、-(ch2)1-3nh2、-conz“(ch2)1-3nh2和–conz“ch2cooh，其中z“代表-h或-nh2。如果r⁴代表–l-#1，则r¹优选地为–mod(尤其是如果r³不代表–mod)。

对于r²优选的是-h。

对于r⁴优选的是-h、–l-#1或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团。如上所述，在这种情况下，–l-#1含有式-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2cox)-co*-的基团，其中(l-)天冬酰胺或(l-)天冬氨酸的羰基(由*标识)的羰基直接结合至上式中的与r⁴结合的氮原子。如果r⁴代表–l-#1，则r¹或r³优选地为-mod。

对于r³优选的是–l-#1、-mod或c1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–oh、-o-烷基、-sh、-s-烷基、-o-co-烷基、-o-c(＝o)-nh-烷基、nh-c(＝o)-烷基、nh-c(＝o)-nh-烷基、s(o)n-烷基、so2-nh-烷基、nh-烷基、n(烷基)2或nh2，n代表0、1或2(其中烷基优选地为c1-3-烷基)。如果r⁴代表–l-#1，则r³优选地为–mod(尤其是如果r¹不代表–mod)。

对于r⁵优选的是-h或-f。

对于r⁶和r⁷优选的是彼此独立地为-h、(任选地氟代的)c1-3-烷基、(任选地氟代的)c2-4-烯基、(任选地氟代的)c2-4-炔基、羟基或卤素。

对于r⁸优选的是支链c1-5-烷基，特别是式–c(ch3)2-(ch2)0-2–ry的基团，其中ry代表–h、–oh、-co2h或-nh2。特别优选的是式–c(ch3)2-(ch2)–ry的基团，其中ry代表–h。

对于r⁹优选的是-h或-f。

对于–mod优选的是hooc-(chx)x-am-ch2-ch2-nh-co-，其中x代表2至6的数字，x代表-h、-nh2或-cooh，并且代表am-co-nh-或-nh-co-(特别优选的是hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-)。

尤其优选的是其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1的式(iia)的化合物，并且

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a代表–c＝(o)-；

r¹代表-h、-cooh、-conhnh2、-(ch2)1-3nh2、-conz“(ch2)1-3nh2和–conz“ch2cooh，其中z“代表-h或nh2；

r²代表-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团；

r³代表可被卤素(特别是f)或任选地氟代的c1-3-烷基单取代或多取代的苯基，或代表任选地氟代的c1-10-烷基，其可任选地被以下基团取代：–oy⁴、-sy⁴、-o-co-y⁴、-o-co-nh-y⁴、nh-co-y⁴、-nh-co-nh-y⁴、s(o)n-y⁴(其中n代表0、1或2)、-so2-nh-y⁴、nh-y⁴或n(y⁴)2，其中y⁴代表h、苯基(任选地被卤素(特别是f)或任选地氟代的c1-3-烷基单取代或多取代)或烷基(其中烷基可被–oh、-cooh和/或-nhco-c1-3-烷基取代并且其中烷基优选地代表c1-3-烷基)，

其中特别优选地，r³可被以下基团取代：–oh、-o-烷基、-sh、-s-烷基、-o-co-烷基、-o-co-nh-烷基、-nh-co-烷基、-nh-co-nh-烷基、-s(o)n-烷基、-so2-nh-烷基、-nh-烷基、-n(烷基)2或-nh2，n代表0、1或2(其中烷基优选地表示c1-3-烷基)，

r⁵为-h或–f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、(任选地氟代的)c1-3-烷基、(任选地氟代的)c2-4-烯基、(任选地氟代的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸为支链c1-5-烷基；以及

r⁹代表-h或-f。

尤其优选地还为其中取代基r⁴代表–l-#1的式(iia)的化合物，并且

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a代表co(羰基)；

r¹代表-h、-cooh、-conhnh2、-(ch2)1-3nh2、-conz“(ch2)1-3nh2、–conz“ch2cooh，其中z“代表-h或-nh2，或hooc-(chx)x-am-ch2-ch2-nh-co-，其中x为2至6的数字，x代表-h、-nh2或-cooh，并且am代表-co-nh-或-nh-co-，(特别优选的是hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-)。

r²代表-h；

r³代表-(ch2)oh、-ch(ch3)oh、-ch2sch2ch(cooh)nhcoch3、-ch(ch3)och3，可被1-3个卤原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基，或hooc-(chx)x-am-ch2-ch2-nh-co-，其中x为2至6的数字，x代表h、nh2或cooh，并且am代表-co-nh-或-nh-co-(特别优选的是hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-)或–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh，其中x为0或1，并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶为-h或-coch3；

r⁵为-h或–f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、(任选地氟代的)c1-3-烷基、(任选地氟代的)c2-4-烯基、(任选地氟代的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸为支链c1-5-烷基；以及

r⁹代表-h或-f。

此外，优选的是(单独或组合地)

●r¹代表–l-#1、-cooh、hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-或-h，

●r²代表-h，

●r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团；

●a代表–c＝(o)-；

●r³代表-(ch2)oh、-ch(ch3)oh、-ch2sch2ch(cooh)nhcoch3、-ch(ch3)och3、可被1-3个卤原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基，hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-、–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh，其中x为0或1，并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶为-h或-coch3，或代表–l-#1；

●r⁵代表-h，

●r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、c1-3-烷基或卤素；特别地，r⁶和r⁷代表-f；

●r⁸代表c1-4-烷基(优选叔丁基)；和/或

●r⁹代表-h，

●其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1。

此外，根据本发明还优选

●r¹代表–l-#1、-cooh、hooc-ch2-ch2-ch(cooh)-nh-co-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-ch2-ch2-co-nh-ch2-ch2-nh-co-；hooc-ch(nh2)-(ch2)4-nh-co-ch2-ch2-nh-co-或-h，

●r²代表-h，

●r⁴代表-h或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团；

●a代表–c＝(o)-，

●r³代表-(ch2)oh、-ch(ch3)oh、-ch2sch2ch(cooh)nhcoch3、-ch(ch3)och3，可被1-3个卤原子、1-3个氨基或1-3个烷基(其可任选地被卤代)取代的苯基，或代表–l-#1；

●r⁵代表-h，

●r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、c1-3-烷基或卤素；特别地，r⁶和r⁷代表-f；

●r⁸代表c1-4-烷基(优选叔丁基)；和

●r⁹代表-h，

●其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1。

另外，根据本发明优选以下adc或apdc：

式(iib)：

其中x1、x2、x3具有与式(iia)中相同的含义(其中优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)，r¹、r²、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹具有与式(iia)中相同的含义，a代表–c(＝o)-，b代表单键、–o-ch2–或–ch2-o-，以及r²⁰代表nh2、f、cf3或ch3并且n代表0、1或2。

式(iic)：

其中x1、x2、x3具有与式(iiia)或(iii)中相同的含义(其中优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)，a、r¹、r³、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹具有与式(iia)中相同的含义，其中a优选地代表–c(＝o)-以及r³代表–ch2oh、-ch2och3、-ch(ch3)oh或-ch(ch3)och3，并且leg代表豆荚蛋白酶可裂解的r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-基团，其中r²¹、p2和p3具有与式(iia)中相同的含义。

式(iid)：

其中x1、x2、x3具有与式(iia)中相同的含义(其中优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)，a、r³、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹具有与式(iia)中相同的含义，其中a优选地为–c(＝o)-以及r³为–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh，其中x为0或1并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶代表-h或-coch3，并且leg代表豆荚蛋白酶可裂解的r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-基团，其中r²¹、p2和p3具有与式(iia)中相同的含义。

式(iie)：

其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n，a、r³、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹具有与式(iiia)或(iii)中相同的含义，并且r1代表-l–#。

此外，优选的是在式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)和(iie)的化合物中(单独或组合地)：

●z代表-cl或-br；

●r¹代表-(ch2)0-3z，其中z代表-co-ny¹y²，其中y²代表-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘并且y¹代表-h、-nh2或-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z’；

●y¹代表-h，y²代表-(ch2ch2o)3-ch2ch2z‘并且z‘代表–cooh；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘并且z‘代表-(conhchy⁴)2cooh；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-(conhchy⁴)2cooh并且y⁴基团中的一个代表异丙基而另一个代表–(ch2)3-nhconh2；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-(conhchy⁴)2cooh并且y⁴基团中的一个代表–ch3而另一个代表–(ch2)3-nhconh2；

●y⁴代表任选地被–nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基；

●至少一个代表性y⁴选自异丙基和–ch3。

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-conhchy⁴cooh并且y⁴代表任选地被–nh2取代的芳基或苄基；

●y⁴代表氨基苄基；

●r²代表–(ch2)0-3z并且z代表–sy³；

●r⁴代表-co-chy⁴-nhy⁵并且y⁵代表h；

●r⁴代表-co-chy⁴-nhy⁵并且y⁵代表–co-chy⁶-nh2；

●y⁴代表任选地被–nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基。

此外，优选的是式(iia)中的r¹、r²或r³代表-mod，特别是当r⁴代表–l-#1时(特别是当–l为直接在–n-r⁴或–n—l-#1处裂解的可裂解接头，以使得r⁴或l被h替代时)。

特别优选地，r³代表-mod并且r¹或r⁴代表–l-#1或–l-binder，

其中–mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-g3，其中

r¹⁰代表-h或c1-c3-烷基；

g1代表–nhco-、-conh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、-conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-c(＝o)-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，g3代表-h或-cooh；以及

其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团。

特别优选地，基团–mod具有(优选末端)-cooh基团，例如在甜菜碱基团中。优选地，基团–mod具有式–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh，其中x为0或1，并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶代表-h或-coch3。

此外，优选的是在式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)或(iiie)中(单独或组合地)：

●z代表-cl或-br；

●r¹代表-(ch2)0-3z，其中z代表-co-ny¹y²，其中y²代表-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘并且y¹代表-h、-nh2或-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z’；

●y¹代表-h，y²代表-(ch2ch2o)3-ch2ch2z‘并且z‘代表–cooh；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘并且z‘代表-(conhchy⁴)2cooh；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-(conhchy⁴)2cooh并且一个代表性y⁴代表异丙基而另一个代表–(ch2)3-nhconh2；

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-(conhchy⁴)2cooh并且一个代表性y⁴代表–ch3而另一个代表–(ch2)3-nhconh2；

●y⁴代表任选地被–nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基；

●至少一个代表性y⁴选自异丙基和–ch3。

●y¹代表-h，y²代表-ch2ch2z‘，z‘代表-conhchy⁴cooh并且y⁴代表任选地被–nh2取代的芳基或苄基；

●y⁴代表氨基苄基；

●r²代表–(ch2)0-3z并且z代表–sy³；

●r⁴代表-co-chy⁴-nhy⁵并且y⁵代表h；

●r⁴代表-co-chy⁴-nhy⁵并且y⁵代表–co-chy⁶-nh2；

●y⁴代表任选地被–nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基。

此外还优选的是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)或(iiie)的化合物，以及其盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或

x1代表n，x2代表c且x3代表n；或

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；或

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch或cf，x2代表n且x3代表c；

(优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)；

r¹代表h、–l-#1、–mod或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-nhy³、-oy³、-sy³、卤素、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2、-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘(例如-(ch2)0-3z‘)或-ch(ch2w)z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、nh2、-so3h、-cooh、-nh-co-ch2-ch2-ch(nh2)cooh或-(co-nh-chy⁴)1-3cooh，其中w代表-h或-oh，

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基；

r²代表-h、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

r⁴代表-h或豆荚蛋白酶可裂解基团

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-；

a代表-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2nh-或-c(＝nnh2)-；

r³代表–l-#1、-mod或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基或c5-10-杂环烷基，其可任选地被以下基团取代：1-3个–oh基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个o-烷基、1-3个–sh基团、1-3个-s-烷基、1-3个-o-co-烷基、1-3个-o-co-nh-烷基、1-3个-nh-co-烷基、1-3个-nh-co-nh-烷基、1-3个-s(o)n-烷基、1-3个-so2-nh-烷基、1-3个-nh-烷基、1-3个-n(烷基)2基团、1-3个-nh((ch2ch2o)1-20h)基团、1-3个-nh2基团或1-3个-(ch2)0-3z基团，其中n代表0、1或2，其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘并且y³代表h、-(ch2)0-3-ch(nhcoch3)z‘、-(ch2)0-3-ch(nh2)z‘或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh(其中“烷基”优选地代表c1-10-烷基)；

r⁵代表-h、-mod、-nh2、-no2、卤素(特别是-f、-cl、-br)、-cn、-cf3、-ocf3、-ch2f、-ch2f、-sh或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-oy³、-sy³、卤素、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、氰基、(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基、羟基、-no2、nh2、-cooh或卤素(特别是-f、-cl、-br)，

r⁸代表(任选地氟代的)c1-10-烷基、(任选地氟代的)c2-10-烯基、(任选地氟代的)c2-10-炔基或(任选地氟代的)c4-10-环烷基；

其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1或均不代表–l-#1，

l代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，

r⁹代表-h、-f、-ch3、-cf3、-ch2f或-chf2；

其中–mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-g3，其中

r¹⁰代表-h或c1-c3-烷基；

g1代表–nhco-、-conh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、-conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-co-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，g3代表-h或-cooh；

其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团。

此外还优选的是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)或(iiie)的化合物，以及其盐、溶剂合物、所述溶剂合物的盐和差向异构体，

其中：

x1代表n，x2代表n且x3代表c；或

x1代表n，x2代表c且x3代表n；或

x1代表ch或cf，x2代表c且x3代表n；或

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch或cf，x2代表n且x3代表c；

(优选x1代表ch，x2代表c且x3代表n)；

r¹代表h、–l-#1、–mod或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-nhy³、-oy³、-sy³、卤素、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2、-(ch2ch2o)0-3-(ch2)0-3z‘(例如-(ch2)0-3z‘)或-ch(ch2w)z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-nh2、-so3h、-cooh、-nh-co-ch2-ch2-ch(nh2)cooh或-(co-nh-chy⁴)1-3cooh，其中w代表-h或-oh，

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基；

r²代表-h、-co-chy⁴-nhy⁵或-(ch2)0-3z，

其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

其中y⁴代表任选地被-nhconh2取代的直链或支链c1-6-烷基，或代表任选地被-nh2取代的芳基或苄基，并且y⁵代表-h或-co-chy⁶-nh2，其中y⁶代表直链或支链c1-6-烷基；

r⁴代表-h或豆荚蛋白酶可裂解基团

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-；

a代表-c(＝o)-、-s(＝o)-、-s(＝o)2-、-s(＝o)2nh-或-c(＝nnh2)-；

r³代表–l-#1、-mod或任选地取代的烷基、环烷基、芳基、杂芳基、杂烷基、杂环烷基，优选c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基或c5-10-杂环烷基，其可任选地被以下基团取代：1-3个–oh基团、1-3个卤原子、1-3个卤代烷基(每一个均具有1-3个卤原子)、1-3个-o-烷基、1-3个–sh基团、1-3个-s-烷基、1-3个-o-co-烷基、1-3个-o-co-nh-烷基、1-3个-nh-co-烷基、1-3个-nh-co-nh-烷基、1-3个-s(o)n-烷基、1-3个-so2-nh-烷基、1-3个-nh-烷基、1-3个-n(烷基)2基团、1-3个-nh((ch2ch2o)1-20h)基团、1-3个-nh2基团或1-3个-(ch2)0-3z基团，其中n代表0、1或2，其中z代表-h、卤素、-oy³、-sy³、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，其中y¹和y²彼此独立地代表h、nh2或-(ch2)0-3z‘并且y³代表h、-(ch2)0-3-ch(nhcoch3)z‘、-(ch2)0-3-ch(nh2)z‘或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表h、so3h、nh2或-cooh(其中“烷基”优选地代表c1-10-烷基)；

r⁵代表-h、-mod、-nh2、-no2、卤素(特别是-f、-cl、-br)、-cn、-cf3、-ocf3、-ch2f、-ch2f、-sh或-(ch2)0-3z，其中z代表-h、-oy³、-sy³、卤素、-nhy³、-co-ny¹y²或-co-oy³，

其中y¹和y²彼此独立地代表-h、-nh2或-(ch2)0-3z‘，并且y³代表-h或-(ch2)0-3z‘，其中z‘代表-h、-so3h、-nh2或-cooh；

r⁶和r⁷彼此独立地代表h或卤素(特别是-f、-cl、-br)，

r⁸代表(任选地氟代的)c1-10-烷基；

其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1或均不代表–l-#1，

l代表接头并且#1代表键合至结合体或其衍生物的键，

r⁹代表-h、-f、-ch3、-cf3、-ch2f或-chf2；

其中–mod代表–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh，其中x为0或1，并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶代表-h或-coch3。

根据本发明特别优选的是以下式v、vi和vii的化合物，其中r¹、r²、r³、r⁴和r⁵具有上述含义(例如对于式(iia)所述的)：

特别优选的是式v、vi、vii的化合物，其中r¹和r⁵代表h或–l-#1；r²代表h；r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，其中p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

其中取代基r¹和r³中的一个代表–l-#1。尤其优选的是对应的式vi的化合物。

本发明的抗体-药物缀合物(adc)优选地具有以下式viii：

其中

m为0至2的数字；

n为0或1；

x为–conh2或–cooh；

la代表自消性接头；

lc代表接头；

a1为衍生自以下氨基酸之一的基团：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

a2为衍生自以下氨基酸之一的基团：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸(当存在多于一个的p3时，p3因此可以具有不同的含义)；

d1为iii的化合物；

r代表z1-(co)q-，其中q为0或1并且z1代表c1-10-烷基、c5-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c5-10-杂芳基烷氧基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、-nh-co-烷基、n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r¹基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r¹代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)，以及ab代表抗体，并且s为1至20的数字，优选2至8，更优选3至5，例如4。

本发明的抗体-前药缀合物(apdc)优选地具有以下式ix：

其中

m为0至2的数字；

n为0或1；

o为0或1；

x为–conh2或–cooh；

la代表自消性接头；

lb代表接头；

a1为衍生自以下氨基酸之一的基团：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

a2为衍生自以下氨基酸之一的基团：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸(当存在多于一个的p3时，p3因此可以具有不同的含义)；

d1为iii的化合物；

r代表z1-(co)q-，其中q为0或1并且z1代表c1-10-烷基、c5-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c5-10-杂芳基烷氧基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、-nh-co-烷基、n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r¹基团(其中x代表0或1而v代表1至20的数字，并且r¹代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)，以及ab代表抗体，并且s为1至20的数字，优选2至8，更优选3至5，例如4。

接头

文献公开了用于将有机分子共价偶联(缀合)到结合体(例如抗体)的各种选择(参见例如k.langandj.w.chin.chem.rev.2014,114,4764-4806,m.rashidianetal.bioconjugatechem.2013,24,1277-1294)。根据本发明优选的是ksp抑制剂或前药通过已经作为游离硫醇存在或通过还原二硫桥产生的一个或多个抗体的半胱氨酸残基的硫原子与抗体缀合，和/或通过一个或多个抗体的赖氨酸残基的nh基团与抗体缀合。然而，也可以通过酪氨酸残基、通过谷氨酰胺残基、通过非天然氨基酸残基、通过游离羧基或通过抗体的糖残基将ksp抑制剂或前药与抗体连接。

根据本发明，还可以将药物分子缀合到结合体的特定缀合位点，这提高了产品的均一性。文献描述了各种缀合位点特异性缀合的方法(agarwaletal.,bioconjug.chem.26,176-192(2015)；caletal.,angew.chem.int.ed.engl.53,10585-10587(2014)；behrensetal.,mabs6,46-53(2014)；panowskietal.,mabs6,34-45(2014))。这些方法还特别包括使用例如转谷氨酰胺酶(tgase)、糖基转移酶或甲酰甘氨酸生成酶((sochajetal.,biotechnologyadvances33,775-784,(2015))的酶促缀合方法。

根据本发明，可以提供纺锤体驱动蛋白抑制剂的缀合位点特异性结合体缀合物，其中纺锤体驱动蛋白抑制剂缀合至结合体的谷氨酰胺侧链。

当结合体是抗体时，其含有受体谷氨酰胺，优选在恒定区。这样的受体谷氨酰胺可以通过将合适位置突变为谷氨酰胺引入(例如重链的突变n297q，kabateu编号)或通过产生去糖基化或非糖基化抗体引入(例如通过借助于pngasef的酶促去糖基化或通过重链的突变n297x，kabateu编号(此处x可以是除n之外的任何氨基酸))。在去糖基化或非糖基化抗体的后一种情况下，重链的谷氨酰胺残基q295(kabateu编号)变成受体谷氨酰胺。特别优选的是含有n297a或n297q突变(kabateu编号)的抗体。因此，本发明中描述的所有抗体同样包括这些抗体的非糖基化变体，其是通过借助于pngasef的去糖基化或通过将重链的n297(kabateu编号)(抗体的kabat编号体系，参见kabatetal.,sequencesofproteinsofimmulologicalinterest,第5版publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))突变为除n以外的任何其他氨基酸来产生。此外，本文所述的所有抗体同样包含所述抗体的变体，其凭借工程改造而含有用于转谷氨酰胺酶催化的反应的一个或多个受体谷氨酰胺残基。

用于这种缀合位点特异性缀合的一种方法是文献中描述的涉及借助转谷氨酰胺酶进行的结合体的缀合位点特异性缀合的方法。还包括细菌转谷氨酰胺酶(btg)(ec2.3.2.13)的转谷氨酰胺酶(tgase)是催化谷氨酰胺的γ-羰基-酰胺基团与赖氨酸的伯胺基团之间形成共价键的酶家族。由于此类转谷氨酰胺酶也接受除赖氨酸以外的底物作为胺供体，所以其被用于在合适的受体谷氨酰胺处修饰蛋白质(包括抗体)(jegeretal.,angewandtechemieint.ed.engl49,9995-9997(2010)；jostenetal.,j.immunol.methods240,47-54(2000)；mindtetal.,bioconjugatechem.19,271-278(2008)；dennleretal.,inantibodydrugconjuagtes(ducry,l.,ed.),pp205-215,humanapress.(2013))。一方面，转谷氨酰胺酶已经用于将药物缀合至含有人工谷氨酰胺标签的抗体，所述人工谷氨酰胺标记是已通过基因工程引入至抗体中的受体谷氨酰胺残基(stropetal.,chem.biol.20,161-167(2013))。另一方面，已经指出抗体重链恒定区的保守谷氨酰胺残基q295(kabateu编号)是非糖基化igg1分子的骨架中用于细菌转谷氨酰胺酶(ec2.3.2.13)的唯一γ-羰基-酰胺供体，因此是受体谷氨酰胺，而当抗体已在重链的n297位(kabateu编号)处被糖基化时，则在igg1的骨架中不存在受体谷氨酰胺(jegeretal.,angewandtechemieint.ed.engl49,9995-9997(2010))。总之，细菌转谷氨酰胺酶可以用于在抗体的受体谷氨酰胺残基处缀合胺-供体底物，例如药物-接头构建体。这样的受体谷氨酰胺可以通过以下方式引入：通过突变来工程改造抗体或通过产生非糖基化抗体。可以通过使用n-糖苷酶f(pngasef)的去糖基化或通过将重链的糖基化位点的n297(kabateu编号)突变为除n以外的任何其他氨基酸来引入这样的非糖基化抗体。对于含有突变n297d、n297q(jegeretal.,angewandtechemieint.ed.engl49,9995-9997(2010))或n297s(参见专利申请wo2013092998a1andwo2013092983a2)的非糖基化抗体变体，已经记载了使用细菌转谷氨酰胺酶进行的这种非糖基化抗体的酶促缀合。通过转谷氨酰胺酶进行的这种非糖基化抗体的酶缀促合通常提供dar为2的adc，其中两条重链在位置q295(kabateu编号)处均被特异性地功能化。只有重链的n297q突变为每个重链提供额外的缀合位点。这种变体的缀合产生adc为4的dar，其中两条重链在位置q295和q297处均被特异性功能化。

其中重链携带突变q295n和n297q的抗体变体在每个重链的位置q297(kabat编号)仅具有一个受体谷氨酰胺残基(simonejeger,sitespecificconjugationoftumourtargetingantibodiesusingtransglutaminase,thesisatethzurich(2009))。在文献中有几个实例描述了使用细菌转谷氨酰胺酶进行的非糖基化抗体的缀合位点特异性缀合(例如dennleretal.,bioconjugatechemistry19,569-578(2014)；lhospiceetal.,molecularpharmaceutics12,1863-1871(2015))。图3总结了非糖基化抗体的转谷氨酰胺酶催化的缀合位点特异性功能化的策略。

偶联——以缀合位点特异性和以缀合位点非特异性方式——都是使用所谓的接头完成的。可以将接头分为可在体内裂解的接头组和在体内稳定的接头组(参见l.ducryandb.stump,bioconjugatechem.21,5-13(2010))。可在体内裂解的接头具有可在体内裂解的基团，其中又可区分可在体内化学裂解的基团和可在体内酶促裂解的基团。“可在体内化学裂解”和“可在体内酶促裂解”意指接头或基团在循环中稳定并且仅在靶细胞处或靶细胞内被其中不同的化学或酶促环境(较低的ph；升高的谷胱甘肽浓度；存在溶酶体酶如豆荚蛋白酶、组织蛋白酶或纤溶酶，或糖苷酶如例如β-葡糖醛酸糖苷酶)裂解，从而释放低分子量ksp抑制剂或其衍生物。可在体内化学裂解的基团特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；可在体内酶促裂解的基团特别是2-8-寡肽基团，特别是二肽基团或糖苷。肽裂解位点公开于bioconjugatechem.2002,13,855-869和bioorganic&medicinalchemistryletters8(1998)3341-3346，以及bioconjugatechem.1998,9,618-626。这些包括例如丙氨酸-丙氨酸-天冬酰胺、缬氨酸-丙氨酸、缬氨酸-赖氨酸、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-赖氨酸以及苯丙氨酸-赖氨酸(任选地具有额外的酰胺基团)。

为了确保游离药物的有效释放，任选地也可以在酶促裂解位点与药物之间掺入所谓的自消性接头元件(例如在上式iia中的sig或在上式viii和ix中的la)(anticanceragentsinmedicinalchemistry,2008,8,618-637)。药物可以通过各种机制释放，例如在初始酶促释放亲核基团之后，随后通过经由电子级联进行消除(bioorg.med.chem.,1999,7,1597；j.med.chem.,2002,45,937；bioorg.med.chem.,2002,10,71)或通过环化相应的接头元件(bioorg.med.chem.,2003,11,2277；bioorg.med.chem.,2007,15,4973；bioorg.med.chem.lett.,2007,17,2241)或通过两者的组合(angew.chem.inter.ed.,2005,44,4378)。图中示出了这样的接头元件的实例：

用于药物释放的连续酶促步骤的实例，例如借助组蛋白脱乙酰酶和组织蛋白酶l，记载于nat.commun.,2013,4,2735(参见图4)。

在体内稳定的接头的特征为高稳定性(在血浆中24小时后少于5％的代谢物)，并且不具有上述可在体内化学或酶促裂解的基团。

接头-l-(如式viii中的lc和式ix中的lb)优选地具有以下基础结构(i)至(iv)中的一种：

(i)–(c＝o)m–sg1-l1-l2-

(ii)–(c＝o)m–l1-sg-l1-l2-

(iii)–(c＝o)m–l1-l2-

(iv)–(c＝o)m–l1-sg-l2

其中m为0或1；sg是一种可在体内(化学或酶促)裂解的基团(特别是二硫化物、腙、缩醛和缩醛胺；或可被豆荚蛋白酶、组织蛋白酶或纤溶酶裂解的2-8-寡肽基团)，sg1是寡肽基团或优选地为二肽基团，l1代表在体内稳定的有机基团，而l2代表与结合体的偶联基团或单键。此处，偶联优选地为连接至抗体的半胱氨酸残基或赖氨酸残基。或者，偶联可以连接至抗体的酪氨酸残基、谷氨酰胺残基或非天然氨基酸。非天然氨基酸可以含有例如醛或酮基(例如甲酰甘氨酸)或叠氮基或炔基(参见lan&chin,cellularincorporationofunnaturalaminoacidsandbioorthogonallabelingofproteins,chem.rev.2014,114,4764-4806)。

根据本发明特别优选的是基础接头结构(iii)。通过代谢，具有基础接头结构(iii)的本发明缀合物的给药以及接头与抗体的半胱氨酸或赖氨酸残基的偶联得到下式的半胱氨酸或赖氨酸衍生物：

其中l1在每种情况下均连接至低分子量ksp抑制剂，例如式(iii)或(iia)、(iib)、(iic)、(iid)、(iie)、(iif)或(iv)的化合物，其中–l-#1代表分别衍生自赖氨酸和半胱氨酸的上述两个基团之一。

根据本发明还优选的是基础接头结构(ii)和(iv)，特别是当在位置r1处连接时，特别是当基团l1具有以下结构之一时：

(a)–nh-(ch2)0-4-(chch3)0-4-chy⁵-co-y⁷，其中y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶代表-h或-coch3，并且y⁷代表单键或–nh-(ch2)0-4–chnh2-co-，以使得在裂解后获得对应的结构–nh-(ch2)0-4-(chch3)0-4-chy⁵-cooh或–nh-(ch2)0-4-(chch3)0-4-chy⁵-co-nh-(ch2)0-4-chnh2-cooh。

(b)–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-co-，其中x为0或1，并且y⁵代表-h或-nhy⁶，其中y⁶代表-h或-coch3，以使得在裂解后获得对应的结构–ch2-sx-(ch2)0-4-chy⁵-cooh。

当连接至位置r⁴时，特别是如果m＝0时，根据本发明还优选的是基础接头结构(i)。

如果接头连接到半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基上，则l2优选地衍生自与半胱氨酸的巯基反应的基团。这些包括卤代乙酰基、马来酰亚胺、氮丙啶、丙烯酰基、芳基化化合物、乙烯基砜、吡啶基二硫化物、tnb硫醇和二硫化物还原剂。这些基团通常以亲电子方式与巯基键反应，形成硫化物(例如硫醚)或二硫桥。优选的是稳定的硫桥。l2优选地为

其中

#¹表示与抗体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，并且

r²²代表-cooh、-coor、-cor、-conhr、-conr2(其中r在每种情况下代表c1-3-烷基)、-conh2，优选-cooh。

对于l2特别优选的是：

或

其中#1表示与抗体的硫原子的连接点，#2表示与药物的连接点，x代表1或2，并且r²²代表-cooh、-coor、-cor、-conr2、-conhr(其中r在每种情况下代表c1-3-烷基)、-conh2，优选-cooh。优选x＝1并且r²²代表-cooh。

在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选大于90％(在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选作为式a3或a4的两种结构之一。在本文中，式a3或a4的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在

根据本发明，l1优选由下式表示

#¹–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-#²

其中

r¹⁰代表-h、-nh2或c1-c3-烷基；

g1代表–nhco-、-conh-或(其中如果g1代表–nhco-或则r¹⁰不为-nh2)；

n为0或1；

o为0或1；以及

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、-c(nh)nr^y-、conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表-h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-co-、-cr^x＝n-o-(其中r^x代表h、c1-c3-烷基或苯基)和/或具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环、-so-或-so2-(优选)，其中包括任何侧链的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-so-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

g2优选地代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10-元(例如5-至10-元)芳族或非芳族杂环、-so-或-so2-(优选)，其中包括侧链(如果存在的话)的烃链可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

g2中的其他间断基团优选地为

其中r^x代表h、c1-c3-烷基或苯基。

在本文中，#1是与ksp抑制剂或前药连接的键，而#2是与抗体的偶联基团(例如l2)连接的键。

亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链通常包括具有所述的各个数目的碳原子的α,ω-二价烷基。优选的实例包括：亚甲基、乙烷-1,2-二基(1,2-亚乙基)、丙烷-1,3-二基(1,3-亚丙基)、丁烷-1,4-二基(1,4-亚丁基)、戊烷-1,5-二基(1,5-亚戊基)、己烷-1,6-二基(1,6-亚己基)、庚烷-1,7-二基(1,7-亚庚基)、辛烷-1,8-二基(1,8-亚辛基)、壬烷-1,9-二基(1,9-亚壬基)、癸烷-1,10-二基(1,10-亚癸基)。然而，烃链中的亚烷基还可为支链的，即上述直链亚烷基的一个或多个氢原子可任选地被c1-10-烷基取代，从而形成侧链。此外，烃链还可含有环状亚烷基(环烷二基)，例如1,4-环己烷二基或1,3-环戊烷二基。这些环状基团可以是未饱和的。特别地，在烃基中可以存在芳族基团(亚芳基)，例如亚苯基。而且，也在环状亚烷基和亚芳基中，一个或多个氢原子还可任选地被c1-10-烷基取代。以此方式，形成任选地支化的烃链。该烃链具有总共0至100个碳原子，优选1至50个，特别优选2至25个碳原子。

侧链(如果存在的话)可以相同或不同地被-nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸单取代或多取代。

烃链可被一个或多个以下基团相同或不同地间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、-so2-、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的5-至10元芳族或非芳族杂环、-so-或-so2-(优选)。

g2中的其他间断基团优选地为

优选地，接头对应于下式：

§-(co)m-l1-l2-§§

其中

m为0或1；

§代表与药物分子或前药连接的键以及

§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，并且

l1和l2具有以上给出的含义。

特别优选地，l1具有式–nr¹¹b-，其中

r¹¹代表-h或-nh2；

b代表–[(ch2)x-(x⁴)y]w-(ch2)z-，

w＝0至20；

x＝0至5；

x＝0至5；

y＝0或1；

z＝0至5；并且

x⁴代表–o-、-conh-、–nhco-或

根据本发明优选的接头l具有下式：

其中

#3代表与药物分子或前药连接的键，

#4代表与结合肽或蛋白质连接的键，

r¹¹代表-h或-nh2；

b代表–[(ch2)x-(x⁴)y]w-(ch2)z-，

w＝0至20；

x＝0至5；

y＝0或1；

z＝1至5；并且

x⁴代表–o-、-conh-、–nhco-或

进一步优选的是其中接头l1是以下基团之一的接头：

§-nh-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)6-§§；

§-nh-(ch2)2-o-(ch2)2-§§；

§-nh-ch(cooh)-(ch2)4-§§

§-nh-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-o-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)3-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch(ch3)-§§；

§-nh-(ch2)2-o-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-(ch2)4-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch(c2h4cooh)-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)3-(ch2)2-§§；

§-nh-(ch2)2-s(＝o)2-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)3-nh-c(＝o)-ch2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-ch(ch2cooh)-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch(c2h4cooh)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-ch(ch2oh)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch[c(＝o)-nh-(ch2)2-o)4-(ch2)2cooh]-ch2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-§§；

§-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-ch(ch3)-c(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nhc(＝o)-nh-(ch2)2-§§；

§-nhc(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-nhc(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nhc(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nhc(＝o)-nh-(ch2)4-ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-ch(isoc3h7)-c(＝o)-nh-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-c(＝o)-oc(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-ch(isoc3h7)-c(＝o)-nh-ch(ch3)-c(＝o)-oc(＝o)-ch2-§§；

§-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)§§；

§-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)§§；

§-nh-(ch2)2-c(＝o)-nh-ch(ch3)-c(＝o)-nh-ch[(ch2)3-nh-c(＝o)-nh2]-c(＝o)-nh§§；

§-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-§§；

§-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-§§；

§-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-(ch2)5-c(＝o)-nh-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)2-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)2-(ch2)5-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch5-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-ch(cooh)-ch2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(nh2)-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)2-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)2-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)5-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)2-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-ch(cooh)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-(ch2)2-c(＝o)-nh-ch(c2h4cooh)-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[nh-c(＝o)-(ch2)2-cooh]-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-ch3]-c(＝o)-nh-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch(ch3)-nh-c(＝o)-ch(isoc3h7)-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[nh-c(＝o)-(ch2)2-cooh]-c(＝o)-nh-(ch2)2-s(＝o)2-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[nh-c(＝o)-(ch2)2-cooh]-c(＝o)-nh-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[c(＝o)-nh-(ch2)2-cooh]-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o-ch2-§§；

§-ch2-s-ch2ch[c(＝o)-nh-(ch2)2-cooh]-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§；

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-(ch2)2ch(cooh)-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-ch2-§§

或

§-ch2-s-ch2ch(cooh)-nh-c(＝o)-ch[(ch2)2-cooh]-nh-c(＝o)-((ch2)2-o)4-(ch2)2-nh-c(＝o)-(ch2)2-§§，

其中

§代表连接至活性成分分子的键

§§代表连接至抗体的键并且

isoc3h7代表异丙基。

在其中接头是通过r¹处的氢原子的取代偶联或在r4处与可裂解的接头sg1组合偶联的式(iia)的缀合物中，尤其优选上述接头，即r1代表-l-#1或r4代表-sg1-l-#1，其中#1代表与抗体连接的键。

此外根据本发明还优选的是以下接头：在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与抗体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与抗体连接的键的总数计)，特别优选地作为式a5或a6的两个结构之一：

其中

#¹表示与抗体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，并且

r²²代表-cooh、-coor、-cor、-conr2、-conhr(其中r在每种情况下代表c1-3-烷基)、-conh2，优选-cooh。

在本文中，式a5或a6的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至抗体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在

其他连接至半胱氨酸侧链或半胱氨酸残基的接头-l-具有下式：

其中

§代表与药物分子或前药连接的键以及

§§代表与结合肽或蛋白质连接的键，

m代表0、1、2或3；

n代表0、1或2；

p代表0至20；并且

l3代表

其中

o为0或1；

并且

g3代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元(优选5-至10元)芳族或非芳族杂环、-so-或-so2-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

在上式中，优选地

m为1；

p为0；

n为0；

并且l3代表

其中

o为0或1；并且

g3代表-(ch2ch2o)s(ch2)t(conh)uch2ch2o)v(ch2)w-，其中

s、t、v和w每一个均彼此独立地为0至20而u为0或1。

上述式§-(co)m-l1-l2-§§中的优选基团l1如下所示，其中r代表0至20的数字，优选0至15，特别优选1至20，尤其优选2至10：

表c中给出了l1的其他实例，其中该基团在框中突出显示。

下表a和a'中给出了接头部分l1的实例。此外该表还说明了这些l1的实例优选地与哪个基团l2组合，还有优选的偶联点(r¹或r³或r⁴)和m的优选值，这是l1前面是否存在羰基(参见§-(co)m-l1-l2-§§)。这些接头优选地与半胱氨酸残基偶联。如果l2是琥珀酰亚胺或由其衍生，则该酰亚胺也可以完全或部分地为水解的开链琥珀酰胺的形式，如上所述。根据l1，这种向开链琥珀酰胺的水解可能或多或少是显著的或根本不存在。

表a

**特别优选的，在这些行中给出的接头l1连接到选自以下的接头l2上：

和/或

其中#¹表示与结合体的硫原子的连接点，#²表示与基团l¹的连接点，r²²优选地代表-cooh。在本发明的缀合物中或在本发明的缀合物的混合物中，存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，其程度优选地大于80％，特别优选地大于90％(在每种情况下均基于接头与结合体连接的键的总数计)，特别优选作为式a7或a8的两种结构之一。此处，式a7或a8的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比例，基于连接至结合体的键的数目计。然后剩余的键以以下结构存在

表a‘

**:参见表a的注**。

***:当存在该结构l2时，可同时存在下式的结构l2：

具有相应接头的缀合物的实例具有以下结构，其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n，并且l1具有以上给出的含义，l2和l3具有与l1相同的含义，ak1代表通过半胱氨酸残基连接的抗体并且n为1至10的数字。更优选地，ak1优选地是人类、人源化或嵌合单克隆抗体。特别优选的是与tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)特异性结合的非糖基化的抗tweakr的抗体，特别是抗tweakr的抗体tpp-2658。

当接头连接到赖氨酸侧链或赖氨酸残基时，可以使用与上述接头相同的接头来偶联至半胱氨酸侧链，除了l2优选地为羰基(例如通过相应的活化羧酸进行偶联)。

具有基础结构(i)的缀合物的实例具有以下结构之一，其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n，l4具有与l1相同的含义，ak1为通过半胱氨酸残基连接的非糖基化的抗tweakr的抗体，并且n为1至10的数字，并且式iia的位置r⁴中(即在-nh2基团中)的氢原子被式r²¹-co-p3-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团替代：

其中r²¹代表c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被-nh2、-so3h、-cooh、-sh或–oh单取代或多取代：p2为单键或选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg和his；

p3为单键或选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg和his。

特别优选的是与tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)特异性结合的抗tweakr的抗体，特别是非糖基化的抗tweakr的抗体tpp-2658。

在转谷氨酰胺酶催化的缀合的情况下，文献公开了以缀合位点特异性方式将有机分子共价偶联(缀合)至结合体(例如抗体)的各种选择(参见例如sochajetal.,biotechnologyadvances,33,775-784,(2015),panowskietal.,mabs6,34-45(2014))。根据本发明优选的是使用转谷氨酰胺酶通过抗体的受体谷氨酰胺残基将ksp抑制剂或前药缀合至所述抗体。这种受体谷氨酰胺残基可以通过抗体的工程改造或通过产生非糖基化的抗体的突变来生成。抗体中的这些受体谷氨酰胺的数目优选地为2或4。使用合适的接头用于偶联(缀合)。合适的接头结构是具有游离胺供体官能度的那些接头，所述游离胺供体官能度构成转谷氨酰胺酶的合适底物。所述接头能够以多种方式连接到所述抗体。

优选地，在转谷氨酰胺酶催化的缀合的情况下，接头具有上述基础结构(i)至(iv)中的一种，其中l1、sg、sg1和m具有以上给出的含义，但l2优选地为以下基团中的一种：

其中ry为-h、nhco烷基、-nh2

或

其中ry为-conh烷基、-conh2，

其中

#¹代表与l¹的连接点

#²代表与结合体的谷氨酰胺残基的连接点。

优选地，ry为h或-nhcome。

相应的缀合物的实例具有以下结构，其中x1、x2、x3、ry和l1具有与上述相同的含义，ak代表结合体，优选抗体，其中n优选地为2或4：

特别优选的ksp抑制剂缀合物

根据本发明特别优选的是如下的ksp抑制剂缀合物，其中ak(ak1；ak2；ak3)代表结合体或其衍生物(优选抗体)，并且n为1至50的数字，优选1.2至20且更优选地为2至8。ak1优选地为通过半胱氨酸残基键合至ksp抑制剂的抗体；ak2；优选地为通过赖氨酸残基键合至ksp抑制剂的抗体；ak3优选地为通过谷氨酰胺残基键合至ksp抑制剂的抗体。本文所使用的结合体或抗体优选地为说明书中优选描述的结合体和抗体。

ksp抑制剂-接头中间体或前体-接头中间体以及缀合物的制备

本发明的缀合物是通过首先提供低分子量的ksp抑制剂或其前药与接头来制备。然后将以此方式获得的中间体与结合体(优选抗体)反应。

优选地，为了与半胱氨酸残基偶联，将以下化合物中的一种与含半胱氨酸的结合体(如抗体)反应，所述抗体任选地为此目的而被部分还原：

其中r代表-h或–cooh，

其中k代表任选地被c1-c6-烷氧基或–oh取代的直链或支链c1-c6烷基，并且

其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n，sg1、l1、l2、l3和l4具有与上述相同的含义。

在上述式中，同样也在下面的反应方案和结构式中，式iia的位置r⁴中(即在-nh2基团中)的氢原子可以被式

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式

r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团替代

其中p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

其中r²¹代表c1-10-烷基、c6-10-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被-nh2、-so3h、-cooh、-sh或–oh单取代或多取代。

在每一个上述化合物以及下述化合物中，叔丁基可以被环己基替代。

该化合物可以例如以其三氟乙酸盐的形式使用。对于与结合体(例如抗体)的反应，所述化合物优选地以相对于所述结合体来说2至12倍摩尔过量来使用。

优选地，为了与赖氨酸残基偶联，使以下化合物中的一种与含赖氨酸的结合体(例如抗体)反应：

其中x1代表ch，x2代表c且x3代表n，并且l4与l1具有相同的含义，而l1具有与上述相同的含义。

对于与半胱氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：

其他中间体和其他抗体可以相应地反应。

对于与赖氨酸残基的中间体偶联，所述反应可以如下所示：

根据所述接头，在缀合后，琥珀酰亚胺连接的adc可以转化为开链琥珀酰胺，其具有有利的稳定性特征。

该反应(开环)可以在ph7.5至9(优选在ph8)，在25℃至37℃的温度下进行，例如通过搅拌。优选的搅拌时间是8至30小时。

在上式中，x1代表ch、x2代表c且x3代表n，sg1和l1具有与上述相同的含义，l2、l3和l4具有与l1相同的含义；r和k具有与上述相同的含义。ak1是通过半胱氨酸残基偶联的非糖基化抗tweakr的抗体，ak2是通过赖氨酸残基偶联的非糖基化抗tweakr的抗体。更优选地，ak1和ak2是与tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)特异性结合的非糖基化抗tweakr的抗体，特别是非糖基化抗tweakr的抗体tpp-2658。

其他定义

表述“转谷氨酰胺酶”，也可互换地用作“tgase”或“tg”，其应被理解为是指具有通过酰基转移反应连接蛋白质的能力的酶，所述酰基转移反应是在肽结合的谷氨酰胺的γ-羧酰胺基与赖氨酸的ε-氨基或结构上相关的伯胺(例如氨基戊基)或例如肽结合的赖氨酸的ε-氨基之间的进行，其生成8-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸异肽键。tgase包括细菌转谷氨酰胺酶(btg)，例如具有ec参考号2.3.2.13的酶(蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶)。

当涉及抗体的氨基酸残基时，表述“受体谷氨酰胺”是指这样的谷氨酰胺残基，即其在合适的条件下被转谷氨酰胺酶识别，并且可以在转谷氨酰胺酶催化下通过该特定谷氨酰胺和赖氨酸或结构上相关的伯胺(例如氨基戊基)之间的反应与其相连。受体谷氨酰胺可以是表面暴露的谷氨酰胺。

本文的“氨基酸修饰”或“突变”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。本文优选的氨基酸修饰是取代。本文的“氨基酸取代”或“取代”是指在蛋白序列的给定位置处的氨基酸被替代为另一个氨基酸。例如，取代y50w描述了其中第50位的酪氨酸已被替代为色氨酸的亲本多肽的变体。多肽的“变体”描述了具有与参考多肽(通常是天然多肽或“亲本”多肽)基本上相同的氨基酸序列的多肽。多肽变体可以在天然氨基酸序列中的特定位置处具有一个或多个氨基酸替代、缺失和/或插入。

表述“缀合位点特异性缀合物”描述了结合体(优选抗体)和残基(优选接头-药物残基)的缀合物，其中所述结合体在一个或多个限定位置(优选谷氨酰胺残基)处被官能化。转谷氨酰胺酶(tgase)(包括细菌转谷氨酰胺酶(btg)(ec2.3.2.13))在识别谷氨酰胺-蛋白质底物方面表现出强的特异性，并且可以催化“缀合位点特异性缀合”。

表述“均一缀合物”或“均一adc”描述了缀合位点特异性缀合物的混合物，其中至少60％、70％、80％或90％的结合体的每个结合体具有相同数量的缀合残基。在抗体的情况下，该数目应该是偶数，优选2或4。

结合体(binder)

从广义上讲，术语“结合体”被理解为是指结合至存在于待由结合体-药物缀合物解决的某个靶细胞群处的靶分子的分子。术语结合体应理解为以其最广泛的含义，并且还包括例如凝集素、能够结合某些糖链的蛋白质和磷脂结合蛋白。这样的结合体包括例如高分子量蛋白(结合蛋白)、多肽或肽(结合肽)、非肽(例如由keefead.,etal.,nat.rev.drugdiscov.2010；9:537-550综述的适体(us5,270,163)或维生素)以及所有其他细胞结合分子或物质。例如，结合蛋白是抗体和抗体片段或抗体模拟物，例如亲和体(affibody)、阿德奈汀(adnectin)、抗运载蛋白(anticalin)、darpins、高亲合性多聚体(avimer)、纳米抗体(nanobody)(由gebauerm.etal.,curr.opinioninchem.biol.2009；13:245-255；nuttalls.d.etal.,curr.opinioninpharmacology2008；8:608-617综述)。结合肽是例如配体的配体/受体对，例如配体的vegf/受体对vegf/kdr，如配体的转铁蛋白/受体对转铁蛋白/转铁蛋白受体或细胞因子/细胞因子受体，如配体的tnfα/受体对tnfα/tnfα受体。

“结合体”可以含有受体谷氨酰胺残基，其可以通过转谷氨酰胺酶(tgase)(包括细菌转谷氨酰胺酶(btg)(ec2.3.20.13))官能化。该受体谷氨酰胺可以以天然形式存在于结合体中，或者以特别方式产生。受体谷氨酰胺可以通过在合适的位置插入谷氨酰胺残基(例如通过含有受体谷氨酰胺的融合标签，或通过适当位置的突变产生谷氨酰胺残基)产生，或受体谷氨酰胺是由任何氨基酸的突变产生的，所述突变导致事先未被转谷氨酰胺酶识别的特定谷氨酰胺残基转化为受体谷氨酰胺，或者受体谷氨酰胺是通过翻译后修饰中的修饰(例如糖基化)产生的，这种改变具有使事先未被转谷氨酰胺酶识别的天然存在的谷氨酰胺成为受体谷氨酰胺的作用。当结合体是抗体时，它含有受体谷氨酰胺，优选地在恒定区。这样的受体谷氨酰胺可以通过将合适的位置突变为谷氨酰胺(例如突变n297qkabateu编号)产生或通过产生去糖基化或非糖基化的抗体(例如通过借助pngasef的去糖基化或通过突变n297x，kabateu编号)产生。在去糖基化或非糖基化抗体的后一种情况中，重链的谷氨酰胺残基q295(kabateu编号)变成受体谷氨酰胺。特别优选含有n297a或n297q突变(kabateu编号)的抗体。

术语“非糖基化抗体”或“去糖基化抗体”在本文中用于定义含有fc区的抗体或抗体衍生物，所述fc区缺少连接至ch2结构域中的保守性l-糖基化位点的聚糖。例如，非糖基化抗体可以通过重链的糖基化位点n297(kabateu编号)的突变或通过在缺少糖基化能力的表达系统中表达抗体来产生。抗体去糖基化的方法是公知常识(例如winkelhake&nicolson(1976),jbiolchem.251(4):1074-80))。去糖基化抗体可以例如通过借助pngasef进行的酶促去糖基化来产生。在本发明的一个实施方案中，可以通过在原核宿主中表达来获得去糖基化抗体。合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)以及假单胞菌属(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)和葡萄球菌属(staphylococcusgenera)的一些种。在本发明的另一个实施方案中，去糖基化抗体可以通过使用哺乳动物细胞表达系统以及糖基化抑制剂衣霉素来获得(nose&wigzell(1983),procnatlacadsciusa,80(21):6632-6)。此时，所述修饰是防止抗体的fc部分的ch2结构域中的重链的保守性n-糖基化位点n297处的糖基化(kabat编号)。

所述文献还公开了有机分子与抗体的缀合位点特异性共价偶联(缀合)的各种选择。关于本发明特别关注的是毒性基团与抗体通过抗体的两个或四个受体谷氨酰胺残基的缀合。

所述文献还公开了有机分子与抗体共价偶联(缀合)的各种选择。根据本发明优选的是通过抗体的半胱氨酸残基的一个或多个硫原子和/或通过抗体的赖氨酸残基的一个或多个nh基团将毒性基团与抗体缀合。然而，还可以通过游离羧基或通过抗体的糖残基将毒性基团与抗体结合。

最广义上的“靶分子”应理解为是指存在于靶细胞群中的分子，其可以是蛋白质(例如生长因子的受体)或非肽类分子(例如糖或磷脂)。其优选地是受体或抗原。

术语“细胞外”靶分子描述了附着于细胞上的靶分子，其位于细胞外部，或位于细胞外部的靶分子的一部分，即结合体可以在完整细胞上结合其细胞外靶分子。细胞外靶分子可以锚定在细胞膜中或者是细胞膜的组分。本领域技术人员会知道鉴定细胞外靶分子的方法。对于蛋白质，这可以通过确定所述蛋白质的跨膜结构域和所述蛋白质在膜中的定向来鉴定。这些数据通常被存储在蛋白质数据库(例如swissprot)中。

术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子，与非癌细胞相比，其更大量地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上。优选地，与非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上，其中与非癌细胞相比，选择性地描述了在相同组织类型的癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。使用癌症靶分子允许使用本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。

结合体可以通过键连接至接头。结合体的连接可以通过结合体的杂原子。根据本发明的可用于连接的结合体的杂原子是硫(在一个实施方案中通过结合体的巯基)、氧(根据本发明借助于结合体的羧基或羟基)和氮(在一个实施方案中通过结合体的伯胺或仲胺基团或酰胺基团)。这些杂原子可以存在于天然结合体中或通过化学方法或分子生物学方法引入。根据本发明，所述结合体与所述的毒性基团的连接对结合体相对于靶分子的结合活性仅具有很小的影响。在优选的实施方案中，连接对结合体相对于靶分子的结合活性没有影响。

根据本发明，术语“抗体”应理解为其最广泛的含义并包含免疫球蛋白分子，例如完整或修饰的单克隆抗体、多克隆抗体或多特异性抗体(例如双特异性抗体)。免疫球蛋白分子优选地包括具有四条多肽链的分子，通常通过二硫键连接的两条重链(h链)和两条轻链(l链)。每条重链包含重链的可变域(缩写为vh)和重链的恒定域。例如，重链的恒定域可以包含三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链包含可变域(缩写为vl)和恒定域。轻链的恒定域包含结构域(缩写为cl)。vh和vl结构域可以进一步细分成具有超变性(hypervariability)的区域，也称为互补决定区(缩写为cdr)和具有低序列变异性的区域(框架区，缩写为fr)。通常，每个vh和vl区由三个cdr和最多四个fr组成。例如从氨基末端到羧基末端按以下顺序：fr、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。抗体可以从任何合适的物种获得，例如，兔、骆马(llama)、骆驼、小鼠或大鼠。在一个实施方案中，抗体是人源的或鼠源的。抗体可以例如是人的、人源化的或嵌合的。

术语“单克隆”抗体是指从基本上均一的抗体群获得的抗体，即所述群体的单个抗体除了天然发生的突变之外是相同的，突变可以是小数目。单克隆抗体以高特异性识别单个抗原结合位点。术语单克隆抗体不是指特定的制备过程。

术语“完整”抗体是指包含抗原结合结构域以及轻链和重链的恒定域的抗体。恒定域可以是天然存在的结构域或其具有许多修饰的氨基酸位置的变体，并且也可以是非糖基化的。

术语“修饰的完整”抗体是指这样的完整抗体，其是通过其氨基末端或羧基末端借助于共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另外的多肽或蛋白质融合。此外，抗体可以被修饰以便在确定的位置引入反应性半胱氨酸以促进与毒性基团的偶联(参见junutulaetal.，natbiotechnol.2008aug；26(8):925-32)。

术语“人”抗体是指这样的抗体，其可以从人获得的或者是合成的人抗体。“合成的”人抗体是基于对人抗体序列的分析通过计算机部分或完全地从合成序列获得的抗体。例如，人抗体可以由从人源的抗体序列文库分离的核酸编码。这样的抗体的实例可以发现于etal.,naturebiotech.2000,18:853-856。这样的“人”和“合成”抗体还包括通过由pngasef进行的去糖基化或重链的n297(kabat编号)突变成任何其他氨基酸而产生的非糖基化变体。

术语“人源化”或“嵌合”抗体描述了由序列的非人的部分和人的部分组成的抗体。在这些抗体中，人免疫球蛋白(受体)的部分序列被非人免疫球蛋白(供体)的序列部分取代。在很多情况中，供体是鼠免疫球蛋白。在人源化抗体的情况下，受体的cdr的氨基酸被供体的氨基酸替代。有时，框架的氨基酸也被供体的相应氨基酸替代。在一些情况下，人源化抗体含有在抗体优化期间引入的，既不存在于受体中也不存在于供体中的氨基酸。在嵌合抗体的情况下，供体免疫球蛋白的可变域与人抗体的恒定区融合。此类“人源化”和“嵌合”抗体还包括通过由pngasef进行的去糖基化或重链的n297(kabat编号)突变成任何其它氨基酸而产生的非糖基化变体。

如本文所用，术语互补决定区(cdr)是指与抗原结合所需的可变抗体结构域的那些氨基酸。通常，每个可变区具有称为cdr1、cdr2和cdr3的三个cdr区。每个cdr区可以包含根据kabat的定义的氨基酸和/或根据chotia定义的超可变(hypervariable)环的氨基酸。根据kabat的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置24-34(cdr1)、50-56(cdr2)和89-97(cdr3)的区域以及可变重链的31-35(cdr1)、50–65(cdr2)和95–102(cdr3)的区域(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.publichealthservice,nationalinstitutesofhealth,bethesda,md.(1991))。根据chotia的定义包含例如可变轻链的约氨基酸位置26-32(cdr1)、50-52(cdr2)和91-96(cdr3)的区域以及可变重链的26-32(cdr1)、53-55(cdr2)和96-101(cdr3)的区域(chothiaandlesk；jmolbiol196:)。在一些情况下，cdr可包含来自根据kabat和chotia定义的cdr区的氨基酸。

根据重链的恒定区的氨基酸序列，可将抗体分为不同的类别。完整抗体主要有五类：iga、igd、ige、igg和igm，其中有几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别的重链的恒定区称为[阿尔法/α]、[德耳塔/δ]、[伊普西隆/ε]、[伽马/γ]和[谬/μ]。抗体的三维结构和亚基结构都是已知的。

将抗体/免疫球蛋白的术语“功能片段”或“抗原结合抗体片段”定义为仍然包含抗体/免疫球蛋白的抗原结合结构域的抗体/免疫球蛋白的片段(例如igg的可变结构域)。抗体的“抗原结合结构域”通常包含抗体的一个或多个超可变区，例如cdr、cdr2和/或cdr3区。

然而，在抗体与抗原的结合过程中，抗体的“框架”或“骨架”区也可起作用。框架区形成cdr的骨架。优选地，抗原结合结构域至少包含可变轻链的第4至103位的氨基酸和可变重链的第5至109位的氨基酸，更优选可变轻链的第3至107位的氨基酸和可变重链的第4至111位的氨基酸，特别优选完全的可变轻链和重链，即vl的第1-109位的氨基酸和vh的第1-113位的氨基酸(根据wo97/08320编号)。

本发明的“功能片段”或“抗原结合抗体片段”非排他性地包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段，双抗体，单域抗体(dab)，线性抗体，抗体的单个链(单链fv，缩写为scfv)；以及多特异性抗体，例如双特异性抗体和三特异性抗体，例如从抗体片段形成的多特异性抗体c.a.kborrebaeck,editor(1995)antibodyengineering(breakthroughsinmolecularbiology),牛津大学出版社；r.kontermann&s.duebel,editor(2001)antibodyengineering(springerlaboratorymanual),springerverlag。除了“多特异性”或“多功能性”抗体以外的抗体是具有相同结合位点的那些抗体。多特异性抗体可以对抗原的不同表位具有特异性，或者可以对多于一种抗原的表位具有特异性(参见例如wo93/17715；wo92/08802；wo91/00360；wo92/05793；tuttetal.,1991,j.immunol.147:6069；u.s.专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；或kostelnyetal.,1992,j.immunol.148:15471553)。可以构建f(ab')2或fab分子，使得ch1和cl结构域之间发生的分子间二硫化物相互作用的数量可以减少或完全防止。

“表位”是指能够特异性结合免疫球蛋白或t细胞受体的蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链或其组合)组成，并且通常具有特定的三维结构特性和特定的电荷特性。

“功能片段”或“抗原结合抗体片段”可以经由其氨基末端或羧基末端通过共价键(例如肽键)与不来源于抗体的另一种多肽或蛋白质融合。此外，抗体和抗原结合片段可以通过在确定的位置引入反应性半胱氨酸来修饰，以促进与毒性基团的偶联(参见junutulaetal.natbiotechnol.2008aug；26(8):925-32)。

多克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备。单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(andmilstein,nature,256,495-497,1975)。人单克隆抗体和人源化单克隆抗体可以通过本领域普通技术人员已知的方法制备(olssonetal.,methenzymol.92,3-16或cabillyetal.us4,816,567或bossetal.us4,816,397)。

本领域普通技术人员知晓用于制备人抗体及其片段的多种方法，例如通过转基因小鼠(nlonberganddhuszar,intrevimmunol.1995；13(1):65-93)或噬菌体展示技术(phagedisplaytechnologien)(clacksonetal.,nature.1991年8月15日；352(6336):624-8)。本发明的抗体可以从重组抗体文库获得，所述重组抗体文库例如由大量健康志愿者收集的多种抗体的氨基酸序列组成。抗体也可以通过已知的重组dna技术产生。抗体的核酸序列可以通过常规测序获得，或者可以从公众可获得的数据库获得。

已经纯化了“分离的”抗体或结合体以移除细胞的其它成分。可能干扰诊断或治疗用途的细胞的污染成分例如是细胞的酶、激素或其他肽或非肽成分。优选的抗体或结合体是与抗体或结合体相比纯化程度超过95重量％的抗体或结合体(例如通过lowry法、uv-vis光谱法或通过sds毛细管凝胶电泳测定)。此外，纯化程度使得可以确定氨基末端或内部氨基酸序列的至少15个氨基酸的抗体或已经纯化至均一的抗体，均一性(homogeneity)是通过sds-page在还原或非还原条件下测定(检测可通过考马斯亮蓝染色或优选通过银显色来测定)。然而，抗体通常是通过一个或多个纯化步骤来制备。

术语“特异性的结合(specificbinding)”或“特异性地结合(bindsspecifically)”是指结合预定抗原/靶分子的抗体或结合体。抗体或结合体的特异性结合通常描述亲和力至少为10^-7m的抗体或结合体(称为kd值；即优选kd值小于10^-7m的那些抗体或结合体)，其中抗体或结合体对预定抗原/靶分子的亲和力比对不是预定抗原/靶分子或紧密相关抗原/靶分子的非特异性抗原/靶分子(例如牛血清白蛋白或酪蛋白)高至少两倍。抗体优选地具有至少10^-7m的亲和力(称为kd值；换言之，优选kd值小于10^-7m的那些抗体)，优选至少10^-8m，更优选10^-9m至10^-10m。例如，可以通过表面等离子体共振光谱法来确定kd值。

本发明的抗体-药物缀合物同样表现出在这些范围内的亲和力。亲和力优选地基本上不受药物缀合的影响(通常，亲和力降低小于一个数量级，换言之，例如至多10^-8m至10^-7m)。

根据本发明使用的抗体还明显优选地具有高选择性。当本发明的抗体对靶蛋白表现出的亲和力比对于独立的其他抗原高至少2倍，优选5倍或更优选10倍，则存在高选择性，例如人血清白蛋白(亲和力可以例如通过表面等离子体共振光谱法来测定)。

此外，所使用的本发明的抗体优选地是交叉反应性的。为了能够促进且更好地解释临床前研究，例如毒理学或活性研究(例如在异种移植小鼠中)，如果根据本发明使用的抗体不仅结合人靶蛋白而且还结合用于研究的物种中的物种靶蛋白，那么这是有利的。在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应性。对于毒理学和活性研究，优选使用啮齿动物、狗和非人灵长类科的种。优选的啮齿动物的种是小鼠和大鼠。优选的非人灵长类动物是猕猴、黑猩猩和长尾猕猴。

在一个实施方案中，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还与选自鼠、大鼠和长尾猕猴(成束猴(macacafascicularis))的至少一种其他物种的靶蛋白交叉反应。特别优选的是，除了人的靶蛋白之外，根据本发明使用的抗体还至少与小鼠靶蛋白交叉反应。优选交叉反应性抗体，其对其他非人物种的靶蛋白的亲和力与对人的靶蛋白的亲和力相差不超过50倍，更特别是不超过10倍。

针对癌症靶分子的抗体

结合剂(如抗体或其抗原结合片段)所针对的靶分子优选地是癌症靶分子。术语“癌症靶分子”描述了这样的靶分子，即与非癌细胞相比，其更大量地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上。优选地，与非癌细胞相比，癌症靶分子选择性地存在于相同组织类型的一种或多种癌细胞种类上，其中与非癌细胞相比，选择性地描述了在相同组织类型的癌细胞上至少两倍的富集(“选择性癌症靶分子”)。使用癌症靶分子允许使用根据本发明的缀合物选择性治疗癌细胞。

对抗原(例如癌细胞抗原)特异性的抗体，可由本领域普通技术人员通过他或她熟悉的方法(例如重组表达)制备或可以商购(例如来自merckkgaa,germany)。癌症治疗中已知的可商购抗体的实例是(西妥昔单抗，merckkgaa)、(贝伐单抗，roche)和(曲妥珠单抗，genentech)。曲妥珠单抗是igg1κ型的重组的人源化单克隆抗体，其在基于细胞的测定(kd＝5nm)中以高亲和力结合人表皮生长受体的细胞外结构域。该抗体在cho细胞中重组产生。所有这些抗体也可以作为这些抗体的非糖基化变体产生，通过由pngasef进行的去糖基化或者通过重链的n297(kabat编号)突变为任何氨基酸来产生。

在优选的实施方案中，靶分子是选择性癌症靶分子。

在特别优选的实施方案中，靶分子是蛋白质。

在一个实施方案中，靶分子是细胞外靶分子。在优选的实施方案中，细胞外靶分子是蛋白质。

癌症靶分子是本领域技术人员已知的。下面列出了这些实例。

癌症靶分子的实例是：

(1)egf受体(ncbi参考序列np_005219.2)，seqidno：213(1210个氨基酸)：

＞gi|29725609|ref|np_005219.2|egfr受体前体[智人(homosapiens)]mrpsgtagaallallaalcpasraleekkvcqgtsnkltqlgtfedhflslqrmfnncevvlgnleityvqrnydlsflktiqevagyvlialntveriplenlqiirgnmyyensyalavlsnydanktglkelpmrnlqeilhgavrfsnnpalcnyesiqwrdivssdflsnmsmdfqnhlgscqkcdpscpngscwgageencqkltkiicaqqcsgrcrgkspsdcchnqcaagctgpresdclvcrkfrdeatckdtcpplmlynpttyqmdvnpegkysfgatcvkkcprnyvvtdhgscvracgadsyemeedgvrkckkcegpcrkvcngigigefkdslsinatnikhfknctsisgdlhilpvafrgdsfthtppldpqeldilktvkeitgflliqawpenrtdlhafenleiirgrtkqhgqfslavvslnitslglrslkeisdgdviisgnknlcyantinwkklfgtsgqktkiisnrgensckatgqvchalcspegcwgpeprdcvscrnvsrgrecvdkcnllegeprefvenseciqchpeclpqamnitctgrgpdnciqcahyidgphcvktcpagvmgenntlvwkyadaghvchlchpnctygctgpglegcptngpkipsiatgmvgalllllvvalgiglfmrrrhivrkrtlrrllqerelvepltpsgeapnqallrilketefkkikvlgsgafgtvykglwipegekvkipvaikelreatspkankeildeayvmasvdnphvcrllgicltstvqlitqlmpfgclldyvrehkdnigsqyllnwcvqiakgmnyledrrlvhrdlaarnvlvktpqhvkitdfglakllgaeekeyhaeggkvpikwmalesilhriythqsdvwsygvtvwelmtfgskpydgipaseissilekgerlpqppictidvymimvkcwmidadsrpkfreliiefskmardpqrylviqgdermhlpsptdsnfyralmdeedmddvvdadeylipqqgffsspstsrtpllsslsatsnnstvacidrnglqscpikedsflqryssdptgaltedsiddtflpvpeyinqsvpkrpagsvqnpvyhnqplnpapsrdphyqdphstavgnpeylntvqptcvnstfdspahwaqkgshqisldnpdyqqdffpkeakpngifkgstaenaeylrvapqssefiga

细胞外结构域由下划线标出。

(2)间皮素(swissprot参考q13421-3)，seqidno：214(622个氨基酸)：

＞sp|q13421-3|msln_human间皮素的亚型2os＝智人gn＝msln

malptarpllgscgtpalgsllfllfslgwvqpsrtlagetgqeaapldgvlanppnisslsprqllgfpcaevsglstervrelavalaqknvklsteqlrclahrlseppedldalpldlllflnpdafsgpqactrffsritkanvdllprgaperqrllpaalacwgvrgsllseadvralgglacdlpgrfvaesaevllprlvscpgpldqdqqeaaraalqgggppygppstwsvstmdalrgllpvlgqpiirsipqgivaawrqrssrdpswrqpertilrprfrrevektacpsgkkareideslifykkweleacvdaallatqmdrvnaipftyeqldvlkhkldelypqgypesviqhlgylflkmspedirkwnvtsletlkallevnkghemspqvatlidrfvkgrgqldkdtldtltafypgylcslspeelssvppssiwavrpqdldtcdprqldvlypkarlafqnmngseyfvkiqsflggaptedlkalsqqnvsmdlatfmklrtdavlpltvaevq

kllgphveglkaeerhrpvrdwilrqrqddldtlglglqggipngylvldlsmqealsgtpcllgpgpvltvlalllastla

其中间皮素由氨基酸296-598编码。氨基酸37-286编码巨核细胞促进因子。间皮素通过gpi锚锚定在细胞膜上并位于细胞外。

(3)碳酸酐酶ix(swissprot参考q16790)，seqidno：215(459个氨基酸)：

＞sp|q16790|cah9_human碳酸酐酶9os＝智人gn＝ca9pe＝1sv＝2

maplcpspwlpllipapapgltvqlllsllllvpvhpqrlprmqedsplgggssgeddplgeedlpseedspreedppgeedlpgeedlpgeedlpevkpkseeegslkledlptveapgdpqepqnnahrdkegddqshwryggdppwprvspacagrfqspvdirpqlaafcpalrplellgfqlpplpelrlrnnghsvqltlppglemalgpgreyralqlhlhwgaagrpgsehtveghrfpaeihvvhlstafarvdealgrpgglavlaafleegpeensayeqllsrleeiaeegsetqvpgldisallpsdfsryfqyegslttppcaqgviwtvfnqtvmlsakqlhtlsdtlwgpgdsrlqlnfratqplngrvieasfpagvdsspraaepvqlnsclaagdilalvfgllfavtsvaflvqmrrqhrrgtkggvsyrpaevaetga

细胞外结构域由下划线标出。

(4)c4.4a(ncbi参考序列np_055215.2；同义词lypd3)，seqidno：216(346个氨基酸)：

＞gi|93004088|ref|np_055215.2|含有ly6/plaur结构域的蛋白3前体[智人]

mdparkagaqamiwtagwllllllrggaqalecyscvqkaddgcspnkmktvkcapgvdvcteavgavetihgqfslavrgcgsglpgkndrgldlhgllafiqlqqcaqdrcnaklnltsraldpagnesayppngvecyscvglsreacqgtsppvvscynasdhvykgcfdgnvtltaanvtvslpvrgcvqdefctrdgvtgpgftlsgsccqgsrcnsdlrnktyfspripplvrlpppepttvasttsvttstsapvrptsttkpmpaptsqtprqgveheasrdeeprltggaaghqdrsnsgqypakggpqqphnkgcvaptaglaalllavaagvll

成熟的细胞外结构域由下划线标出。

(5)cd52(ncbi参考序列np_001794.2)，seqidno：217

＞gi|68342030|ref|np_001794.2|campath-1抗原前体[智人]

mkrflfllltisllvmvqiqtglsgqndtsqtsspsassnisggiflffvanaiihlfcfs

(6)her2(ncbi参考序列np_004439.2)，seqidno：218

＞gi|54792096|ref|np_004439.2|受体酪氨酸-蛋白激酶erbb-2亚型a[智人]

melaalcrwglllallppgaastqvctgtdmklrlpaspethldmlrhlyqgcqvvqgnleltylptnaslsflqdiqevqgyvliahnqvrqvplqrlrivrgtqlfednyalavldngdplnnttpvtgaspgglrelqlrslteilkggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqlaltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqcaagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsaniqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslpdlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtvpwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqraspltsiisavvgillvvvlgvvfgilikrrqqkirkytmrrllqetelvepltpsgampnqaqmrilketelrkvkvlgsgafgtvykgiwpdgenvkipvaikvlrentspkankeildeayvmagvgspyvsrllgicltstvqlvtqlmpygclldhvrenrgrlgsqdllnwcmqiakgmsyledvrlvhrdlaarnvlvkspnhvkitdfglarlldideteyhadggkvpikwmalesilrrrfthqsdvwsygvtvwelmtfgakpydgipareipdllekgerlpqppictidvymimvkcwmidsecrprfrelvsefsrmardpqrfvviqnedlgpaspldstfyrslledddmgdlvdaeeylvpqqgffcpdpapgaggmvhhrhrssstrsgggdltlglepseeeaprsplapsegagsdvfdgdlgmgaakglqslpthdpsplqrysedptvplpsetdgyvapltcspqpeyvnqpdvrpqppspregplpaarpagatlerpktlspgkngvvkdvfafggavenpeyltpqggaapqphpppafspafdnlyywdqdppergappstfkgtptaenpeylgldvpv

(7)cd20(ncbi参考序列np_068769.2)，seqidno：219

＞gi|23110987|ref|np_068769.2|b淋巴细胞抗原cd20[智人]

mttprnsvngtfpaepmkgpiamqsgpkplfrrmsslvgptqsffmresktlgavqimnglfhialggllmipagiyapicvtvwyplwggimyiisgsllaateknsrkclvkgkmimnslslfaaisgmilsimdilnikishflkmeslnfirahtpyiniyncepanpseknspstqycysiqslflgilsvmlifaffqelviagivenewkrtcsrpksnivllsaeekkeqtieikeevvgltetssqpkneedieiipiqeeeeeetetnfpeppqdqesspiendssp

(8)淋巴细胞活化抗原cd30(swissprotidp28908)，seqidno：220

＞gi|68348711|ref|np_001234.2|肿瘤坏死因子受体超家族成员8亚型1前体[智人]

mrvllaalgllflgalrafpqdrpfedtchgnpshyydkavrrccyrcpmglfptqqcpqrptdcrkqcepdyyldeadrctacvtcsrddlvektpcawnssrvcecrpgmfcstsavnscarcffhsvcpagmivkfpgtaqkntvcepaspgvspacaspenckepssgtipqakptpvspatssastmpvrggtrlaqeaaskltrapdspssvgrpssdpglsptqpcpegsgdcrkqcepdyyldeagrctacvscsrddlvektpcawnssrtcecrpgmicatsatnsrarcvpypicaaetvtkpqdmaekdttfeapplgtqpdcnptpengeapastsptqsllvdsqasktlpiptsapvalsstgkpvldagpvlfwvilvlvvvvgssafllchrracrkrirqklhlcypvqtsqpklelvdsrprrsstqlrsgasvtepvaeerglmsqplmetchsvgaayleslplqdaspaggpssprdlpeprvstehtnnkiekiyimkadtvtvgtvkaelpegrglagpaepeleeeleadhtphypeqetepplgscsdvmlsveeegkedplptaasgk

(9)淋巴细胞粘附分子cd22(swissprotidp20273)，seqidno：221

＞gi|157168355|ref|np_001762.2|b细胞受体cd22亚型1前体[智人]

mhllgpwllllvleylafsdsskwvfehpetlyawegacvwipctyraldgdlesfilfhnpeynkntskfdgtrlyestkdgkvpseqkrvqflgdknknctlsihpvhlndsgqlglrmesktekwmerihlnvserpfpphiqlppeiqesqevtltcllnfscygypiqlqwllegvpmrqaavtstsltiksvftrselkfspqwshhgkivtcqlqdadgkflsndtvqlnvkhtpkleikvtpsdaivregdsvtmtcevsssnpeyttvswlkdgtslkkqntftlnlrevtkdqsgkyccqvsndvgpgrseevflqvqyapepstvqilhspavegsqveflcmslanplptnytwyhngkemqgrteekvhipkilpwhagtyscvaenilgtgqrgpgaeldvqyppkkvttviqnpmpiregdtvtlscnynssnpsvtryewkphgaweepslgvlkiqnvgwdnttiacaacnswcswaspvalnvqyaprdvrvrkkikplseihsgnsvslqcdfssshpkevqffwekngrllgkesqlnfdsispedagsyscwvnnsigqtaskawtlevlyaprrlrvsmspgdqvmegksatltcesdanppvshytwfdwnnqslpyhsqklrlepvkvqhsgaywcqgtnsvgkgrsplstltvyyspetigrrvavglgsclaililaicglklqrrwkrtqsqqglqenssgqsffvrnkkvrraplsegphslgcynpmmedgisyttlrfpemniprtgdaessemqrpppdcddtvtysalhkrqvgdyenvipdfpedegihyseliqfgvgerpqaqenvdyvilkh

(10)骨髓细胞(myloidcell)表面抗原cd33(swissprotidp20138)，seqidno：222

＞gi|130979981|ref|np_001763.3|骨髓细胞表面抗原cd33亚型1前体[智人]

mplllllpllwagalamdpnfwlqvqesvtvqeglcvlvpctffhpipyydknspvhgywfregaiisrdspvatnkldqevqeetqgrfrllgdpsrnncslsivdarrrdngsyffrmergstkysykspqlsvhvtdlthrpkilipgtlepghsknltcsvswaceqgtppifswlsaaptslgprtthssvliitprpqdhgtnltcqvkfagagvttertiqlnvtyvpqnpttgifpgdgsgkqetragvvhgaiggagvtallalclcliffivkthrrkaartavgrndthpttgsaspkhqkksklhgptetsscsgaaptvemdeelhyaslnfhgmnpskdtsteysevrtq

(11)跨膜糖蛋白nmb(swissprotidq14956)，seqidno：223

＞gi|52694752|ref|np_001005340.1|跨膜糖蛋白nmb亚型a前体[智人]

meclyyflgflllaarlpldaakrfhdvlgnerpsaymrehnqlngwssdendwneklypvwkrgdmrwknswkggrvqavltsdspalvgsnitfavnlifprcqkedangnivyekncrneaglsadpyvynwtawsedsdgengtgqshhnwfpdgkpfphhpgwrrwnfiyvfhtlgqyfqklgrcsvrvsvntanvtlgpqlmevtvyrrhgrayvpiaqvkdvyvvtdqipvfvtmfqkndrnssdetflkdlpimfdvlihdpshflnystinkwsfgdntglfvstnhtvnhtyvlngtfslnltvkaaapgpcppppppprpskptpslattlksydsntpgpagdnplelsripdencqinrygheqatitivegilevniiqmtdvlmpvpwpesslidfvvtcqgsiptevctiisdptceitqntvcspvdvdemclltvrrtfngsgtycvnltlgddtslaltstlisvpdrdpasplrmansalisvgclaifvtvisllvykkhkeynpienspgnvvrskglsvflnrakavffpgnqekdpllknqefkgvs

(12)粘附分子cd56(swissprotidp13591)，seqidno：224

＞gi|94420689|ref|np_000606.3|神经细胞粘附分子1亚型1[智人]

mlqtkdliwtlfflgtavslqvdivpsqgeisvgeskfflcqvagdakdkdiswfspngekltpnqqrisvvwnddssstltiynaniddagiykcvvtgedgseseatvnvkifqklmfknaptpqefregedavivcdvvsslpptiiwkhkgrdvilkkdvrfivlsnnylqirgikktdegtyrcegrilargeinfkdiqvivnvpptiqarqnivnatanlgqsvtlvcdaegfpeptmswtkdgeqieqeeddekyifsddssqltikkvdkndeaeyiciaenkageqdatihlkvfakpkityvenqtameleeqvtltceasgdpipsitwrtstrnisseektldghmvvrsharvssltlksiqytdageyictasntigqdsqsmylevqyapklqgpvavytwegn

qvnitcevfaypsatiswfrdgqllpssnysnikiyntpsasylevtpdsendfgnynctavnrigqeslefilvqadtpsspsidqvepysstaqvqfdepeatggvpilkykaewravgeevwhskwydakeasmegivtivglkpettyavrlaalngkglgeisaasefktqpvqgepsapklegqmgedgnsikvnlikqddggspirhylvryralssewkpeirlpsgsdhvmlksldwnaeyevyvvaenqqgkskaahfvfrtsaqptaipangsptsglstgaivgilivifvlllvvvditcyflnkcglfmciavnlcgkagpgakgkdmeegkaafskdeskepivevrteeertpnhdggkhtepnettpltepekgpveakpecqetetkpapaevktvpndatqtkeneska

(13)表面分子cd70(swissprotidp32970)，seqidno：225

＞gi|4507605|ref|np_001243.1|cd70抗原[智人]

mpeegsgcsvrrrpygcvlraalvplvaglviclvvciqrfaqaqqqlpleslgwdvaelqlnhtgpqqdprlywqggpalgrsflhgpeldkgqlrihrdgiymvhiqvtlaicssttasrhhpttlavgicspasrsisllrlsfhqgctiasqrltplargdtlctnltgtllpsrntdetffgvqwvrp

(14)表面分子cd74(swissprotidp04233)，seqidno：226

＞gi|10835071|ref|np_004346.1|hlaii类组织相容性抗原γ链亚型b[智人]

mhrrrsrscredqkpvmddqrdlisnneqlpmlgrrpgapeskcsrgalytgfsilvtlllagqattayflyqqqgrldkltvtsqnlqlenlrmklpkppkpvskmrmatpllmqalpmgalpqgpmqnatkygnmtedhvmhllqnadplkvypplkgsfpenlrhlkntmetidwkvfeswmhhwllfemsrhsleqkptdappkesleledpssglgvtkqdlgpvpm

(15)b淋巴细胞抗原cd19(swissprotidp15391)，seqidno：227

＞gi|296010921|ref|np_001171569.1|b淋巴细胞抗原cd19亚型1前体[智人]

mppprllffllfltpmevrpeeplvvkveegdnavlqclkgtsdgptqqltwsresplkpflklslglpglgihmrplaiwlfifnvsqqmggfylcqpgppsekawqpgwtvnvegsgelfrwnvsdlgglgcglknrssegpsspsgklmspklyvwakdrpeiwegeppclpprdslnqslsqdltmapgstlwlscgvppdsvsrgplswthvhpkgpksllslelkddrpardmwvmetglllprataqdagkyychrgnltmsfhleitarpvlwhwllrtggwkvsavtlaylifclcslvgilhlqralvlrrkrkrmtdptrrffkvtpppgsgpqnqygnvlslptptsglgraqrwaaglggtapsygnpssdvqadgalgsrsppgvgpeeeegegyeepdseedsefyendsnlgqdqlsqdgsgyenpedeplgpededsfsnaesyenedeeltqpvartmdflsphgsawdpsreatslagsqsyedmrgilyaapqlrsirgqpgpnheedadsyenmdnpdgpdpawggggrmgtwstr

(16)表面蛋白粘蛋白1(swissprotidp15941)，seqidno：228

＞gi|65301117|ref|np_002447.4|粘蛋白1亚型1前体[智人]

mtpgtqspffllllltvltvvtgsghasstpggeketsatqrssvpssteknalstgvsffflsfhisnlqfnssledpstdyyqelqrdisemflqiykqggflglsnikfrpgsvvvqltlafregtinvhdvetqfnqykteaasrynltisdvsvsdvpfpfsaqsgagvpgwgiallvlvcvlvalaivylialavcqcrrknygqldifpardtyhpmseyptyhthgryvppsstdrspyekvsagnggsslsytnpavaatsanl

(17)表面蛋白cd138(swissprotidp18827)，seqidno：229

＞gi|29568086|ref|np_002988.3|多配体蛋白聚糖1前体[智人]

mrraalwlwlcalalslqpalpqivatnlppedqdgsgddsdnfsgsgagalqdttlsqqtpstwkdtqlltaiptspeptgleataaststlpagegpkegeavvlpevepgltareqeatprprettqlptthqastttattaqepatshphrdmqpghhetstpagpsqadlhtphtedggpsateraaedgassqlpaaegsgeqdftfetsgentavvavepdrrnqspvdqgatgasqglldrkevlggviagglvglifavclvgfmlyrmkkkdegsysleepkqanggayqkptkqeefya

(18)整联蛋白αv(genbank登记号：np_002201.1)，seqidno：230

＞gi|4504763|ref|np_002201.1|整联蛋白αv亚型1前体[智人]

mafpprrrlrlgprglplllsglllplcrafnldvdspaeysgpegsyfgfavdffvpsassrmfllvgapkanttqpgiveggqvlkcdwsstrrcqpiefdatgnrdyakddplefkshqwfgasvrskqdkilacaplyhwrtemkqerepvgtcflqdgtktveyapcrsqdidadgqgfcqggfsidftkadrvllggpgsfywqgqlisdqvaeivskydpnvysikynnqlatrtaqaifddsylgysvavgdfngdgiddfvsgvpraartlgmvyiydgknmsslynftgeqmaayfgfsvaatdingddyadvfigaplfmdrgsdgklqevgqvsvslqrasgdfqttklngfevfarfgsaiaplgdldqdgfndiaiaapyggedkkgivyifngrstglnavpsqilegqwaarsmppsfgysmkgatdidkngypdlivgafgvdrailyrarpvitvnaglevypsilnqdnktcslpgtalkvscfnvrfclkadgkgvlprklnfqvellldklkqkgairralflysrspshsknmtisrgglmqceeliaylrdesefrdkltpitifmeyrldyrtaadttglqpilnqftpanisrqahilldcgednvckpklevsvdsdqkkiyigddnpltlivkaqnqgegayeaelivsiplqadfigvvrnnealarlscafktenqtrqvvcdlgnpmkagtqllaglrfsvhqqsemdtsvkfdlqiqssnlfdkvspvvshkvdlavlaaveirgvsspdhiflpipnwehkenpeteedvgpvvqhiyelrnngpssfskamlhlqwpykynnntllyilhydidgpmnctsdmeinplrikisslqttekndtvagqgerdhlitkrdlalsegdihtlgcgvaqclkivcqvgrldrgksailyvksllwtetfmnkenqnhsyslkssasfnviefpyknlpieditnstlvttnvtwgiqpapmpvpvwviilavlagllllavlvfvmyrmgffkrvrppqeeqereqlqphengegnset

(19)畸胎癌源性生长因子1蛋白tdgf1(genbank登记号：np_003203.1)，seqidno：231

＞gi|4507425|ref|np_003203.1|畸胎癌源性生长因子1亚型1前体[智人]

mdcrkmarfsysviwimaiskvfelglvaglghqefarpsrgylafrddsiwpqeepairprssqrvppmgiqhskelnrtcclnggtcmlgsfcacppsfygrncehdvrkencgscphdtwlpkkcslckcwhgqlrcfpqaflpgcdglvmdehlvasrtpelppsartttfmlvgiclsiqsyy

(20)前列腺特异性膜抗原psma(swissprotid：q04609)，seqidno：232

＞gi|4758398|ref|np_004467.1|谷氨酸羧肽酶2亚型1[智人]

mwnllhetdsavatarrprwlcagalvlaggffllgflfgwfikssneatnitpkhnmkafldelkaenikkflynftqiphlagteqnfqlakqiqsqwkefgldsvelahydvllsypnkthpnyisiinedgneifntslfeppppgyenvsdivppfsafspqgmpegdlvyvnyartedffklerdmkincsgkiviarygkvfrgnkvknaqlagakgvilysdpadyfapgvksypdgwnlpgggvqrgnilnlngagdpltpgypaneyayrrglaeavglpsipvhpigyydaqkllekmggsappdsswrgslkvpynvgpgftgnfstqkvkmhihstnevtriynvigtlrgavepdryvilgghrdswvfggidpqsgaavvheivrsfgtlkkegwrprrtilfaswdaeefgllgstewaeensrllqergvayinadssiegnytlrvdctplmyslvhnltkelkspdegfegkslyeswtkkspspefsgmprisklgsgndfevffqrlgiasgrarytknwetnkfsgyplyhsvyetyelvekfydpmfkyhltvaqvrggmvfelansivlpfdcrdyavvlrkyadkiysismkhpqemktysvsfdslfsavknfteiaskfserlqdfdksnpivlrmmndqlmflerafidplglpdrpfyrhviyapsshnkyagesfpgiydalfdieskvdpskawgevkrqiyvaaftvqaaaetlseva

(21)酪氨酸蛋白激酶epha2(swissprotid：p29317)，seqidno：233

＞gi|32967311|ref|np_004422.2|肝配蛋白a型受体2前体[智人]

melqaaracfallwgcalaaaaaaqgkevvlldfaaaggelgwlthpygkgwdlmqnimndmpiymysvcnvmsgdqdnwlrtnwvyrgeaerifielkftvrdcnsfpggasscketfnlyyaesdldygtnfqkrlftkidtiapdeitvssdfearhvklnveersvgpltrkgfylafqdigacvallsvrvyykkcpellqglahfpetiagsdapslatvagtcvdhavvppggeeprmhcavdgewlvpigqclcqagyekvedacqacspgffkfeasespclecpehtlpspegatsceceegffrapqdpasmpctrppsaphyltavgmgakvelrwtppqdsggredivysvtceqcwpesgecgpceasvrysepphgltrtsvtvsdlephmnytftvearngvsglvtsrsfrtasvsinqteppkvrlegrsttslsvswsipppqqsrvwkyevtyrkkgdsnsynvrrtegfsvtlddlapdttylvqvqaltqegqgagskvhefqtlspegsgnlaviggvavgvvlllvlagvgffihrrrknqrarqspedvyfskseqlkplktyvdphtyedpnqavlkftteihpscvtrqkvigagefgevykgmlktssgkkevpvaiktlkagytekqrvdflgeagimgqfshhniirlegviskykpmmiiteymengaldkflrekdgefsvlqlvgvlrgiaagmkylanmnyvhrdlaarnilvnsnlvckvsdfglsrvleddpeatyttsggkipirwtapeaisyrkftsasdvwsfgivmvevmtygerpywelsnhevmkaindgfrptpmdcpsaiyqlmmqcwqqerarrpkfadivsildklirapdslktladfdprvsirlpstsgsegvpfrtvsewlesikmqqytehfmaagytaiekvvqmtnddikrigvrlpghqkriaysllglkdqvntvgipi

(22)表面蛋白slc44a4(genbank登记号：np_001171515)，seqidno：234

＞gi|295849282|ref|np_001171515.1|胆碱转运蛋白样蛋白4亚型2[智人]

mggkqrdeddeaygkpvkydpsfrgpiknrsctdviccvlfllfilgyivvgivawlygdprqvlyprnstgaycgmgenkdkpyllyfnifscilssniisvaenglqcptpqtvitslqqelcpsfllpsapalgrcfpwtnvtppalpgitndttiqqgisglidslnardisvkifedfaqswywilvalgvalvlsllfilllrlvagplvlvlilgvlgvlaygiyycweeyrvlrdkgasisqlgfttnlsayqsvqetwlaalivlavleailllmliflrqririaiallkeaskavgqmmstmfyplvtfvllliciaywamtalylatsgqpqyvlwasnisspgcekvpintscnptahlvnsscpglmcvfqgysskgliqrsvfnlqiygvlglfwtlnwvlalgqcvlagafasfywafhkpqdiptfplisafirtlryhtgslafgaliltlvqiarvileyidhklrgvqnpvarcimccfkcclwclekfikflnrnayimiaiygknfcvsaknafmllmrnivrvvvldkvtdlllffgkllvvggvgvlsffffsgripglgkdfksphlnyywlpimtsilgayviasgffsvfgmcvdtlflcfledlernngsldrpyymsksllkilgkkneappdnkkrkk

(23)表面蛋白bmpr1b(swissprot：o00238)

(24)转运蛋白slc7a5(swissprot：q01650)

(25)上皮前列腺抗原steap1(swissprot：q9uhe8)

(26)卵巢癌抗原muc16(swissprot：q8wxi7)

(27)运输蛋白slc34a2(swissprot：o95436)

(28)表面蛋白sema5b(swissprot：q9p283)

(29)表面蛋白lypd1(swissprot：q8n2g4)

(30)内皮素受体b型ednrb(swissprot：p24530)

(31)环指蛋白rnf43(swissprot：q68dv7)

(32)前列腺癌相关蛋白steap2(swissprot：q8nft2)

(33)阳离子通道trpm4(swissprot：q8td43)

(34)补体受体cd21(swissprot：p20023)

(35)b细胞抗原受体复合体相关蛋白cd79b(swissprot：p40259)

(36)细胞粘附抗原ceacam6(swissprot：p40199)

(37)二肽酶dpep1(swissprot：p16444)

(38)白细胞介素受体il20rα(swissprot：q9uhf4)

(39)蛋白聚糖bcan(swissprot:q96gw7)

(40)肝配蛋白受体ephb2(swissprot：p29323)

(41)前列腺干细胞相关蛋白psca(genbank登记号：np_005663.2)

(42)表面蛋白lhfpl3(swissprot：q86up9)

(43)受体蛋白tnfrsf13c(swissprot：q96rj3)

(44)b细胞抗原受体复合体相关蛋白cd79a(swissprot：p11912)

(45)受体蛋白cxcr5(swissprot：p32302)

(46)离子通道p2x5(swissprot：q93086)

(47)淋巴细胞抗原cd180(swissprot：q99467)

(48)受体蛋白fcrl1(swissprot：q96la6)

(49)受体蛋白fcrl5(swissprot：q96rd9)

(50)mhcii类分子ia抗原hla-dob(genbank登记号：np_002111.1)

(51)t细胞蛋白vtcn1(swissprot：q7z7d3)

(52)tweakr(seqidno:169(蛋白)；seqidno:170(dna)。

(53)淋巴细胞抗原cd37(swissprot：p11049)

(54)fgf受体2；fgfr2(基因id：2263；官方代号：fgfr2)，fgfr2受体以不同的剪接变体(α、β、iiib、iiic)形式存在。所有剪接变体可以作为靶分子。

(55)跨膜糖蛋白b7h3(cd276；基因id：80381)

(56)b细胞受体baffr(cd268；基因id：115650)

(57)受体蛋白ror1(基因id：4919)

(58)表面受体il3ra(cd123；基因id：3561)

(59)cxc趋化因子受体cxcr5(cd185；基因id643)

(60)受体蛋白合胞素(syncytin)(基因id30816)

在本发明优选的主题中，癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、(6)和(52)。

在本发明另一个特别优选的主题中，结合体结合至细胞外癌症靶分子，所述细胞外癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、(6)和(52)。

在本发明另一个特别优选的主题中，结合体特异性结合至细胞外癌症靶分子，所述细胞外癌症靶分子选自癌症靶分子(1)-(60)，特别是(1)、(6)和(52)。在一个优选的实施方案中，结合体在与靶细胞上的其细胞外靶分子结合后，由于结合而被靶细胞内化。这导致可以是免疫缀合物或adc的结合体-药物缀合物被靶细胞摄取。然后优选地在细胞内，使用优选的溶酶体方法处理结合体。

在一个实施方案中，结合体是结合蛋白。在优选的实施方案中，结合体是抗体、非糖基化抗体、抗原结合抗体片段、多特异性抗体或抗体模拟物。

优选的抗体模拟物是亲和体(affibody)、阿德奈汀(adnectin)、抗运载蛋白(anticalin)、darpins、高亲合性多聚体(avimer)或纳米抗体(nanobody)。优选的多特异性抗体是双特异性抗体和三特异性抗体。

在优选的实施方案中，结合体是抗体或抗原结合抗体片段，更优选分离的抗体或分离的抗原结合抗体片段。

优选的抗原结合抗体片段是fab、fab'、f(ab')2和fv片段、双抗体、dab、线性抗体以及scfv。特别优选的是fab、双抗体和scfv。

在特别优选的实施方案中，结合体是抗体。特别优选的是单克隆抗体或其抗原结合抗体片段。进一步特别优选的是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或其抗原结合抗体片段。

结合癌症靶分子的抗体或结合抗原的抗体片段可由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。癌症靶分子的结合体可以商购获得或可以由本领域普通技术人员使用已知的方法(例如化学合成或重组表达)来制备。用于制备抗体或抗原结合抗体片段的其它方法记载于wo2007/070538(参见第22页“抗体”)。本领域技术人员已知如何编译诸如噬菌体展示文库(例如morphosyshucalgold)的方法并将其用于发现抗体或抗原结合抗体片段(参见wo2007/070538，第24页以及第70页上的ak实施例1、第72页上的ak实施例2)。用于制备使用来自b细胞的dna文库的抗体的其他方法例如记载于第26页(wo2007/070538)。人源化抗体的方法记载于wo2007070538的第30-32页并详细记载于queenetal.,pros.natl.acad.sci.usa8610029-10033,1989或wo90/0786中。此外，一般来说，用于重组表达蛋白质的方法并且特别是用于重组表达抗体的方法是本领域技术人员已知的(参见例如bergerandkimrnel(guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology,vo1.alaboratorymanual,(第二版,coldspringharborlaboratorypress；coldspringharbor,n.y.；1989)vol.1-3)；currentprotocolsinmolecularbiology,(f.m.ausabeletal.[eds.],currentprotocols,greenpublishingassociates,inc./johnwiley&sons,inc.)；harlowetal.,(monoclonalantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1988,paul[ed.])；fundamentalimmunology,(lippincottwilliams&wilkins(1998))；以及harlowetal.,(usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1998))。本领域技术人员已知表达蛋白质/抗体所必需的相应载体、启动子和信号肽。常见的方法也记载于wo2007/070538的第41-45页。制备igg1抗体的方法记载于例如wo2007/070538的第74页的实施例6ff中。允许测定与其抗原结合后的抗体内化的方法是本领域技术人员已知的，并且例如记载于wo2007/070538的第80页。本领域技术人员能够使用记载于wo2007/070538中的方法，其已经被用于以与制备具有不同靶分子特异性的抗体的类似方式制备碳酸酐酶ix(mn)抗体。

抗egfr的抗体

结合癌症靶分子egfr的抗体的实例是西妥昔单抗(inn号7906)、帕尼单抗(inn号8499)和尼妥珠单抗(inn号8545)。西妥昔单抗(药品注册号db00002)是嵌合的抗egfr1的抗体，其是在sp2/0小鼠骨髓瘤细胞中产生，并由imclonesystemsinc/merckkgaa/bristol-myerssquibbco.销售。西妥昔单抗被标明用于治疗具有野生型k-ras基因的转移性、表达egfr的结肠直肠癌。它的亲和力为10^-10m。

序列：

西妥昔单抗轻链(κ)，seqidno：235：

dilltqspvilsvspgervsfscrasqsigtnihwyqqrtngsprllikyasesisgipsrfsgsgsgtdftlsinsvesediadyycqqnnnwpttfgagtklelkrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

西妥昔单抗重链，seqidno：236：

qvqlkqsgpglvqpsqslsitctvsgfsltnygvhwvrqspgkglewlgviwsggntdyntpftsrlsinkdnsksqvffkmnslqsndtaiyycaraltyydyefaywgqgtlvtvsaastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdlavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

帕尼单抗(inn号8499)(药品注册号db01269)是重组单克隆人igg2抗体，其特异性结合人egf受体1并由abgenix/amgen销售。帕尼单抗源自转基因小鼠(xenomouse)的免疫。这些小鼠能够产生人免疫球蛋白(轻链和重链)。选择产生针对egfr的抗体的特异性b细胞克隆，并用cho细胞(中国仓鼠卵巢细胞)永生化该克隆。这些细胞现在用于生产100％的人抗体。帕尼单抗用于治疗表达egfr的转移性结肠直肠癌，其对氟嘧啶、奥沙利铂和伊立替康的化学疗法有抗性。它的亲和力为10^-11m。

序列：

帕尼单抗轻链(κ)，seqidno：237：

diqmtqspsslsasvgdrvtitcqasqdisnylnwyqqkpgkapklliydasnletgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyfcqhfdhlplafgggtkveikrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

帕尼单抗重链，seqidno：238：

qvqlqesgpglvkpsetlsltctvsggsvssgdyywtwirqspgkglewighiyysgntnynpslksrltisidtsktqfslklssvtaadtaiyycvrdrvtgafdiwgqgtmvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg

尼妥珠单抗(inn号8545)(ep00586002、ep00712863)是特异性结合人egf受体1的人源化单克隆igg1抗体并由ymbioscienecsinc.(mississaugacanada)销售。它是在非分泌nso细胞(哺乳动物细胞系)中产生。尼妥珠单抗被批准用于治疗头部和颈部肿瘤、高度恶性星形细胞瘤和多形性胶质母细胞瘤(不在欧盟和美国)和胰腺癌(孤儿药，ema)。它的亲和力为10^-8m。

尼妥珠单抗轻链(seqidno：239)：

diqmtqspsslsasvgdrvtitcrssqnivhsngntyldwyqqtpgkapklliykvsnrfsgvpsrfsgsgsgtdftftisslqpediatyycfqyshvpwtfgqgtklqitrtvaapsvfifppsdeqlksgtasvvcllnnfypreakvqwkvdnalqsgnsqesvteqdskdstyslsstltlskadyekhkvyacevthqglsspvtksfnrgec

尼妥珠单抗重链(seqidno：240)：

qvqlqqsgaevkkpgssvkvsckasgytftnyyiywvrqapgqglewigginptsggsnfnekfktrvtitadessttaymelsslrsedtafyfctrqglwfdsdgrgfdfwgqgttvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkkvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk

egfr抗体的其他实施方案如下：

●扎鲁木单抗/2f8/humax-egfr，来自genmaba/s(wo02/100348、wo2004/056847，inn号8605)

●奈昔木单抗/11f8，imclone/imc-11f8，来自imclonesystemsinc.[elililly&co](wo2005/090407(ep01735348-a1、us2007/0264253-a1、us7,598,350、wo2005/090407-a1)，inn号9083)

●马妥珠单抗/抗egfrmab、merckkgaa/抗egfrmab、takeda/emd72000/emd-6200/emd-72000和emd-55900/mab425/单克隆抗体425，来自merckkgaa/takeda(wo92/15683，inn号8103(马妥珠单抗))

●rg-7160/ga-201/ga201/r-7160/r7160/rg7160/ro-4858696/ro-5083945/ro4858696/ro5083945，来自glycartbiotechnologyag(rocheholdingag)(wo2010/112413-a1、wo2010/115554)

·gt-mab5.2-gex/cetugex来自glycotopegmbh(wo2008/028686-a2(ep01900750-a1、ep01911766-a1、ep02073842-a2、us2010/0028947-a1)

·isu-101，来自isuabxisinc(isuchemicalcoltd)/scancell(wo2008/004834-a1)

·abt-806/mab-806/ch-806/抗egfr单克隆抗体806，来自ludwiginstituteforcancerresearch/abbott/lifesciencepharmaceuticals(wo02/092771、wo2005/081854和wo2009/023265)

·sym-004(由两种嵌合的igg1抗体(992和1024)组成)，来自symphogena/s(wo2010/022736-a2)

·mr1-1/mr1-1kdel，来自ivaxcorp(tevapharmaceuticalindustriesltd)(dukeuniversity)，(专利：wo2001/062931-a2)

·针对缺失型突变体的抗体，egfrviii，来自amgen/abgenix(wo2005/010151、us7,628,986)

·sc-100，来自scancellltd(wo01/088138-a1)

·mdx-447/emd82633/bab-447/h447/mab，egfr，medarex/merckkgaa，来自bristol-myerssquibb(us)/merckkgaa(de)/takeda(jp)，(wo91/05871、wo92/15683)

·抗egfr-mab，来自xencor(wo2005/056606)

·dxl-1218/抗egfr单克隆抗体(癌症)，innexus，来自innexusbiotechnologyinc，pharmaprojectsph048638

在优选的实施方案中，抗egfr的抗体选自：西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗(panitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、奈昔木单抗(necitumumab)、马妥珠单抗(matuzumab)、rg-716、gt-mab5.2-gex、isu-101、abt-806、sym-004、mr1-1、sc-100、mdx-447和dxl-1218。

在特别优选的实施方案中，抗egfr的抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗和马妥珠单抗。

本领域技术人员知道可以用于从上述抗体的cdr区通过序列变异的方式制备其他抗体的方法，这些其他的抗体对靶分子具有相似或更好的亲和力和/或特异性。

在另一个实施方案中，抗egfr的抗体或抗原结合抗体片段选自包含以下抗体之一的轻链的三个cdr区和重链的三个cdr区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗、rg-716、gt-mab5.2-gex、isu-101、abt-806、sym-004、mr1-1、sc-100、mdx-447和dxl-1218。

在另一个实施方案中，抗egfr的抗体或抗原结合抗体片段选自包含以下抗体之一的轻链的三个cdr区和重链的三个cdr区的抗体或抗原结合抗体片段：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、扎鲁木单抗、奈昔木单抗、马妥珠单抗。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗碳酸酐酶ix抗体

结合癌症靶分子碳酸酐酶ix的抗体的实例描述于wo2007/070538-a2(例如权利要求1-16)。

在优选的实施方案中，抗碳酸酐酶ix抗体或抗原结合抗体片段选自抗碳酸酐酶ix抗体或抗原结合抗体片段3ee9(wo2007/070538-a2中的权利要求4(a))、3ef2(wo2007/070538-a2中的权利要求4(b))、1e4(wo2007/070538-a2中的权利要求4(c))、3a4(wo2007/070538-a2中的权利要求4(d))、3ab4(wo2007/070538-a2)中的权利要求4(e))、3ah10(wo2007/070538-a2中的权利要求4(f))、3bb2(wo2007/070538-a2中的权利要求4(g))、1aa1(wo2007/070538-a2中的权利要求4(h))、5a6(wo2007/070538-a2中的权利要求4(i))和5aa3(wo2007/070538-a2中的权利要求4(j))。

抗c4.4a抗体：

根据本发明，可以使用c4.4a抗体。

c4.4a抗体和抗原结合片段的实例记载于wo2012/143499a2。通过引用的方式，将wo2012/143499a2的所有抗体由此纳入本发明的说明书，并且它们可以用于本发明中。抗体的序列在wo2012/143499a2的表1中给出，其中每行示出了列1中列出的抗体的可变轻链或可变重链的各自的cdr氨基酸序列。

在一个实施方案中，在与表达c4.4a的细胞结合后，抗c4.4a抗体或其抗原结合抗体片段被细胞内化。

在另一个实施方案中，抗c4.4a抗体或抗原结合抗体片段包含在wo2012/143499a2的表1或wo2012/143499a2的表2中列出的抗体的至少一个、两个或三个cdr氨基酸序列。这样的抗体的优选实施方案同样列于wo2012/143499a2中并且通过引用的方式纳入本文。

抗her2的抗体

结合癌症靶分子her2的抗体的实例是曲妥珠单抗(trastuzumab，genentech)。曲妥珠单抗是特别用于治疗乳腺癌的人源化抗体。

除了曲妥珠单抗(inn7637，cas号：rn：180288-69-1)和帕妥珠单抗(cas号：380610-27-5)之外，与her2结合的抗体的其它实例是wo2009/123894-a2、wo200/8140603-a2或wo2011/044368-a2中公开的抗体。抗her2缀合物的一个实例是曲妥珠单抗-美坦新(emtansine)(inn-no.9295)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。另外，可以使用通过由pngasef进行的去糖基化或通过重链的n297(kabat编号)突变成任何氨基酸而产生的曲妥珠单抗的非糖基化变体。另外，还可以使用所述抗体的变体，其已经改造以含有一个或多个用于转谷氨酰胺酶介导的反应的受体谷氨酰胺。

抗cd20的抗体

结合癌症靶分子cd20的抗体的实例是利妥昔单抗(genentech)。利妥昔单抗(cas号：174722-31-7)是用于治疗非霍奇金淋巴瘤的嵌合抗体。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗cd52的抗体

结合癌症靶分子cd52的抗体的实例是阿仑珠单抗(genzyme)。阿仑珠单抗(cas号码：216503-57-0)是一种用于治疗慢性淋巴细胞白血病的人源化抗体。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗间皮素的抗体：

抗间皮素的抗体的实例记载于例如wo2009/068204。通过引用的方式，将wo2009/068204中记载的所有抗体由此纳入本说明书中，使得这些抗体可以用于本文公开的本发明的上下文中。

根据本发明使用的抗间皮素的抗体也显著优选地与间皮素不变结合。不变结合的特征在于例如根据本发明使用的抗体结合至间皮素的表位，所述表位不能被另外的细胞外蛋白掩蔽。这种另外的细胞外蛋白是例如蛋白质卵巢癌抗原125(ca125)。优选地使用的抗体的特征在于它们与间皮素的结合不被ca125阻断。

抗cd30的抗体

结合癌症靶分子cd30并可用于治疗癌症(例如霍奇金淋巴瘤)的抗体的实例是本妥昔单抗(brentuximab)，伊妥木单抗(iratumumab)和wo2008/092117、wo2008/036688或wo2006/089232中公开的抗体。抗cd30缀合物的实例是本妥昔单抗-维多汀(brentuximabvedotin)(inn编号9144)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗cd22的抗体

结合癌症靶分子cd22并可用于治疗癌症(例如淋巴瘤)的抗体的实例是依托珠单抗(inotuzumab)和依帕珠单抗(epratuzumab)。抗cd22缀合物的实例是依托珠单抗-奥唑米星(inotuzumabozagamycin)(inn号8574)或抗cd22-mmae和抗cd22-mc-mmae(casrn分别为139504-50-0和474645-27-7)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗cd33的抗体

与癌症靶分子cd33结合并可用于治疗癌症(例如白血病)的抗体的实例是吉妥珠单抗(gemutuzumab)和林妥珠单抗(lintuzumab)(inn7580)。抗cd33缀合物的实例是吉妥珠单抗(gemutuzumab-ozagamycin)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗nmb的抗体

结合癌症靶分子nmb并可用于治疗癌症(例如黑素瘤或乳腺癌)的抗体的实例是格列姆巴妥木单抗(glembatumumab)(inn9199)。抗nmb缀合物的实例是格列姆巴妥木单抗-维多汀(glembatumumabvedotin)(casrn：474645-27-7)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗cd56的抗体

结合癌症靶分子cd56并可用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤、小细胞肺癌、mcc或卵巢癌)的抗体的实例是罗佛珠单抗(lorvotuzumab)。抗cd57缀合物的实例是罗佛珠单抗-美登素(lorvotuzumabmertansine)(casrn：139504-50-0)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗cd70的抗体

结合癌症靶分子cd70并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤或肾细胞癌)的抗体的实例公开于wo2007/038637-a2和wo2008/070593-a2中。抗cd70缀合物的实例是sgn-75(cd70mmaf)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗cd74的抗体

结合癌症靶分子cd74并可用于治疗癌症(例如多发性骨髓瘤)的抗体的实例是米拉珠单抗。抗cd74缀合物的实例是米拉珠单抗-多柔比星(casrn：23214-92-8)。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗cd19的抗体

结合癌症靶分子cd19并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗体的实例公开于wo2008/031056-a2中。其他抗体和抗cd19缀合物(sar3419)的实例公开于wo2008/047242-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗粘蛋白的抗体

结合癌症靶分子粘蛋白-1并可用于治疗癌症(例如非霍奇金淋巴瘤)的抗体的实例是克莱维足单抗(clivatuzumab)和wo2003/106495-a2、wo2008/028686-a2中公开的抗体。抗粘蛋白缀合物的实例公开于wo2005/009369-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗cd138的抗体

结合癌症靶分子cd138及其缀合物的抗体的实例公开于wo2009/080829-a1、wo2009/080830-a1中，所述抗体可用于治疗癌症，例如多发性骨髓瘤。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗整联蛋白-αv的抗体

结合癌症靶分子整联蛋白αv的抗体并可用于治疗癌症(例如黑素瘤、肉瘤或癌)的抗体的实例为英妥木单抗(intetumumab)(casrn：725735-28-4)、阿昔单抗(abciximab)(casrn：143653-53-6)、埃达珠单抗(etaracizumab)(casrn：892553-42-3)和公开于us7,465,449、ep719859-a1、wo2002/012501-a1和wo2006/062779-a2中的抗体。抗整联蛋白αv缀合物的实例是英妥木单抗-dm4和在wo2007/024536-a2中公开的其他adc。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗tdgf1的抗体

结合癌症靶分子tdgf1并可用于治疗癌症的抗体的实例是wo02/077033-a1、us7,318,924、wo2003/083041-a2和wo2002/088170-a2中公开的抗体。抗tdgf1缀合物的实例公开于wo2002/088170-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗psma的抗体

结合癌症靶分子psma并可用于治疗癌症(例如前列腺癌)的抗体的实例是wo97/35616-a1、wo99/47554-a1、wo01/009192-a1和wo2003/034903中公开的抗体。抗psma缀合物的实例公开于wo2009/026274-a1和wo2007/002222中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文下。

抗epha2的抗体

结合癌症靶分子epha2、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症的抗体的实例公开于wo2004/091375-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗slc44a4的抗体

结合癌症靶分子slc44a4、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症(例如胰腺癌或前列腺癌)的抗体的实例公开于wo2009/033094-a2和us2009/0175796-a1中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗hla-dob的抗体

结合癌症靶分子hla-dob的抗体的实例是抗体lym-1(casrn：301344-99-0)，其可用于治疗癌症，例如非霍奇金淋巴瘤。抗hla-dob缀合物的实例例如公开于wo2005/081711-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可用于本发明的上下文中。

抗vtcn1的抗体

结合癌症靶分子vtcn1、可用于制备缀合物并可用于治疗癌症(例如卵巢癌、胰腺癌、肺癌或乳腺癌)的抗体的实例公开于wo2006/074418-a2中。通过引用的方式，将这些抗体及其抗原结合片段纳入本文，并且它们可以用于本发明的上下文中。

抗fgfr2的抗体

根据本发明，可以使用抗fgfr2的抗体。

抗fgfr2的抗体和抗原结合片段的实例记载于wo2013076186中。通过引用的方式，将wo2013076186的所有抗体由此纳入本发明的说明书中，并且它们可以用于本发明中。抗体的序列示于wo2013076186的表9和表10中。优选衍生自称为m048-d01和m047-d08的抗体、抗原结合片段和抗体的变体。优选的抗fgfr2与已知的fgfr2的各种剪接变体结合。

在一个实施方案中，抗fgfr2的抗体或其抗原结合抗体片段在与表达fgfr2的细胞结合后被细胞内化。

在另一个实施方案中，抗fgfr2的抗体或抗原结合抗体片段包含wo2013076186的表9或表10中列出的抗体的至少一个、两个或三个cdr氨基酸序列。

抗tweakr的抗体

在优选的实施方案中，当抗tweakr的抗体或其抗原结合片段用于本发明的方法中时，该抗体或片段选自下文记载的那些(同样公开于wo2014/199817(a1)中)。另外，结合tweakr的抗体是本领域技术人员已知的，参见例如wo2009/020933(a2)或wo2009140177(a2)。另外，可以使用所述的抗tweakr的抗体的非糖基化变体，其是通过由pngasef进行的去糖基化或通过重链的n297(kabat编号)突变为任何氨基酸而产生。另外，还可以使用已经改造以含有一个或多个用于转谷氨酰胺酶介导的反应的受体谷氨酰胺的抗体的变体。

本发明具体涉及与抗体或其抗原结合抗体片段或其变体的缀合物，其导致tweakr(seqidno:169(蛋白质)；seqidno:170(dna))的强烈活化，导致在过表达tweakr的各种癌细胞中强烈诱导细胞凋亡。

已经描述的抗tweakr的抗体(例如pdl-192)对tweakr的激动活性(在诱导细胞凋亡和抑制增殖的方面)是有限的并且达不到内源性配体tweak的效力。这种激动活性的缺乏不是基于亲和力的降低，因为这些抗体在tweakr上结合的亲和力与内源性配体tweak相比处于相似的范围内(michaelsonjsetal.,mabs.2011年7月-8月；3(4):362-75；culppaetal.,clincancerres.2010年1月15日；16(2):497-508)，甚至具有更高结合亲和力的抗体不一定显示更有效的信号传导活性(culppaetal.,clincancerres.2010年1月15日；16(2):497-508)。此外，已经证明已经记载的抗体的抗肿瘤活性取决于fc效应子功能，并且证明adcc在小鼠模型中的体内效力中起重要作用。

抗tweakr的抗体的生成

使用完整的人抗体噬菌体文库(hoetrmetal.,natbiotechnol2005；23(3):344-8)通过蛋白淘选来分离本发明的tweakr特异性人单克隆抗体(hoogenboomhr,natbiotechnol2005；23(3):1105-16)，使用人和小鼠tweakr的二聚fc融合的细胞外结构域作为固定的靶。鉴定了11种不同的fab噬菌体，并将相应的抗体克隆到哺乳动物egg表达载体中，其提供在可溶性fab中缺失的ch2-ch3结构域。鉴定优选的抗体后，将这些表达为全长igg。已经通过在各个抗体的重链中引入突变n297a或n297q来产生所述抗体的非糖基化变体。例如，如tometal.,methodsexpress:expressionsystemseditedbymichealr.dysonandyvesdurocher,scionpublishingltd,2007中的第12章所述(参见ak-实施例1)，在哺乳动物细胞中瞬时表达这些构建体。如在ak-实施例2中所述，通过蛋白质-a色谱法纯化抗体并进一步使用elisa和biacore分析通过它们与可溶性单体tweakr的结合亲和力来进行表征。为了确定抗tweakr的抗体的细胞结合特性，通过流式细胞术测试了对许多细胞系(ht29、hs68、hs578)的结合。进行nfκb报告基因测定以检查所鉴定的所有11种抗体(人igg1)的激动活性。选择具有最高体外活性的抗体(tpp-883)用于进一步的活性和亲和力成熟(详见ak-实施例1)。检测到具有改善的激动活性的单一取代变体：cdr-h3的g102t。最后，基于与最佳单一取代变体g102t相比的提高的亲和力选择了7种变体。将其相应的dna克隆到哺乳动物igg表达载体中，并在上述nf-κb报道基因测定中检查功能活性。最后，将获得的序列与人种系序列进行比较，并且修改对亲和力和效力没有任何显著影响的偏差。通过抗体文库筛选以及通过亲和力和/或活性成熟获得以下抗体：“tpp-2090”、“tpp-2149”、“tpp-2093”、“tpp-2148”、“tpp-2084”、“tpp-2077”、“tpp-1538”、“tpp-883”、“tpp-1854”、“tpp-1853”、“tpp-1857”和“tpp-1858”。

本发明的抗体还可以通过本领域已知的方法获得，如抗体噬菌体展示筛选(参见例如hoetrmetal.,natbiotechnol2005；23(3):344-8)、公认的杂交瘤技术(参见例如andmilsteinnature.1975年8月7日；256(5517):495-7)或小鼠的免疫，特别是hmab小鼠(例如velocimmune)的免疫。

抗tweakr的抗体的具体实施方案

本发明的一个实施方案是提供在一种或多种表达tweakr的细胞系中强烈诱导半胱天冬酶3/7的抗体或其抗原结合抗体片段或其变体。在优选的实施方案中，一种或多种表达tweakr的细胞系存在于widr、a253、nci-h322、ht29和786-o中。可通过本领域已知的常规方法(包括本文所述的那些方法)测量“半胱天冬酶3/7的诱导”。在一个实施方案中，根据本发明使用以capase3/7溶液(promega，#g8093)进行的活性测定并读取victorv(perkinelmer)上的发光来测定“半胱天冬酶3/7的诱导”。在孵育时间结束时，测定半胱天冬酶3/7活性，并与未处理的细胞比较确定半胱天冬酶3/7的诱导因子。当诱导因子大于1.2、优选大于1.5、甚至更优选大于1.8、甚至更优选大于2.1、甚至更优选大于2.5时，称抗体表现出半胱天冬酶3/7的“强烈诱导”。所提供的是抗tweakr的抗体，其与已经记载的激动性抗体[例如pdl-192(tpp-1104)、p4a8(tpp-1324)、136.1(tpp-2194)]相比并且还与300ng/ml重组人tweak相比，在ht29细胞中导致更强烈的半胱天冬酶3/7的诱导。在widr、a253、nic-h322和786-o细胞中也观察到这种在癌细胞中诱导胱天蛋白酶3/7的强烈活性，其中在大多数实验中，与参照抗体[pdl-192(tpp-1104)、p4a8(tpp-1324)]相比并且与300ng/mltweak相比，所检查的本发明的抗体诱导了更高的变化因子。本发明的一些抗体仅以中等亲和力(>10nm)与tweakr结合，其明显小于内源性配体tweak的亲和力，并且与其他已知的激动性抗体相比也更小。这种性质提供了其他可能的优点，例如，可能更深入地渗透肿瘤。

就此而言，本发明的一个实施方案是提供在新的表位特异性结合tweakr的抗体或其抗原结合抗体片段，其特征在于选择性结合tweakr(seqidno:169；也参见图1)的第47位的天冬氨酸(d)(d47)。所鉴定的某些tweakr氨基酸对于抗体相互作用来说的依赖性与针对这些抗体确定的激动活性相关。天然配体tweak表现出tweakr的有效活化，并依赖于亮氨酸46结合在tweakr的半胱氨酸富集结构域中(pellegrinietal.,febs280:1818-1829)。p4a8显示出非常低的激动活性并且至少部分与tweakr的半胱氨酸富集结构域以外的结构域相互作用。pdl-192表现出中等的激动活性，并且依赖于r56结合至半胱氨酸富集结构域，但与tweak配体位点相对。本发明的抗体(例如tpp-2090)依赖于d47进行结合，tweak依赖于l46进行结合。因此，tweak结合到相似但不同的结合位点(图7)。因此，本发明表现出强烈激动活性的抗体结合至抗体的新表位(d47-依赖性)，其与非常高的激动活性相关。

tweakr(seqidno:169)的第47位处的氨基酸(d47)被认为对于本发明的抗体结合来说是关键性的，这意味着当抗体通过将该残基修饰成丙氨酸而损失超过20％、或者超过30％、或者超过40％、或者超过50％、或者超过60％、或者超过70％、或者超过80％、或者超过90％、或者100％的其elisa信号时，抗体特异性结合至tweakr(seqidno:169)的第47位处的d(d47)，如ak-实施例2和图6中所描述的。或者，与tpp-2203相比，对于tpp-2614来说，当抗体损失超过20％、或者超过30％、或者超过40％、或者超过50％、或者超过60％、或者超过70％、或者超过80％、或者超过90％、或者100％的其elisa信号时，抗体特异性结合至tweakr(seqidno:169)的第47位处的d(d47)。优选地，与tpp-2203相比，对于tpp-2614来说，当抗体损失超过80％的其elisa信号时，抗体特异性结合至tweakr(seqidno:169)的第47位处的d(d47)。

在本申请中，参考下列本发明的优选抗体，如下表所示：“tpp-2090”、“tpp-2149”、“tpp-2093”、“tpp-2148”、“tpp-2084”“tpp-2077”、“tpp-1538”、“tpp-883”、“tpp-1854”、“tpp-1853”、“tpp-1857”、“tpp-1858”、“tpp-2658”。

表：抗体的蛋白序列：

tpp-2090是：包含对应于seqidno:2的重链的区域和对应于seqidno:1的轻链的区域的抗体。

tpp-2658是：包含对应于seqidno:241的重链的区域和对应于seqidno:1的轻链的区域的抗体。

tpp-5442是：包含对应于seqidno:242的重链的区域和对应于seqidno:1的轻链的区域的抗体。

tpp-8825是：包含对应于seqidno:243的重链的区域和对应于seqidno:1的轻链的区域的抗体。

tpp-2149是：包含对应于seqidno:12的重链的区域和对应于seqidno:11的轻链的区域的抗体。

tpp-2093是：包含对应于seqidno:22的重链的区域和对应于seqidno:21的轻链的区域的抗体。

tpp-2148是：包含对应于seqidno:32的重链的区域和对应于seqidno:31的轻链的区域的抗体。

tpp-2084是：包含对应于seqidno:42的重链的区域和对应于seqidno:41的轻链的区域的抗体。

tpp-2077是：包含对应于seqidno:52的重链的区域和对应于seqidno:51的轻链的区域的抗体。

tpp-1538是：包含对应于seqidno:62的重链的区域和对应于seqidno:61的轻链的区域的抗体。

tpp-883是：包含对应于seqidno:72的重链的区域和对应于seqidno:71的轻链的区域的抗体。

tpp-1854是：包含对应于seqidno:82的重链的区域和对应于seqidno:81的轻链的区域的抗体。

tpp-1853是：包含对应于seqidno:92的重链的区域和对应于seqidno:91的轻链的区域的抗体。

tpp-1857是：包含对应于seqidno:102的重链的区域和对应于seqidno:101的轻链的区域的抗体。

tpp-1858是：包含对应于seqidno:112的重链的区域和对应于seqidno:111的轻链的区域的抗体。

tpp-2090是：包含对应于seqidno:10的重链可变区和对应于seqidno:9的轻链可变区的抗体。

tpp-2658是：包含对应于seqidno:10的重链可变区和对应于seqidno:9的轻链可变区的抗体。

tpp-5442是：包含对应于seqidno:10的重链可变区和对应于seqidno:9的轻链可变区的抗体。

tpp-8825是：包含对应于seqidno:10的重链可变区和对应于seqidno:9的轻链可变区的抗体。

tpp-2149是：包含对应于seqidno:20的重链可变区和对应于seqidno:19的轻链可变区的抗体。

tpp-2093是：包含对应于seqidno:30的重链可变区和对应于seqidno:29的轻链可变区的抗体。

tpp-2148：是包含对应于seqidno:40的重链可变区和对应于seqidno:39的轻链可变区的抗体。

tpp-2084：是包含对应于seqidno:50的重链可变区和对应于seqidno:49的轻链可变区的抗体。

tpp-2077：是包含对应于seqidno:60的重链可变区和对应于seqidno:59的轻链可变区的抗体。

tpp-1538：是包含对应于seqidno:70的重链可变区和对应于seqidno:69的轻链可变区的抗体。

tpp-883：是包含对应于seqidno:80的重链可变区和对应于seqidno:79的轻链可变区的抗体。

tpp-1854：是包含对应于seqidno:90的重链可变区和对应于seqidno:89的轻链可变区的抗体。

tpp-1853：是包含对应于seqidno:100的重链可变区和对应于seqidno:99的轻链可变区的抗体。

tpp-1857：是包含对应于seqidno:110的重链可变区和对应于seqidno:109的轻链可变区的抗体。

tpp-1858：是包含对应于seqidno:120的重链可变区和对应于seqidno:119的轻链可变区的抗体。

表：抗体的dna序列

抗tweakr的抗体的优选实施方案如下：

非糖基化的抗tweakr的抗体或其抗原结合片段，其与tweakr(seqidno:169)的第47位处的d(d47)特异性结合。

根据实施方案1的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是激动性抗体。

根据实施方案1或2的抗体或其抗原结合片段，其包含：

可变重链，其包含：

由包含式pypmx的氨基酸序列(seqidno:171)编码的重链的cdr1，其中x是i或m；

由包含式yispsggxthyadsvkg的氨基酸序列(seqidno:172)编码的重链的cdr2，其中x是s或k；和

由包含式ggdtyfdyfdy的氨基酸序列(seqidno:173)编码的重链的cdr3；

以及可变轻链，其包含：

由包含式rasqsisxyln的氨基酸序列(seqidno:173)编码的轻链的cdr1，其中x是g或s；

由包含式xasslqs的氨基酸序列(seqidno:175)编码的轻链的cdr2，其中x是q，a或n；和

由包含式qqsyxxpxit(seqidno:176)的氨基酸序列编码的轻链的cdr3，其中第5位的x是t或s，第6位的x是t或s且第8位的x是g或f。

前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合片段，其包含：

可变重链，其包含如seqidno:6所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:7所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:8所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:3所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:4所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:5所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:16所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:17所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:18所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:13所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:14所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:15所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:26所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:27所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:28所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:23所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:24所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:25所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:36所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:37所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:38所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:33所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:34所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:35所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:46所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:47所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:48所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:43所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:44所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:45所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:56所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:57所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:58所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:53所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:54所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:55所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:66所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:67所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:68所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:63所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:64所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:65所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:76所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:77所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:78所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:73所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:74所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:75所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:86所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:87所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:88所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:83所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:84所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:85所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:96所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:97所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:98所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:93所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:94所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:95所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:106所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:107所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:108所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:103所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:104所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:105所示的轻链的可变cdr3序列，或

可变重链，其包含如seqidno:116所示的重链的可变cdr1序列、如seqidno:117所示的重链的可变cdr2序列和如seqidno:118所示的重链的可变cdr3序列，以及

可变轻链，其包含seqidno:113所示的轻链的可变cdr1序列、seqidno:114所示的轻链的可变cdr2序列和seqidno:115所示的轻链的可变cdr3序列。

前述实施方案中任一个的抗体或其抗原结合片段，其包含：

重链的可变序列，如seqidno:10所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:9所示，或

重链的可变序列，如seqidno:20所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:19所示，或

重链的可变序列，如seqidno:30所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:29所示，或

重链的可变序列，如seqidno:40所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:39所示，或

重链的可变序列，如seqidno:50所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:49所示，或

重链的可变序列，如seqidno:60所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:59所示，或

重链的可变序列，如seqidno:70所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:69所示，或

重链的可变序列，如seqidno:80所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:79所示，或

重链的可变序列，如seqidno:90所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:89所示，或

重链的可变序列，如seqidno:100所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:99所示，或

重链的可变序列，如seqidno:110所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:109所示，或

重链的可变序列，如seqidno:120所示，以及轻链的可变序列，如seqidno:119所示。

前述实施方案中任一个的抗体，其是igg抗体。

前述实施方案中任一个的抗体，其包含：

如seqidno:2所示的重链序列，以及如seqidno:1所示的轻链序列，或

如seqidno:12所示的重链序列，以及如seqidno:11所示的轻链序列，或

如seqidno:22所示的重链序列，以及如seqidno:21所示的轻链序列，或

如seqidno:32所示的重链序列，以及如seqidno:31所示的轻链序列，或

如seqidno:42所示的重链序列，以及如seqidno:41所示的轻链序列，或

如seqidno:52所示的重链序列，以及如seqidno:51所示的轻链序列，或

如seqidno:62所示的重链序列，以及如seqidno:61所示的轻链序列，或

如seqidno:72所示的重链序列，以及如seqidno:71所示的轻链序列，或

如seqidno:82所示的重链序列，以及如seqidno:81所示的轻链序列，或

如seqidno:92所示的重链序列，以及如seqidno:91所示的轻链序列，或

如seqidno:102所示的重链序列，以及如seqidno:101所示的轻链序列，或

如seqidno:112所示的重链序列，以及如seqidno:111所示的轻链序列，或

如seqidno:241所示的重链序列，以及如seqidno:1所示的轻链序列，或

如seqidno:242所示的重链序列，以及如seqidno:1所示的轻链序列，或

如seqidno:243所示的重链序列，以及如seqidno:1所示的轻链序列。

前述实施方案中任一个的抗原结合片段或前述实施方案中任一个的抗体的抗原结合片段，其为scfv、fab、fab'片段或f(ab')2片段。

前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其为单克隆抗体或其抗原结合片段。

前述实施方案中任一个的抗体或抗原结合片段，其是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体或抗原结合片段。

特别优选抗tweakr的抗体tpp-2685。

本发明的一个实施方案是提供适用于纺锤体驱动蛋白抑制剂的转谷氨酰胺酶介导的缀合的抗体。

人的野生型全长抗体亚型在重链的第295位(kabateu编号)处具有保守的受体谷氨酰胺，其在存在转谷氨酰胺酶的情况下是可接近且反应性的，这导致当抗体处于非糖基化形式时形成抗体和合适化合物的缀合物。此类非糖基化抗体或去糖基化抗体缺少与fc区的ch2结构域中的保守糖基化位点n297连接的聚糖。例如，可以通过重链的糖基化位点n297(kabateu编号)的突变或通过在缺少糖基化能力的表达系统中表达抗体来产生非糖基化抗体。抗体去糖基化的方法是公知常识(例如winkelhake&nicolson(1976),jbiolchem.251(4):1074-80))。去糖基化抗体可以例如通过借助pngasef进行酶促去糖基化来产生。在本发明的一个实施方案中，可以通过在原核宿主中表达来获得去糖基化抗体。合适的原核宿主包括但不限于大肠杆菌(e.coli)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimurium)以及假单胞菌属(pseudomonas)、链霉菌属(streptomyces)和葡萄球菌属(staphylococcusgenera)的一些种。在本发明的另一个实施方案中，去糖基化抗体可以通过使用哺乳动物细胞表达系统以及糖基化抑制剂衣霉素来获得(nose&wigzell(1983),procnatlacadsciusa,80(21):6632-6)。此时，所述修饰是防止抗体的fc部分的ch2结构域中的重链的保守n-糖基化位点n297处的糖基化(kabat编号)。

在本发明的另一个实施方案中，通过突变重链中的糖基化位点n297(kabat编号)产生非糖基化抗体。已经针对含有突变n297d、n297q(jegeretal.,angewandtechemieint.ed.engl49,9995-9997(2010))或n297s(参见专利申请wo2013092998a1和wo2013092983a2)的抗体变体描述了这种经改造的去糖基化抗体的酶促缀合。此外，本发明证明了转谷氨酰胺酶可以有效地催化具有n297a突变(kabateu编号)的非糖基化抗体变体的缀合。

在存在转谷氨酰胺酶的情况下，可以通过抗体工程来产生额外的或替代的反应性残基。本发明化合物包括谷氨酰胺改造的抗体，其中野生型或亲本抗体的一个或多个氨基酸已被谷氨酰胺替代，或其中谷氨酰胺残基，任选地与另一种氨基酸(例如含有受体谷氨酰胺的标签)一起被引入亲本或野生型分子中。

在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基位于重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，n297位置处的天冬酰胺(kabat编号)已被换为除谷氨酰胺外的残基。优选n297d、n297q、n297s或n297a，甚至更优选n297a。因此，具有n297x取代以及在第295位(kabat编号)处具有谷氨酰胺的抗体每条重链具有一个受体谷氨酰胺。因此完整的igg每个抗体具有两个缀合位点。

在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基位于重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，n297位置处的天冬酰胺(kabat编号)已被换为谷氨酰胺。因此所述抗体具有n297q取代。因此，具有n297q取代和在第295位(kabat编号)具有谷氨酰胺的抗体每条重链具有两个受体谷氨酰胺，并且因此具有两个偶联位点。因此完整的igg每个抗体具有四个缀合位点。

在存在转谷氨酰胺酶的情况下，具有反应性的抗体的谷氨酰胺残基在重链中，通常在恒定域中。在一个实施方案中，n297位置处的天冬酰胺(kabat编号)已被换为谷氨酰胺，并且在第295位的谷氨酰胺已被替换。因此所述抗体具有n297q和q295x取代。优先q295n取代。因此，具有n297q取代且在295位(kabat编号)没有谷氨酰胺的抗体每条重链具有一个受体谷氨酰胺，并且因此具有一个缀合位点。因此，完整的igg每个抗体具有两个缀合位点。

因此，适用于转谷氨酰胺酶介导的缀合的优选抗体包括：

i.n297x取代，其中x是除天冬酰胺以外的任何氨基酸；更优选的是n297d、n297q、n297s或n297a，甚至更优选的是n297a和n297q。

ii.n297q取代和q295x取代，其中x是除谷氨酰胺以外的任何氨基酸，优选q295n。

同位素、盐、溶剂合物、同位素变体

本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体在此应理解为是指其中本发明化合物中的至少一个原子已被替换为具有相同原子序数但具有不同于自然界中通常或主要存在的原子质量的另一个原子的化合物。可纳入本发明化合物的同位素的实例是氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的那些同位素，例如²h(氘)、³h(氚)、¹³c、¹⁴c、¹⁵n、¹⁷o、¹⁸o、³²p、³³p、³³s、³⁴s、³⁵s、³⁶s、¹⁸f、³⁶cl、⁸²br、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁹i和¹³¹i。本发明化合物的特定同位素变体(尤其是其中已经掺入一种或多种放射性同位素的那些化合物的同位素变体)可能是有益的，例如用于检查作用机制或体内的药物分布；由于相对容易的可制备性和可检测性，特别是用³h或¹⁴c同位素标记的化合物适合于此目的。另外，掺入同位素(例如掺入氘)，可能由于化合物具有更高的代谢稳定性(例如体内半衰期延长或所需活性剂量降低)而导致特定的治疗益处；因此，本发明化合物的这些修饰在一些情况下也可构成本发明的优选实施方案。本发明化合物的同位素变体可以通过本领域技术人员已知的方法制备，例如通过下文进一步描述的方法和工作实施例中描述的操作、通过使用相应的同位素修饰各个试剂和/或起始化合物。

本发明上下文中优选的盐是本发明化合物的生理上可接受的盐。还包括本身不适用于药物应用，但可用于例如分离或纯化本发明化合物的盐。

本发明化合物的生理学上可接受的盐包括无机酸、羧酸和磺酸的酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘二磺酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、马来酸和苯甲酸的盐。

本发明化合物的生理学上可接受的盐还包括常规碱的盐，例如且优选碱金属盐(例如钠盐和钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及由氨或有机胺衍生的具有1至16个碳原子的铵盐，例如且优选乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二环己胺、二甲基氨基乙醇、普鲁卡因、二苄胺、n-甲基哌啶、n-甲基吗啉、精氨酸、赖氨酸和1,2-乙二胺。

在本发明的上下文中命名为溶剂合物的是通过与溶剂分子配位而形成固体或液体状态的复合体的本发明化合物的那些形式。水合物是与水配位的溶剂合物的具体形式。在本发明上下文中优选的溶剂合物是水合物。

此外，本发明还包括本发明化合物的前药。本申请上下文中的术语“前药”是指本身可以是具有生物活性或无活性的，但在其体内停留时间内被转化(例如代谢或水解方式)成本发明化合物的化合物。

具体实施方案

以下实施方案是特别优选的：

实施方案a：

下式的apdc及apdc的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐

其中ksp-l-是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)、(iie)或下式(iif)的化合物，所述结合剂是人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段(优选抗her2的抗体、抗egfr的抗体或抗tweakr的抗体，更优选与在tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)特异性结合的抗tweakr的抗体，特别是抗tweakr的抗体tpp-2658)，并且n是1至10的数字：

式(iif)：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a是-c(＝o)-(羰基)；

r¹代表–l-#1、-h、-cooh、-conhnh2、-(ch2)1-3nh2、-conz“(ch2)1-3nh2和–conz“ch2cooh，其中z“代表-h或-nh2；

r²是-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2co)nh2)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

r³代表–l-#1或c1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–oh、o-烷基、sh、s-烷基、o-co-烷基、o-co-nh-烷基、nh-co-烷基、nh-co-nh-烷基、s(o)n-烷基、so2-nh-烷基、nh-烷基、n(烷基)2或nh2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为c1-3-烷基)；

r⁵为-h或-f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、(任选地氟化的)c1-3-烷基、(任选地氟化的)c2-4-烯基、(任选地氟化的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸是支链的c1-5-烷基；且

r⁹是-h或-f，

其中取代基r¹和r³之一代表-l-#1，且

-l-表示接头且#1表示与抗体连接的键。

接头优选地为接头

§-(co)m-l1-l2-§§

其中m为0或1；

§代表与ksp连接的键，

§§代表与抗体连接的键，且

l2

其中

#¹表示与抗体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，

并且l1由下式表示

#¹–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-#²

其中r¹⁰表示-h、-nh2或c1-c3-烷基；

g1表示-nhco-或

n是0或1；

o是0或1；且

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，或-so-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

此处，#1是与ksp抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如l2)的键。

实施方案b：

下式的apdc及apdc的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐

其中ksp-l-是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)、(iie)、(iif)或下式(iig)的化合物，所述结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：

式(iig)：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a是co(羰基)；

r¹是–l-#1、-h、-cooh、-conhnh2、-(ch2)1-3nh2、-conz“(ch2)1-3nh2和–conz“ch2cooh，其中z“代表-h或-nh2；

r²是-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的豆荚蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

r³代表–l-#1或c1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–oh、o-烷基、sh、s-烷基、o-co-烷基、o-co-nh-烷基、nh-co-烷基、nh-co-nh-烷基、s(o)n-烷基、so2-nh-烷基、nh-烷基、n(烷基)2或nh2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为c1-3-烷基)；

r⁵为-h或-f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表-h、(任选地氟化的)c1-3-烷基、(任选地氟化的)c2-4-烯基、(任选地氟化的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸是支链的c1-5-烷基；且

r⁹是-h或-f，

其中取代基r¹和r³之一代表-l-#1，且

-l-表示接头且#1表示与抗体连接的键。

-l-优选地由下式表示

§-(co)m-l1-l2-§§

其中m为0或1；

§代表与ksp连接的键，

§§代表与抗体连接的键，且

l2

其中

#¹表示与抗体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，

并且l1由下式表示

#¹–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-#²，

其中r¹⁰表示-h、-nh2或c1-c3-烷基；

g1表示-nhco-或

n是0或1；

o是0或1；且

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，或-so-(优选)，其中侧链(如果存在的话)可被–nhco-nh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

#1是与ksp抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如l2)的键。

或者，接头可以与赖氨酸侧链或赖氨酸残基键合。

实施方案c：

下式的apdc及apdc的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐

其中ksp-l-是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)、(iie)、(iif)、(iig)或下式(iih)的化合物，结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：

式(iih)：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a是-c(＝o)-(羰基)；

r¹是–l-#1；

r²是-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或r²¹-(co)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

r³为c1-10-烷基-，其可任选地被以下基团取代：–oh、-o-烷基、-sh、-s-烷基、-o-co-烷基、-o-co-nh-烷基、-nh-co-烷基、-nh-co-nh-烷基、-s(o)n-烷基、-so2-nh-烷基、-nh-烷基、-n(烷基)2或-nh2，n代表0、1或2，(其中烷基优选地为c1-3-烷基)，或-mod；

其中-mod代表–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-h，其中

r¹⁰表示-h或c1-c3-烷基；

g1表示–nhco-、-conh-或(其中，如果g1代表–nhco-或r¹⁰不是nh2)；

n是0或1；

o是0或1；且

g2为具有1至10个碳原子的直链和/或支链烃基并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nr^y-、-nr^yco-、conr^y-、-nr^ynr^y-、-so2nr^ynr^y-、-conr^ynr^y-(其中r^y代表h、苯基、c1-c10-烷基、c2-c10-烯基或c2-c10-炔基，其每一个均可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cn-nh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代)、-co-、-cr^x＝n-o-(其中r^x代表h、c1-c3-烷基或苯基)，其中包括任何侧链的烃链可被nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、-nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代，其中–mod基团优选地具有至少一个–cooh基团；

r⁵为h或f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表h、(任选地氟化的)c1-3-烷基、(任选地氟化的)c2-4-烯基、(任选地氟化的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸是支链的c1-5-烷基；且

r⁹是h或f，

其中-l-表示接头且#1表示与抗体连接的键，

其中-l-由下式表示

§-(co)m-l1-l2-§§

其中m为0或1；

§代表与ksp连接的键，

§§代表与抗体连接的键，且

l2

其中

#¹表示与抗体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，

并且l1由下式表示

#¹–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-#²

其中r¹⁰表示-h、-nh2或c1-c3-烷基；

g1表示-nhco-或

n是0或1；

o是0或1；且

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环，-so-或so2-(优选)，其中包括侧链的烃链(如果存在的话)可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2,nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

此处，#1是与ksp抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如l2)的键。

实施方案d：

具有下式的抗体缀合物

其中

r²和r⁵代表-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c510-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r22基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且r22代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

r³代表-ch2oh；

r1代表–l1-l2-binder，其中

l1代表

其中#2代表与l2的连接，#1代表与l1的连接；

并且l2代表下式a5和a6的结构中的一种或两种：

其中

#¹表示与结合体的硫原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，且

r22代表-cooh、-coor、-cor、-conhr(其中r在每种情况下均代表c1-3-烷基)、-conh2，优选-cooh。

在根据本发明的缀合物中或在根据本发明的缀合物的混合物中，存在与结合体的半胱氨酸残基连接的键，其达到优选超过80％、特别优选超过90％(在每种情况下基于接头与结合体的键的总数)的程度，所述键特别优选地作为式a5或a6的两种结构中的一种。

此处，式a5或a6的结构通常一起存在，优选地以60:40至40:60的比率，基于与结合体连接的键的数目计。然后，其余键以以下结构存在

结合体优选地为结合蛋白或肽，特别优选人、人源化或嵌合单克隆抗体或其抗原结合片段，特别是抗tweakr的抗体或其抗原结合片段或者抗egfr的抗体或其抗原结合片段。特别优选这样的抗tweakr的抗体，其特异性结合tweakr(seqidno:169)的第47位中的氨基酸d(d47)，特别是抗tweakr的抗体tpp-2658或抗egfr的抗体西妥昔单抗或尼妥珠单抗。作为结合体的替代物，还可以存在半胱氨酸残基。

实施方案e：

下式的apdc及apdc的盐、溶剂合物和所述溶剂合物的盐

其中ksp-l-是式(iia)、(iib)、(iic)、(iid)、(iie)、(iif)、(iig)、(iih)或下式(iii)的化合物，所述结合剂是抗体，并且n是1至10的数字：

式(iii)：

其中

x1代表n，x2代表n且x3代表c；

x1代表ch，x2代表c且x3代表n；

x1代表nh，x2代表c且x3代表c；或

x1代表ch，x2代表n且x3代表c；

a是co(羰基)；

r¹是-h或-cooh，

r²是-h；

r⁴代表式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式r²¹-(c＝o)(0-1)-(p3)(1-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团，

其中r²¹代表c1-10-烷基、c5-芳基或c6-10-芳烷基、c5-10-杂烷基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳基、c5-10-杂环烷基、杂芳基、杂芳基烷基、c1-10-烷氧基、c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基、c5-10-杂烷氧基、c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基、c5-10-杂环烷氧基，其可被以下基团单取代或多取代：-nh2、-nh-烷基、-n(烷基)2、nh-co-烷基、-n(烷基)-co烷基、-so3h、-so2nh2、-so2-n(烷基)2、-cooh、-conh2、-con(烷基)2或–oh、-h，或–ox-(ch2ch2o)y-r²²基团(其中x代表0或1，v代表1至20的数字，并且r²²代表–h、–烷基(优选c1-12-烷基)、-ch2-cooh、-ch2-ch2-cooh或-ch2-ch2-nh2)；

p2为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3为选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his或各自的n-烷基氨基酸之一，优选n-甲基氨基酸；

r³为–l-#1；

r⁵为h或f；

r⁶和r⁷彼此独立地代表h、(任选地氟化的)c1-3-烷基、(任选地氟化的)c2-4-烯基、(任选地氟化的)c2-4-炔基、羟基或卤素；

r⁸是支链的c1-5-烷基；且

r⁹是-h或-f，

其中-l-表示接头且#1表示与抗体连接的键。

其中-l-由下式表示

§-(c＝o)m-l1-l2-§§

其中

m为0或1；

§代表与ksp连接的键，

§§代表与抗体连接的键，且

l2

其中

#¹表示与抗体的硫原子或氮原子的连接点，

#²表示与基团l¹的连接点，

并且l1由下式表示

#¹–(nr¹⁰)n-(g1)o-g2-#²

其中r¹⁰表示-h、-nh2或c1-c3-烷基；

g1表示-nhco-或

n是0或1；

o是0或1；且

g2代表具有1至100个碳原子的选自亚芳基和/或直链和/或支链和/或环状的亚烷基的直链或支链烃链，并且其可被一个或多个以下基团间断一次或多于一次：-o-、-s-、-so-、so2、-nh-、-co-、-nhco-、-conh-、-nme-、-nhnh-、-so2nhnh-、-conhnh-、-cr^x＝n-o-(其中rx代表h、c1-c3-烷基或苯基)以及具有至多4个选自n、o和s的杂原子的3-至10元芳族或非芳族杂环、-so-或-so2-(优选)，其中包括侧链的烃链(如果存在的话)可被–nhconh2、-cooh、-oh、-nh2、nh-cnnh2、磺酰胺、砜、亚砜或磺酸取代。

#1是与ksp抑制剂连接的键，#2是连接偶联基团与结合体(例如l2)的键。

治疗用途

可采用本发明化合物治疗的过度增殖性疾病特别包括癌症和肿瘤疾病。在本发明的上下文中，这些癌症和肿瘤疾病被理解为特别指以下疾病，但不限于此：乳腺癌和乳腺肿瘤(包括导管和小叶形式的乳腺癌，也是原位的)、呼吸道的肿瘤(小细胞癌或非小细胞癌、支气管癌)、脑肿瘤(例如脑干的肿瘤和下丘脑的肿瘤、星形细胞瘤、室管膜瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、脑膜瘤以及神经外胚层和松果体瘤)、消化道器官的肿瘤(食道癌、胃癌、胆囊癌、小肠癌、大肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝肿瘤(尤其是肝细胞癌、胆管上皮癌和混合肝细胞胆管上皮癌)、头部和颈部的肿瘤(喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、唇癌和口腔癌、口腔黑素瘤)、皮肤肿瘤(基底细胞癌、棘细胞癌(spinalioma)、鳞状细胞癌、kaposi氏肉瘤、恶性黑色素瘤、非黑色素皮肤癌、merkel细胞皮肤癌、肥大细胞肿瘤)、软组织的肿瘤(尤其是软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、纤维肉瘤、血管肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤)、眼睛的肿瘤(特别是眼内黑素瘤和视网膜母细胞瘤)、内分泌腺和外分泌腺的肿瘤(例如甲状腺和甲状旁腺的肿瘤、胰腺和唾液腺癌、腺癌)、泌尿道的肿瘤(膀胱、阴茎、肾脏、肾盂和输尿管的肿瘤)和生殖器官的肿瘤(子宫内膜癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、女性的外阴癌和子宫癌以及男性的前列腺癌和睾丸癌)。这些癌症和肿瘤疾病还包括血液、淋巴系统和脊髓的增殖性疾病，其以固体形式且为循环细胞，例如白血病、淋巴瘤和骨髓增生性疾病，例如急性骨髓白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病，以及aids相关淋巴瘤、hodgkin氏淋巴瘤、非hodgkin氏淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、burkitt氏淋巴瘤和中枢神经系统中的淋巴瘤。

这些在人类中被充分特征的疾病也可以在其他哺乳动物中以相似的病因发生，在其他哺乳动物中同样可以用本发明的化合物进行治疗。

用本发明的化合物治疗上述癌症疾病包括治疗实体瘤和治疗实体瘤的转移或循环形式。

在本发明的上下文中，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”以常规意义使用，意指照料、照顾、护理患者，目的是对抗、减轻、减弱或缓解疾病或健康异常，改善由该疾病所损害的生活状态，例如在癌症的情况下。

因此，本发明还提供了本发明化合物用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症的用途。

本发明还提供了本发明化合物在制备用于治疗和/或预防病症，特别是上述病症中的用途。

本发明还提供了本发明化合物在治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法中的用途。

本发明还提供了使用有效量的至少一种本发明的化合物治疗和/或预防病症，特别是上述病症的方法。

本发明化合物可以单独使用，或者如果需要的话，与一种或多种其他药理学活性物质组合使用，条件是该组合不会导致不合乎需要的和不可接受的副作用。因此，本发明还提供了药物，其包含至少一种本发明化合物和一种或多种其他药物，特别用于治疗和/或预防上述病症。

例如，本发明化合物可以与已知的抗过度增殖物质、细胞抑制物质或细胞毒性物质组合用于治疗癌症疾病。合适的组合药物的实例包括：

131i-chtnt、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龙(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、ado-曲妥珠单抗(ado-trastuzumab)-美坦新、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地白介素(aldesleukin)、阿仑珠单抗(alemtuzumab)、阿仑膦酸(alendronicacid)、阿利维a酸(alitretinoin)、六甲蜜胺(altretamine)、氨磷汀(amifostine)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、5-氨基乙酰丙酸已基酯(hexyl5-aminolevulinate)、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西司亭(ancestim)、茴香脑二硫杂环戊二烯硫酮(anetholedithiolethione)、血管紧张素ii(angiotensinii)、抗凝血酶ⅲ(antithrombiniii)、阿瑞吡坦(aprepitant)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿格拉滨(arglabin)、三氧化二砷(arsenictrioxide)、天冬酰胺酶(asparaginase)、阿昔替尼(axitinib)、阿扎胞苷(azacitidine)、贝洛替康(belotecan)、苯达莫司汀(bendamustine)、贝林司他(belinostat)、贝伐单抗(bevacizumab)、贝沙罗汀(bexarotene)、比卡鲁胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博来霉素(bleomycin)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、波舒替尼(bosutinib)、本妥昔单抗-维多汀(brentuximabvedotin)、白消安(busulfan)、卡巴他赛(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、亚叶酸钙(calciumfolinate)、左亚叶酸钙(calciumlevofolinate)、卡培他滨(capecitabine)、卡罗单抗(capromab)、卡铂(carboplatin)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡妥索单抗(catumaxomab)、塞来考昔(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、赛立替尼(ceritinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、西多福韦(cidofovir)、西那卡塞(cinacalcet)、顺铂(cisplatin)、环磷酰胺(cladribine)、氯膦酸(clodronicacid)、氯法拉滨(clofarabine)、库潘里昔布(copanlisib)、克立他酶(crisantaspase)、克里唑替尼(crizotinib)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、环丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、更生霉素(dactinomycin)、达拉菲尼(dabrafenib)、达沙替尼(dasatinib)、柔红霉素(daunorubicin)、地西他滨(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素2(denileukin-diftitox)、地舒单抗(denosumab)、地普奥肽(depreotide)、地洛瑞林(deslorelin)、右雷佐生(dexrazoxane)、二溴螺氯铵(dibrospidiumchloride)、环氧乳醇(dianhydrogalactitol)、双氯芬酸(diclofenac)、多西紫杉醇(docetaxel)、多拉司琼(dolasetron)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、多柔比星(doxorubicin)、多柔比星+雌酮(doxorubicin+oestrone)、屈大麻酚(dronabinol)、依决洛单抗(edrecolomab)、依利醋铵(elliptiniumacetate)、内皮他丁(endostatin)、依诺他滨(enocitabine)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、表柔比星(epirubicin)、环硫雄醇(epitiostanol)、α依伯汀(epoetin-alfa)、β依泊汀(epoetin-beta)、ζ依泊汀(epoetin-zeta)、依他铂(eptaplatin)、艾立布林(eribulin)、埃罗替尼(erlotinib)、艾美拉唑(esomeprazole)、雌氮芥(estramustine)、依托泊甙(etoposide)、依维莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法倔唑(fadrozole)、芬太尼(fentanyl)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、叶酸(folicacid)、福美坦(formestane)、福沙匹坦(fosaprepitant)、福莫司汀(fotemustine)、氟维司群(fulvestrant)、钆布醇(gadobutrol)、钆特醇(gadoteridol)、钆特酸葡甲胺盐(gadotericacidmegluminesalt)、钆弗塞胺(gadoversetamide)、钆塞酸(gadoxeticacid)二钠盐(gd-eob-dtpa二钠盐)、硝酸镓(galliumnitrate)、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他滨(gemcitabine)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、谷卡匹酶(glucarpidase)、氧化型谷胱甘肽(glutoxim)、戈舍瑞林(goserelin)、格拉司琼(granisetron)、粒细胞集落刺激因子(granulocytecolonystimulatingfactor(g-csf))、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(gm-csf))、二盐酸组胺(histaminedihydrochloride)、组氨瑞林(histrelin)、羟基脲(hydroxycarbamide)、i-125种子、伊班膦酸(ibandronicacid)、替伊莫单抗(ibritumomab-tiuxetan)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊马替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、英丙舒凡(improsulfan)、吲地司琼(indisetron)、英卡膦酸(incadronicacid)、丁烯英酯(ingenolmebutate)、干扰素-α(interferon-alfa)、干扰素-β(interferon-beta)、干扰素-γ(interferon-gamma)、碘比醇(iobitridol)、碘苄胍(123i)(iobenguane(123i))、碘美普尔(iomeprol)、伊匹木单抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊曲康唑(itraconazole)、伊沙匹隆(ixabepilone)、兰瑞肽(lanreotide)、兰索拉唑(lansoprazole)、拉帕替尼(lapatinib)、lasocholine、来那度胺(lenalidomide)、香菇多糖(lentinan)、来曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、左炔诺孕酮(levonorgestrel)、左甲状腺素钠片(levothyroxin-sodium)、利培非格司亭(lipegfilgrastim)、利舒脲(lisuride)、洛铂(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼达明(lonidamine)、马索罗酚(masoprocol)、甲羟孕酮(medroxyprogesteron)、甲地孕酮(megestrol)、美拉胂醇(melarsoprol)、美法仑(melphalan)、美雄烷(mepitiostan)、巯嘌呤(mercaptopurine)、美司钠(mesna)、美沙酮(methadone)、甲氨蝶呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、甲氨基酮戊酸盐(methylaminolevulinate)、甲泼尼龙(methylprednisolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、甲酪氨酸(metirosine)、米法莫肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米铂(miriplatin)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴卫矛醇(mitolactol)、丝裂霉素(mitomycin)、米托坦(mitotan)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫加珠单抗(mogamulizumab)、莫拉司亭(molgramostim)、莫哌达醇(mopidamol)、盐酸吗啡(morphinehydrochloride)、硫酸吗啡(morphinesulfate)、大麻隆(nabilone)、nabiximols、那法瑞林(nafarelin)、纳洛酮+喷他佐辛(naloxone+pentazocine)、纳曲酮(naltrexone)、那托司亭(nartograstim)、奈达铂(nedaplatin)、奈拉滨(nelarabine)、奈立膦酸(neridronicacid)、纳武单抗喷曲肽(nivolumabpentetreotide)、尼洛替尼(nilotinib)、尼鲁米特(nilutamide)、尼莫唑(nimorazole)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、硝氨丙吖啶(nitracrine)、纳武单抗(nivolumab)、阿托珠单抗(obinutuzumab)、奥曲肽(octreotide)、奥法木单抗(ofatumumab)、美琥他辛(omacetaxinmepesuccinate)、奥美拉唑(omeprazole)、昂丹司琼(ondansetron)、奥古蛋白(orgotein)、orilotimod、奥沙利铂(oxaliplatin)、羟可酮(oxycodone)、羟甲烯龙(oxymetholone)、奥佐米星(ozogamicin)、p53基因治疗、紫杉酚(paclitaxel)、钯-103晶种(palladium-103seed)、帕洛诺司琼(palonosetron)、帕米磷酸(pamidronicacid)、帕木单抗(panitumumab)、泮托拉唑(pantoprazole)、帕唑帕尼(pazopanib)、培门冬酶(pegaspargase)、帕母单抗(pembrolizumab)、培干扰素α-2b(peg-interferonalfa-2b)、培美曲塞(pemetrexed)、喷司他丁(pentostatin)、培洛霉素(peplomycin)、全氟丁烷(perflubutane)、培磷酰胺(perfosfamide)、培妥珠单抗(pertuzumab)、毕西巴尼(picibanil)、毛果芸香碱(pilocarpine)、吡柔比星(pirarubicin)、匹杉琼(pixantron)、普乐沙福(plerixafor)、普利霉素(plicamycin)、聚氨葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇(polyoestradiolphosphate)、聚维酮+玻璃酸钠(polyvinylpyrrolidone+sodiumhyaluronate)、多糖-k(polysaccharide-k)、泊马度胺(pomalidomide)、普纳替尼(ponatinib)、卟吩姆钠(porfimer-sodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、泼尼氮芥(prednimustine)、泼尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、丙考达唑(procodazole)、普萘洛尔(propranolol)、喹高利特(quinagolide)、雷贝拉唑(rabeprazole)、雷妥莫单抗(racotumomab)、氯化镭-233(radium-223chloride)、雷多替尼(radotinib)、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、雷莫司琼(ramosetron)、雷莫芦单抗(ramucirumab)、雷莫司汀(ranimustine)、雷莫司汀(rasburicase)、雷佐生(razoxan)、(refametinib)、瑞戈非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronicacid)、羟乙磷酸铼-186(rhenium-186etidronate)、利妥昔单抗(rituximab)、罗米地新(romidepsin)、罗莫肽(romurtid)、罗尼昔利布(roniciclib)、来昔决南钐(153sm)(samarium(153sm)lexidronam)、沙妥莫单抗(satumomab)、胰泌素(secretin)、西普鲁塞-t(sipuleucel-t)、西佐喃(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘氨双唑钠(sodiumglycididazole)、索拉非尼(sorafenib)、司坦唑醇(stanozolol)、链脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、他米巴罗汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他喷他多(tapentadol)、他索那敏(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、巯诺莫单抗锝(99mtc)(technetium(99mtc)nofetumomabmerpentan)、99mtc-hynic-[tyr3]-奥曲肽(99mtc-hynic-[tyr3]-octreotide)、喃氟啶(tegafur)、喃氟啶+吉美嘧啶+奥替拉西(tegafur+gimeracil+oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦西莫司(temsirolimus)、替尼泊甙(teniposide)、睾酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙立度胺(thalidomide)、噻替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、促甲状腺素α(thyrotropinalfa)、硫鸟嘌呤(tioguanine)、托珠单抗(tocilizumab)、托泊替坎(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫单抗(tositumomab)、曲贝替定(trabectedin)、曲马朵(tramadol)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、曲奥舒凡(treosulfan)、维a酸(tretinoin)、曲氟尿苷+替吡嘧啶(trifluridine+tipiracil)、曲美替尼(trametinib)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲磷胺(trofosfamide)、血小板生成素(thrombopoietin)、乌苯美司(ubenimex)、戊柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、伐他拉尼(vatalanib)、维罗非尼(vemurafenib)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春氟宁(vinflunine)、长春瑞滨(vinorelbine)、维莫德吉(vismodegib)、伏林司他(vorinostat)、钇-90玻璃微球体(yttrium-90glassmicrobeads)、净司他丁(zinostatin)、净司他丁斯酯(zinostatinstimalamer)、唑来膦酸(zoledronicacid)、佐柔比星(zorubicin)。

此外，所述抗体可以选自mps1类抑制剂或针对靶标ox-40、cd137/4-1bb、dr3、ido1/ido2、lag-3和cd40的抗体。

另外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。

通常，以下目标可以通过本发明化合物与其他细胞抑制活性剂或细胞毒性活性剂的组合来实现：

·与使用单独活性成分的治疗相比，在减缓肿瘤生长、减小肿瘤尺寸或甚至完全消除肿瘤方面功效提高；

·以比单一疗法情况下的剂量更低的剂量使用化学疗法药物的可能性；

·与单独给药相比，副作用更少的更可耐受的疗法的可能性；

·治疗更广谱的肿瘤的可能性；

·获得更高的治疗反应率；

·与当前的标准疗法相比，患者的存活时间更长。

此外，本发明化合物还可以与放射疗法和/或外科手术干预组合使用。

本发明还提供了药物，其包含至少一种通常与一种或多种惰性的、无毒的、药学上合适的赋形剂一起的本发明化合物，以及其用于上述目的的用途。

本发明化合物可以全身地和/或局部地起作用。为此目的，它们可以以合适的方式给药，例如肠胃外给药，可能吸入地或作为植入物或支架给药。

本发明化合物可以以适合于这些给药途径的给药形式给药。

肠胃外给药可以绕过吸收步骤(例如静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰内)或者可以包括吸收(例如肌肉内、皮下、皮内、经皮或腹膜内)。适于胃肠外给药的给药形式包括以溶液剂、悬液剂、乳剂或冻干剂形式的用于注射和输注的制品。优选肠胃外给药，尤其是静脉内给药。

通常，已发现在胃肠外给药的情况下，给药约0.001至1mg/kg体重，优选约0.01至0.5mg/kg体重的量有益于达到有效的结果。

然而，在某些情况下，有必要偏离所述的量，具体地根据体重、给药途径、个体对药物的反应、制品的性质以及进行给药的时间或间隔。因此，在一些情况下，小于上述最小量时可能就足够了，而在其他情况下，必须超过所提到的上限。在给药更大量的情况下，可以建议在一天中将它们分成几个单独剂量。

实施例

下面的实施例举例说明本发明。本发明不限于这些实施例。

除非另有说明，下面的试验和实施例中的百分比是重量百分比；份数是重量份数。液体/液体溶液的溶剂比例、稀释比例和浓度数据在每种情况下均是基于体积。

合成路线：

作为工作实施例的示例，以下方案示出了成为工作实施例的示例性合成路线：在这些方案中，式iia的位置r⁴中的氢原子(即在-nh2基团中)可以被式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-nh-ch(ch2conh2)-co-的基团或式r²¹-(co)(0-1)-(p3)(0-2)-p2-的组织蛋白酶可裂解基团取代，其中p2是选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

p3是选自以下的氨基酸：gly、pro、ala、val、nva、leu、ile、met、phe、tyr、trp、ser、thr、cys、asn、gln、asp、glu、lys、arg、瓜氨酸和his；

其中r²¹代表c1-10-烷基，c6-10-芳基或c6-10-芳烷基，c5-10-杂烷基，c1-10-烷基-o-c6-10-芳基，c5-10-杂环烷基，c1-10-烷氧基，c6-10-芳氧基或c6-10-芳烷氧基，c5-10-杂烷氧基，c1-10-烷基-o-c6-10-芳氧基，c5-10-杂环烷氧基，其可被-nh2、-so3h、-cooh、-sh或–oh单取代或多取代。

方案1：半胱氨酸连接的adc的合成

方案2：半胱氨酸连接的adc的合成

方案3：半胱氨酸连接的adc的合成

方案4：半胱氨酸连接的adc的合成

方案5：赖氨酸连接的adc的合成

a)三光气，thf，在氩气下

方案6：赖氨酸连接的adc的合成

方案7：adc前体分子的合成

[a)：edci、hobt、二异丙基乙胺，rt；b)乙醇、哌啶、甲胺、水，rt；c)hatu、二异丙基乙胺，rt；d)tfa、dcm，rt]

方案8：adc前体分子的合成

[a)：例如edci、hobt、二异丙基乙胺、dmf，rt；b)例如dcm/tfa20:1，rt；c)例如hatu、二异丙基乙胺、dmf，rt；d)例如tfa、dcm，rt]

方案9：adc前体分子的合成

[a)：例如2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐、二异丙基乙胺、dcm，rt；b)例如2mlioh溶液、thf、水，rt，区域异构体(regiosisomer)的hplc分离；c)例如edci、hobt、二异丙基乙胺、dmf，rt；d)例如tfa、dcm，rt]

方案10：adc前体分子的合成

[a)：例如h2、pd-c、etoh，rt；b)例如对硝基苄基溴、k2co3、dmf；c)例如乙醇、40％浓度的甲胺水溶液，50℃；d)例如连二亚硫酸二钠、thf、水，50℃；e)例如hatu、二异丙基乙胺、dmf，rt；f)例如哌啶、40％浓度的甲胺水溶液、乙醇，50℃；g)例如二异丙基乙胺、dmf，rt；h)例如哌啶、dmf，rt；i)tfa、dcm，rt]

方案11：adc前体分子的合成

[a)：例如et3n、dmf，rt；b)例如h2、pd-c、etoh/乙酸乙酯/thf(1:1:1)，rt；c)例如4-甲基吗啉、dmf，rt；d)例如hatu、hoat、二异丙基乙胺、dmf，rt；e)例如tfa，rt]

方案12：adc前体分子的合成

[a)：例如nabh(oac)3、hoac、二氯甲烷，rt；b)例如氯乙酰氯、net3、dcm，rt；c)例如cs2co3、dmf，50℃；d)例如1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、t3p^(r)、二异丙基乙胺、mecn，rt；e)例如tfa，rt]

方案13：adc前体分子的合成

[a)：例如甲磺酰氯、net3、二氯甲烷，0℃；b)例如nan3、dmf，40℃；c)例如h2、pd-c、etoh/乙酸乙酯(1:1)，rt；d)例如tbaf、thf，rt；e)例如1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮、net3、caco3、1,4-二噁烷，rt；f)例如n-氯代琥珀酰亚胺、tempo、四正丁基氯化铵、氯仿、0.05n碳酸钾/0.05n碳酸氢钠溶液(1:1)；g)例如nabh(oac)3、hoac、二氯甲烷，rt；h)例如氯乙酰氯、net3、dcm，rt；i)例如tbaf、thf、水，rt；j)例如4-甲基吗啉、dmf，rt；k)例如tfa，rt；

方案14：adc前体分子的合成

[a)：例如甲醛、na2co3、水，rt；b)例如ac2o、吡啶、thf，rt；c)例如丙二酸二叔丁酯、kotbu、thf，rt；d)例如libh4、thf，rt；e)例如tbdmscl、咪唑、dcm，rt；f)例如dess-martin过碘烷、dcm；g)例如三乙酰氧基硼氢化钠、acoh、dcm，rt；h)例如nbu4nf、thf，rt；i)例如socl2、thf，rt；j)例如acsk、nbu4ni、dmf，90℃；k)例如naoh、meoh、thf，rt；l)例如tcep、二噁烷，rt；m)例如差向异构体的分离；n)例如6n盐酸、thf，rto)例如mal-dpeg(3)-mal、pbs缓冲液、acn，rt]

方案15：adc前体分子的合成

[a)：例如mal-dpeg(3)-mal、pbs缓冲液、acn，rt]

方案16：adc前体分子的合成

[a)：例如bf3oet2、thf，0℃；b)：例如亚硝酸异戊酯，-10℃，0.5h；c)：例如2-氯-3-氧代丁酸甲酯、吡啶、水，-5℃；d)：例如net3、甲苯，rt；e)：例如et3sih、tfa，rt；f)：例如libh4、thf，60℃；g)：例如dess-martin过碘烷、dcm，rt；h)：例如(r)-(+)-甲基-2-丙基亚磺酰胺、异丙氧钛(iv)、thf，rt；i)：例如叔丁基锂、戊烷、thf，-78℃；j)：例如在二噁烷中的hcl、thf、meoh，rt；k)：例如3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙醛、nab(oac)3h、acoh、dcm，rt；l)：例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、net3、dcm，rt；m)：例如甲胺、水、etoh，50℃]

方案17：adc前体分子的合成

[a)：例如n-(叔丁氧羰基)-5-氧代-l-正缬氨酸叔丁酯、nab(oac)3h、acoh、dcm，rt；b)：例如乙酸2-氯-2-氧代乙酯、net3、dcm，rt；c)：例如甲胺、水、etoh，60℃；d)：例如thf、dcm，50℃；e)：例如boc2o、net3、dcm，rt；f)：例如三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)、hatu、二异丙基乙胺、dmf，rt；f)：例如tfa、dcm，rt；

方案18：半胱氨酸连接的adc的合成

方案19：半胱氨酸连接的adc的合成

方案20：半胱氨酸连接的adc的合成

方案21：半胱氨酸连接的adc的合成

方案22：中间体的合成

[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、dcm，rt；b)例如乙酰氧基乙酰氯、net3、dcm，rt；c)例如lioh、thf/水，rt；d)例如h2、pd-c、etoh，rt；e)例如teoc-osu、net3、二噁烷，rt；f)：例如fmoc-cl、二异丙基乙胺、二噁烷/水2:1，rt]

方案23：中间体的合成

[a)：例如三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、dcm，rt；b)例如乙酰氧基乙酰氯、net3、dcm，rt；c)例如lioh、甲醇，rt；d)例如tfa、dcm，rt；e)例如boc2o、二异丙基乙胺、dcm，rt]

方案24：中间体的合成

[a)：例如苄基溴、cs2co3、dmf，rt；b)例如pd(dppf)2cl2、dmf、na2co3，85℃；c)例如lialh4、thf，0℃；mno2、dcm，rt；d)例如ti(iopr)4、thf，rt；e)例如tbuli、thf，-78℃；meoh、nh4cl；f)例如hcl/1,4-二噁烷]

方案25：半胱氨酸连接的adc的合成

方案26：通过水解的琥珀酰胺合成半胱氨酸连接的adc

这种方法特别用于其中l1＝ch2的adc，以将这些adc转化成开链连接形式。

方案27：adc前体分子的合成

[a)：三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、dcm，rt；b)乙酰氧基乙酰氯、二异丙基乙胺、dcm，rt；c)lioh、meoh，rt；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)hatu、dmf、二异丙基乙胺，rt；e)氯化锌、三氟乙醇，50℃，edta]。

方案28：adc前体分子的合成

[a)：hatu、dmf、二异丙基乙胺，rt；b)氯化锌、三氟乙醇，50℃，edta]。

方案29：adc前体分子的合成

[a)：三乙酰氧基硼氢化钠、乙酸、dcm，rt；b)乙酰氧基乙酰氯、三乙胺、dcm，rt；c)lioh、meoh，rt；d)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)hatu、dmf、二异丙基乙胺，rt；e)氯化锌、三氟乙醇，50℃，edta]。

方案30：用于合成中间体和adc前体的一般方法

[a)：hatu、dmf、n,n-二异丙基乙胺，rt或edci、hobt、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rtb)h2、10％pd-c、meoh，rt；c)r²¹-cooh、edci、hobt、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rt或r²¹-cooh、hatu、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rt或r²¹-coosu、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rt]

方案31：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的adc前体分子的合成

[a)：hatu、dmf、n,n-二异丙基乙胺，rt或edci、hobt、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rtb)h2、10％pd-c、meoh，rt；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rt]

方案32：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的adc前体分子的合成

[a)：hatu、dmf、n,n-二异丙基乙胺，rt或edci、hobt、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rtb)h2、10％pd-c、meoh，rt；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮、n,n-二异丙基乙胺、dmf，rt]

此外，根据方案32、33和34的其他中间体可以转化成豆荚蛋白酶可裂解的adc和apdc前体。

作为方案32-34中所示的苄氧基羰基的替代物，可以使用在肽化学中确立的其他保护基，并通过同样已知的相应方法连接它们。保护基策略的选择根据本领域技术人员已知的、关于与分子中存在的其它结构元件的相容性的要求进行。如果它们仍然存在，则分子中的其它保护团可以在最后一步中被移除。

合成也可以任选地按照它们的顺序重排。

方案33：具有豆荚蛋白酶可裂解首基(headgroup)的半胱氨酸键合的adc的合成

[a)：hatu、dmf、n,n-二异丙基乙胺，rt；b)2-5个当量的tcep、pbsph7.2，在rt下搅拌30min；c)在rt和氩气下搅拌90min，然后通过pd10柱(g-25，gehealthcare)重新缓冲至ph8，并在氩气和rt下搅拌过夜，随后通过超速离心进行浓缩并用pbs(ph7.2)设定所需浓度]

方案34：具有豆荚蛋白酶可裂解接头的赖氨酸键合的adc的合成

[a)：hatu、dmf、n,n-二异丙基乙胺，rt；b)h2、10％pd-c、甲醇1.5h，rt；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮、n,n-二异丙基乙胺、dmf，在rt下搅拌过夜；d)在pbs中的ak2，加入5个当量的溶于dmso中的活性酯，在rt和氩气下搅拌60min，再加入5个当量的溶于dmso中的活性酯，在rt和氩气下搅拌60min，然后通过用pbs缓冲液(ph7.2)(g-25,gehealthcare)平衡的pd10柱纯化，随后通过超速离心进行浓缩并用pbs缓冲液(ph7.2)设定所需浓度]

方案35：具有豆荚蛋白酶可裂解首基(headgroup)的adc前体的合成

[a)：nabh(oac)3、hoac、二氯甲烷，rt；b)氯乙酰氯、net3、dcm，rt；c)l-半胱氨酸、nahco3、dbu、异丙醇/水，50℃；d)hatu、dmf、二异丙基乙胺，rt；e)氯化锌、三氟乙醇，50℃；f)d)hatu、dmf、二异丙基乙胺，rt]

方案36：通过转谷氨酰胺酶偶联进行的adc合成

[a：在dpbsph7.4中的5mgak3(c～10mg/ml)，6个当量的毒性基团-接头前体(例如中间体q31-q34)，加入50μl12.5μl(1.25u)重组细菌转谷氨酰胺酶的水溶液(100u/ml)和37.5μldpbsph7.4，在37℃下孵育24h]

a.实施例

缩写和首字母缩略词：

a431ns人肿瘤细胞系

a549人肿瘤细胞系

abcb1atp-结合盒亚家族b成员1(p-gp和mdr1的同义词)

abs.无水的(absolute)

ac乙酰基

acn乙腈

aq.含水的、水溶液

atp三磷酸腺苷

bcrp乳腺癌耐药蛋白、外排转运蛋白

bep2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐

boc叔丁氧基羰基

br.宽(在nmr中)

ex.实施例

bxpc3人肿瘤细胞系

ca.近于、大约

ci化学电离(在ms中)

d双峰(在nmr中)

d天

tlc薄层色谱

dci直接化学电离(在ms中)

dcm二氯甲烷

dd二个双重峰(在nmr中)

dmap4-n,n-二甲氨基吡啶

dme1,2-二甲氧基乙烷

dmemdulbecco改良eagle培养基(用于细胞培养的标准化营养培养基)

dmfn,n-二甲基甲酰胺

dmso二甲基亚砜

dpbs,d-pbs,pbsdulbecco磷酸盐缓冲盐溶液

pbs＝dpbs＝d-pbs,ph7.4,来自sigma,

编号d8537组成:

0.2gkcl

0.2gkh2po4(无水)

8.0gnacl

1.15gna2hpo4(无水)

用h2o补足至1l

dt两个三重峰(在nmr中)

dttdl-二硫苏糖醇

d.th.理论值(在化学产量中)

edcn'-(3-二甲氨基丙基)-n-乙基碳二亚胺盐酸盐

egfr表皮生长因子受体

ei电子碰撞电离(在ms中)

elisa酶联免疫吸附测定

eq.当量

esi电喷射离子化(在ms中)

esi-microtofqesi-microtofq(tof＝飞行时间且q＝四级的质谱仪的名称)

fcs胎牛血清

fmoc(9h-芴-9-基甲氧基)羰基

sat.饱和的

gtp鸟苷-5'-三磷酸

h小时

hatuo-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐

hct-116人肿瘤细胞系

hepes4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸

hoac乙酸

hoat1-羟基-7-氮杂苯并三唑

hobt1-羟基-1h-苯并三唑水合物

hosun-羟基琥珀酰亚胺

hplc高压、高效液相色谱

ht29人肿瘤细胞系

ic50半最大抑制浓度

i.m.肌内、给药至肌肉内

i.v.静脉内、给药至静脉内

conc.浓缩的

kpl-4人肿瘤细胞系

ku-19-19人肿瘤细胞系

lc-ms液相色谱-偶联的质谱

llc-pk1cellslewis肺癌猪肾细胞系

l-mdr人mdr1转染的llc-pk1细胞

lovo人肿瘤细胞系

m多重峰(在nmr中)

me甲基

mdr1多药耐药蛋白1

mecn乙腈

min分钟

ms质谱法

mtt3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基-2h-四唑鎓溴化物

nci-h292人肿瘤细胞系

nci-h520人肿瘤细胞系

nmmn-甲基吗啉

nmpn-甲基-2-吡咯烷酮

nmr核磁共振光谱法

nmri源自海军医学研究所(nmri)的小鼠品系

nudemice实验动物

nsclc非小细胞肺癌

pbs磷酸盐缓冲盐溶液

pd/c活性炭上的钯

p-gpp-糖蛋白、转运蛋白

pngasef用于裂解糖的酶

quant.定量(在产量中)

quart四重峰(在nmr中)

quint五重峰(在nmr中)

rf保留指数(在tlc中)

rt室温

rt保留时间(在hplc中)

s单峰(在nmr中)

s.c.皮下地、给药于皮肤下

scc-4人肿瘤细胞系

scc-9人肿瘤细胞系

scidmice具有重症联合免疫缺陷的测试小鼠

sk-hep-1人肿瘤细胞系

t三重峰(在nmr中)

tbaf四正丁基氟化铵

tcep三(2-羧乙基)膦

tempo(2,2,6,6-四甲基哌啶-1-基)氧基

tert叔

tfa三氟乙酸

thf四氢呋喃

2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三次磷酸盐(trioxatriphosphinane)2,4,6-三氧化物

uv紫外分光法

v/v体积比(溶液的)

z苄基羰基

786-o人肿瘤细胞系

氨基酸缩写

ala＝丙氨酸

arg＝精氨酸

asn＝天冬酰胺

asp＝天冬氨酸

cys＝半胱氨酸

glu＝谷氨酸

gln＝谷氨酰胺

gly＝甘氨酸

his＝组氨酸

ile＝异亮氨酸

leu＝亮氨酸

lys＝赖氨酸

met＝甲硫氨酸

nva＝正缬氨酸

phe＝苯丙氨酸

pro＝脯氨酸

ser＝丝氨酸

thr＝苏氨酸

trp＝色氨酸

tyr＝酪氨酸

val＝缬氨酸

hplc和lc-ms方法：

方法1(lc-ms)：

仪器：watersacquitysqduplc系统；柱：watersacquityuplchsst31.8μ50x1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸；流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％a→1.2min5％a→2.0min5％a；烤箱：50℃；流速：0.40ml/min；uv检测：208-400nm。

方法2(lc-ms)：

ms仪器类型：waterssynaptg2s；uplc仪器类型：watersacquityi-class；柱：waters，beh300，2.1x150mm，c181.7μm；流动相a：1l水+0.01％甲酸；流动相b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min2％b→1.5min2％b→8.5min95％b→10.0min95％b；烤箱：50℃；流速：0.50ml/min；uv检测：220nm

方法3(lc-ms)：

ms仪器：waters(micromass)qm；hplc仪器：agilent1100系列；柱：agilentzorbaxextend-c183.0x50mm3.5微米；流动相a：1l水+0.01mol碳酸铵，流动相b：1l乙腈；梯度：0.0min98％a→0.2min98％a→3.0min5％a→4.5min5％a；烤箱：40℃；流速：1.75ml/min；uv检测：210nm

方法4(lc-ms)：

ms仪器类型：waterssynaptg2s；uplc仪器类型：watersacquityi-class；柱：waters，hsst3，2.1x50mm，c181.8μm；流动相a：1l水+0.01％甲酸；流动相b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min10％b→0.3min10％b→1.7min95％b→2.5min95％b；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；uv检测：210nm

方法5(lc-ms)：

仪器：watersacquitysqduplc系统；柱：watersacquityuplchsst31.8μ50x1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min95％a→6.0min5％a→7.5min5％a；烤箱：50℃；流速：0.35ml/min；紫外检测：210-400nm。

方法6(lc-ms)：

仪器：具有watersuplcacquity的micromassquattropremier；色谱柱：thermohypersilgold1.9μ50x1mm；流动相a：1l水+0.5ml50％浓度的甲酸；流动相b：1l乙腈+0.5ml50％浓度的甲酸；梯度：0.0min97％a→0.5min97％a→3.2min5％a→4.0min5％a烘箱：50℃；流速：0.3ml/min；uv检测：210nm。

方法7(lc-ms)：

仪器：agilentmsquad6150；hplc：agilent1290；柱：watersacquityuplchsst31.8μ50x2.1mm；流动相a：1l水+0.25ml99％浓度的甲酸，流动相b：1l乙腈+0.25ml99％浓度的甲酸；梯度：0.0min90％a→0.3min90％a→1.7min5％a→3.0min5％a烘箱：50℃；流速：1.20ml/min；uv检测：205-305nm。

方法8(lc-ms)：

ms仪器类型：waterssynaptg2s；uplc仪器类型：watersacquityi-class；柱：waters，hsst3，2.1x50mm，c181.8μm；流动相a：1l水+0.01％甲酸；流动相b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min2％b→2.0min2％b→13.0min90％b→15.0min90％b；烤箱：50℃；流速：1.20ml/min；uv检测：210nm

方法9：用于实施例181-191的lc-ms-预纯化方法(方法lind-lc-ms-预)

ms仪器：waters；hplc仪器：waters(柱watersx-bridgec18，19mmx50mm，5μm，流动相a：水+0.05％氨，流动相b：具有梯度的乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv检测：dad；210-400nm)。

或

ms仪器：waters；hplc仪器：waters(柱phenomenexluna5μc18(2)100a，axiatech.50x21.2mm，流动相a：水+0.05％甲酸，流动相b：具有梯度的乙腈(ulc)；流速：40ml/min；uv检测：dad；210-400nm)。

方法10：用于实施例181-191的lc-ms分析方法(lind_sqd_sb_aq)

ms仪器：waterssqd；hplc仪器：watersuplc；柱：zorbaxsb-aq(agilent)，50mmx2.1mm，1.8μm；流动相a：水+0.025％甲酸，流动相b：乙腈(ulc)+0.025％甲酸；梯度：0.0min98％a-0.9min25％a-1.0min5％a-1.4min5％a-1.41min98％a-1.5min98％a；烤箱：40℃；流速：0.600ml/min；uv检测：dad；210nm。

方法11(hplc)：

仪器：hp1100系列

柱：merckchromolithspeedrodrp-18e，50-4.6mm，目录号1.51450.0001，预柱chromolithguardcartridgekit，rp-18e，5-4.6mm，目录号1.51470.0001

梯度：流速5ml/min

进样体积5μl

溶剂a：hclo4(70％浓度)的水溶液(4ml/l)

溶剂b：乙腈

开始20％b

0.50min20％b

3.00min90％b

3.50min90％b

3.51min20％b

4.00min20％b

柱温度：40℃

波长：210nm

方法12(lc-ms)：

ms仪器类型：thermoscientificft-ms；仪器类型uhplc+：thermoscientificultimate3000；柱：waters，hsst3，2.1x75mm，c181.8μm；流动相a：1l水+0.01％甲酸；流动相b：1l乙腈+0.01％甲酸；梯度：0.0min10％b→2.5min95％b→3.5min95％b；烤箱：50℃；流速：0.90ml/min；uv检测：210nm/最佳积分路径210-300nm

方法13：(lc-ms)：

ms仪器：waters(micromass)quattromicro；仪器watersuplcacquity；柱：watersbehc181.7μ50x2.1mm；流动相a：1l水+0.01mol甲酸铵，流动相b：1l乙腈；梯度：0.0min95％a→0.1min95％a→2.0min15％a→2.5min15％a→2.51min10％a→3.0min10％a；烤箱：40℃；流速：0.5ml/min；uv检测：210nm。

其制备未在下文中明确描述的所有反应物或试剂都是从通常可获得的来源商购的。对于其制备同样未在下文中描述且不能商购或者从通常不可获得的来源获得的所有其他反应物或试剂，可参考其中记载了它们的制备的公开文献。

方法14：(lc-ms)(mcw-ltq-poroshell-tfa98-10min)

ms仪器类型：thermofisherscientificltq-orbitrap-xl；hplc仪器类型：agilent1200sl；柱：agilent，poroshell120，3x150mm，sb-c182.7μm；洗脱液a：1l水+0.1％三氟乙酸；流动相b：1l乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度：0.0min2％b→0.3min2％b→5.0min95％b→10.0min95％b；烤箱：40℃；流速：0.75ml/min；uv检测：210nm

起始化合物和中间体：

中间体c1

三氟乙酸-(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)

标题化合物如wo2006/002326中所述制备。

中间体c2

(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯

将4.22g(14.5mmol)n-(叔丁氧基羰基)-l-高丝氨酸叔丁酯溶于180ml二氯甲烷中，然后加入3.5ml吡啶和9.2g(21.7mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1λ5,2-苯并二噁茂-3(1h)-酮。将反应在rt下搅拌1h，然后用500ml二氯甲烷稀释，用10％浓度硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后用5％浓度柠檬酸连续萃取两次并用10％浓度碳酸氢钠溶液萃取两次。分离有机相，用硫酸镁干燥，然后减压干燥。将残余物溶于乙醚中，并加入hcl(乙醚溶液)。滤出沉淀，然后将滤液浓缩并从乙腈/水中冻干。得到3.7g(93％)(2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，其不经进一步纯化可用于下一步骤。(rf：0.5(dcm/甲醇95/5)。

将3.5g(9.85mmol)中间体c1溶于160mldcm中，加入3.13g(14.77mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.7ml乙酸，在rt下搅拌5min后，加入3.23g(11.85mmol)(2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯，并将反应在rt下再搅拌30min。然后将溶剂减压蒸发，将残余物溶于乙腈/水中，滤出沉淀的固体并干燥，得到5.46g(84％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.5min；

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝613(m+h)⁺。

中间体c3

(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将5.46g(8.24mmol)中间体c2溶于160mldcm中，加入4.8ml三乙胺和2.2ml(20.6mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在rt下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物通过在biotage/isolera(snap340g)上进行的柱色谱法使用流动相环己烷/乙酸乙酯2:1进行纯化。得到4.57g(75％)酰化的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝713(m+h)⁺。

将1g(1.36mmol)该中间体溶于20mldcm中，加入20mltfa。在rt下搅拌5h后，浓缩混合物，并将残余物用正戊烷研磨两次。在每种情况下，将正戊烷倾析出，并将剩余的固体在高真空下干燥。得到1.1g(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸/三氟乙酸(1:1)。lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝557(m+h)⁺。

将0.91g(1.57mmol)该中间体溶于70mldcm中，加入3.43g(15.7mmol)二碳酸二叔丁酯和4.1ml的n,n-二异丙基乙胺。在rt下搅拌30min后，将反应用dcm稀释并用5％浓度的柠檬酸萃取。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。将残余物用正戊烷研磨两次，在每种情况下均将正戊烷倾析出。

hplc(方法11):rt＝2.55min；

lc-ms(方法1):rt＝1.3min；ms(esipos):m/z＝657(m+h)⁺。

中间体c4

(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酸/三氟乙酸(1:1)

将5.46g(8.24mmol)中间体c2溶于160mldcm中，加入4.8ml三乙胺和2.2ml(20.6mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在rt下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物通过在biotage/isolera(snap340g)上进行的柱色谱法使用流动相环己烷/乙酸乙酯2:1进行纯化。得到4.57g(75％)酰化的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝713(m+h)⁺。

将1.5g(2.035mmol)该中间体溶于50ml乙醇中，加入5.8ml40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌4h，然后浓缩。将残余物溶于dcm中并用水洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩。将残余物在高真空下干燥。得到1.235mg该中间体，其不经进一步纯化即进一步反应。

将1.235mg(1.5mmol)该中间体溶于15mldcm中，并加入15mltfa。在rt下搅拌4h后，浓缩混合物。残余物经制备型hplc纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈中冻干。得到1.04g(定量)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝515(m+h)⁺。

中间体c5

(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将0.9g(1.24mmol)中间体c4溶于60mldcm中，加入2.7g(12.5mmol)二碳酸二叔丁酯和3.3mln,n-二异丙基乙胺。在rt下搅拌45min后，浓缩反应物，将残余物溶于乙醚中，加入正戊烷直至混合物开始变混浊。将反应冷却至0℃，然后倾析。再次，将正戊烷加入到残余物中并倾析混合物。将残留的固体从乙腈/水1:1中冻干，得到0.95g(定量)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.5min；

lc-ms(方法1):rt＝1.27min；ms(esipos):m/z＝615(m+h)⁺。

中间体c6

三氟乙酸/{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-肼基-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

将150mg(0.16mmol)中间体c3溶于21mldmf中，然后加入37.2mg(0.19mmol)n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、37mg(0.243mmol)1-羟基苯并三唑、85μln,n-二异丙基乙胺以及最后的45mg(0.18mmol)可商购的9h-芴-9-基肼基羧酸甲酯。将混合物在rt下搅拌过夜，然后减压浓缩。残余物经制备型hplc纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈/水中冻干。得到60mg(理论的41％)受保护的中间体。

hplc(方法11):rt＝2.9min；

lc-ms(方法1):rt＝1.47min；ms(esipos):m/z＝893(m+h)⁺。

将60mg(0.067mmol)该中间体溶于19ml乙醇中，加入681μl哌啶和386μl40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌18h，然后浓缩。将残余物溶于乙腈/水2:1中并用tfa调节至ph2。然后将混合物再次浓缩并将残余物通过制备型hplc进行纯化。适当的级分被浓缩，残余物从乙腈/水中冻干。得到25mg(理论值的51％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.2min；

lc-ms(方法1):rt＝1.27min；ms(esipos):m/z＝629(m+h)⁺。

中间体c7

1-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸/三氟乙酸(1:1)

将0.2g(0.305mmol)中间体c3溶于80mldcm中，加入0.125g(0.46mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(bep)、94mg(0.61mmol)可商购的乙基肼基乙酯盐酸盐和159μln,n-二异丙基乙胺，然后将混合物在rt下搅拌1h。然后将乙酸乙酯和水加入到反应混合物中，分离各相。有机相用饱和氯化钠溶液萃取，然后用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物减压干燥，不经纯化而进一步反应。为此目的，将其溶于20ml四氢呋喃中，加入10ml水和3.2ml2n氢氧化锂溶液。将反应在rt下搅拌1h，然后使用tfa将ph调节至7。然后将反应物浓缩，并将残余物经制备型hplc纯化。以这种方式，将标题化合物从其较早洗脱的区域异构体中分离出来。合并相应级分、冻干并干燥得到19.7g(2步的理论值的8％)的标题化合物，其为无色泡沫。

hplc(方法11):rt＝2.4min；

lc-ms(方法1):rt＝1.22min；ms(esipos):m/z＝687(m+h)⁺。

在受保护的中间体阶段通过nmr光谱法分离区域异构体之后，区域异构体的结构指定在单独的实验中进行。标题化合物的受保护的(1-{(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丁酰基}肼基)乙酸乙酯中间体具有以下1hnmr光谱：

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝7.8(m,2h),7.4-7.2(m,6h),7.08(m,1h),6.73(d,1h),5.6(s,1h),5.25and4,89(2d,2h),4.89and4.77(2d,2h),4.62(t,1h),4.32and3.78(2d,2h),4.1(t,2h),3.62-3.47(m),2.13(s,3h),1.41and0.72(2m,2h),1.3(s,9h),1.18(t,3h),0.92(s,9h).

中间体c8

n-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸

将293mg(0.41mmol)中间体c3溶于25mldmf中，然后加入144mg(0.75mmol)n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、128mg(0.83mmol)1-羟基苯并三唑、218μln,n-二异丙基乙胺和最后的70mg(0.5mmol)可商购的3-甲氧基-3-氧代丙烷-1-氯化铵。将反应在rt下搅拌4h，然后减压浓缩。残余物经制备型hplc纯化。将适当的级分浓缩并将残余物在高真空下干燥。这得到177mg(理论值的53％)的受保护的中间体。

hplc(方法11):rt＝2.6min；

lc-ms(方法1):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝742(m+h)⁺。

将177mg(0.22mmol)该中间体溶于20ml甲醇中，并加入2.8ml2n氢氧化锂溶液。将反应在rt下搅拌18h。然后浓缩混合物，将残余物溶于水中，并使用5％浓度的柠檬酸将溶液调节至ph5。然后将混合物用dcm萃取两次，有机相用硫酸镁干燥并浓缩。残余物最终从乙腈/水中冻干，得到133mg(理论值的81％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.3min；

lc-ms(方法3):rt＝7.4min；ms(esipos):m/z＝686(m+h)⁺。

中间体c9

(6s)-6-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-4,7-二氧代-3,11,14,17-四氧杂-5,8-二氮杂二十烷-20-酸

在第一步中，在存在44mg(0.228mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、35mg(0.228mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和60μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将70mg(0.114mmol)中间体c5与32mg(0.114mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁基酯在15mldmf溶液中偶联。将反应在rt下搅拌过夜，产物通过制备型hplc纯化。得到33mg(理论值的33％)的受保护的中间体。将其与1.1ml三氟乙酸在11ml二氯甲烷中搅拌1h，在后处理后，得到26mg(98％)的完全脱保护的化合物。

最后，将中间体溶于2mldcm中，叔丁氧羰基保护基是通过两次加入(在每种情况下)10mg二碳酸二叔丁酯和79μln,n-二异丙基乙胺，同时在rt下搅拌3天来引入。通过制备型hplc纯化产物，得到16.4mg(理论值的66％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.3min；

lc-ms(方法1):rt＝1.22min；ms(esipos):m/z＝818(m+h)⁺。

中间体c10

{3-[{(1r)-1-[1-(3-氨基苄基)-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

标题化合物是由中间体c1经6个步骤制备：在第一步中，将1g(2.77mmol)中间体c1和0.864g(5mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯在100ml甲醇中合并，加入400ml乙酸和1.288g(13.9mmol)硼烷-吡啶复合体。将反应在rt下搅拌3天。然后将混合物减压浓缩并将残余物通过在硅胶上进行的快速色谱法(流动相：二氯甲烷/乙酸乙酯9:1→二氯甲烷/甲醇95:5)纯化。浓缩适当的级分并在高真空下干燥，得到1.255g(理论值的80％)n-烷基化的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.0min；ms(esipos):m/z＝513(m+h)⁺。

将1.255g(2.2mmol)该中间体溶于50mldcm中，然后加入1.2ml三乙胺和0.52ml(4.85mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在rt下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取三次，然后用饱和氯化钠溶液萃取三次。将有机相用硫酸钠干燥，然后浓缩。残余物是通过制备型hplc纯化，得到593mg(理论值的41％)酰化的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.4min；ms(esipos):m/z＝613(m+h)⁺。

将993mg(0.91mmol)该中间体溶于100ml乙醇中，加入60mg10％的活性炭上的钯后，在rt和标准氢气压力下氢化3min。然后滤去催化剂，减压移除溶剂。得到494mg(理论值的91％)脱苄基化的咪唑衍生物，其为几乎无色的油状物。lc-ms(方法1):rt＝1.17min；ms(esipos):m/z＝523(m+h)⁺。

将150mg(0.25mmol)该中间体初始加入到15mldmf中，并加入69.2mg(0.5mmol)碳酸钾。在rt下搅拌15min后，加入60mg(0.28mmol)对硝基苄基溴，并将混合物搅拌过夜。然后减压移除溶剂，将残余物溶于乙酸乙酯中并用饱和碳酸氢钠溶液萃取。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型hplc纯化。将适当的级分在旋转蒸发器上浓缩并将残余物从1,4-二噁烷中冻干。得到169mg(定量)的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.39min；ms(esipos):m/z＝658(m+h)⁺。

将165mg(0.251mmol)该中间体溶于30ml乙醇中，加入0.35ml40％浓度的甲胺水溶液。将反应在50℃下搅拌5h，然后再次加入相同量的甲胺溶液。搅拌10h后，减压浓缩反应物。将馏出物用乙醚再蒸馏两次，然后将残余物从乙腈/水中冻干。得到148mg(理论值的89％)该中间体。

lc-ms(方法6):rt＝2.97min；ms(esipos):m/z＝616(m+h)⁺。

将98mg(0.15mmol)前体溶于15mlthf中，然后在rt下加入569mg(3.27mmol)连二亚硫酸二钠在6ml水中的溶液。在50℃下搅拌8h后，再次加入等量的溶于1ml水中的连二亚硫酸盐。在50℃下再搅拌16h后，将反应冷却至rt，并用乙酸乙酯萃取。将有机相浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。从1,4-二噁烷中冻干残余物，得到44.5mg(理论值的47％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝586(m+h)⁺。

中间体c11

r/s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸酯(1:1)

首先将990.0mg(2.79mmol)的(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺加入15.0ml二氯甲烷中，加入828.8mg(3.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和129.9mg(3.21mmol)乙酸，并将混合物在rt下搅拌5min。加入698.1mg(3.21mmol)溶于15.0ml二氯甲烷中的(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体l58)，并将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，并且将有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)两次。将有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇100:2)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.25g(理论值的73％)的化合物[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝556(m+h)⁺。

向400.0mg(0.65mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯中加入151.4mg(1.5mmol)三乙胺和161.6mg(1.43mmol)氯乙酰氯。将反应混合物在rt下搅拌过夜。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用水洗涤三次，用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到254.4mg(理论值的57％)的化合物{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esineg):m/z＝676(m+hcoo^-)^-。

将117.4mg(0.19mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml异丙醇中，加入928.4μl1mnaoh和50.2mg(0.37mmol)dl-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌4.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，并且将有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化残余物。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到75.3mg(理论值的48％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝731(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9h),0.40(m,1h),0.75-0.91(m,11h),1.30(m,1h),1.99-2.23(m,2h),2.63-2.88(m,4h),3.18-3.61(m,5h),3.79-4.10(m,3h),4.89(d,1h),4.89(d,1h),5.16(d,1h),5.56(s,1h),6.82(m,1h),6.91(s,1h),6.97(m,1h),7.13-7.38(m,6h),7.49(s,1h),7.63(m,1h),8.26(s,3h).

中间体c12

r/s-[(8s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸

以与中间体c11的合成类似的方式进行合成，使用(2s)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(中间体l57)和中间体c52作为起始物质。

lc-ms(方法1):rt＝1.18min；ms(esipos):m/z＝775(m+h)⁺。

中间体c13

9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)]-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸

将90.0mg(0.15mmol)中间体c16和43.6(0.23mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸溶于9.0ml甲醇中，加入一滴水和73.9mg(0.54mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4h，然后用乙酸乙酯稀释。有机相用水/饱和的nacl溶液和饱和的nacl溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:2)。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到理论值的83％的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.44min；ms(esipos):m/z＝701(m+h)⁺。

中间体c14

r/s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸

首先将100.0mg(0.17mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体c16)加入4.0ml异丙醇中，并加入276.5mg(0.85mmol)1mnaoh溶液和45.9mg(0.34mmol)d/l-高半胱氨酸。将反应混合物在50℃下搅拌1h。反应混合物用乙酸乙酯稀释。有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤。用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化残余物。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。

得到92.6mg(理论值的66％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝688(m+h)⁺。

中间体c15

[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将750.0mg(2.11mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c1)溶于15.0ml二氯甲烷中，加入626.0mg(2.95mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和139μl(2.43mmol)hoac，并将混合物在rt下搅拌5min。然后加入420.3mg(2.43mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(根据文献方法j.med.chem.2003,46,3536的合成)，并将混合物在rt下搅拌过夜。加入乙酸乙酯，反应混合物用饱和碳酸钠溶液萃取两次。有机相用饱和nacl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝4:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到881.0mg(理论值的82％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝513[m+h]⁺。

中间体c16

{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

首先将373.4mg(0.73mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体c15)加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入169.5mg(1.68mmol)三乙胺和181.0mg(1.60mmol)氯乙酰氯。将反应混合物在rt下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯，并将混合物用水反复萃取。有机相用饱和nacl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:0.5)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到336.0mg(理论值的75％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝589[m+h]⁺。

中间体c17

9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸

首先将50.0mg(0.09mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体c16)加入2.0mldmf中，并加入69.1mg(0.21mmol)碳酸铯和28.8mg(0.10mmol)1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸。将混合物在50℃下搅拌过夜。加入水并将反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到25.1mg(理论值的35％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.42min；ms(esipos):m/z＝835[m+h]⁺。

中间体c18

[22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯

首先将21.0mg(0.03mmol)9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸(中间体c17)和5.8mg(0.0.3mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.0ml乙腈中，加入26.1mg(0.20mmol)n,n-二异丙基乙胺和20.9mg(0.03mmol)t3p(50％乙酸乙酯溶液)。将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到19.7mg(理论值的79％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.42min；ms(esipos):m/z＝835[m+h]⁺。

中间体c19

(13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯

首先将58.5mg(0.10mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体c16)加入到2.0mldmf中，并加入44.0mg(0.20mmol)(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体l39)和64.7mg(0.20mmol)碳酸铯。将混合物在50℃下搅拌4h。用46.6mg(0.079mmol)中间体c16重复该反应。将两种反应混合物合并，并直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到98.0mg(理论值的71％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.62min；ms(esipos):m/z＝774[m+h]⁺。

中间体c20

三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

首先将98.0mg(0.13mmol)(13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-10-硫杂-7,13-二氮杂-2-硅杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(中间体c19)加入2.0mldmf/叔丁醇(9:1)中，并加入96.2mg(0.63mmol)csf。将混合物在90℃下搅拌16h。将反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到57.1mg(理论值的61％)的标题化合物。该化合物还包含相应的亚砜。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝630[m+h]⁺。

中间体c21

[38-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯

首先将57.1mg(0.08mmol)三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体c20)加入到3.0mldmf中，加入53.0mg(0.08mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂-二十七烷-1-基}丙酰胺和15.5mg(0.15mmol)加入三乙胺。将混合物在rt下搅拌16h。将反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到49.7mg(理论值的49％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1204[m+h]⁺。

中间体c22

[38-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-35-氧代-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35λ4-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯

标题化合物在中间体c21的合成中作为副产物形成。得到15.5mg(理论值的15％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.25min；ms(esipos):m/z＝1220[m+h]⁺。

中间体c23

3-氨基-4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯

立体异构体的混合物

首先将411.2mg(1.15mmol)3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体c28)和339.7mg(0.96mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c1)加入到6.0ml二氯甲烷中，并加入68.9mg(1.15mmol)hoac，将混合物在rt下搅拌1h。加入405.2mg(1.91mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在rt下搅拌2h。减压蒸发溶剂，并且向残余物中加入乙酸乙酯和水。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用biotageisolera(硅胶，柱50gsnap，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到541.5mg(理论值的81％)化合物3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.24和1.29min；ms(esipos):m/z＝698[m+h]⁺。

将541.5mg(0.78mmol)3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于13.0ml二氯甲烷中，并加入180.6mg(1.78mmol)三乙胺。将反应溶液冷却至0℃，加入233.1mg(1.71mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在rt下搅拌16h。再加入180.6mg(1.78mmol)三乙胺和233.1mg(1.71mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在rt下再搅拌80h。减压蒸发溶剂，并且将残余物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用biotageisolera(硅胶，柱50gsnap，流速40ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到529.2mg(理论值的86％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.53和1.56min；ms(esipos):m/z＝798[m+h]⁺。

首先将529.2mg(0.66mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入10.0mldmf/叔丁醇(9:1)中，并加入503.7mg(3.32mmol)csf。将反应混合物在90℃下搅拌16h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物使用biotageisolera(硅胶，柱50gsnap，流速25ml/min，二氯甲烷/甲醇)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到172.4mg(理论值的40％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.05和1.35min；ms(esipos):m/z＝654[m+h]⁺。

首先将172.4mg(0.26mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-氨基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.5ml甲醇/水(2:1)中，加入80.2mg(0.58mmol)碳酸钾，将混合物在rt下搅拌16h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤一次，并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到116.0mg(理论值的72％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.01min和1.03min；ms(esipos):m/z＝612[m+h]⁺。

中间体c24

三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(1:1)

将26.8mgn-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c1)溶于3.0ml二氯甲烷中，加入5.2mg(0.09mmol)hoac和22.4mg(0.11mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在rt下搅拌5min。加入62.4mg(0.09mmol)3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体l29)，并将混合物在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到57.6mg(理论值的91％)化合物三氟乙酸/3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.25和1.27min；ms(esipos):m/z＝712[m+h]⁺。

首先将77.0mg(0.11mmol)3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入1.5ml二氯甲烷中，并加入21.9mg(0.22mmol)三乙胺。然后在0℃下，加入29.5mg(0.22mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于乙酸乙酯中。将有机相用水、饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂。用77.0mg(0.11mmol)3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯重复所述反应。将合并的残余物在硅胶上纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝2:1)。得到171.1mg(理论值的85％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.56和1.57min；ms(esipos):m/z＝812[m+h]⁺。

首先将30.0mg(0.04mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入0.5mltbaf溶液(1m的thf溶液)中。将混合物在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到25.0mg(理论值的92％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝626[m+h]⁺。

中间体c25

4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-羧酸

首先将171.4mg(0.48mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c1)加入4.0ml二氯甲烷中，加入248.5mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体l30)和34.8mg(0.58mmol)hoac。将反应混合物在rt下搅拌1h。加入204.4mg(0.97mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在rt下搅拌60h。减压移除溶剂，并且将残余物使用biotageisolera(硅胶，柱25gsnap，流速25ml/min，石油醚/乙酸乙酯)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到267.0mg(理论值的77％)化合物3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝683[m+h]⁺。

将267.0mg(0.39mmol)3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于5.0ml二氯甲烷中，加入91.0mg(0.90mmol)三乙胺，并将混合物冷却至0℃。加入117.4mg(0.86mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在rt下搅拌16h。再加入593.4mg(5.87mmol)三乙胺和427.0mg(3.13mmol)乙酰氧基乙酰氯，将混合物在rt下再搅拌10h。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到216.3mg(理论值的71％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.70和1.72min；ms(esipos):m/z＝783[m+h]⁺。

首先将216.3mg(0.28mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.0mlthf中，加入16.6mg(0.28mmol)hoac和361.1mg(1.38mmol)tbaf溶液(1m的thf溶液)。将反应溶液在rt下搅拌4h。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到94.0mg(理论值的51％)化合物3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝669[m+h]⁺。

首先将52.0mg(0.08mmol)3-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲基}-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入4.0mlpbs缓冲液/乙腈(9:1)和1.2mg(0.01mmol)tempo。然后同时加入14.1mg(0.16mmol)亚氯酸钠在1.0ml水中的溶液和115.8μl(0.16mmol)10％浓度的次氯酸钠溶液。将反应混合物在rt下搅拌16h。将反应混合物倒入10％浓度的亚硫酸钠溶液中，加入乙酸乙酯。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和nacl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝683[m+h]⁺。

首先将103.0mg(0.15mmol)4-{[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-(二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]甲

基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-羧酸加入到4.5ml甲醇/水(2:1)中，加入45.9mg(0.33mmol)碳酸钾，并将混合物在rt下搅拌3h。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配。水相用乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和nacl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，标题化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝1.35min；ms(esipos):m/z＝641[m+h]⁺。

中间体c26

[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

首先将590mg(1.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和155μl(2.70mmol，162mg)乙酸加入30ml二氯甲烷中，并且将混合物在rt下搅拌30min。然后滴加溶于40ml二氯甲烷中的600mg(1.687mmol)(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(通过用1n氢氧化钠水溶液萃取三氟乙酸/(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)获得)和750mg(2.362mmol)(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯。将混合物在rt下搅拌2h。然后加入乙酸乙酯，混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤，浓缩有机相。通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)分离残余物。得到510mg(理论值的46％)目标化合物，其为非对映异构体混合物。

异构体1：

lc-ms(方法1):rt＝1.36min(51％)；ms(eipos):m/z＝657[m+h]⁺。

异构体2：

lc-ms(方法1):rt＝1.41min(49％)；ms(eipos):m/z＝657[m+h]⁺。

中间体c27

乙酸2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基)(2,2-二甲基丙基){3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯

首先将510mg(0,776mmol)(3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯加入30ml二氯甲烷中，加入181mg(249μl，1.786mmol)三乙胺和219mg(1.553mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将反应混合物在rt下搅拌2h，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)分离残余物。得到290mg(理论值的49％)目标化合物，其为差向异构体混合物。

异构体1：

lc-ms(method1):rt＝1.70min；ms(eipos):m/z＝757[m+h]⁺。

异构体2：

lc-ms(方法1):rt＝1.72min；ms(eipos):m/z＝757[m+h]⁺。

中间体c28

乙酸2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯

将285mg(0.376mmol)乙酸(2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯溶于5mlthf中。加入452μl(0.452mmol)1m四正丁基氟化铵的thf溶液，将反应混合物在rt下搅拌3h。通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)分离反应混合物并冻干。得到214mg(理论值的81％，根据lc/ms的纯度＝92％)目标化合物，其为差向异构体的混合物。

异构体1：

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(eipos):m/z＝643[m+h]⁺。

异构体2：

lc-ms(method1):rt＝1.40min；ms(eipos):m/z＝643[m+h]⁺。

中间体c29

乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯

首先将210mg(0.301mmol)乙酸2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-(羟甲基)丙基}氨基)-2-氧代乙酯加入8ml无水thf中，在rt下滴加溶于8ml无水thf中的178mg(1.503mmol，109μl)亚硫酰氯，将混合物在rt下搅拌40min。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于16ml无水dmf中，加入172mg(1.503mmol)硫代乙酸钾和133mg(0.361mmol)四正丁基碘化铵，将混合物在90℃下搅拌2h。冷却后，加入水，并且将混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用旋转蒸发器浓缩，并且将残余物通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)纯化并冻干。得到155mg(理论值的69％，根据lc/ms的纯度＝94％)的目标化合物，其为差向异构体混合物。

异构体1：

lc-ms(method1):rt＝1.50min；ms(eipos):m/z＝701[m+h]⁺。

异构体2：

lc-ms(method1):rt＝1.51min；ms(eipos):m/z＝701[m+h]⁺。

中间体c30

[二硫烷二基双(2-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙烷-3,1-二基)]二氨基甲酸二叔丁酯

首先将1.220g(1.010mmol，根据lc/ms的纯度＝58％)乙酸2-([3-(乙酰基硫烷基)-2-{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙酯加入30mlthf和30ml甲醇中，加入10ml1n氢氧化钠水溶液，混合物在rt下搅拌2h。加入水，并且将反应混合物用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)分离残余物。得到390mg(理论值的54％，根据lc/ms的纯度＝86％)目标化合物，其为非对映异构体混合物。

异构体：

lc-ms(method1):rt＝1.81min；ms(eipos):m/z＝1232[m+h]⁺。

中间体c31

3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯

将390mg(0.272mmol，根据lc/ms的纯度＝86％)[二硫烷二基双(2-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙烷-3,1-二基)]二氨基甲酸二叔丁酯溶于20ml1,4-二噁烷和10mlpbs缓冲液中，加入234mg(0.817mmol)3,3',3”-膦三基三丙酸盐酸盐(1:1)。将混合物在rt下搅拌16h。然后将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并用二氯甲烷研磨，将滤液浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于8ml异丙醇中并通过手性色谱法(柱：250x30mm填充有daicelchiralpakaz-h，流动相：异己烷/异丙醇＝90:10)纯化。产生了两个目标化合物的级分。级分1含有181.2mg(理论值的50％)异构体1，级分2得到90.2mg(理论值的25％)异构体2。

异构体1：

手性hplc(柱：250x4.6mm，填充有diacelchiralpakaz-h，流动相：异己烷/乙醇90:10)：rt＝6.98min.

lc-ms(method1):rt＝1.47min；ms(eipos):m/z＝617[m+h]⁺。

异构体2：

手性hplc(柱：250x4.6mm，填充有diacelchiralpakaz-h，流动相：异己烷/乙醇90:10)：rt＝9.39min.

lc-ms(method1):rt＝1.47min；ms(eipos):m/z＝617[m+h]⁺。

中间体c32

n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)

将123mg(199.42μmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯(异构体1)溶于2mlthf中并在rt下与10ml半浓缩的盐酸一起搅拌1h。将反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。得到108mg(理论值的98％)目标化合物。

异构体1

lc-ms(method1):rt＝0.95min；ms(eipos):m/z＝517[m+h]⁺。

中间体c33

n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)

将123mg(199.42μmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-(硫烷基甲基)丙基}氨基甲酸叔丁酯(异构体2)溶于2mlthf中，并在rt下与10ml半浓缩的盐酸一起搅拌1h。将反应溶液在氩气下脱气，然后冻干。得到58mg(理论值的63％，根据lc/ms的纯度＝91％)目标化合物。

异构体2

lc-ms(method1):rt＝0.97min；ms(eipos):m/z＝517[m+h]⁺。

中间体c34

[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

首先将3.790g(10.02mmol)(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(通过用1n氢氧化钠水溶液萃取三氟乙酸/(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(1:1)获得)、3.186g(15.04mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和690μl(12.03mmol，722mg)加入100ml二氯甲烷中。将混合物在rt下搅拌5min。

然后加入4.687g(27.06mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯，并且将混合物在rt下搅拌16h。反应混合物用二氯甲烷稀释并用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。通过在硅胶上进行的色谱法(流动相：二氯甲烷/乙酸乙酯，梯度＝4:1→1:1)纯化残余物。得到2.57g(理论值的48％，根据lc/ms的纯度＝96％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.00min；ms(eipos):m/z＝513[m+h]⁺。

中间体c35

{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

首先将200mg(0.38mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯加入9ml无水二氯甲烷中，在rt下加入120μl(0.86mmol，87mg)三乙胺。在rt下，滴加溶于1ml无水二氯甲烷中的83mg(0.45mmol)4-硝基苯甲酰氯，并将混合物在rt下搅拌1h。加入水，将混合物在旋转蒸发器上浓缩。通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)分离残余物并干燥。得到181mg(理论值的73％)的目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.47min；ms(eipos):m/z＝662[m+h]⁺。

中间体c36

{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯

首先将170mg(0.26mmol){3-[(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯加入10ml乙酸中。加入143mg(2.57mmol)铁粉，将混合物在50℃下搅拌16h。冷却后，加入水，混合物用乙酸乙酯萃取。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩。将残余物在hv下干燥。得到154mg(理论值的77％，根据lc/ms的纯度＝82％)目标化合物。

lc-ms(方法5):rt＝4.73min；ms(eipos):m/z＝632[m+h]⁺。

中间体c37

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺

将38.6mg(0.05mmol，lc/ms纯度＝82％){3-[(4-氨基苯甲酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯溶于无水dmf中，加入24.8mg(0.06mmol)hatu和13.0mg(0.10mmol)n,n-二异丙基乙胺。将混合物在rt下搅拌5min，加入63mg(0.06mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸，并将混合物在rt下搅拌3h。加入7.5mg(0.06mmol)3h-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(hoat)，并将混合物搅拌16h。加入19.1mg(0.05mmol)hatu，并且将混合物在50℃下搅拌2h。冷却后，反应混合物直接通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化。得到6.5mg(理论值的9％，根据lc/ms的纯度＝83％)的标题化合物。

lc-ms(方法2):rt＝7.89min；ms(eipos):m/z＝1200.6[m+h]⁺。

中间体c38

2-[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮

首先将300.0mg(0.84mmol)2-[3-({(1r)-1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮(中间体c1)加入4.0ml二氯甲烷中，加入58.3mg(0.97mmol)hoac和250.4mg(1.18mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在rt下搅拌5min。加入197.2mg(0.97mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙醛。将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液洗涤两次，用饱和nacl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，残余物在硅胶上(流动相：乙酸乙酯/环己烷1:5)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到333.3mg(70％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.05min；ms(esipos):m/z＝543[m+h]⁺。

中间体c39

乙酸2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基)-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯

首先将332.3mg(0.61mmol)2-[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮(中间体c38)加入到8.0ml二氯甲烷中，加入142.5mg(1.35mmol)三乙胺。在0℃下，加入184.0mg(1.35mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次，用饱和nacl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶上(流动相：乙酸乙酯/环己烷1:3)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到367.1mg(63％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.42min；ms(esipos):m/z＝643[m+h]⁺。

中间体c40

n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺

首先将583.1mg(0.91mmol)乙酸2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯(中间体c39)加入15.0ml乙醇中，并加入1.41g(18.15mmol)甲胺(40％水溶液)。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物与甲苯共蒸馏三次。残余物用硅胶色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:5)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到324.9mg(73％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝471[m+h]⁺。

中间体c41

三氟乙酸/l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺(1:1)

首先将50.0mg(0.11mol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)和30.4mg(0.11mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸酯加入2.0mldmf中，加入32.2mg(0.32mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入19.1mg(0.32mmol)hoac，反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到38.0mg(56％)化合物[(2s)-1-({3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.26min；ms(esipos):m/z＝642[m+h]⁺。

首先将33.6mg(0.05mmol)[(2s)-1-({3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸叔丁酯加入3.0ml二氯甲烷中。加入119.4mg(1.05mmol)tfa，将反应混合物在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到32.8mg(96％)化合物三氟乙酸/n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝542[m+h]⁺。

首先将29.5mg(0.05mmol)三氟乙酸/n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺(1:1)和14.1mg(0.05mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-n-(叔丁氧基羰基)-l-缬氨酸酯加入到1.0mldmf中，并加入18.2mg(0.18mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到23.1mg(69％)化合物n-(叔丁氧羰基)-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.30min；ms(esipos):m/z＝741[m+h]⁺。

将19.4mg(0.03mmol)n-(叔丁氧基羰基)-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺溶于1.5ml二氯甲烷中，加入59.7mg(0.52mmol)tfa。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入119.4mg(1.04mmol)tfa，并将混合物再次在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，并且将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到19.2mg(97％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝641[m+h]⁺。

中间体c42

四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐

首先加入3.00g(21.16mmol，2.68ml)三氟化硼-二乙醚复合体，在0℃下缓慢滴加溶于27ml无水thf中的1.37g(10.58mmol)2,5-二氟苯胺。在-10℃下，滴加溶于3ml无水thf中的1.61g(13.75mmol，1.85ml)亚硝酸异戊酯溶液，并在相同温度下继续搅拌30min。加入15ml乙醚，滤出沉淀的重氮盐，用少量乙醚洗涤并在高真空下干燥。得到2.27g目标化合物(理论值的94％)。

lc-ms(方法6):rt＝0.24min；ms(esipos):m/z＝141[m]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝8.11-8.17(m,1h),8.36-8.43(m,1h),8.69-8.73(m,1h).

中间体c43

氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯

在氩气氛下，首先将3.63g(24.13mmol)2-氯-3-氧代丁酸甲酯加入100ml水中，并在-5℃下加入48.90g(618.19mmol，50.00ml)吡啶，将混合物在此温度下搅拌10min。t-5℃，然后加入5.00g(21.94mmol)四氟硼酸2,5-二氟苯重氮盐，导致形成橙色悬液。混合物在此温度下搅拌30min，反应用水稀释并用二氯甲烷萃取三次。将合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到5.52g目标化合物(理论值的97％，根据lc/ms的纯度＝96％)。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esipos):m/z＝249[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝3.85(s,3h),6.88-6.94(m,1h),7.16-7.21(m,1h),7.31-7.37(m,1h),10.00(s,1h).

中间体c44

4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-羧酸甲酯

将3.50g(13.52mmol)氯[2-(2,5-二氟苯基)亚肼基]乙酸甲酯(根据lc/ms的纯度96％)溶于9ml无水甲苯中，加入2.61g(14.87mmol)(2e)-3-(二甲基氨基)-1-苯基丙-2-烯-1-酮和3.01g(29.73mmol)，4.14ml)三乙胺，将混合物在室温下搅拌16h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物通过制备型hplc(流动相：acn/含有0.1％甲酸的水，梯度)分离。得到1.79g(理论值的39％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝343[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝3.86(s,3h),7.44-7.50(m,1h),7.55-7.72(m,4h),7.81-7.87(m,3h),8.80(d,1h).

中间体c45

[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]甲醇

首先将3.18g(8.92mmol)4-苯甲酰基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-羧酸甲酯(根据lc/ms的纯度＝96％)加入到50ml三氟乙酸中，滴加8.74g(75.13mmol，12ml)三乙基硅烷，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将得到的残余物溶于120ml无水thf中，并在0℃下滴加2.89g(33.63mmol，33.63ml)硼烷-四氢呋喃复合体。将混合物搅拌过夜。由于转化率低，加入另外12.33ml(12.33mmol)的1m硼氢化锂的thf溶液。将混合物在室温下搅拌1h，在60℃下搅拌30min，在80℃下搅拌2h。在0℃下，用60ml饱和碳酸氢钠溶液小心猝灭反应。用100ml乙酸乙酯萃取混合物(在每种情况下)两次，合并的有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发仪上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。得到2.67g(理论值的76％，纯度＝96％)目标化合物。

lc-ms(方法3):rt＝2.79min；ms(esipos):m/z＝329[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝3.91(s,2h),4.45(d,2h),6.51(s,1h),7.18-7.23(m,2h),7.27-7.32(m,4h),7.46-7.53(m,1h),7.60-7.65(m,1h),7.95(d,1h).

中间体c46

4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-甲醛

将2.66g(8.50mmol)[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]甲醇(纯度96％)溶于150ml二氯甲烷中，4.33g(10.20mmol)dess-martin过碘烷一次加入少量。将混合物在室温下搅拌2h，然后加入100ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和100ml10％浓度的硫代硫酸钠溶液，将混合物搅拌20min。分离出有机相，用硫酸钠干燥并在高真空下浓缩。得到2.35g(理论值的88％，纯度＝95％)目标化合物。

lc-ms(方法7):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝299[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝4.12(s,2h),7.17-7.21(m,1h),7.27-7.31(m,4h),7.37-7.42(m,1h),7.57-7.62(m,1h),7.75-7.78(m,1h),8.22(d,1h),10.06(s,1h).

中间体c47

(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺

将2.35g(7.56mmol)4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-甲醛溶于25ml无水thf中，加入1.10g(9.08mmol)(r)-(+)-2-甲基-2-丙磺酰胺和4.73g(16.64mmol)异丙氧基钛(iv)。将反应混合物在室温下搅拌16h，加入20ml饱和氯化钠溶液和30ml乙酸乙酯。然后加入约3g硅藻土，并将混合物在回流下煮沸1h。过滤混合物，从滤液中分离有机相。水相用乙酸乙酯萃取，合并的有机相用饱和氯化钠溶液洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。所述残余物不经进一步纯化即可进一步使用。

在氩气氛下，将残余物溶于60ml无水thf并冷却至-78℃，滴加14.5ml(23.24mmol)叔丁基锂的戊烷溶液(c＝1.6mol/l)。反应在-78℃下搅拌3h，然后用5ml甲醇和15ml饱和氯化铵溶液猝灭。在搅拌下，使反应混合物升温至室温(约30min)。用乙酸乙酯萃取混合物，有机相用饱和氯化钠溶液萃取，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。所述残余物不经进一步纯化即可进一步使用。

将残余物溶于30mlthf和6ml甲醇中，加入6ml(24.00mmol)4n氯化氢的二噁烷溶液，并将混合物在室温下搅拌1h。然后加入15ml饱和碳酸钠溶液，并将混合物用乙酸乙酯萃取。分离出有机相，用旋转蒸发器浓缩并在高真空下干燥。通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)分离残余物。得到两个目标化合物的级分。第一级分产生1.31g的产物(理论值的72％，lc/ms纯度＝97％)和第二级分0.37g的产物(理论值的17％，lc/ms纯度＝83％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝356[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.91(s,9h),1.71(s,2h),3.59(s,1h),3.87(s,2h),7.17-7.32(m,6h),7.45-7.51(m,1h),7.61-7.65(m,1h),7.84(sbr,1h).

中间体c48

(2s)-4-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯

将1.28g(3.35mmol，lc/ms纯度93％)(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶于100ml无水二氯甲烷中，在室温下加入261mg(4.35mmol，250μl)乙酸和1.14g(4.34mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，接着在搅拌5min后，加入1.19g(4.35mmol)(2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯。将混合物在室温下搅拌15min，在旋转蒸发器上浓缩，溶于乙腈和水中，通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化。得到1.64g(理论值的80％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.10min；ms(esipos):m/z＝613[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.01(s,9h),1.32(s,9h),1.35(s,9h),1.80-1.89(m,1h),2.01-2.11(m,1h),2.54-2.71(m,2h),3.75-3.81(m,1h),3.90(s,2h),4.18(d,1h),7.13(d,1h),7.20-7.24(m,1h),7.28-7.34(m,5h),7.52-7.58(m,1h),7.76-7.80(m,1h),8.10(sbr,1h),8.23(sbr,1h).

中间体c49

(2s)-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙酰氧基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸

将225mg(0.37mmol)(2s)-4-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯溶于10ml无水二氯甲烷，加入156mg(1.54mmol)三乙胺。在0℃下，加入125mg(0.92mmol)乙酰氧基乙酰氯，并将混合物在rt下搅拌16h。再加入251mg(1.84mmol)乙酰氧基乙酰氯和186mg(1.84mmol)三乙胺，将混合物在rt下搅拌3h。加入少量二氯甲烷，并且将混合物用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于10ml乙醇中，加入0.91ml(12.67mmol)40％浓度的甲胺水溶液，将混合物在50℃下搅拌3h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，并将有机相用水洗涤两次。有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于2ml二氯甲烷中，加入2ml(25.96mmol)三氟乙酸，并且将混合物在50℃下搅拌4h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物在高真空下干燥。将残余物溶于10ml无水二氯甲烷中，加入298mg(2.95mmol)三乙胺和429mg(1.97mmol)二碳酸二叔丁酯，并将混合物在rt下搅拌1h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物通过制备型hplc(流动相：acn/水，梯度)纯化。得到62mg(理论值的27％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.32min；ms(esipos):m/z＝615[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.91(s,9h),1.32(s,9h),2.64-2.72(m,4h),3.50-3.58(m,1h),3.72(dd,2h),4.07-4.22(m,2h),4.47-4.54(m,1h),5.75(s,1h),6.84-6.89(m,1h),7.15-7.30(m,6h),7.47-7.53(m,1h),7.70-7.75(m,1h),8.09-8.13(m,1h),11.66(sbr,1h).

中间体c50

[(2s)-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁烷-2-基]氨基甲酸叔丁酯

将60mg(0.1mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸溶于10ml无水dmf中，加入74mg(0.20mmol)hatu。将74mg(0.29mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)分别溶于2ml无水dmf中，加入38mg(0.29mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将混合物滴加到反应混合物中。将反应在rt下搅拌3天。混合物直接通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化。得到9.3mg(理论值的13％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝737[m+h]⁺。

中间体c51

n-{(2s)-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸

首先，以与中间体c2类似的方式，将中间体c47用n-{(2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酰基}-β-丙氨酸苄基酯还原性烷基化。然后如对于中间体c27所述的，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2m氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。得到23mg的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝686(m+h)⁺。

中间体c52

(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺

首先将10.00g(49.01mmol)4-溴-1h-吡咯-2-羧酸甲酯加入100.0mldmf中，加入20.76g(63.72mmol)碳酸铯和9.22g(53.91mmol)苄基溴。将反应混合物在rt下搅拌过夜。将反应混合物在水和乙酸乙酯之间分配，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。用90.0g4-溴-1h-吡咯-2-羧酸甲酯重复该反应。

将两个合并的反应物通过制备型rp-hplc(柱：daiso300x100；10μ，流速：250ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到125.15g(理论值的87％)化合物1-苄基-4-溴-1h-吡咯-2-羧酸甲酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.18min；ms(esipos):m/z＝295[m+h]⁺。

在氩气下，首先将4.80g(16.32mmol)1-苄基-4-溴-1h-吡咯-2-羧酸甲酯加入dmf中，加入3.61g(22.85mmol)(2,5-二氟苯基)硼酸、19.20ml饱和碳酸钠水溶液和1.33g(1.63mmol)[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]-二氯化钯(ii):二氯甲烷。将反应混合物在85℃下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤。有机相用水萃取，然后用饱和nacl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝100:3)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到3.60g(理论值的67％)化合物1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-羧酸甲酯。

lc-ms(方法7):rt＝1.59min；ms(esipos):m/z＝328[m+h]⁺。

首先将3.60g(11.00mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-羧酸甲酯加入90.0mlthf中，并在0℃下加入1.04g(27.50mmol)氢化铝锂(2.4m的thf溶液)。将反应混合物在0℃下搅拌30min。在0℃下，加入饱和酒石酸钾钠溶液，并向反应混合物中加入乙酸乙酯。有机相用饱和酒石酸钾钠溶液萃取三次。有机相用饱和nacl溶液洗涤一次，用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于30.0ml二氯甲烷中。加入3.38g(32.99mmol)氧化锰(iv)，将混合物在rt下搅拌48h。再加入2.20g(21.47mmol)氧化锰(iv)，并将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤饼用二氯甲烷洗涤。减压蒸发溶剂，并将残余物2.80g(1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-甲醛)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法7):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝298[m+h]⁺。

首先将28.21g(94.88mmol)1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-甲醛与23.00g(189.77mmol)(r)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入到403.0ml无水thf中，加入67.42g(237.21mmol)异丙氧钛(iv)，将混合物在rt下搅拌过夜。加入500.0ml饱和nacl溶液和1000.0ml乙酸乙酯，并将混合物在rt下搅拌1h。通过硅藻土过滤混合物，滤液用饱和nacl溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，残余物用biotageisolera(硅胶，柱1500+340gsnap，流速200ml/min，乙酸乙酯/环己烷1:10)纯化。

lc-ms(方法7):rt＝1.63min；ms(esipos):m/z＝401[m+h]⁺。

首先将25.00g(62.42mmol)(r)-n-{(e/z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺在氩气下加入无水thf中并冷却至-78℃。然后在-78℃下加入12.00g(187.27mmol)叔丁基锂(1.7m的戊烷溶液)，并将混合物在此温度下搅拌3h。在-78℃下，然后依次加入71.4ml甲醇和214.3ml饱和氯化铵溶液，并将反应混合物升温至rt，并在rt下搅拌1h。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物(r)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法6):rt＝2.97min；ms(esipos):m/z＝459[m+h]⁺。

首先将28.00g(61.05mmol)(r)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺加入186.7ml1,4-二噁烷中，然后加入45.8mlhcl的1,4-二噁烷溶液(4.0m)。将反应混合物在rt下搅拌2h，并且减压蒸发溶剂。通过制备性rp-hplc(柱：kinetix100x30；流速：60ml/min，mecn/水)纯化残余物。减压蒸发乙腈并向含水残余物中加入二氯甲烷。有机相用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到16.2g(理论值的75％)的标题化合物。

lc-ms(方法6):rt＝2.10min；ms(esipos):m/z＝338[m-nh2]⁺,709[2m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.87(s,9h),1.53(s,2h),3.59(s,1h),5.24(d,2h),6.56(s,1h),6.94(m,1h),7.10(d,2h),7.20(m,1h),7.26(m,2h),7.34(m,2h),7.46(m,1h).

中间体c53

(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

首先，以与中间体c2类似的方式，将中间体c52用(2s)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯来还原性烷基化。然后如对于中间体c27所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2m氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。将以这种方式获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在rt下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9h-芴-9-基甲基酯在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下引入fmoc保护基。

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝734(m-h)^-。

中间体c54

n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酰基]-β-丙氨酸

首先，以与中间体c2类似的方式，将中间体c52用n-[(2s)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酰基]-β-丙氨酸苄基酯还原性烷基化。然后如对于中间体c27所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。将以这种方式获得的中间体溶于甲醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在rt下用标准压力下的氢气氢化1h。然后用2m氢氧化锂的甲醇溶液水解酯基。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9h-芴-9-基甲基酯在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下引入fmoc保护基。得到48mg标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.38min；ms(esipos):m/z＝807(m+h)⁺。

中间体c55

2-[3-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮

将340mg(0.96mmol)(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺溶于7ml无水dcm中，在rt下加入69mg(1.15mmol，60μl)乙酸和284mg(1.34mmol)三乙酰氧基硼氢化钠。搅拌混合物15min，然后加入233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙醛。将混合物在rt下搅拌4.5h。再加入233mg(1.15mmol)3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙醛、69mg(1.15mmol，60μl)乙酸和284mg(1.34mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，并将混合物在rt下搅拌7h。加入乙酸乙酯，反应混合物用饱和碳酸钠溶液洗涤。将有机相浓缩并将残余物通过制备型hplc[1.)流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度；2.)流动相：acn/水+1％tfa+1.0％net3)]纯化两次。得到108mg(理论值的21％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝543[m+h]⁺。

中间体c56

乙酸2-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}[3-(1,3-二氧代-1,3-二氢-2h-异吲哚-2-基)丙基]氨基)-2-氧代乙酯

首先将102mg(0.19mmol)2-[3-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]-1h-异吲哚-1,3(2h)-二酮加入2ml无水dcm中，并在rt下加入44mg(0.43mmol)三乙胺。在0℃下，加入31mg(0.23mmol)溶于1ml纯dcm中的乙酸2-氯-2-氧代乙酯。将混合物在rt下搅拌40min。再加入溶于0.5ml纯dcm中的26mg乙酸2-氯-2-氧代乙酯和19mg(0.19mmol)三乙胺，将混合物在rt下搅拌60min。

加入水，在旋转蒸发仪上浓缩混合物，并且将残余物通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化。得到106mg(理论值的88％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝643[m+h]⁺。

中间体c57

三氟乙酸/{(2s)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

根据标准方法，通过在存在hatu的情况下将中间体c49与(2-氨基乙基)氨基甲酸9h-芴-9-基甲基酯偶联，随后用哌啶移除fmoc保护基，制备标题化合物。得到14mg标题化合物(经2步的理论值的40％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝657(m+h)⁺。

中间体c58

(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸

将4.3g(12.2mmol)中间体c52溶于525mldcm中，并加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在rt下搅拌5min后，加入溶于175mldcm中的8.99g(24.5mmol)中间体l57，将反应物在rt下再搅拌45min。然后将反应物用300mldcm稀释并用100ml碳酸氢钠溶液洗涤两次，用饱和nacl溶液洗一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。然后将残余物通过制备型rp-hplc(柱：chromatorexc18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到4.6g(理论值的61％)(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯。

lc-ms(方法12):rt＝1.97min；ms(esipos):m/z＝614(m+h)⁺。

首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入76mldcm中并在存在2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在rt下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94ml三乙胺，将反应在rt下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并连续用300ml5％浓度的柠檬酸萃取两次，用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，再用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝714(m+h)⁺。

将2.17mg(2.64mmol)该中间体溶于54mlthf和27ml水中，加入26ml2摩尔氢氧化锂溶液。将混合物在rt下搅拌30min，然后使用1.4mltfa将ph调节至3和4之间。将混合物减压浓缩。一旦大部分thf被蒸馏出去，将水溶液用dcm萃取两次，然后减压浓缩至干燥。残余物通过制备型hplc(柱：chromatorexc18)纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.1g(理论值的63％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝656(m-h)^-。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9h),0.58(m,1h),0.74-0.92(m,11h),1.40(m,1h),3.3(m,2h),3.7(m,1h),3.8-4.0(m,2h),4.15(q,2h),4.9and5.2(2d,2h),5.61(s,1h),6.94(m,2h),7.13-7.38(m,7h),7.48(s,1h),7.60(m,1h),12.35(s,1h).

中间体c59

(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2s)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

首先，如对于中间体c53所述的，将(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸苄基酯的仲氨基在存在三乙胺的情况下用(2s)-2-甲氧基丙酰氯(中间体c53的中间体)酰化。将获得的中间体溶于乙醇中，加入钯碳(10％)，并将混合物在rt下用标准压力下的氢气氢化1h。将脱保护的化合物溶于二噁烷/水2:1中，最后一步使用氯甲酸9h-芴-9-基甲基酯在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下引入fmoc保护基。

lc-ms(方法1):rt＝1.39min；ms(esipos):m/z＝764(m-h)^-。

中间体c60

(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2s)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-2-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}丁酸

该合成以与中间体c53类似的方式进行。

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z＝750(m+h)⁺。

中间体c61

n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-β-丙氨酸

通过将60mg(0.091mmol)中间体c58与β-丙氨酸甲酯偶联，然后用2m氢氧化锂溶液进行酯裂解来制备标题化合物。经2步，得到67mg(理论值的61％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.29min；ms(esipos):m/z＝729(m+h)⁺。

中间体c62

n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-d-丙氨酸

以与中间体c61类似的方式，由中间体c58和d-丙氨酸甲酯制备标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.32min；ms(esipos):m/z＝729(m+h)⁺。

中间体c63

三氟乙酸/{(2s)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)

该中间体的合成开始于在第一步，在存在28.7mg(0.15mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9mg(0.15mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和39μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将50mg(0.075mmol)中间体c3与26.2mg(0.082mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸9h-芴-9-基甲基酯盐酸盐(1:1)偶联。在rt下搅拌18h后，浓缩混合物，并且将残余物通过制备型hplc纯化。得到45mg(理论值的65％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.51min；ms(esipos):m/z＝921(m+h)⁺。

将45mg(0.049mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入176μl40％浓度的甲胺水溶液。反应在50℃下搅拌，6h后和9h后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下再搅拌14h后，再加入700μl甲胺溶液，再搅拌20h后，最后浓缩混合物。将残余物溶于dcm中并用水洗涤。浓缩有机相并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并在高真空下干燥残余物得到32mg(理论值的99％){(2s)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝657(m+h)⁺。

中间体c64

三氟乙酸/{(2s)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

标题化合物是以与中间体c63类似的方式由中间体c58制备。

hplc(方法11):rt＝2.4min；

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝700(m+h)⁺。

中间体c65

(8s)-8-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸

首先将215mg(0.59mmol)中间体l66加入到25ml二氯甲烷中，加入377mg(0.89mmol)dess-martin过碘烷和144μl(1.78mmol)吡啶。将混合物在rt下搅拌30min。然后用300ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的na2s2o3溶液，10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。得到305mg醛，其不经进一步纯化即进行反应。

将175mg(0.49mmol)中间体c52溶于50ml二氯甲烷中，加入147mg(0.69mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和32.5μl乙酸。在rt下搅拌5min后，加入214mg(0.593mmol)上述醛，并将反应在rt下搅拌过夜。此处，代替预期产物，形成[(2s)-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}氨基)-1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。由于该酰亚胺也可以转化成标题化合物，所以浓缩反应物并将残余物通过制备型hplc纯化。合并合适的含酰亚胺的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到195mg(58％)上述酰亚胺。

lc-ms(方法5):rt＝3.32min；ms(esipos):m/z＝667(m+h)⁺。

将65mg(97.5μmol)该酰亚胺溶于15ml二氯甲烷中，加入367μl(3.4mmol)乙酰氧基乙酰氯和595μln,n-二异丙基乙胺。在rt下搅拌30min之后，将反应物在不加热的情况下减压浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并在高真空下干燥后得到28mg(理论值的37％)(8s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基乙酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.44min；ms(esipos):m/z＝767(m+h)⁺。

将28mg(37μmol)该中间体溶于3ml甲醇中，加入548μl2m氢氧化锂溶液。在rt下搅拌10min后，用三氟乙酸将反应物调节至ph4，然后浓缩。残余物经制备型hplc纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥，得到26mg(96％的理论值)的标题化合物，其为白色固体。

lc-ms(方法1):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝743(m+h)⁺。

中间体c66

[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(甘氨酰氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

首先，根据肽化学的经典方法(hatu偶联和boc移除)由n-[(苄氧基)羰基]甘氨酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁基酯制备三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)。

将13mg(0.036mmol)该中间体和25mg(0.033mmol)中间体c58溶于3mldmf中，加入19mg(0.05mmol)hatu和17μln,n-二异丙基乙胺。在rt下搅拌10min后，浓缩混合物，并且将残余物通过制备型hplc纯化。得到17.8mg(理论值的60％)中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.36min；ms(esipos):m/z＝891(m+h)⁺。

将17mg(0.019mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，加入钯碳(10％)，将混合物在rt下用标准压力下的氢气氢化2h。滤除催化剂，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到9mg(理论值的62％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esipos):m/z＝757(m+h)⁺。

中间体c67

[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸9h-芴-9-基甲基酯

首先将605.3mg(1.71mmol)(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体c52)加入10.0ml二氯甲烷中，加入506.7mg(2.39mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和117.9mg(1.96mmol)乙酸，将混合物在rt下搅拌5min。加入溶于10.0ml二氯甲烷中的580.0mg(1.96mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸9h-芴-9-基甲基酯(中间体l70)，并将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)两次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物用硅胶色谱分离(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到514.7mg(理论值的46％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.10min；ms(esipos):m/z＝634(m+h)⁺。

中间体c68

[3-({(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

合成是以与化合物中间体c67的合成类似的方式进行。

1000.0mg(2.81mmol)(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙-1-胺(中间体c47)

835.0mg(3.94mmol)三乙酰氧基硼氢化钠

194.0mg(3.24mmol)乙酸

560.0mg(3.24mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯

得到695.8mg(理论值的48％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.02min；ms(esipos):m/z＝513(m+h)⁺。

中间体c69

11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸

首先将117.0mg(0.19mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c70)和21.6mg(0.20mmol)3-硫烷基丙酸加入到3.0ml甲醇中，加入89.5mg(0.65mmol)碳酸钾，将混合物在50℃下搅拌4h。用乙酸乙酯稀释反应混合物，有机相用水和饱和的nacl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤中。得到106.1mg(理论值的73％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.42min；ms(esineg):m/z＝700(m-h)^-。

中间体c70

{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

首先将908.1mg(1.63mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体c11的合成)和545.6mg(5.39mmol)三乙胺加入10.0ml二氯甲烷中，并将混合物冷却至0℃。在此温度下，加入590.5mg(5.23mmol)氯乙酰氯，并将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用饱和nacl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到673.8mg(理论值的65％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.53min；ms(esineg):m/z＝676(m+hcoo^-)^-。

中间体c71

s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将536.6mg(4.43mmol)l-半胱氨酸与531.5mg(6.33mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.5ml水中。加入溶于25.0ml异丙醇中的400mg(0.63mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c70)和1.16g(7.59mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到449.5mg(理论值的86％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.20min；ms(esipos):m/z＝717(m+h)⁺。

中间体c72

(9s)-9-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸

首先将90mg(0.212mmol)中间体l72加入到6ml二氯甲烷中，加入86μl(1.06mmol)吡啶和135mg(0.318mmol)dess-martin过碘烷。将混合物在rt下搅拌30min。然后用30ml二氯甲烷稀释反应物，有机相用10％浓度的na2s2o3溶液洗涤两次，用5％浓度的柠檬酸溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。以该方式获得的醛不经进一步纯化即反应。

将63mg(0.177mmol)中间体c52溶于15ml二氯甲烷中，加入52.4mg(0.247mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和20.2μl乙酸。在rt下搅拌5min后，加入89.6mg(0.212mmol)上述醛，并将反应在rt下搅拌20min。将反应物减压浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。合并适当的级分后，减压蒸发溶剂，并且将残余物从乙腈/水中冻干。得到71mg(经过两步的理论值的53％)(9r)-9-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.21min；ms(esipos):m/z＝761(m+h)⁺。

将70mg(92μmol)该中间体溶于15ml二氯甲烷中，将混合物冷却至10℃，加入54μl三乙胺和25.5μl(0.23mmol)乙酰氧基乙酰氯。在rt下搅拌1h后，加入相同量的酰基氯和三乙胺，在rt下再搅拌1h后再次加入。然后将反应在rt下再搅拌30min，然后减压浓缩，并且将残余物通过制备型hplc纯化。合并适当的级分，蒸发溶剂并将残余物从乙腈/水中冷干，得到46.5mg(理论值的59％)酰化的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.53min；ms(esipos):m/z＝861(m+h)⁺。

将46mg(53μmol)该中间体溶于5ml甲醇中，加入2.7ml2m氢氧化锂溶液。在rt下搅拌10min后，用乙酸将反应物调节至ph3-4，然后用15ml水稀释。水相用乙酸乙酯萃取，有机相用硫酸镁干燥并浓缩。将残余物从乙腈/水中冻干，在高真空下干燥残余物之后，得到37mg(理论量的90％)的标题化合物，其为白色固体。

lc-ms(方法1):rt＝1.32min；ms(esipos):m/z＝729(m+h)⁺。

中间体c73

s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-l-半胱氨酸

首先将619mg(0.86mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)加入到8.8ml二氯甲烷中，加入87mg(0.86mmol)三乙胺和224mg(0.86mmol)n-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。1h后，加入45mg(0.17mmol)n-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰氧基]吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在rt下搅拌1h。将混合物减压浓缩，将残余物溶于二氯甲烷中，然后将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次。有机相用硫酸镁干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到602mg(71％，纯度87％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.58min；ms(esipos):m/z＝861(m+h)⁺。

中间体c74

三氟乙酸3-氨基-n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(11)

将75mg(0.114mmol)中间体c58溶于12.5mldmf中，并在存在65mg(0.11mmol)hatu和79μln,n-二异丙基乙胺的情况下与78mg(0.171mmol)中间体l75偶联。通过制备型hplc纯化后，将中间体溶于20ml乙醇中，并在rt、氢气标准压力下用10％活性炭上的钯氢化1h。然后过滤催化剂，减压移除溶剂，产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水11中冻干，得到63mg(经2步的理论值的64％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.16min；ms(eipos):m/z＝844[m+h]⁺。

中间体c75

(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯

将4.3g(12.2mmol)中间体c52溶于525mldcm中，加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在rt下搅拌5min后，加入溶于175mldcm中的3.23g(11.85mmol)(2s)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(由(3s)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸通过经典方法制备)，并将混合物在rt下再搅拌45min。然后将混合物用dcm稀释并用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型hplc纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。

lc-ms(方法12):rt＝1.97min；ms(esipos):m/z＝614.32(m+h)⁺。

将200mg(0.33mmol)该中间体溶于10mldcm中，然后加入105μl三乙胺和77μl(0.717mmol)乙酰氧基乙酰氯。将混合物在rt下搅拌过夜，然后减压浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，然后浓缩。得到213mg(75％)的标题化合物，其为米色泡沫。

lc-ms(方法1):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝714(m+h)⁺。

中间体c76

n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物是由中间体c75根据肽化学的经典方法(用氯化锌移除teoc保护基、在存在hatu的情况下用n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酰化并用氢氧化锂的thf/水溶液进行酯裂解)制备。

lc-ms(方法1):rt＝1.23min；ms(esipos):m/z＝818(m+h)⁺。

中间体c77

s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-l-半胱氨酸

首先将4-叔丁氧基-4-氧代丁酸(8.39mg，48.1μmol)加入1.0mldmf中，加入7.37mg(48.1μmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物、15.5mg(48.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和8.60μl(48.1μmol)n,n-二异丙基乙胺，将混合物在rt下搅拌10min。首先将40.0mg(0.048mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸三氟乙酸(11)(中间体c71)加入1.0mldmf中，加入25.4μl(141.9mmol)n,n-二异丙基乙胺，将混合物加入到反应中，并将反应混合物在rt下搅拌4h。反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，残余物在高真空下干燥。得到35.0mg(理论值的83％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.76min；ms(esipos):m/z＝873[m+h]⁺

中间体c78

11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸

首先将197mg(0.354mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参见中间体c11的合成)加入5.0ml二氯甲烷中，并将混合物加热至40℃。在此温度下，加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在rt下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在rt下搅拌1h。然后加入240μl(3.0mmol)吡啶和220μl(1.8mmol)4-氯-4-氧代丁酸甲酯，并将混合物在rt下搅拌1h。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用5％khso4溶液萃取(在每种情况下)3次。有机相用饱和nacl溶液洗涤并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的31％)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝670[m+h]⁺

首先将78.3mg(117μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸甲酯加入到4.0mlthf中，加入800μl甲醇、160μl水和230μl(230μmol)lioh水溶液(1m)。将反应混合物在rt下搅拌3h，用乙酸猝灭并直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到64.8mg(理论值的85％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.61min；ms(esineg):m/z＝654[m-h]^-

中间体c79

三氟乙酸3-氨基-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-硅杂十七烷-17-基)-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

首先将57.4mg(81.8μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)加入到5.7mldmf中，加入74.0mg(164μmol)三氟乙酸3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)(中间体l75)、43μl(250μmol)n,n-二异丙基乙胺和62.2mg(164μmol)hatu，将混合物在rt下搅拌1h。将反应混合物在rt下搅拌1h，用乙酸淬灭并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，乙基胺残余物在高真空下干燥。得到52.4mg(理论值的63％)化合物n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.64min；ms(esipos):m/z＝1022[m]⁺

在氩气下，首先将6.23mg(27.7μmol)乙酸钯(ii)加入3.0ml二氯甲烷中，加入12μl(83μmol)三乙胺和89μl(550μmol)三乙基硅烷，并将混合物搅拌5min。然后加入在3.0ml二氯甲烷中的56.7mg(55.5μmol)n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，将混合物在rt下搅拌过夜。将混合物浓缩至几乎干燥，加入乙腈/水，过滤混合物并通过制备rp-hplc(柱：reprosil125x30；μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到37.4mg(理论值的67％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):):rt＝2.15min；ms(esipos):m/z＝888[m+h]⁺

中间体c80

s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[15-(甘氨酰氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-l-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将43.4mg(95.1μmol)1-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸(中间体l90)加入2.5mldmf中，加入14.6mg(95.1μmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物、30.5mg(95.1μmol)(苯并三唑-1-基氧基)双二甲基氨基甲基鎓氟硼酸盐和16.5μl(95.1μmol)n,n-二异丙基乙胺，并将混合物搅拌10min。将79.0mg(95.1μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸三氟乙酸(1:1)(中间体c71)溶于2.5mldmf中，加入49.5μl(285.3μmol)n,n-二异丙基乙胺，并将混合物加入到反应中。将反应混合物在rt下搅拌2h，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到44.2mg(理论值的40％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[15-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法12):rt＝2.57min；ms(esipos):m/z＝1156[m+h]⁺

将60.2mg(52.1μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[15-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基]-l-半胱氨酸悬浮于3.0ml乙醇中，加入6.0mg在活性炭上的钯(10％)，并将混合物在rt和标准压力下用氢气氢化1h。再一次，加入6.0mg活性炭上的钯(10％)，并将混合物在rt和标准压力下用氢气氢化1h。滤出催化剂，在减压下移除反应混合物中的溶剂，并在高真空下干燥。残余物通过制备rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到29.4mg(理论值的50％)的标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝3.77min；ms(esipos):m/z＝1021[m+h]⁺

中间体c81

(r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺

在氩气和-78℃下，将18.7ml(37.45mmol)环己基氯化镁的乙醚溶液(2m)加入3.12ml(6.24mmol)二甲基锌的甲苯溶液(2.0m)中，并将混合物在-78℃下搅拌30min。然后在-78℃下加入5.0g(12.48mmol)(r)-n-{(e/z)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]亚甲基}-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺的thf溶液，并将反应混合物在此温度下搅拌1h，然后在rt下搅拌4h。然后在-78℃下，加入ml的饱和氯化铵溶液，并使反应混合物升温至rt。混合物用乙酸乙酯稀释并用水洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物使用biotageisolera(硅胶，乙酸乙酯/环己烷25:75)纯化，得到1.59g(理论值的26％)中间体。

lc-ms(方法12):rt＝2.76min；ms(esineg):m/z＝483[m-h]^-

在氩气下，首先将264.0mg(0.54mmol)该中间体加入0.5ml1,4-二噁烷中，然后加入1.36mlhcl的1,4-二噁烷溶液(4.0m)。将反应混合物在rt下搅拌1h。加入二氯甲烷，反应混合物用1m氢氧化钠水溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物使用biotageisolera(硅胶，甲醇/二氯甲烷98:2)纯化。减压蒸发溶剂，将残余物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到148mg(理论值的72％)的标题化合物。

lc-ms(方法13):rt＝2.07min；ms(esipos):m/z＝364[m-nh2]⁺

中间体c82

(3-{[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

在氩气下，将392.2mg(1.85mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和91.29mg(1.52mmol)乙酸加入到503.0mg(1.32mmol)1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-环己基甲胺(中间体c81)在1.4ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在rt下搅拌10min。然后加入574.6(2.38mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯的二氯甲烷溶液，将混合物在rt下搅拌过夜。加入143mg(0.66mmol)(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯后，将混合物再搅拌2h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和nacl溶液各洗涤两次，用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型hplc纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到488g(理论值的63％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.89min；ms(esipos):m/z＝582(m+h)⁺。

中间体c83

(3-{[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将280.0mg(2.77mmol)三乙胺和397.8mg(3.52mmol)氯乙酰氯加入到487.9mg(0.84mmol)(3-{[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c82)以及分子筛在8.40ml二氯甲烷的溶液中，将反应混合物在rt下搅拌6h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物未经纯化即进一步使用。得到470mg(理论值的85％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.88min；ms(esipos):m/z＝680(m+na)⁺。

中间体c84

s-{11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-l-半胱氨酸

将322.1mg(2.66mmol)l-半胱氨酸与319.0mg(3.80mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.19ml水中。将250.0mg(0.38mmol)(3-{[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c83)溶于1.90ml异丙醇中，加入693.8g(4.56mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到276mg(理论值的97％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.34min；ms(esipos):m/z＝744(m+h)⁺。

中间体c85

s-{11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸

将34.8mg(0.27mmol)n,n-二异丙基乙胺加入到100mg(0.13mmol)s-{11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-l-半胱氨酸(1:1)(中间体c84)和41.5mg(0.13mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮在4.0mldmf中的混合物中，将反应混合物在rt下搅拌3h。不进行后处理，通过制备型hplc纯化混合物。得到88mg(理论值的70％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.71min；ms(esipos):m/z＝936(m+h)⁺。

中间体c86

11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸

将161.65mg(1.17mmol)碳酸钾加入到220.0mg(0.33mmol)(3-{[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基](氯乙酰基)氨基}丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c83)和39.02mg(0.37mmol)3-硫烷基丙酸在7.45ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和饱和用nacl溶液反复洗涤。有机相用硫酸钠干燥，并减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到201mg(理论值的83％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.72min；ms(esineg):m/z＝726(m-h)^-。

中间体c87

(13-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基](环己基)甲基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂3,6,13-三氮杂十六烷-16-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将54.18mg(0.28mmol)n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体l1)、71.01mg(0.50mmol)n,n-二异丙基乙胺、104.46mg(0.27mmol)hatu和0.23ml(0.14mmol)1-羟基-7-氮杂苯并三唑0.5m的dmf溶液加入到100mg(0.14mmol)11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c86)在1.37mldmf的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌5h。不经进一步后处理，将混合物通过制备型hplc纯化。得到41mg(理论的33％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.61min；ms(esipos):m/z＝907(m+h)⁺。

中间体c88

3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯三氟乙酸(1:1)

立体异构体的混合物

将1.71g(8.05mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和0.40g(6.61mmol)乙酸加入到2.04mg(5.75mmol)(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙烷-1-胺(中间体c52)在51ml二氯甲烷中的溶液中，并将反应混合物在rt下搅拌5min。然后加入1.32g(6.61mmol)3-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯在20ml二氯甲烷中的溶液，并将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用乙酸乙酯稀释，有机相用饱和碳酸钠溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)两次，用硫酸镁干燥并浓缩。残余物经制备型hplc纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到1.86g(理论值的50％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.99min；ms(esipos):m/z＝538(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体c89

3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯

将1.36g(13.42mmol)三乙胺和2.13g(18.87mmol)氯乙酰氯加入到2.89g(4.19mmol，80％纯度)的3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体c88)以及分子筛在42ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌5h。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。得到449mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体1和442mg(理论值的17％)的标题化合物的异构体2。

异构体1lc-ms(方法1):rt＝2.74min；ms(esipos):m/z＝614(m+h)⁺。

异构体2lc-ms(方法1):rt＝2.78min；ms(esipos):m/z＝614(m+h)⁺。

中间体c90

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(异构体1)

将357.3mg(0.58mmol)l-半胱氨酸与488.7mg(4.07mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.3ml水中。加入溶于23.0ml异丙醇中的357.0mg(0.58mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体1)(中间体c89，异构体1)和1.06g(6.98mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到255.0mg(理论值的62％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝699(m+h)⁺。

中间体c91

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(异构体2)

将453.5mg(3.74mmol)l-半胱氨酸与449.2mg(5.35mmol)碳酸氢钠一起悬浮于2.1ml水中。加入溶于21.1ml异丙醇中的3287.4mg(0.54mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体c89，异构体2)和0.98g(6.42mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤，并用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂。残余物未经纯化即进一步使用。得到221.0mg(理论值的59％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.12min；ms(esipos):m/z＝699(m+h)⁺。

中间体c92

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸(异构体1)

将18.49mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07mmol)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(中间体c90)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮在3.3mldmf中的混合物中，将反应混合物在rt下搅拌45min。不进行后处理，将混合物通过制备型hplc纯化。得到65mg(理论值的100％，71％纯度)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.31min；ms(esipos):m/z＝892(m+h)⁺。

中间体c93

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基)-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸(异构体2)

将18.49mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺加入到50mg(0.07mmol)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(中间体c91)和22.06mg(0.07mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮在3.0mldmf中的混合物中，将反应混合物在rt下搅拌90min。不进行后处理，将混合物通过制备型hplc纯化。得到63mg(理论值的98％，纯度73％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝892(m+h)⁺。

中间体c94

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸(异构体1)

将18.5mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺加入到50.0mg(0.07mmol)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(中间体c90)和18.0mg(0.07mmol)-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮在3.3mldmf中的混合物中，将反应混合物在rt下搅拌30min。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和nh4cl溶液和饱和用nacl溶液反复洗涤有机相。有机相用硫酸镁干燥，并减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到57mg(理论值的81％，纯度85％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝836(m+h)⁺。

中间体c95

3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体1)

将302.5mg(2.19mmol)碳酸钾加入到384.0mg(0.62mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体c89，异构体1)和73.0mg(0.69mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到358.0mg(理论值的84％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝684(m+h)⁺。

中间体c96

3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(异构体2)

将226.0mg(1.64mmol)碳酸钾加入到287.0mg(0.45mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(中间体c89，异构体2)和54.6mg(0.51mmol)3-硫烷基丙酸在14ml甲醇和几滴水的混合物中。将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到318.7mg(理论值的88％，纯度88％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.36min；ms(esipos):m/z＝684(m+h)⁺。

中间体c97

3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)

在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)hatu加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体c96)在2.81mldmf中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌10min。然后加入22.75mg(0.07mmol)n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体l1)在1.4mldmf中的溶液和5mg(0.04mmol)n,n-二异丙基乙胺，将混合物在rt下搅拌过夜。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物未经后处理即进一步使用。得到26mg(理论值的84％)的标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝4.39min；ms(esipos):m/z＝863(m+h)⁺。

中间体c98

3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)

在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)hatu加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体c96)在2.81mldmf中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌10min。然后加入37.30mg(0.07mmol)n-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸在1.4mldmf中的溶液和5mg(0.04mmol)n,n-二异丙基乙胺，将混合物在rt下搅拌过夜。加入水，并用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即使用。得到22mg(理论值的63％)的标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝4.54min；ms(esipos):m/z＝919(m+h)⁺。

中间体c99

3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,19三氧代-12,15-二氧杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(异构体2)

在氩气下，将14.17mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺和27.80mg(0.07mmol)hatu加入25.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体c96)在2.81mldmf中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌10min。然后加入35.05mg(0.07mmol)n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺-乙烷(1:1)三氟乙酸(中间体l82)在1.4mldmf中的溶液和5mg(0.04mmol)n,n-二异丙基乙胺，将混合物在rt下搅拌过夜。加入水，用二氯甲烷萃取混合物。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物经制备型hplc纯化。得到25mg(理论值的60％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝4.52min；ms(esipos):m/z＝1007(m+h)⁺。

中间体c100

(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2r)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将22.2mg(0.068mmol)(2r)-n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)三氟乙酸加入到45mg(0.068mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸(中间体c58)在5.8mldmf中的溶液中。在rt下搅拌30min后，将39mg(0.10mmol)hatu和36mg(0.27mmol)n,n-二异丙基乙胺加入到混合物中。将反应混合物在rt下搅拌1h。未经后处理，将混合物通过制备型hplc纯化。得到7mg(理论值的12％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z851(m+h)⁺。

中间体c101

三氟乙酸/(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氨基丁酸甲酯(1:1)

将4.3g(12.2mmol)中间体c52溶于525mldcm中，加入3.63g(17.12mmol)三乙酰氧基硼氢化钠和8.4ml乙酸。在rt下搅拌5min后，加入溶于175mldcm中的3.23g(11.85mmol)(2s)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯(通过经典方法由(3s)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸制备)，并将混合物在rt下再搅拌45min。然后将混合物用dcm稀释，用100ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次并然后用饱和氯化钠溶液萃取两次。有机相用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。残余物经制备型hplc纯化。合并适当的级分，在高真空下浓缩并干燥残余物，得到4.6g(理论值的61％)中间体。

lc-ms(方法12):rt＝1.97min；ms(esipos):m/z＝614.32(m+h)⁺。

首先将2.06g(3.36mmol)该中间体加入到76mldcm中并在存在2.1ml三乙胺的情况下用0.81ml(7.17mmol)乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。在rt下搅拌20h后，加入0.36ml乙酸2-氯-2-氧代乙酯和0.94ml三乙胺，将反应在rt下再搅拌15min。然后将混合物用500ml乙酸乙酯稀释并依次用300ml5％柠檬酸萃取两次、用300ml饱和碳酸氢钠溶液萃取两次，用100ml饱和氯化钠溶液萃取一次，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到2.17g(理论值的79％)受保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝714(m+h)⁺。

将321mg(0.342mmol)该中间体溶于7ml2,2,2-三氟乙醇中。加入279.5mg(2.05mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入599mg(2.05mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸和2ml0.1％浓度的三氟乙酸水溶液，然后将混合物减压浓缩。残余物经制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到60mg(理论值的26％)的标题化合物，其仍含有一部分脱乙酰的化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min和0.95min；ms(esipos):m/z＝528和570(m+h)⁺。

中间体c102

(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}丁酸

首先，以与中间体c2类似的方式，用(2s)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯将中间体c52还原性烷基化。然后将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化，然后用2m氢氧化锂的甲醇溶液水解两个酯基。

lc-ms(方法1):rt＝1.31min；ms(esipos):m/z＝646(m-h)^-.

中间体c103

n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-n2-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-谷氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

首先通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下使151mg(0.23mmol)中间体c102与128g(0.234mmol)中间体l98在dmf中偶联来制备标题化合物。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在rt、标准氢气压力下氢化30min来移除z保护基，得到标题化合物。

产率：经过2个阶段的理论值的30％

lc-ms(方法1):rt＝1.14min；ms(esipos):m/z＝929(m+h)⁺。

中间体c104

(3r,4r)-3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

向2.24g(6.31mmol)(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙-1-胺以及分子筛在56.0ml二氯甲烷中的溶液中加入1.87g(8.84mmol)三乙酰氧基硼氢化钠，将混合物在室温下搅拌15min。随后，加入2.20g(7.58mmol)(3r,4s)-3-氟-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(参考wo2014/151030a1)，并将反应混合物在室温下搅拌3.5h。混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。残余物经制备型hplc纯化。得到1.39g(理论值的24％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.15min；ms(esipos):m/z＝600(m+h)⁺。

中间体c105

(3r,4r)-3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

向692.8mg(0.88mmol)(3r,4r)-3-[({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)甲基]-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯以及分子筛在8.7ml二氯甲烷中的溶液中加入295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯，将反应混合物在rt下搅拌2.5h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。将残余物与分子筛一起再次溶于8.7ml二氯甲烷中，加入295.0mg(2.91mmol)三乙胺和418.9mg(3.71mmol)氯乙酰氯，将反应混合物在rt下搅拌3h。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化铵溶液洗涤。有机相用硫酸钠干燥并浓缩。有机相用硫酸钠干燥、浓缩并不经纯化即进一步使用。得到691mg(理论值的74％，纯度64％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.78min；ms(esipos):m/z＝676(m+h)⁺。

中间体c106

3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸

向691.0mg(0.65mmol)(3r,4r)-3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体c105)和76.3mg(0.72mmol)3-硫烷基丙酸在15ml甲醇和几滴水中的混合物中加入316mg(2.29mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌1.5h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物未经后处理即进一步使用。得到502mg(理论值的67％，纯度65％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esineg):m/z＝744(m-h)^-.

中间体c107

s-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸

将203.6mg(1.68mmol)l-半胱氨酸与201.7mg(2.40mmol)碳酸氢钠一起悬浮于0.95ml水中。向其中加入溶于9.5ml异丙醇中的170.0mg(0.24mmol)(3r,4r)-3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]甲基}-4-氟吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(中间体105)和438.5g(2.40mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌3h。将乙酸乙酯加入到反应混合物中，用饱和碳酸氢钠溶液反复洗涤有机相，并用饱和nacl溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥，并且减压蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到152mg(理论值的83％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.26min；ms(esipos):m/z＝762(m+h)⁺。

中间体c108

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

标题化合物是通过在存在edci、hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下将103mg(0.16mmol)中间体c102与110mg(0.175mmol)n⁶-β-丙氨酰基-n²-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯在dmf中偶联来制备。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在二氯甲烷/甲醇1:1中，在rt、标准氢气压力下氢化1h来移除z保护基，得到标题化合物，产量为113mg(经过2阶段的理论值的75％)。

lc-ms(方法1):rt＝1.17min；ms(esipos):m/z＝957(m+h)⁺。

此处使用的中间体是通过肽化学的常规方法通过以下步骤来制备：在存在hatu的情况下偶联可商购的n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和n²-[(苄氧基)羰基]-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，z保护基的氢解脱离，由1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮引入三甲基甲硅烷基乙氧基羰基(teoc)保护基以及最后通过在7.5％三氟乙酸的二氯甲烷溶液中搅拌45min温和脱离boc保护基。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝462(m+h)⁺。

中间体c109

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-谷氨酸二叔丁基酯

首先，二肽衍生物β-丙氨酰基-l-谷氨酸二叔丁基酯是通过肽化学的常规方法通过以下步骤来制备：在存在hatu的情况下偶联可商购的n-[(苄氧基)羰基]-β-丙氨酸和l-谷氨酸二叔丁基酯盐酸盐(1:1)，随后氢解脱离z保护基。然后通过将该中间体与中间体c102在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联来制备标题化合物，随后通过在10％在活性炭上的钯上，在甲醇中，在rt、标准氢气压力下氢化45min来脱离z保护基。

lc-ms(方法1):rt＝0.99min；ms(esipos):m/z＝826[m+h]⁺。

中间体c110

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-谷氨酸二苄基酯

标题化合物是通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联l-谷氨酸二苄基酯(其已经通过在乙酸乙酯和5％碳酸氢钠溶液之间分配来预先从其对甲苯磺酸盐中释放)与中间体c61，随后用氯化锌的三氟乙醇溶液脱离teoc保护基来制备。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝894[m+h]⁺。

中间体c111

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-d-谷氨酸二叔丁基酯

以与中间体c109类似的方式合成标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.06min；ms(esipos):m/z＝826[m+h]⁺。

中间体c112

n²-乙酰基-n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-n⁶-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺

标题化合物是通过以下步骤来制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下中间体c102和中间体l108在dmf中的hatu偶联，以及随后通过在dcm/甲醇1:1中、在10％在活性炭上的钯上、在标准压力下的氢化脱离z保护基。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝826(m+h)⁺。

中间体c113

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸苄基酯(1:1)

首先，三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸苄基酯(1:1)是通过以下方式由可商购的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸制备，即通过在存在edc/dmap的情况下用苯甲醇进行酯化，接着用三氟乙酸消去boc保护基。然后将该氨基酸单元在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下在dmf中与中间体c58偶联。在最后一步中，通过在50℃下在三氟乙醇中与6个当量的氯化锌搅拌2h并通过制备型hplc纯化，得到标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.05min；ms(esipos):m/z＝824[m+h]⁺。

中间体c114

三氟乙酸/4-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)丁酸叔丁酯(1:1)

首先，将中间体c102与4-氨基丁酸叔丁酯盐酸盐(1:1)在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联。随后，通过在10％在活性炭上的钯上，在dcm/甲醇1:1中，在rt、标准氢气压力下氢化1h，得到标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.0min；ms(esipos):m/z＝655[m+h]⁺。

中间体c115

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-甲基丁酰胺(1:1)

首先，以与中间体c2类似的方式，将中间体c52用(2s)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸苄基酯来还原性烷基化。随后，按照中间体c27中所述，将仲氨基用乙酸2-氯-2-氧代乙酯来酰化。

将190mg(0.244mmol)该中间体溶于7.5ml乙醇中，加入0.35ml40％甲胺水溶液。将混合物在50℃下搅拌3h，然后再次加入相同量的甲胺。在50℃下再搅拌5h后，浓缩混合物，残余物通过制备型hplc纯化。得到78mg(理论值的48％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.32min；ms(eipos):m/z＝661[m+h]⁺。

将78mg(0.118mmol)该中间体溶于8ml乙醇中，加入15mg10％在活性炭上的钯后，在rt、标准氢气压力下氢化3h。然后过滤出催化剂，减压移除溶剂，并且将产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水中冻干后，得到33mg(理论值的44％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝527(m+h)⁺。

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝8.1(m,1h),8.0(m,3h),7.9(m,1h),7.65(m,1h),7.5(s,1h),7.15-7.35(m,5h)7.0(m,1h),6.85(m,1h),5.6(s,1h),4.9and5.2(2d,2h),4.02and4.22(2d,2h),3.2-3.5(m,6h),0.7and1.46(2m,2h),0.8(s,9h).

中间体c116

三氟乙酸/n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(1:1)

将三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)(81.0mg，100μmol)(中间体f104)和n²-(叔丁氧基羰基)-l-天冬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(43.0mg，131μmol)溶于5.0mldmf中。将反应混合物与n,n-二异丙基乙胺(61μl，350μmol)在rt下搅拌1h，然后直接通过制备型rp-hplc(柱：chromatorex125x30；10μ，流速：75ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物冻干。得到84mg(理论值的88％)化合物[(2s)-4-氨基)-1-({(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁烷-2-基}氨基)-1,4-二氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝907[m+h]⁺

[(2s)-4-氨基-1-({(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基)-1,4-二氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯(83.0mg，91.5μmol)溶于5.0ml三氟乙醇中。向反应混合物中加入氯化锌(74.8mg，549μmol)，将反应混合物在50℃下再搅拌15min。向混合物中加入乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(160mg，549μmol)，所述混合物用5.0ml乙腈/水稀释，加入tfa(20μl)，搅拌混合物10min。通过注射器式过滤器过滤混合物并通过制备型rp-hplc(柱：chromatorex125x30；10μ，流速：75ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到50mg(理论值的58％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝807[m+h]⁺

中间体l1

三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。

hplc(方法11):rt＝0.19min；

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝198(m+h)⁺。

中间体l2

三氟乙酸/rel-(1r,2s)-2-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过用edc/hobt偶联并随后用tfa脱保护来由50mg(0.214mmol)可商购的顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸和60mg(0.235mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到36mg(经2步的理论值的38％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝252(m+h)⁺。

中间体l3

三氟乙酸/(1s,2r)-2-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过用edc/hobt偶联并随后用tfa脱保护来由50mg(0.214mmol)可商购的(1s,2r)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和72mg(0.283mmol)同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到13mg(经2步的理论值的16％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法1):rt＝0.2min；ms(esipos):m/z＝252(m+h)⁺。

中间体l4

三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)环己烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}环己基)甲基]-1h-吡咯-2,5-二酮和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备。

hplc(方法11):rt＝0.26min；

lc-ms(方法1):rt＝0.25min；ms(esipos):m/z＝280(m+h)⁺。

中间体l5

三氟乙酸/n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-β-丙氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮和n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸制备。

hplc(方法11):rt＝0.22min；

lc-ms(方法1):rt＝0.22min；ms(esipos):m/z＝260(m+h)⁺。

中间体l6

三氟乙酸/n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-l-赖氨酸叔丁酯(1:1)

标题化合物是通过最初在存在edc/hobt的情况下偶联可商购的6-(2,5-二氧代-2,3-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸与部分保护的肽l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸叔丁酯来制备，其通过肽化学的经典方法制备。随后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌，在氨基上进行脱保护，得到标题化合物，产率37％。

hplc(方法11):rt＝1.29min；

lc-ms(方法1):rt＝0.62min；ms(esipos):m/z＝566(m+h)⁺。

中间体l7

三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在hatu的情况下与n2-(叔丁氧基羰基)-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸偶联，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用tfa再次脱保护。得到32mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.31min；

lc-ms(方法1):rt＝0.47min；ms(esipos):m/z＝516(m+h)⁺。

中间体l8

三氟乙酸/l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式根据肽化学的经典方法由可商购的1-(4-氨基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮顺序来制备，即通过依次在存在hatu的情况下与n²-(叔丁氧基羰基)-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸偶联，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用tfa再次脱保护。得到171mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.23min；

lc-ms(方法7):rt＝0.3min；ms(esipos):m/z＝417(m+h)⁺。

中间体l9

三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体l7类似的方式，由可商购的乙酸(4-氨基苯基)甲酯制备。得到320mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.45min；

lc-ms(方法1):rt＝0.48min；ms(esipos):m/z＝493(m+h)⁺。

中间体l10

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-rel-n⁶-{[(1r,2s)-2-氨基环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)

标题化合物是通过以下方式由中间体l6制备，即通过用edc/hobt与顺式-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-环戊烷羧酸偶联，随后用tfa脱保护。得到12mg(经2步的理论值的52％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.45min；

lc-ms(方法1):rt＝0.73min；ms(esipos):m/z＝677(m+h)⁺。

中间体l11

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1s,2r)-2-氨基环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:2)

标题化合物是通过以下方式由中间体l6来制备，即通过用edc/hobt与(1s,2r)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，随后用tfa脱保护。得到11mg(经2步的理论值的39％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.45min；

lc-ms(方法1):rt＝0.74min；ms(esipos):m/z＝677(m+h)⁺。

中间体l12

三氟乙酸/1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)

将381mg(2.46mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-羧酸甲酯加入到228mg(1.12mmol)溶于7ml二噁烷/水1:1中的[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯中。然后加入1.2ml饱和碳酸氢钠溶液，并且将反应在rt下搅拌。在总共5天的搅拌和进一步添加相同量的碳酸氢钠溶液2次之后，将反应通过用三氟乙酸酸化、在旋转蒸发器上浓缩并通过制备型hplc纯化残余物来进行后处理。合并适当的级分，减压移除溶剂，并且将残余物从乙腈/水1:1中冻干。

将残余物溶于3ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸。在rt下搅拌15min后，减压移除溶剂并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到70mg(经2步的理论值的67％)的标题化合物，其为树脂状残余物。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法1):rt＝0.18min；ms(esipos):m/z＝185(m+h)⁺。

中间体l13

三氟乙酸/n2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-赖氨酸叔丁酯(1:1)

标题化合物是通过在存在edc/hobt的情况下偶联(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸与n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，随后以与中间体l6类似的方式温和地移除叔丁氧基羰基保护基来制备。

hplc(方法11):rt＝0.42min；

lc-ms(方法1):rt＝0.43min；ms(esipos):m/z＝340(m+h)⁺。

中间体l14

三氟乙酸/1-[2-(4-氨基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)

以与中间体l2类似的方式，经2步从哌嗪-1-基氨基甲酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸制备标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法3):rt＝0.25min；ms(esipos):m/z＝239(m+h)⁺。

中间体l15

三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰胺(1:1)

将2.93g(10.58mmol)3-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸叔丁酯溶于100ml二噁烷/水1:1中，加入3.28g(21.15mmol)2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-羧酸甲酯和饱和碳酸氢钠溶液直到达到6-7的ph值。将溶液在rt下搅拌30min，然后减压蒸发1,4-二噁烷。然后加入200ml水，并将混合物用300ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)三次。合并有机萃取物，用硫酸镁干燥并过滤。浓缩得到棕色油状的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸叔丁酯，然后将其在高真空下干燥。

hplc(方法11):rt＝1.5min；

lc-ms(方法3):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝375(m+nh4)⁺。

通过标准方法(用tfa脱保护，与(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯偶联并用tfa再次脱保护)该中间体转化为标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法3):rt＝0.25min；ms(esipos):m/z＝344(m+h)⁺。

中间体l16

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

将535mg(1.73mmol)可商购的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮和930mln,n-二异丙基乙胺加入到266mg(1.33mmol)l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸在24mldmf中的溶液中。反应在超声波浴中处理24h，然后减压浓缩至干燥。剩余的残余物是通过制备型hpcl纯化，在浓缩适当的级分并在高真空下干燥残余物之后，得到337mg(理论值的50％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.4min；

lc-ms(方法3):rt＝0.58min；ms(esipos):m/z＝468(m+h)⁺。

中间体l17

三氟乙酸/n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-l-赖氨酸叔丁酯(1:1)

标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在edc/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联172mg(0.37mmol)中间体l16和125mg(0.37mmol)n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸dcm溶液中在rt下搅拌2h使氨基脱保护。从乙腈/水中的冻干，经2步得到194mg(理论值的49％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.1min；

lc-ms(方法1):rt＝0.58min；ms(esipos):m/z＝652(m+h)⁺。

中间体l18

三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是根据肽化学的经典方法，以与中间体l7类似的方式，通过以下方式由(4-氨基苯基)乙酸甲酯来制备，即通过在存在hatu的情况下连接n²-(叔丁氧基羰基)-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联并用tfa再次脱保护。得到330mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.29min；

lc-ms(方法1):rt＝0.41min；ms(esipos):m/z＝465(m+h)⁺。

中间体l19

三氟乙酸/l-丙氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是依次根据肽化学的经典方法，由1,4-苯二胺制备。在第一步中，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将942mg(8.72mmol)1,4-苯二胺用0.8g(2.9mmol)n²-(叔丁氧基羰基)-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸来单酰化。在第二步中，以类似的方式，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将仲苯胺基氨基用(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸来酰化。用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用tfa再次脱保护，然后在另外3个合成步骤中得到标题化合物，通过该路线得到148mg标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.21min；ms(esipos):m/z＝474(m+h)⁺。

lc-ms(方法4):rt＝0.2min；ms(esipos):m/z＝474(m+h)⁺。

中间体l20

三氟乙酸/l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体l8类似的方式，根据肽化学的经典方法，通过以下步骤由可商购的1-(4-氨基苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过依次在存在hatu的情况下与n²-(叔丁氧基羰基)-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸偶联，用tfa脱保护，与n-(叔丁氧基羰基)-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，并用tfa再次脱保护。得到171mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.28min；

lc-ms(方法1):rt＝0.39min；ms(esipos):m/z＝445(m+h)⁺。

中间体l21

l-缬氨酰基-n⁶-(叔丁氧基羰基)-n-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-l-赖氨酰胺

标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的0.42g(2.56mmol)(4-氨基苯基)乙酸甲酯制备，即通过依次在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与n6-(叔丁氧基羰基)-n2-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-赖氨酸偶联，用哌啶脱保护，在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后在10％在活性炭上的钯上氢解移除苄氧基羰基保护基。

hplc(方法11):rt＝1.5min；

lc-ms(方法1):rt＝0.73min；ms(esipos):m/z＝493(m+h)⁺。

中间体l22

三氟乙酸/n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{4-[(2s)-2-氨基-3-甲氧基-3-氧代丙基]苯基}-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是依次根据肽化学的经典方法由n-(叔丁氧基羰基)-4-硝基-l-苯丙氨酸制备。在第一步中，首先将2.5g(8.06mmol)该起始原料转化为铯盐，然后用碘甲烷的dmf溶液转化为甲酯。

在甲醇中经在10％在活性炭上的钯上氢解，然后将硝基转化为氨基。

然后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将以该方式生成的氨基用n5-氨基甲酰基-n2-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-鸟氨酸的dmf溶液来酰化。在下一步中，用哌啶的dmf溶液移除fmoc基团。

然后在存在1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基-1h-苯并三唑水合物和n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf中用n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酸进行偶联，最后用三氟乙酸移除叔丁氧基羰基。

hplc(方法11):rt＝1.6min；

lc-ms(方法1):rt＝0.77min；ms(esipos):m/z＝673(m+h)⁺。

中间体l23

三氟乙酸/n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]-β-丙氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即在存在edci/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。

hplc(方法11):rt＝0.19min.

中间体l24

三氟乙酸/1-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环丙烷羧酰胺(1:1)

将114mg(0.67mmol)可商购的1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷羧酸溶于25mldcm中，加入110mg(0.623mmol)可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)和395μln,n-二异丙基乙胺，将混合物冷却至-10℃。然后加入217mg(0.793mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐，将混合物在rt下搅拌2h。然后将混合物用乙酸乙酯稀释并连续用10％浓度的柠檬酸、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液萃取，然后用硫酸镁干燥并浓缩。在高真空下干燥，得到152mg受保护的中间体。

然后将它们溶于10mldcm中并用1ml三氟乙酸脱保护。从乙腈/水中冻干，得到158mg(经2步的理论值的71％)的标题化合物。

hplc(方法11):rt＝0.19min.

lc-ms(方法3):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝224(m+h)⁺。

中间体l25

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸

将31.4mg(0.17mmol)缬氨酰基-l-丙氨酸溶于3.0mldmf中，加入115.0mg(0.17mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和33.7mg(0.33mmol)三乙胺。将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到74.1mg(理论值的58％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.61min；ms(esipos):m/z＝763[m+h]⁺。

中间体l26

l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸

将600.0mg(1.58mmol)n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸悬浮于25.0ml水/乙醇/thf(1:1:0.5)中，加入在活性炭上的靶(10％)，并将混合物在rt下用标准压力下的氢气氢化5h。滤出催化剂，并且减压蒸发溶剂。所得化合物不经进一步纯化即用于下一步。

lc-ms(方法1):rt＝0.42min；ms(esipos):m/z＝247[m+h]⁺。

将180mg(0.73mmol)n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸溶于5.0mldmf中，加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。然后加入254.6mg(0.73mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌3.5h。反应溶液通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝480[m+h]⁺。

首先将272.2mg(0.57mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸加入20.0ml乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)中，加入27.2mg在活性炭上的钯。在rt和标准压力下将混合物用氢气氢化5h。借助celite^(r)过滤混合物，并且将滤饼用乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。标题化合物(182mg，理论值的72％)未经进一步纯化即用于下一反应步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.53min；ms(esipos):m/z＝346[m+h]⁺。

中间体l27

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸

首先将30mg(0.07mmol)l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸(中间体l26)和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺加入1.5mldmf中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应溶液在rt下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.77min；ms(esipos):m/z＝920[m+h]⁺。

中间体l28

3-甲酰基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯

首先将461.7mg(1.15mmol)3-乙基-4-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)吡咯烷-1,3-二羧酸1-叔丁酯(该化合物是根据wo2006/066896的文献方法制备)加入5.0ml无水二氯甲烷中，并将混合物冷却至-78℃。然后缓慢滴加326.2mg(2.29mmol)二异丁基氢化铝溶液(1m，在thf中)，并将混合物在-78℃下搅拌2h(通过薄层色谱(石油醚/乙酸乙酯＝3:1)监测)。逐滴加入溶于60ml水中的1.3g(4.59mmol)酒石酸钾钠溶液，使反应混合物升温至rt。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并且将水相用乙酸乙酯萃取三次。合并的有机相用饱和nacl溶液洗涤一次，并且用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到629.0mg作为粗产物的标题化合物，将其不经进一步纯化即立即用于下一反应步骤中。

中间体l29

3-甲酰基-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯

非对映异构体的混合物

首先将807.1mg(2.34mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(根据wo2006/100036的文献方法制备)加入8.0ml二氯甲烷中，加入236.4mg(2.34mmol)三乙胺。在0℃下，滴加267.6mg(2.34mmol)甲磺酰氯，并将反应混合物在rt下搅拌过夜。再加入133.8mg(1.17mmol)甲磺酰氯和118.2mg(1.17mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌过夜。混合物用二氯甲烷稀释，并且将有机相用饱和的碳酸氢钠溶液、5％浓度的硫酸氢钾溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在biotageisolera(硅胶，柱50gsnap，流速66ml/min，环己烷/乙酸乙酯)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到402.0mg(理论值的41％)化合物3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.38min；ms(esipos):m/z＝424[m+h]⁺。

首先将400.0mg(0.94mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-{[(甲基磺酰基)氧基]甲基}吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入5.0mldmf中，加入98.2mg(1.51mmol)叠氮化钠。将反应混合物在40℃下搅拌10h。然后再加入30.7mg(0.47mmol)叠氮化钠，并将该混合物在40℃下再搅拌10h。加入乙酸乙酯，并且将有机相用水反复洗涤。用硫酸镁干燥有机相后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到309.5mg(理论值的89％)化合物3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝1.50min；ms(esipos):m/z＝371[m+h]⁺。

将250mg(0.68mmol)3-(叠氮基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于10.0ml乙酸乙酯/乙醇(1:1)中，加入25.0mg在活性炭上的靶(10％)。在rt和标准压力下，将混合物用氢气氢化8h。通过celite^(r)过滤反应物，并将滤饼用乙酸乙酯充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到226.2mg(理论值的82％)化合物3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝345[m+h]⁺。

715.0mg(2.08mmol)3-(氨基甲基)-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯溶于15.0mlthf中，并且加入2.28ml(2.28mmol)tbaf溶液(1m，在thf中)。将反应混合物在rt下搅拌过夜。减压蒸发溶剂，残余物(1.54g)不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.41min；ms(esipos):m/z＝231[m+h]⁺。

首先将1.54g(4.88mmol)3-(氨基甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入1,4-二噁烷中，加入541.8mg(4.88mmol)氯化钙(无水)和488.6mg(4.88mmol)碳酸钙，并且剧烈搅拌混合物。然后加入592.8mg(5.86mmol)三乙胺和1.52g(5.86mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮，并且将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入644.9mg(10.7mmol)hoac和乙酸乙酯。有机相用水洗涤两次，用饱和nacl溶液洗涤一次。用硫酸镁干燥后，减压蒸发溶剂，并且将残余物在硅胶(流动相：二氯甲烷/甲醇＝100:1)上纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到346.9mg(理论值的19％)化合物3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝375[m+h]⁺。

首先将804.0mg(2.15mmol)3-(羟甲基)-4-[({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)甲基]吡咯烷-1-羧酸叔丁酯加入20.0ml氯仿和20.0ml0.05n碳酸钾/0.05n碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入59.7mg(0.22mmol)氯化四正丁基铵，然后加入429.9mg(3.22mmol)n-氯代琥珀酰亚胺和33.5mg(0.22mmol)tempo，并且将反应混合物在rt下剧烈搅拌过夜。将有机相分离出来并减压移除溶剂。残余物通过硅胶(流动相：环己烷/乙酸乙酯＝3:1)色谱分离。得到517.0mg(理论值的46％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝373[m+h]⁺。

中间体l30

3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-甲酰基吡咯烷-1-羧酸叔丁酯

立体异构体的混合物

首先将250.0mg(0.72mmol)3-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-4-(羟甲基)吡咯烷-1-羧酸叔丁酯(该化合物根据wo2006/100036的文献方法制备)加入12.5ml二氯甲烷/dmso(4:1)中，并加入219.6mg(2.17mmol)三乙胺。在2℃下，每次一点地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在2℃下搅拌3h。再每次一点地加入345.5mg(2.17mmol)三氧化硫-吡啶复合体，并将混合物在rt下搅拌17h。将反应混合物在二氯甲烷和水之间分配。将水相用二氯甲烷萃取三次，将合并的有机相用水洗涤一次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤(薄层色谱法：石油醚/乙酸乙酯7:3)。

中间体l31

{[(叔丁氧基羰基)氨基]甲基}丙二酸二叔丁酯

将57.2g(488.27mmol)氨基甲酸叔丁酯、51.2ml(683.57mmol)37％浓度的甲醛水溶液和25.9g(244.13mmol)碳酸钠加入到600ml水中。加热混合物直至形成溶液，然后在rt下搅拌16h。用500ml二氯甲烷萃取所形成的悬液，分离出有机相，用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸钠干燥。将混合物在旋转蒸发器上浓缩并将残余物在高真空下干燥，得到结晶固体。将残余物溶于1000ml无水thf中，并在rt下逐滴加入322ml(3.414mol)乙酸酐和138ml(1.707mol)吡啶的混合物。将反应混合物在rt下搅拌16h，然后在旋转蒸发器上浓缩(在室温下水浴)。将残余物溶于乙醚中，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤三次，并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。有机相用硫酸钠干燥并在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥2天。将残余物溶于2000ml无水thf中，并在冰冷却下加入456ml(456.52mmol)1m叔丁醇钾的thf溶液。将混合物在0℃下搅拌20min，然后滴加溶于200ml无水thf中的100.8g(456.52mmol)丙二酸二叔丁酯。将混合物在rt下搅拌48h，然后加入水。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并溶于500ml乙酸乙酯中。混合物用500ml水和100ml饱和氯化钠溶液洗涤，并且将有机相用硫酸钠干燥。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。通过硅胶过滤(流动相：环己烷/乙酸乙酯，梯度＝30:1→5:1)纯化残余物。得到37.07g(理论值的22％)目标化合物。

lc-ms(方法6):rt＝2.87min；ms(esipos):m/z＝346[m+h]⁺。

中间体l32

[3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将37.0g(107.11mmol)(乙酰氧基甲基)丙二酸二叔丁酯溶于1000ml无水thf中，在冰冷却下滴加535.5ml(1071.10mmol)2m硼氢化锂的thf溶液。逐滴加入19.3ml(1071.10mmol)水，并将混合物在rt下搅拌4.5h。将反应混合物在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。将残余物溶于1500ml乙酸乙酯中，加入100ml水，并将混合物在水冷(稍微放热的)下搅拌30min。分离出有机相，并且将水相用500ml乙酸乙酯萃取两次。有机相在旋转蒸发器上浓缩，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.7g(理论值的94％)目标化合物。

lc-ms(方法6):rt＝1.49min；ms(eipos):m/z＝106[m-c5h8o2]⁺。

中间体l33

[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯

将20.00g(97.44mmol)(3-羟基-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于1000ml无水二氯甲烷中，然后在rt下加入6.63g(97.44mmol)咪唑和16.16g(107.18mmol)叔丁基(氯)二甲基硅烷。将反应混合物在rt下搅拌16h，并用半浓缩的氯化钠溶液洗涤。水相用乙酸乙酯萃取，并且将合并的有机相用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到28.50g(理论值的92％)目标化合物。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6h),0.86(s,9h),1.37(s,9h),1.58-1.73(m,1h),2.91(q,2h),3.33-3.36[m,(2h,hidden)],3.53-3.58(m,2h),6.65-6.72(m,1h).

中间体l34

(3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-甲酰基丙基)氨基甲酸叔丁酯

将12.65g(39.591mmol)[3-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-2-(羟甲基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶于200ml二氯甲烷中，并在rt下逐滴加入19.31g(45.53mmol)溶于150ml二氯甲烷中的dess-martin过碘烷。将混合物在rt下搅拌2h，然后加入250ml半浓缩的碳酸氢钠溶液和250ml10％浓度的硫代硫酸钠溶液，将混合物搅拌20min。分离出有机相，水相用乙酸乙酯萃取。将合并的有机相用300ml水洗涤，用硫酸钠干燥，在旋转蒸发器上浓缩并在高真空下干燥。得到11.35g(理论值的90％)目标化合物。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.02(s,6h),0.84(s,9h),1.36(s,9h),1.48-1.51(m,1h),3.08-3.32[m,(1h,hidden)],3.50-3.58(m,2h),3.81-3.91(m,1h),6.71(t,1h),9.60(d,1h).

中间体l35

(3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯

标题化合物是根据文献(例如jeanbastideetal.j.med.chem.2003,46(16),3536-3545)中已知的方法制备。

中间体l36

n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

将100mg(0.57mmol)n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸溶于4.0mldmf中，加入0.08ml(0.57mmol)三乙胺。然后加入199.0mg(0.57mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸和0.08ml(0.57mmol)三乙胺。将混合物在rt下搅拌48h。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/含0.1％tfa的水)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到75.7mg(理论值的33％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.69min；ms(esipos):m/z＝409[m+h]⁺。

中间体l37

l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

将75.7mg(0.19mmol)中间体l36悬浮于25ml水/乙醇/thf中，加入7.5mg在活性炭上的钯(10％)，将混合物在rt下用在标准压力下的氢气氢化4.5h。滤出催化剂，减压移除反应混合物中的溶剂并在高真空下干燥。将残余物不经进一步纯化即用于下一步。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。得到64.9mg(理论值的93％)的标题化合物。

lc-ms(方法6):rt＝0.25min；ms(esipos):m/z＝275[m+h]⁺。

中间体l38

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

首先将38.3mg(0.14mmol)中间体l37加入3.0mldmf中，并加入96.4mg(0.14mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺和39.0μl(0.28mmol)三乙胺。将混合物在rt下搅拌过夜。然后加入16.0μl(0.28mmol)hoac，将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到58.9mg(理论值的45％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.61min；ms(esipos):m/z＝849[m+h]⁺。

中间体l39

(2-硫烷基乙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

首先将300mg(2.64mmol)2-氨基乙硫醇盐酸盐(1:1)加入3.0ml二氯甲烷中，加入668.0mg(6.60mmol)三乙胺和719.1mg(2.77mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮。将混合物在rt下搅拌2天(通过薄层色谱监测：二氯甲烷/甲醇＝100:1.5)。加入乙酸乙酯，并将反应混合物用水洗涤三次。有机相用饱和nacl溶液洗涤两次并用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。该化合物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

中间体l40

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸

将600mg(1.58mmol)n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/thf(1:1:0.5)中用在活性炭上的靶(10％)，在rt和标准压力下用氢气氢化。化合物n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.99min；ms(esipos):m/z＝247[m+h]⁺。

将180.0(0.73mmol)n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸溶于5.0mldmf中，并加入74.0mg(0.73mmol)加入三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌3.5h。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝480[m+h]⁺。

将272.2mg(0.57mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸溶于20ml乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)中，加入27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和rt下用氢气氢化。混合物通过celite^(r)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.53min；ms(esipos):m/z＝346[m+h]⁺。

将30.0mg(0.07mmol)l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸和46.1mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶于1.5mldmf中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到55.6mg(理论值的90％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.77min；ms(esipos):m/z＝920[m+h]⁺。

中间体l41

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸

将600mg(1.58mmol)n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸在25.0ml水/乙醇/thf(1:1:0.5)中用在活性炭上的钯(10％)在rt和标准压力下用氢气氢化。化合物n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.99min；ms(esipos):m/z＝247[m+h]⁺。

将180.0(0.73mmol)n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸溶于5.0mldmf中，并加入74.0mg(0.73mmol)三乙胺。加入254.6mg(0.73mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯和74.0mg(0.73mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌3.5h。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化反应混合物。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到294.1mg(理论值的76％)化合物n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝480[m+h]⁺。

将272.2mg(0.57mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸溶于20.0ml乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)中,加入27.2mg在活性炭上的钯，将混合物在标准压力和rt下用氢气氢化。将混合物经celite^(r)过滤，滤饼用乙酸乙酯/乙醇/thf(1:1:1)充分洗涤。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到182.0mg(理论值的72％)化合物l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.53min；ms(esipos):m/z＝346[m+h]⁺。

将30.0mg(0.07mmol)l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸和34.3mg(0.07mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶于1.5mldmf中，加入6.8mg(0.07mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到40.6mg(理论值的82％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.73min；ms(esipos):m/z＝744[m+h]⁺。

中间体l42

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

首先将50.0mg(0.18mmol)l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸(中间体l37)加入到dmf中，加入93.6mg(0.18mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和36.9mg(0.37mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入21.9mg(0.37mmol)hoac，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到20.6mg(理论值的14％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.55min；ms(esipos):m/z＝673[m+h]⁺。

中间体l43

n-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸

首先将11.3mg(0.04mmol)l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸(中间体l37)加入dmf中，并加入50.0mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{63-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-63-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36,39,42,45,48,51,54,57,60-二十氧杂六十三烷-1-基}丙酰胺和8.3mg(0.08mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入4.9mg(0.08mmol)hoac，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的20％)的标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝1377[m+h]⁺。

中间体l44

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸

将73.3mg(0.39mmol)l-缬氨酰基-l-丙氨酸溶于7.0mldmf中，加入200.0mg(0.39mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺和78.8mg(0.78mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到103.3mg(理论值的45％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.58min；ms(esipos):m/z＝587[m+h]⁺。

中间体l45

(2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸叔丁酯

将2.00g(7.26mmol)n-(叔丁氧基羰基)-l-高丝氨酸叔丁酯溶于90ml二氯甲烷中，然后加入1.76ml吡啶和4.62g(10.90mmol)1,1,1-三乙酰氧基-1λ⁵,2-苯碘酰基-3(1h)-酮(dess-martin过碘烷)。将反应物在rt下搅拌2h，然后用200ml二氯甲烷稀释，用10％浓度的硫代硫酸钠溶液萃取两次，然后连续用5％浓度的柠檬酸萃取两次，用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。分离出有机相，用硫酸钠干燥，然后减压浓缩。将100ml乙醚和环己烷(v/v＝1:1)加入到残余物中，结果形成白色沉淀。抽吸过滤。将滤液在旋转蒸发器上浓缩，并在高真空下干燥，得到1.74g(理论值的88％)目标化合物，其为浅黄色油状物。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝274[m+h]⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.38(s,18h),2.64-2.81(m,2h),4.31-4.36(m,1h),7.23(d,1h),9.59(s,1h).

中间体l46

三氟乙酸/n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]-l-谷氨酸叔丁酯(1:1)

标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在edc/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将200mg(0.79mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)与263mg(0.87mmol)(4s)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸/三氟乙酸(1:1)偶联，然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌1h将氨基脱保护。从乙腈/水中冻干，经2步得到85mg(理论值的20％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.37min；ms(esipos):m/z＝326[m+h]⁺。

中间体l47

三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过将中间体l8与n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯偶联，随后用tfa脱保护来制备。

lc-ms(方法3):rt＝1.36min；ms(esipos):m/z＝488(m+h)⁺。

中间体l48

三氟乙酸/(1r,2s)-2-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

以与中间体l2类似的方式，由可商购的(1r,2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸制备标题化合物。

lc-ms(方法3):rt＝1.22min；ms(esipos):m/z＝252(m+h)⁺。

中间体l49

三氟乙酸/n-(溴乙酰基)-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-l-赖氨酸叔丁基酯(1:1)

标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，在二氯甲烷中偶联可商购的溴乙酸酐，然后是部分受保护的肽l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸叔丁酯(按照肽化学的经典方法制备)。然后在温和条件下通过在10％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌在氨基上进行脱保护，经2步得到标题化合物，产率为49％。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝593和595(m+h)⁺。

中间体l50

三氟乙酸/(1s,3r)-3-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由可商购的(1s,3r)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下用hatu偶联，并随后用tfa脱保护。

hplc(方法11):rt＝0.2min；

lc-ms(方法3):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝252(m+h)⁺。

中间体l51

三氟乙酸/(1r,3r)-3-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由可商购的(1r,3r)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下用hatu偶联，并随后用tfa脱保护。

lc-ms(方法3):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝250(m-h)^-.

中间体l52

三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-溴乙酰胺(1:1)

将420mg(2.62mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于50ml二氯甲烷中，加入817mg(3.15mmol)溴乙酸酐和913μl(5.24mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应在rt下搅拌1h，然后减压浓缩。残余物经制备型hplc纯化。

得到577mg受保护的中间体，然后将其溶入50ml二氯甲烷中，并加入10ml三氟乙酸。在rt下搅拌1h后，将反应减压浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干。得到705mg(理论值的65％)的标题化合物。

lc-ms(方法3):rt＝0.34min；ms(esipos):m/z＝181和183(m+h)⁺。

中间体l53

三氟乙酸/(1s,3s)-3-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由可商购的(1s,3s)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下用hatu偶联，并随后用tfa脱保护。

hplc(方法11):rt＝0.19min；

lc-ms(方法3):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝250(m-h)^-.

中间体l54

三氟乙酸/(1r,3s)-3-氨基-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷羧酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由可商购的(1r,3s)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸和同样可商购的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)来制备，即通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下用hatu偶联，随后用tfa脱保护。

lc-ms(方法3):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝252(m+h)⁺。

中间体l55

三氟乙酸/n⁶-d-丙氨酰基-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸叔丁酯(1:1)

标题化合物是通过以下步骤制备：首先在存在hatu的情况下将中间体l6与n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸偶联，随后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌90min在氨基上进行脱保护。

hplc(方法11):rt＝1.35min；

lc-ms(方法1):rt＝0.67min；ms(esipos):m/z＝637(m+h)⁺。

中间体l56

三氟乙酸/叔丁基-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1r,3s)-3-氨基环戊基]羰基}-l-赖氨酸酯(1:1)

标题化合物通过以下步骤制备：首先在存在hatu的情况下将中间体l6与(1r,3s)-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷羧酸偶联，然后在温和条件下通过在25％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌15min来在氨基上进行脱保护。

hplc(方法11):rt＝1.4min；

lc-ms(方法1):rt＝0.7min；ms(esipos):m/z＝677(m+h)⁺。

中间体l57

(2s)-4-氧代-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸甲酯

首先将500.0mg(2.72mmol)l-天冬氨酸甲酯盐酸盐和706.3mg(2.72mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入5.0ml1,4-二噁烷中，并加入826.8mg(8.17mmol)三乙胺。将反应混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到583.9mg(理论值的74％)化合物(3s)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esineg):m/z＝290(m-h)^-.

首先将592.9mg(3s)-4-甲氧基-4-氧代-3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酸加入10.0ml1,2-二甲氧基乙烷中，将混合物冷却至-15℃，加入205.8mg(2.04mmol)4-甲基吗啉和277.9mg(2.04mmol)氯甲酸异丁酯。15min后通过抽滤滤出沉淀物，用10.0ml1,2-二甲氧基乙烷(在每种情况下)进行两次。将滤液冷却至-10℃，剧烈搅拌下加入溶于10ml水中的115.5mg(3.05mmol)硼氢化钠。分离各相，有机相用饱和碳酸氢钠溶液和饱和nacl溶液洗涤(在每种情况下)一次。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到515.9mg(理论值的91％)化合物n-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-高丝氨酸甲酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝278(m+h)⁺。

将554.9mg(2.00mmol)n-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-高丝氨酸甲酯加入30.0ml二氯甲烷中，并加入1.27g(3.0mmol)dess-martin过碘烷和474.7mg(6.00mmol)吡啶。将混合物在rt下搅拌过夜。4h后，反应用二氯甲烷稀释，并且将有机相用10％浓度的na2s2o3溶液、10％浓度的柠檬酸溶液和饱和碳酸氢钠溶液洗涤(在每种情况下)三次。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。得到565.7mg(理论值的97％)的标题化合物。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.03(s,9h),0.91(m,2h),2.70-2.79(m,1h),2.88(dd,1h),3.63(s,3h),4.04(m,2h),4.55(m,1h),7.54(d,1h),9.60(t,1h).

中间体l58

(3-氧代丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

将434.4mg(5.78mmol)3-氨基-1-丙醇和1.50g(5.78mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-羧酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯溶于10.0ml二氯甲烷中，加入585.3mg(5.78mmol)三乙胺，并且将混合物在rt下搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后用硫酸镁干燥。减压蒸发溶剂。残余物(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(996.4mg，理论值的79％)在高真空下干燥，不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

首先将807.0mg(3.68mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯加入15.0ml氯仿和15.0ml0.05n碳酸钾/0.05n碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入102.2mg(0.37mmol)四正丁基氯化铵、736.9mg(5.52mmol)n-氯代琥珀酰亚胺和57.5mg(0.37mmol)tempo，并将反应混合物在rt下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和nacl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤(890.3mg)。

中间体l59

三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)

首先将300.0mg(0.91mmol)(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙基)氨基甲酸叔丁酯加入二氯甲烷中，加入4.2g(36.54mmol)tfa并将混合物在rt下搅拌1h(通过tlc监测：二氯甲烷/甲醇10:1)。减压蒸发挥发性组分，并且将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏四次。将残余物在高真空下干燥，并且不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

lc-ms(方法1):rt＝0.19min；ms(esipos):m/z＝229(m+h)⁺。

中间体l60

6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰氯

将200.0mg(0.95mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸溶于4.0ml二氯甲烷中，加入338.0mg(2.84mmol)亚硫酰氯。将反应混合物在rt下搅拌3h，然后加入1滴dmf。将混合物再搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷共蒸馏三次。粗产物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

中间体l61

三氟乙酸/n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

首先，肽衍生物l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸制备(用edci/dmap与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解，在存在hatu的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联并再一次氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)已酸在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联来制备。然后在温和条件下通过在5％浓度的三氟乙酸的dcm溶液中在rt下搅拌2.5h，在保留酯保护基的情况下，在氨基上进行脱保护。后处理并通过制备型hplc纯化，得到438mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.69min；

lc-ms(方法1):rt＝0.78min；ms(esipos):m/z＝610(m+h)⁺。

中间体l62

三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-l-赖氨酸酯(1:1)

首先，n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯是根据肽化学的经典方法由n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸制备。然后在存在195mg(0.51mmol)hatu和149μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将148mg(0.43mmol)该中间体与200mg(0.43mmol)中间体l16偶联。在浓缩并通过制备型hplc纯化残余物后，将受保护的中间体溶于20mldcm中，通过加入2ml三氟乙酸并在rt下搅拌1h移除叔丁氧基羰基保护基。将残余物浓缩并从乙腈/水中冻干，得到254mg(经2步的理论值的63％)。

hplc(方法11):rt＝1.51min；

lc-ms(方法1):rt＝0.68min；ms(esipos):m/z＝696(m+h)⁺。

中间体l63

(4s)-4-{[(2s)-2-{[(2s)-2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基}-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸

首先，肽衍生物(4s)-4-{[(2s)-2-{[(2s)-2-氨基-3-甲基丁酰基]氨基}丙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸是根据肽化学的经典方法由(2s)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备(用edci/dmap与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除boc保护基，在存在hatu的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联，并在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解)。标题化合物是通过将该部分保护的肽衍生物与可商购的

1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮偶联来制备。后处理并通过制备型hplc纯化，得到601mg标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝611(m+h)⁺。

中间体l64

(4s)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-5-氧代-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]戊酸

标题化合物是根据肽化学的经典方法由(2s)-5-(苄氧基)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸制备(用edci/dmap与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，用三氟乙酸移除boc保护基，在甲醇中在10％在活性炭上的钯上氢解裂解苄基酯，在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮偶联)。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝385(m+h)⁺。

中间体l65

三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-l-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

标题化合物是根据肽化学的经典方法由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酸制备(用edci/dmap与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除boc保护基)。得到373mg(经2步的理论值的79％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.72min；ms(esipos):m/z＝339(m+h)⁺。

中间体l66

(8s)-8-(2-羟乙基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-甲酯

首先将1000mg(2.84mmol)(3s)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸加入10ml1,2-二甲氧基乙烷中，加入344.4mg(3.4mmol)的4-甲基吗啉和504mg(3.69mmol)氯甲酸异丁酯。在rt下搅拌10min后，将反应物冷却至5℃，在剧烈搅拌下每次一点地加入溶于3ml水中的161mg(4.26mmol)硼氢化钠。1h后，再次加入等量的硼氢化钠，然后将反应物缓慢升温至rt。加入170ml水，然后将反应物用200ml乙酸乙酯萃取(在每种情况下)四次。分离各相，有机相用柠檬酸洗涤一次，然后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到760mg(理论值的78％)化合物[(2s)-4-羟基丁烷-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝339(m+h)⁺。

将760mg(2.16mmol)溶于13ml氯化氢/二噁烷中的该中间体在rt下搅拌20min。然后将反应浓缩至5ml，并且加入乙醚。滤出沉淀物并从乙腈/水1:1中冻干。

将以该方式获得的产物溶于132mldmf中，加入345.5mg(2.35mmol)4-甲氧基-4-氧代丁酸，加入970mg(2.55mmol)hatu和1025μln,n-二异丙基乙胺。将混合物在rt下搅拌5min。减压移除溶剂，并且将剩余的残余物通过制备型hplc纯化。将适当的级分合并，并且减压蒸发乙腈。剩余的水相用乙酸乙酯萃取两次，然后浓缩有机相并在高真空下干燥。

将以该方式获得的中间体溶于甲醇中，并在10％在活性炭上的钯上在rt和氢气标准压力下氢化1h。然后滤出催化剂，并且减压移除溶剂。

将247mg该脱保护的化合物溶于20mldmf中，并加入352mg(1.36mmol)1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮和592μln,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在rt下搅拌1h，然后浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。然后减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。经过这5个反应步骤得到218mg标题化合物，总产率为21％。

lc-ms(方法1):rt＝0.74min；ms(esipos):m/z＝363(m+h)⁺。

中间体l67

三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基-β-丙氨酸酯(1:1)

标题化合物是通过以下方式由50mg(0.354mmol)可商购的1-(2-羟基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮来制备，即通过在存在1.5个当量的edci和0.1个当量的4-n,n-二甲基氨基吡啶的情况下，与在10ml二氯甲烷中的134mg(0.71mmol)n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，然后用三氟乙酸脱保护。

产量：56mg(经过2个阶段的理论值的48％)

lc-ms(方法3):rt＝1.15min；ms(esipos):m/z＝213(m+h)⁺。

中间体l68

三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰胺(1:1)

以与中间体l1类似的方式，根据肽化学的经典方法由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酸和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯制备标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝212(m+h)⁺。

中间体l69

三氟乙酸/1-[(苄氧基)羰基]哌啶-4-基-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸酯(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由可商购的4-羟基哌啶-1-羧酸苄酯制备，即通过使用edci/dmap与n2-(叔丁氧基羰基)-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸来酯化，随后用tfa移除boc，然后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与n-[(叔丁氧基)羰基]-l-缬氨酸偶联，最后再次用tfa移除boc。

lc-ms(方法1):rt＝0.62min；ms(esipos):m/z＝492(m+h)⁺。

中间体l70

9h-芴-9-基甲基(3-氧代丙基)氨基甲酸酯

首先将1000.0mg(3.36mmol)(3-羟基丙基)氨基甲酸9h-芴-9-基甲基酯加入15.0ml氯仿和15.0ml0.05n碳酸钾/0.05n碳酸氢钠溶液(1:1)中。然后加入93.5mg(0.34mmol)四正丁基氯化铵、673.6mg(5.04mmol)n-氯代琥珀酰亚胺和52.5mg(0.34mmol)tempo，并将反应混合物在rt下剧烈搅拌过夜。反应混合物用二氯甲烷稀释，有机相用水和饱和的nacl溶液洗涤。有机相用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。将残余物在高真空下干燥并在硅胶上纯化(流动相：环己烷/乙酸乙酯3:1-1:1)。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到589.4mg(理论值的58％)的标题化合物。

lc-ms(方法6):rt＝2.15min；ms(esipos):m/z＝296(m-h)⁺。

中间体l71

[4-(氯羰基)苯基]氨基甲酸叔丁酯

首先将100.0mg(0.42mmol)4-[(叔丁氧基羰基)氨基]苯甲酸加入2.0ml二氯甲烷中，加入64.2mg(0.51mmol)草酰二氯(oxalyldichloride)。将反应混合物在rt下搅拌30min(通过tlc监测：二氯甲烷/甲醇)。然后再加入192.6mg(1.53mmol)草酰二氯和1滴dmf，并将混合物在rt下搅拌1h。减压蒸发溶剂，并且将残余物与二氯甲烷反复共蒸馏。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。

中间体l72

(9s)-9-(羟甲基)-2,2-二甲基-6,11-二氧代-5-氧杂-7,10-二氮杂-2-硅杂十四烷-14-酸苄基酯

标题化合物是根据肽化学的经典方法，通过以下方式由可商购的[(2s)-3-羟基丙-1,2-二基]二氨基甲酸苄基叔丁酯制备，即通过氢解移除z保护基，随后在存在edci/hobt的情况下与4-(苄氧基)-4-氧代丁酸偶联，然后用tfa移除boc保护基，最后通过在存在三乙胺的情况下与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝425[m+h]⁺。

中间体l73

n-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺

将395.5mg(1.87mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸、1.21g(9.36mmol)n,n-二异丙基乙胺和854.3mg(2.25mmol)mmol)hatu加入到300mg(1.87mmol)(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯在20ml二甲基甲酰胺中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌5min。浓缩混合物后，将残余物溶解在dcm中并用水洗涤。有机相用盐水洗涤，用硫酸镁干燥，过滤并浓缩。得到408mg(33％，纯度53％)的标题化合物，其不经进一步纯化即使用。

lc-ms(方法1):rt＝0.75min；ms(esipos):m/z＝354(m+h)⁺。

将1mltfa加入到(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(408mg，0.365mmol)在7ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌0.5h。将反应混合物减压浓缩并将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏两次。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到384mg(94％，纯度57％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.26min；ms(esipos):m/z＝254(m+h)⁺。

中间体l74

3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸

将107mg(0.335mmol)3-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯和93mg(0.369mmol)2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯溶于5ml二甲基甲酰胺中，加入0.074ml(0.671mmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到133mg(86％，纯度100％)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.82min；ms(esipos):m/z＝459(m+h)⁺。

将0.5mltfa加入到3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸叔丁酯(130mg，0.284mmol)在5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到102mg(90％，纯度100％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.52min；ms(esipos):m/z＝402(m+h)⁺。

中间体l75

三氟乙酸/3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(1:1)

标题化合物是根据肽化学的经典方法，由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸制备(用edci/dmap与2-(三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，并用三氟乙酸移除boc保护基)。得到405mg(经2步的理论值的58％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.75min；ms(esipos):m/z＝339(m+h)⁺。

中间体l76

(2s)-2-溴-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸

首先，由(3s)-4-(苄氧基)-3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-4-氧代丁酸根据肽化学的经典方法制备适当受保护的天冬氨酸衍生物(用edci/dmap与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，并氢解移除z保护基和苄基酯)。

将以该方式得到的470mg(1.8mmol)(2s)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸悬浮于10ml水中，加入1.8ml1摩尔浓度的盐酸和0.5ml浓硫酸，然后加入863mg(7.25mmol)溴化钾。然后在10℃下，经30min逐滴加入150mg(2.175mmol)亚硝酸钠在1ml水中的溶液，并将混合物在10-15℃下搅拌2h。然后用50ml乙酸乙酯萃取混合物。有机相用饱和氯化钠溶液洗涤并用硫酸镁干燥。蒸发溶剂并通过制备型hplc纯化产物，得到260mg(理论值的48％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esineg):m/z＝295和297(m-h)^-.

¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ[ppm]＝0.03(s,9h),0.95(t,2h),2.94and3.2(2dd,2h),4.18(t,2h),4.57(t,1h).

中间体l77

三氟乙酸/n-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-溴乙酰胺(1:1)

首先将418mg(2.05mmol)[2-(2-氨基乙氧基)乙基]氨基甲酸叔丁酯与638mg(2.46mmol)溴乙酸酐反应，然后用三氟乙酸移除boc保护基。得到551mg(理论值的63％)的标题化合物。

lc-ms(方法):rt＝0.32min；ms(esipos):m/z＝227和225(m+h)⁺。

中间体l78

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸

标题化合物是通过以下方式由可商购的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸制备，即通过在存在edci/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下与β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)偶联，随后用三氟乙酸脱保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.32min；ms(esipos):m/z＝227(m+h)⁺。

中间体l79

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸

将64.8mg(0.357mmol)β-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)和100mg(0.324mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}1h-吡咯-2,5-二酮溶于4ml二甲基甲酰胺中，加入65.6mg(0.649mmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到84.5mg(77％，纯度100％)n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.78min；ms(esipos):m/z＝339(m+h)⁺。

将1.62mltfa加入到n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸叔丁酯(82.8mg，0.244mmol)在8ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到62.7mg(87％，纯度95％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.75min；ms(esipos):m/z＝283(m+h)⁺。

中间体l80

3-[(15-氨基-4,7,10,13-四氧杂十五烷-1-酰基)氨基]-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯

标题化合物是根据肽化学的经典方法由可商购的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸/n-环己基环己胺(1:1)制备(从盐中释放，并用edci/dmap与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇来酯化，氢解移除z保护基，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与可商购的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸偶联，再次氢解移除z保护基)。

lc-ms(方法1):rt＝0.70min；ms(esipos):m/z＝552(m+h)⁺。

中间体l81

三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄基酯(1:1)

在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，将250mg(1.11mmol)2,2'-磺酰基二乙胺与92.3mg(0.37mmol)1-{[(苄氧基)羰基]氧基}吡咯烷-2,5-二酮在dmf中偶联。随后通过hplc纯化，得到70mg(理论值的47％)的标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝0.64min；ms(esipos):m/z＝257.11(m+h)⁺。

中间体l82

三氟乙酸/n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)

将88.6mg(0.357mmol)n-boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺和100mg(0.324mmol)6-马来酰亚胺基己酸n-琥珀酰亚胺酯溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.071ml(0.650mmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入0.048ml(0.838mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125×30；10μ，流速：75ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到127mg(理论值的81％){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.78min；ms(esipos):m/z＝442(m+h)⁺。

将2.0mltfa加入123mg(225μmol){2-[2-(2-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯在7.5ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌2h。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到111mg(理论值的100％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.31min；ms(esipos):m/z＝342(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2h),1.47(m,4h),2.04(m,2h),2.98(m,2h),3.19(m,2h),3.39(m,4h),3,56(m,6h),7.01(s,2h),7.72(bs,3h),7.80(m,1h).

中间体l83

三氟乙酸/n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)

将200mg(0.805mmol){2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯、150mg(0.966mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸和560μl(3.2mmol)n,n-二异丙基乙胺溶于10ml二甲基甲酰胺中，加入459mg(1.21mmol)hatu。将反应混合物在rt下搅拌30min。减压蒸发溶剂，并且将残余物溶于二氯甲烷。有机相用5％柠檬酸溶液洗涤两次，用硫酸镁干燥，并且减压蒸发溶剂。使用biotageisolera(硅胶，柱25gsnap，二氯甲烷:甲醇98:2)纯化残余物。得到276mg(理论值的89％){2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.67min；ms(esipos):m/z＝386(m+h)⁺。

将4mltfa加入到{2-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]乙基}氨基甲酸叔丁酯(275mg，714μmol)在15ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌30min。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到281mg(理论值的99％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝286(m+h)⁺。

中间体l84

三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)

将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁酯和202mg(0.654mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮溶于4.0ml二甲基甲酰胺中，加入0.130ml(1.2mmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在rt下搅拌过夜。加入0.085ml(1.5mmol)乙酸，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化反应混合物。减压蒸发溶剂，并且将残余物在高真空下干燥。得到275mg(理论值的73％)[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝530(m+h)⁺。

将780μl(10mmol)tfa加入到[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂二十一烷-1-基]氨基甲酸叔丁酯(268mg，505μmol)在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在rt下搅拌过夜。将反应混合物减压浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到266mg(理论值的97％)的标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.46min；ms(esipos):m/z＝430(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.17(m,2h),1.47(m,4h),2.03(m,2h),2.99(m,2h),3.18(m,2h),3.38(m,4h),3,52(m,8h),3,58(m,6h),7.01(s,2h),7.73(bs,3h),7.80(m,1h).

中间体l85

三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)

将200mg(0.594mmol)(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)氨基甲酸叔丁基酯、111mg(0.713mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸和410μl(2.4mmol)n,n-二异丙基乙胺溶解于6ml二甲基甲酰胺中，并加入339mg(0.892mmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌1h并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到130mg(理论值的43％)[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.71min；ms(esipos):m/z＝474(m+h)⁺。

向[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]氨基甲酸叔丁基酯(126mg，267μmol)在4.0ml二氯甲烷中的溶液中加入410μl(5.3mmol)tfa。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到124mg(理论值的95％)标题化合物。

lc-ms(方法13):rt＝0.74min；ms(esipos):m/z＝374(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝2.99(m,2h),3.22(m,2h),3.41(m,2h),3,53(m,8h),3,58(m,6h),4.02(s,2h),7.09(s,2h),7.73(bs,3h),8.21(m,1h)。

中间体l86

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸

将100mg(0.531mmol)l-缬氨酰基-l-丙氨酸和134mg(0.531mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮溶解于3ml二甲基甲酰胺中，并加入0.150ml(1.1mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌8h。将反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到71.5mg(理论值的41％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.42min；ms(esipos):m/z＝326(m+h)⁺。

中间体l87

3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸

将250mg(1.07mmol)3-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯、151mg(0.974mmol)2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸、224mg(1.46mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和224mg(1.17mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于5.0ml二甲基甲酰胺中。将反应混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次，并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到267mg(理论值的64％)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.73min；ms(esipos):m/z＝371(m+h)⁺。

向3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸叔丁酯(263mg，710μmol)在10ml二氯甲烷中的溶液中加入1.1ml(14mmol)tfa。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到240mg(理论值的94％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝0.57min；ms(esipos):m/z＝315(m+h)⁺。

中间体l88

2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酯

将150mg(0.797mmol)l-缬氨酰基-l-丙氨酸和246mg(0.797mmol)1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮溶解于4.0ml二甲基甲酰胺中，并加入0.220ml(1.6mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到302mg(理论值的97％)n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸。

lc-ms(方法12):rt＝1.02min；ms(esipos):m/z＝382(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.82(dd,6h),1.17(m,2h),1.27(d,3h),1.48(m,4h),1.94(m,1h),2.13(m,2h),3.38(t,2h),4.17(m,2h),7.00(s,2h),7.75(d,1h),8.19(d,1h)。

将130mg(0.531mmol)n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸溶解于6.5ml二氯甲烷中，并加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。再加入58.8mg(0.511mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮和78.4mg(0.409mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐。加入二氯甲烷，并将混合物用水洗涤三次。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到172mg(理论值的87％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.28min；ms(esipos):m/z＝479(m+h)⁺。

中间体l89

1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-l-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)

首先将1.00g(2.96mmol)(4s)-5-(苄氧基)-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸加入到13.0mlthf中，并加入510μl(3.6mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙醇和109mg(889μmol)4-二甲基氨基吡啶。将反应混合物冷却至0℃，并加入682mg(3.56mmol)n-乙基-n'-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶解于乙酸乙酯中。将有机相用0.1n的hcl溶液和饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物使用biotageisolera(硅胶，柱25gsnap，环己烷:乙酸乙酯80:20)纯化。得到649mg(理论值的50％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-n-(叔丁氧基羰基)-l-谷氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝4.6min；ms(esipos):m/z＝438(m+h)⁺。

将649mg(1.48mmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-n-(叔丁氧基羰基)-l-谷氨酸酯溶解于7.0ml二噁烷中，并在冰浴冷却下加入14ml(59mmol)4n的hcl(溶于二噁烷中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物在高真空下干燥并通过biotageisolera(硅胶，柱25gsnap，二氯甲烷:甲醇90:10)纯化。得到320mg(理论值的57％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.79min；ms(esipos):m/z＝338(m+h)⁺。

中间体l90

1-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸

首先将118mg(566μmol)n-[(苄氧基)羰基]甘氨酸加入到5.0mldmf中，加入200mg(622μmol)1-氨基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯、130mg(849μmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和130mg(679μmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，并将混合物在室温下搅拌1h。加入乙酸乙酯，并将混合物用浓度为5％的柠檬酸溶液萃取两次并用饱和碳酸氢钠溶液萃取两次。将有机相用饱和氯化钠溶液洗涤两次并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到274mg(理论值的95％)1-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯。

lc-ms(方法12):rt＝1.69min；ms(esipos):m/z＝513(m+h)⁺。

将820μl(11mmol)tfa加入到274mg(535μmol)1-({n-[(苄氧基)羰基]甘氨酰基}氨基)-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸叔丁酯在5.0ml二氯甲烷中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并且将残余物溶于水中并冻干。得到262mg(理论值的100％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.12min；ms(esipos):m/z＝457(m+h)⁺。

中间体l91

三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基1-{[3-氨基-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酰基]氨基}-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸酯(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由市售的3-氧代-1-苯基-2,7,10,13,16-五氧杂-4-氮杂十九烷-19-酸制备(使用edci/dmap与2-三甲基甲硅烷基乙醇来酯化，氢解除去z保护基团，与市售的n-(叔丁氧基羰基)-3-{[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}-d-丙氨酸偶联，并除去fmoc保护基团)。

lc-ms(方法1):rt＝0.74min；ms(esipos):m/z＝552(m+h)⁺。

中间体l92

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，对市售的n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与l-天冬氨酸叔丁酯进行hatu偶联，随后用三氟乙酸对羧基去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.5min；ms(esipos):m/z＝409(m+h)⁺。

中间体l93

n-乙酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，对市售的n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与l-天冬氨酸叔丁酯进行hatu偶联，随后通过在dcm/甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化而对z保护基团去保护，随后在dmf中在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下用乙酸来乙酰化，最后用三氟乙酸对羧基去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.16min；ms(esipos):m/z＝317(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝1.19(2d,6h),1.82(s,3h),2.5(m,2h),4.26(m,2h),4.48(q,1h),6.9(s,1h),7.36(s,1h),8.0(m,3h),12.54(s,1h)。

中间体l94

n-{4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

首先，通过在存在edci/dmap的情况下，使4-(苄氧基)-4-氧代丁酸与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇在dcm中反应，随后氢解裂解苄基酯来制备4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝217(m-h)^-。

此外，通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf中偶联n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与4-硝基苄基l-天冬氨酸酯氢溴酸盐(1:1)，然后在dcm中用三氟乙酸对氨基去保护来制备三氟乙酸/4-硝基苄基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬氨酸酯(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝0.43min；ms(esipos):m/z＝410(m+h)⁺。

然后通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下在dmf中偶联这两个中间体，然后通过在dcm-甲醇1:9中经活性碳上的钯(10％)氢化而对对硝基苄基酯去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.79min；ms(esipos):m/z＝475(m+h)⁺。

中间体l95

n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸

该中间体是通过肽化学的常规方法由n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸和l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)开始制备。

lc-ms(方法12):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝323.16(m+h)⁺。

中间体l96

n-乙酰基-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺

该中间体是通过肽化学的常规方法制备：由偶联2,5-二氧代吡咯烷-1-基-n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸与n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸开始，随后在乙醇中经10％钯/活性碳氢解裂解z保护基团，最后使所得到的二肽与1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮反应。

lc-ms(方法1):rt＝0.25min；ms(esipos):m/z＝317(m+h)⁺。

中间体l97

1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸

首先将1-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-27-酸叔丁酯(100mg，201μmol)加入到1.0mldmf中，并加入(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸(46.8mg，301μmol)、1-羟基-1h-苯并三唑水合物(76.9mg，502μmol)和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(77.0mg，402μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入乙酸乙酯。将有机相用5％柠檬酸溶液洗涤两次，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤两次并用饱和氯化钠溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的13％)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝635[m+h]⁺

向1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸叔丁酯(19.1mg，30.1μmol)在1.0mldcm中的溶液中加入tfa(62μl，600μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h。将反应混合物在减压下浓缩，并将残余物溶于水中并冻干。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到10.8mg(理论值的46％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.55min；ms(esineg):m/z＝577[m-h]^-。

中间体l98

2,2-二甲基丙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(2-氨基乙基)-n²-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-谷氨酸酯(1:1)

首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，偶联(4s)-5-叔丁氧基-4-[(叔丁氧基羰基)氨基]-5-氧代戊酸与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯。随后，通过溶于dcm中的三氟乙酸，分离boc保护基团和叔丁基酯。然后，首先通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf/水中与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应而再保护氨基，然后通过在存在edci/dmap的情况下，在dcm中与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇反应而再保护羧基。在最后一步中，通过在标准压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)的氢解而对末端氨基去保护。通过过滤除去催化剂，浓缩，通过制备型hplc纯化并将残余物从乙腈/水中冻干后，得到标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.82min；ms(esipos):m/z＝434(m+h)⁺。

中间体l99

三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-β-丙氨酰基-l-赖氨酸酯(1:1)

首先，根据肽化学的经典方法由n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸制备2-(三甲基甲硅烷基)乙基n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸酯。然后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与通过标准方法制备的三肽单元n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-β-丙氨酸偶联。然后通过在甲醇中氢解来除去z保护基团，并在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将获得的中间体与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联。在最后一步中，通过在室温下在10％的三氟乙酸的dmf溶液中搅拌1h而在温和条件下对侧链氨基去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干后，得到标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.64min；ms(esipos):m/z＝625(m+h)⁺。

中间体l100

3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸

向3-氰基丙酸甲酯(4g，35.4mmol)在120ml乙醇中的溶液中加入3.69g(53mmol)羟胺盐酸盐和15ml(110mmol)三乙胺。将反应混合物在50℃下搅拌3h。浓缩混合物，将残余物溶于乙酸乙酯中，然后用水和盐水洗涤。将有机相经硫酸镁干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到5g(理论值的97％)(4z)-4-氨基-4-(肟基)丁酸甲酯。

向(4z)-4-氨基-4-(肟基)丁酸甲酯(4.85g，33.19mmol)在120.0ml二噁烷中的溶液中加入6.91g(36.50mmol)n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸和8.22g(39.82mmol)1,3-二环己基碳二亚胺。将反应混合物在室温下搅拌3h。浓缩混合物，将残余物溶于水中并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过快速色谱法纯化。得到6.0g(理论值的57％)(4e)-4-{[n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯。

将(4e)-4-{[n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯(6.0g，18.9mmol)在100mldmf中的溶液在120℃下搅拌5h。将混合物与水混合并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。得到4g(理论值的71％)3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸甲酯。

向(4e)-4-{[n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酰基]氨基}-4-(肟基)丁酸甲酯(4.00g，13.4mmol)在60mlthf中的溶液中加入lioh(1.60g，66.8mmol)在10ml水中的溶液。将反应混合物在60℃下搅拌过夜。将混合物与水混合并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到3.60g(理论值的87％)3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸。

向3-(5-{2-[(叔丁氧基羰基)氨基]乙基}-1,2,4-噁二唑-3-基)丙酸(2.0g，7.01mmol)在30ml二氯甲烷中的溶液中加入2.0ml(26mmol)三氟乙酸。将反应混合物在室温下搅拌1h。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。残余物不经进一步纯化即使用。得到1.50g(理论值的72％)3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸/三氟乙酸(1:1)。

向3-[5-(2-氨基乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(1.5g，5.01mmol)在25mldmf中的溶液中加入1.30g(5.52mmol)1-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-2-氧代乙基]-1h-吡咯-2,5-二酮和1.52g(15.04mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h。将混合物与水混合并用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸钠干燥并浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。得到774mg(理论值的47％)标题化合物。

¹h-nmr(300mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝2.67(t,2h),2.91(t,2h),3.03(t,2h),3.46(q,2h),4.28(s,2h),7.01(s,2h),8.37(t,1h),12.28(bs,1h)。

中间体l101

l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬氨酸叔丁酯

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，hatu偶联市售的n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与l-天冬氨酸叔丁酯盐酸盐，随后在甲醇中经10％钯/活性碳氢解分离z保护基团。

lc-ms(方法7):rt＝0.23min；ms(esineg):m/z＝329(m-h)^-。

中间体l102

n-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

首先将215mg2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-酸(365μmol)和133mg中间体l101(402μmol)加入到1.4mldmf中，加入146mghatu(384μmol)和160μln,n-二异丙基乙胺(910μmol)，并将混合物在室温下搅拌3h。加入水(1.5ml)和acn(0.5ml)。将反应溶液通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度＝1:9→3:2)纯化，随后在2mldcm中用2mltfa分离丁氧基羰基保护基团(在室温下搅拌3h)。

lc-ms(方法1):rt＝0.56min；ms(esineg):m/z＝844.5(m+h)⁺。

中间体l103

n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下由偶联4-吡啶乙酸与市售的l-丙氨酰基-l-丙氨酸叔丁酯开始，随后用三氟乙酸去保护，与l-天冬氨酸叔丁酯偶联，随后用三氟乙酸对羧基去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.15min；ms(esipos):m/z＝394(m+h)⁺。

中间体l104

n-异烟酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是以与中间体l103类似的方式由偶联异烟酸与市售的l-丙氨酰基-l-丙氨酸叔丁酯开始制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝380(m+h)⁺。

中间体l105

n-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬氨酸叔丁酯三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是以与中间体l103类似的方式由偶联[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸与市售的l-丙氨酰基-l-丙氨酸叔丁酯开始制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.17min；ms(esipos):m/z＝380(m+h)⁺。

中间体l106

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，偶联市售的n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-l-天冬氨酸1-叔丁酯。该氨基酸单元是通过以下方法由(3s)-4-叔丁氧基-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-4-氧代丁酸制备：在存在edci和dmap的情况下，与2-(三甲基甲硅烷基)乙醇酯化，随后通过在dcm中的5％的三氟乙酸溶液温和地除去叔丁氧基羰基保护基团。随后，将745mg(1.317mmol)完全保护的中间体溶解于43.5mldcm中，并通过加入3.5ml三氟乙酸并在室温下搅拌5小时，使叔丁基酯温和地水解。通过制备型hplc纯化后，从所得产物混合物中分离出168mg(理论值的25％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝510(m+h)⁺。

中间体l107

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，对市售的n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与l-天冬氨酸叔丁酯进行hatu偶联，随后通过在dcm/甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化将z保护基团去保护，接着在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf中用1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮酰化，最后通过三氟乙酸对羧基去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.35min；ms(esipos):m/z＝412(m+h)⁺。

中间体l108

n²-乙酰基-n-(2-氨基乙基)-n⁶-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺

标题化合物是通过肽化学的常规方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，对市售的n²-乙酰基-n⁶-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸与(2-氨基乙基)氨基甲酸苄酯盐酸盐(1:1)进行hatu偶联，随后通过在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离z保护基团。

lc-ms(方法1):rt＝0.43min；ms(esipos):m/z＝331(m+h)⁺。

中间体l109

n²-乙酰基-n⁶-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-赖氨酸

该中间体是通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，市售的n²-乙酰基-l-赖氨酸与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮在dmf/水1:1中的反应而获得。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝333(m+h)⁺。

中间体l110

n²-乙酰基-n⁶-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-赖氨酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物的合成是在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，由n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与l-天冬氨酸叔丁酯在dmf中偶联开始，随后通过在标准压力下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离z保护基团。随后，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf中将去保护的中间体与中间体l109偶联。随后通过在7.5％的三氟乙酸在dcm的溶液中搅拌1h而完全去保护。在最后一步中，通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，在dmf/水1:1中与1-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应来再保护自由氨基而制备标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.71min；ms(esipos):m/z＝589(m+h)⁺。

中间体l111

n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-n-甲基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，由n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酸与n-甲基-l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的hatu偶联开始，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与l-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)水解分离z保护基团。最后，通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与4-吡啶乙酸偶联，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.16min；ms(esipos):m/z＝408(m+h)⁺。

中间体l112

n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-n-甲基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，由n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酸与n-甲基-l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的hatu偶联开始，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与l-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)水解分离z保护基团。最后，通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-乙酰氧基吡咯烷-2,5-二酮偶联，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.16min；ms(esipos):m/z＝331(m+h)⁺。

中间体l113

n-甲基-n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，由吡啶-4-基乙酸与n-甲基-l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的hatu偶联开始，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与l-丙氨酸叔丁酯偶联，并在dcm中用三氟乙酸对羧基再次去保护。然后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与l-天冬氨酸叔丁酯进行偶联，最后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护。hplc纯化后，得到标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.16min；ms(esipos):m/z＝408(m+h)⁺。

中间体l114

n-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-l-丙氨酰基-n-甲基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺

标题化合物是通过肽化学的经典方法合成：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，由n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酸与n-甲基-l-丙氨酸叔丁酯盐酸盐(1:1)的hatu偶联开始，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护。随后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与l-天冬氨酸叔丁酯偶联，然后在室温、标准氢气压力下在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)水解分离z保护基团。最后，通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酸偶联，随后在dcm中用三氟乙酸对羧基去保护而将所得到的中间体转化为标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.36min；ms(esipos):m/z＝449(m+h)⁺。

中间体l115

三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-谷氨酸二苄酯(1:1)

标题化合物是通过肽化学的经典方法由市售的4-甲基苯磺酸/l-谷氨酸二苄酯(1:1)开始制备：在存在hatu的情况下与n-(叔丁氧基羰基)-β-丙氨酸偶联，最后用tfa分离boc保护基团。

lc-lc-ms(方法1):rt＝0.72min；ms(esipos):m/z＝399[m+h]⁺

中间体f2

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)

将55mg(0.089mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸(中间体c5)溶于12mldmf中，并连续加入68mg(0.268mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)、34.3mg(0.18mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、27.4mg(0.18mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和47μl(0.27mmol)n,n-二异丙基乙胺。将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残留的残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，从1,4-二噁烷中冻干后，得到20mg(理论值的30％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.48min；

lc-ms(方法1):rt＝1.29min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

将20mg(0.027mmol)该中间体溶于5ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌1h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残留的残余物从乙腈/水1:1中冻干。以这种方式，得到19mg(理论值的95％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝637(m+h)⁺。

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝8.28(t,1h),7.9-8.1(m,3h),7.7-7.8(m,2h),7.2-7.4(m,6h)7.0-7.1(m,3h),5.7(s,1h),5.0和5.3(2d,2h),4.08和4.25(2d,2h),3.3-3.65(m,5h),3.1-3.25(m,2h),0.75和1.45(2m,2h),0.9(s,9h)。

中间体f3

三氟乙酸/n-[(3s)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

将13mg(0.021mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸(中间体c5)溶于5mldmf中，然后加入33mg(86μmol)o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐、15μln,n-二异丙基乙胺和22mg(64μmol)市售的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰肼。将反应混合物在室温下搅拌1h。然后将混合物在高真空下浓缩，并将残留的残余物通过制备型hplc纯化。得到9.5mg(理论值的53％)的保护的中间体，其为无色泡沫状物形式。

hplc(方法11):rt＝2.1min；

lc-ms(方法1):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝822(m+h)⁺。

将9.5mg(0.011mmol)该中间体溶于3ml二氯甲烷中，加入1ml三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌2h。然后将反应混合物在减压下浓缩，并将残留的残余物从乙腈/水1:1中冻干。以这种方式，得到7mg(理论值的70％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.75min；

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝722(m+h)⁺。

中间体f4

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(6-{[(2r)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}己基)丁酰胺(1:1)

首先，以与中间体f3类似的方式，在存在hatu的情况下偶联30mg(0.049mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸(中间体c5)与三氟乙酸/9h-芴-9-基甲基-(6-氨基己基)氨基甲酸酯(1:1)。然后根据标准方法用哌啶除去fmoc保护基团。然后在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，将该胺组分与(2r)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰氯(其使用亚硫酰氯由游离酸制备)偶联。在最后一步中，在dcm中用三氟乙酸除去boc保护基团。得到1.1mg(经四个步骤，3％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.83min；

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝764(m+h)⁺。

中间体f5

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(丙酰基)氨基]-n-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由16mg(0.026mmol)中间体c5和8.5mg(0.03mmol)中间体l12制备。得到3mg(经两个步骤，理论值的13％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝681(m+h)⁺。

中间体f6

三氟乙酸/n-[(16s)-16-氨基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-12,15-二氧代-3,6,9-三氧杂-13,14-二氮杂十八烷-18-基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

将8mg(12.7μmol)三氟乙酸/{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-肼基-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯(1:1)(中间体c6)溶于8mldmf中，并加入6mg(19μmol)市售的3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸、5.8mg(15μmol)o-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-n,n,n',n'-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(hatu)和7μl(38μmol)n,n-二异丙基乙胺。将混合物在室温下搅拌15min。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水1:1中并用三氟乙酸调节至ph2。通过制备型hplc纯化。合并适当的级分，浓缩并从乙腈/水1:1中冻干，得到5mg(理论值的41％)boc-保护的中间体。用三氟乙酸除去boc基团，得到4mg(经两个步骤，理论值的32％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.89min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝812(m+h)⁺。

中间体f7

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由25mg(0.037mmol)中间体c5和35mg(0,112mmol)中间体l1制备。得到14.4mg(经两个步骤，理论值的29％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝694(m+h)⁺。

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝8.2(m,1h),7.9-8.1(m,3h),7.7-7.8(m,2h),7.2-7.4(m,6h),7.0-7.12(m,3h),5.7(s,1h),4.95和5.3(2d,2h),4.1和4.25(2d,2h),4.0(s,2h),3.3-3.65(m,5h),3.0-3.15(m,2h),0.7和1.45(2m,2h),0.88(s,9h)。

中间体f8

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由10mg(0.016mmol)中间体c5与13mg(0.018mmol)中间体l6制备。得到10mg(经两个步骤，理论值的49％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.97min；

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝1006(m+h)⁺。

中间体f9

三氟乙酸/n-{(3s)-3-氨基-4-[1-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)肼基]-4-氧代丁基}-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由1.5mg(0.002mmol)中间体c7与0.95mg(0.004mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)制备。得到1.1mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝709(m+h)⁺。

中间体f10

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由14mg(0.022mmol)中间体c5与10mg(0.025mmol)中间体l5制备。得到4.5mg(经两个步骤，理论值的22％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝756(m+h)⁺。

中间体f11

三氟乙酸/n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)环己烷甲酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由12mg(0.019mmol)中间体c5与10mg(0.021mmol)中间体l4制备。得到7mg(经两个步骤，理论值的38％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.04min；

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝776(m+h)⁺。

中间体f12

三氟乙酸/(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是由43mg(0.071mmol)中间体c5与30mg(0.071mmol)中间体l2制备。在boc-保护的中间体阶段，通过制备型hplc(chromatorexc18-10/125x30/12ml/min)分离形成的非对映异构体。分离的非对映异构体的立体化学是通过与以类似方式由市售的(1s,2r)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备的单个非对映异构体进行比较而指定：

级分1：1s2r非对映异构体

产量：13mg(22％)

hplc(方法11):rt＝2.52min；

lc-ms(方法1):rt＝1.31min；ms(esipos):m/z＝848(m+h)⁺。

级分2：1r2s非对映异构体

产量：10mg(17％)

hplc(方法11):rt＝2.56min；

lc-ms(方法1):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝848(m+h)⁺。

然后用tfa对10mg(0.011mmol)1r2s非对映异构体去保护，得到8mg(理论值的75％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.04min；

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝748(m+h)⁺。

中间体f13

三氟乙酸/(1s,2r)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

所述合成是以与中间体f13类似的方式进行，并且是通过对1s2r非对映异构体去保护而得到标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.1min；

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝748(m+h)⁺。

中间体f14

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过在存在hatu的情况下偶联20mg(0.028mmol)中间体c5与18mg(0.028mmol)中间体l7，随后用tfa去封闭(deblock)而制备。得到15mg(经两个步骤，理论值的49％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.97min；

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝1012(m+h)⁺。

中间体f15

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

该中间体是通过在存在hatu的情况下偶联15mg(0.022mmol)中间体c8与14mg(0.026mmolmmol)中间体l8，随后用tfa去封闭而制备。得到7mg(经两个步骤，理论值的27％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.85min；

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝984(m+h)⁺。

中间体f16

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

首先，以与中间体f3类似的方式，在存在hatu的情况下偶联20mg(0.03mmol)中间体c3与三氟乙酸/β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)(中间体l9)(产量：15mg(理论值的44％))。

将26mg(0.023mmol)该中间体n-{(2s)-4-[(乙酰氧基乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2-甲氧基-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺溶解于5ml甲醇中，加入1ml2m的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌90min。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水中，并将混合物使用tfa调节至ph2。然后将混合物再次浓缩，通过制备型hplc纯化残余物后，得到20mg(81％)羧基化合物。

然后将该中间体溶于5mldmf中，并在存在8.4mg(0.022mmol)hatu和16μln,n-二异丙基乙胺的情况下与6mg(0.022mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型hplc纯化，得到17mg(理论值的76％)保护的中间体。将其溶于3mldcm中，并加入1mltfa。在室温下搅拌45min后，浓缩混合物，并将残余物用乙醚消化。抽滤并将残余物在高真空下干燥，得到15mg(81％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝1097(m+h)⁺。

中间体f17

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

以与中间体f12类似的方式，标题化合物是由6mg(0.01mmol)中间体c5与8mg(0.01mmol)中间体l10制备。在boc-保护的中间体阶段，通过制备型hplc(chromatorexc18-10/125x30/12ml/min)分离形成的非对映异构体。分离的非对映异构体的立体化学是通过与以类似方式由市售的(1s,2r)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备的单个非对映异构体进行比较而指定：

级分1：1s2r非对映异构体

产量：1mg

hplc(方法11):rt＝2.73min；

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝1274(m+h)⁺。

级分2：1r2s非对映异构体

产量：0.7mg

hplc(方法11):rt＝2.81min；

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z＝1274(m+h)⁺。

通过溶解于1mldcm中，加入1mltfa并在室温下搅拌1h而实现0.7mg(0.001mmol)1r2s非对映异构体的完全去保护。在减压下浓缩并将残余物从乙腈/水中冻干，得到0.68mg(理论值的94％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.1min；

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝1117(m+h)⁺。

中间体f18

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1s,2r)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

以与中间体f17类似的方式，标题化合物是由8.9mg(0.014mmol)中间体c5与13mg(0,014mmol)中间体l11制备。

hplc(方法11):rt＝2.2min；

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝1117(m+h)⁺。

中间体f1中间体f19

n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-n²-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是通过将25mg(0.041mmol)中间体c5与55mg(0.122mmol)中间体l13偶联，随后去保护而制备。

hplc(方法11):rt＝1.84min；

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝780(m+h)⁺。

中间体f20

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{4-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]哌嗪-1-基}丁酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是通过将10mg(0.015mmol)中间体c5与55mg(0.122mmol)中间体l14偶联，随后去保护而制备。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝735(m+h)⁺。

中间体f21

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是通过将10mg(0.015mmol)中间体c5与7mg(0.015mmol)中间体l15偶联，随后去保护而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝840(m+h)⁺。

中间体f22

三氟乙酸/n-[(3s)-3-氨基-4-(1-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}肼基)-4-氧代丁基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

以与中间体f9类似的方式，标题化合物是通过将13.7mg(0.017mmol)中间体c7与5.9mg(0.017mmol)中间体l1偶联，随后去保护而制备。

hplc(方法11):rt＝2.3min；

lc-ms(方法1):rt＝1.2min；ms(esipos):m/z＝866(m+h)⁺。

中间体f23

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

以与中间体f2类似的方式，标题化合物是通过在存在edc/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联10mg(0.016mmol)中间体c5与16.8mg(0.016mmol)中间体l17，随后去保护而制备。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝1092(m+h)⁺。

中间体f24

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物的制备是以与中间体f16类似的方式进行：

首先，以与中间体f3类似的方式，在存在hatu的情况下偶联30mg(0.046mmol)中间体c3与中间体l18(产量：25mg(理论值的47％))。

将27mg(0.024mmol)该中间体溶解于5ml甲醇中，加入1ml2m的氢氧化锂溶液，并将混合物在室温下搅拌30min，使得甲基酯和乙酰基均裂解。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于乙腈/水中，并将混合物使用tfa调节至ph2。然后再次浓缩混合物，将残余物通过制备型hplc纯化后，得到15mg(58％)羧基化合物。

然后将该中间体溶于3mldmf中,并在存在6.5mg(0.017mmol)hatu和12μln,n-二异丙基乙胺的情况下与4.4mg(0.017mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。通过制备型hplc纯化，得到12mg(理论值的72％)保护的中间体。将其溶于2mldcm中，加入1mltfa。在室温下搅拌30min后，将混合物浓缩并从乙腈/水1:1中冻干。将残余物在高真空下干燥，得到11mg(91％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝1069(m+h)⁺。

中间体f25

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-(4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}苯基)-l-鸟氨酰胺(1:1)

该中间体是通过在存在6.4mg(0.017mmol)hatu和72μln,n-二异丙基乙胺的情况下偶联9.6mg(0.014mmol)中间体c8与10.8mg(0.015mmol)中间体l19，随后用tfa去封闭而制备。得到5mg(经两个步骤，理论值的31％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.8min；

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝1041(m+h)⁺。

中间体f26

三氟乙酸/n-{(15s,19r)-15-氨基-19-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-18-乙醇酰基-20,20-二甲基-14-氧代-4,7,10-三氧杂-13,18-二氮杂二十一烷-1-酰基}-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

该中间体是通过在存在8mg(0.04mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、6mg(0.04mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和11μl(0.06mmol)n,n-二异丙基乙胺的情况下偶联16.4mg(0.02mmol)中间体c9与11.2mg(0.02mmol)中间体l20，随后用tfa去封闭而制备。得到10mg(经两个步骤，理论值的37％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝1144(m+h)⁺。

中间体f27

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n-[4-(2-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)苯基]-l-赖氨酰胺(2:1)

该中间体是经4步制备：

在第一步中，在存在11mg(0.057mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.7mg(0.057mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和15μl(0.085mmol)n,n-二异丙基乙胺的情况下，在5mldmf中将20mg(0.028mmol)中间体c8与16.7mg(0.031mmol)中间体l21偶联。在室温下搅拌4天后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：18mg(理论值的54.5％)。

将18mg(0.016mmol)该中间体溶解于4ml甲醇中，加入194μl2m的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。然后再加入116μl氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下再搅拌4h。然后在减压下除去溶剂，将残余物溶于水中，然后将反应物用浓度为5％的柠檬酸调节至ph5。将混合物用二氯甲烷萃取两次，并将有机相经硫酸钠干燥。然后将有机相过滤并浓缩，并将残余物在高真空下干燥。得到10.5mg(58％)的羧基化合物。

然后将10.5mg(0.009mmol)该中间体溶于4mldmf中，并在存在3.5mg(0.018mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、2.8mg(0.018mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和6μln,n-二异丙基乙胺的情况下与3mg(0.012mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。搅拌过夜之后，再次加入相同量的偶联试剂，并将反应在室温下再搅拌3天。然后将混合物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：6mg(理论值的52％)。

然后将6mg(0.005mmol)该中间体在3mldcm用1ml三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到6mg(理论值的83％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.84min；

lc-ms(方法4):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝1068(m+h)⁺。

中间体f28

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基}氨基)-l-苯丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

该中间体是经5步制备：

在第一步中，在存在44.3mg(0.117mmol)hatu和30μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将40mg(0.058mmol)中间体c8与46mg(0.058mmol)中间体l22偶联。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：53mg(理论值的62.5％)。

在下一步中，在3mldmf中用0.6ml哌啶除去fmoc基团。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：42mg(理论值的82％)。

为了裂解甲基酯，将42mg(0.033mmol)该中间体溶解于2mlthf和1ml水中，加入330μl2m的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌1h。然后将反应物用tfa中和并浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。在高真空下干燥，得到32mg(78％)羧基化合物。

然后在存在18μln,n-二异丙基乙胺的情况下，在2.3mldmf中，将32mg(0.026mmol)该中间体与14.6mg(0.047mmol)市售的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮偶联。在超声波浴中处理4小时后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：20.4mg(理论值的60％)。

在最后一步中，将20.4mg(0.016mmol)该中间体在dcm用三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到20mg(理论值的85％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法5):rt＝2.84min；ms(esipos):m/z＝1197(m+h)⁺。

中间体f29

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}氨基)-l-苯丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物的制备是以与中间体f28类似的方式进行。

hplc(方法11):rt＝2.0min；

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝1111(m+h)⁺。

中间体f30

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)亚磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)

该中间体是经4步制备：

在第一步中，在存在25mg(0.066mmol)hatu和29μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将37.5mg(0.055mmol)中间体c3与15mg(0.066mmol)市售的3-[(2-氨基乙基)硫烷基]丙酸甲酯盐酸盐(1:1)在dmf中偶联。在室温下搅拌15min后，再次加入偶联试剂。将反应物在室温下再搅拌15min，然后浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。产量：21mg(理论值的48％)。

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z＝802(m+h)⁺。

为了裂解甲基酯，将21mg(0.026mmol)该中间体溶解于5ml甲醇中，加入655μl2m的氢氧化锂溶液，并将反应物在室温下搅拌过夜。在此期间，发生硫的部分氧化。将反应物浓缩，并将残余物溶于水中，然后用乙酸调节至ph3。将混合物用50ml乙酸乙酯萃取两次，然后将有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物在高真空下干燥后得到的混合物不经进一步纯化即用于下一步，在存在11.6mg(0.031mmol)hatu和22μln,n-二异丙基乙胺的情况下与8.4mg(0.033mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。将反应物在室温下搅拌5min，然后浓缩。将残余物溶于乙酸乙酯中，并将溶液用浓度为5％的柠檬酸萃取，然后用水萃取。然后将有机相经硫酸镁干燥，过滤并浓缩。将残余物在高真空下干燥后得到的混合物不经进一步纯化即用于下一步。

然后将22mg该粗物质溶解于2mldcm中并用0.5ml三氟乙酸去保护。在室温下搅拌10min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。在高真空下干燥，得到2.1mg标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.8min；

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝784(m+h)⁺。

中间体f31

三氟乙酸/n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n-(3-{[2-{(1r)-1-[(3-氨基丙基)(乙醇酰基)氨基]-2,2-二甲基丙基}-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-1-基]甲基}苯基)-l-丙氨酰胺(1:1)

该中间体是使用肽化学的经典方法由中间体c10经6步合成。

在第一步中，在存在100mg(0.266mmol)hatu和46μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将42mg(0.066mmol)中间体c10与20.7mg(0.066mmol)n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-丙氨酸在5mldmf中偶联。将反应物在室温下搅拌过夜，并将产物通过制备型hplc纯化。得到16mg(理论值的27％)n-酰基化的化合物和9mg(理论值的12％)n-,o-双酰基化的化合物。

n-酰基化的化合物的去保护在dmf中用哌啶进行。双酰基化的化合物在乙醇中用哌啶和甲胺水溶液两者进行处理。在两种情况下，形成(3-{[(1r)-1-{1-[3-(l-丙氨酰基氨基)苄基]-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基}-2,2-二甲基丙基](乙醇酰基)氨基}丙基)氨基甲酸叔丁酯，通过制备型hplc纯化，得到13mg，纯度为95％。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝657(m+h)⁺。

在存在7μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将13mg(0.019mmol)该中间体与9.1mg(0.021mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酸酯在2mldmf中偶联。在室温下搅拌20h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。从1,4-二噁烷/水中冻干，得到10mg(理论值的54％)。

随后在dmf中用哌啶除去fmoc保护基团，得到9mg(当量)部分去保护的中间体。

然后，在存在5μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将9mg(0.01mmol)该中间体与3.2mg(0.01mmol)市售的1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮在2mldmf中偶联。在室温下搅拌过夜后，将反应物浓缩，并将产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水和几滴1,4-二噁烷中冻干，得到3mg(理论值的32％)，在最后一步中将其在2mldcm中用0.5ml三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干，得到3.8mg(当量)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝849(m+h)⁺。

中间体f32

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)

该中间体是通过在存在10.5mg(0.055mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、8.4mg(0,055mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和14μl(0.08mmol)n,n-二异丙基乙胺的情况下，偶联15mg(0,041mmol)中间体c5与16.8mg(0.027mmol)中间体l23，随后用tfa去封闭而制备。得到3.4mg(经两个步骤，理论值的15％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝708(m+h)⁺。

中间体f33

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)

该中间体的合成开始于在第一步中，在存在28.7mg(0.15mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、22.9mg(0.15mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和39μln,n-二异丙基乙胺的情况下，偶联50mg(0.075mmol)中间体c3与26.2mg(0.082mmol)9h-芴-9-基甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯盐酸盐(1:1)。在室温下搅拌18h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。得到45mg(理论值的65％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.51min；ms(esipos):m/z＝921(m+h)⁺。

将45mg(0.049mmol)该中间体溶于10ml乙醇中，并加入176μl浓度为40％的甲胺在水中的溶液。将反应物在50℃下搅拌，其中在6h后和9h后加入相同量的甲胺溶液。在50℃下再搅拌14h后，再加入700μl甲胺溶液，再搅拌20h后，最后浓缩混合物。将残余物溶于dcm中并用水洗涤。将有机相浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物在高真空下干燥，得到32mg(理论值的99％){(2s)-1-[(2-氨基乙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝657(m+h)⁺。

将8.3mg(0.013mmol)的该中间体溶解于4ml二氯甲烷中，并加入3.3mg(0.013mmol)溴代乙酸酐和2μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。将残余物溶于1ml二氯甲烷中并用0.5ml三氟乙酸去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干，得到1.1mg(经两个步骤，理论值的9％)标题化合物。

hphplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝677/679(m+h)⁺。

中间体f34

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

该中间体是通过在存在9.9mg(0.026mmol)hatu和19μln,n-二异丙基乙胺的情况下偶联14mg(0.022mmol)中间体c5与12.7mg(0.024mmol)中间体l8而制备。将反应物在室温下搅拌30min，并将产物通过制备型hplc纯化，然后从乙腈/水中冻干。

将所得到的中间体溶于3ml二氯甲烷中并用1ml三氟乙酸去封闭。在室温下搅拌30min后，将反应物浓缩，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到8.2mg(经两个步骤，理论值的36％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝hplc(方法11):rt＝1.8min；

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝913(m+h)⁺。

中间体f35

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺

在氩气和0℃下，将57.3mg(0.07mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸(中间体l38)、9.2mg(0.07mmol)hoat和32mg(0.08mmol)hatu加入到4.0mldmf中的31.8mg(0.07mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)中。然后加入23.5μl(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。加入7.7μlhoac，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的38％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.12min；ms(esipos):m/z＝651[m+2h]²⁺。

中间体f36

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物的合成是以与中间体f35类似的方式的制备进行。

15.4mg(0.03mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)。

25.0mg(0.03mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l25)。

得到10.7mg(理论值的27％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝1215[m+h]⁺。

中间体f37

三氟乙酸/n-(4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰胺(1:1)

非对映异构体混合物。

化合物3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯是以与中间体c21的合成类似的方式而制备。

分别为8.0(0.01mmol)和13.0mg(0.02mmol)的3-氨基-4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体c23)。

分别为9.0mg(0.01mmol)和14.7mg(0.02mmol)的3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。

产量(合并两种反应物)：

10.5mg(42％)非对映异构体1

11.6mg(46％)非对映异构体2

标题化合物是以与中间体f38的合成类似的方式制备。

10.5mg(0.01mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]氨基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(非对映异构体1)

60.6mg(0.54mmol)tfa。

得到7.4mg(理论值的70％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝1086[m+h]⁺。

中间体f38

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺(1:1)

首先将24.8mg(0.02mmol)[38-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,31,37-三氧代-7,10,13,16,19,22,25,28-八氧杂-35-硫杂-4,32,38-三氮杂四十一烷-41-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体c21)加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入85.8mg(0.75mmol)tfa。将混合物在室温下搅拌16h。在减压下蒸发溶剂中，并将残余物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.0mg(理论值的95％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝1104[m+h]⁺。

中间体f39

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物是以与中间体f35的合成类似的方式而制备。

56.1mg(0.10mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l44)。

45.0mg(0.10mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)。

得到20.9mg(理论值的21％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.16min；ms(esipos):m/z＝1040[m+h]⁺。

中间体f40

三氟乙酸/n-[(4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰胺(1:1)

3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯是以与中间体c21的合成类似的方式而制备。

25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)(中间体c24)。

27.6mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺。

产量：20.6mg(理论值的39％)

lc-ms(方法1):rt＝1.23min；ms(esipos):m/z＝1200[m+h]⁺。

标题化合物是以与中间体f37的合成类似的方式而制备。

26.1mg(0.02mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[33-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,31-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-2,30-二氮杂三十三烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

90.6mg(0.80mmol)tfa。

得到22.9mg(理论值的95％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91和0.92min；ms(esipos):m/z＝1100[m+h]⁺。

中间体f41

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-7,35-二氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3-硫杂-6,34-二氮杂三十七烷-1-酰胺3-氧化物(1:1)

标题化合物是以与中间体f38类似的方式由15.5mg(0.01mmol)中间体c22制备。得到4.0mg(理论值的27％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.90min；ms(esipos):m/z＝1120[m+h]⁺。

中间体f42

三氟乙酸/4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]吡咯烷-3-甲酰胺(1:1)

首先将40.5mg(0.06mmol)4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-甲酸(中间体c25)和14.5mg(0.08mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.0ml乙腈中，加入64.4mg(0.51mmol)n,n-二异丙基乙胺和50.0mg(0.08mmol)t3p，并将混合物在室温下搅拌16h。再次加入相同量的1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)、n,n-二异丙基乙胺和t3p，并将混合物在室温下再搅拌4h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.2mg(理论值的15％)化合物3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.30min；ms(esipos):m/z＝763[m+h]⁺。

首先将7.2mg(0.01mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基甲酰基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入43.0mg(0.38mmol)tfa。将反应混合物在室温下搅拌16h。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125×30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.5mg(理论值的50％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝663[m+h]⁺。

中间体f43

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺

将22.4mg(0.03mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸(中间体l42)溶解于2.0mldmf中，并加入4.5mg(0.03mmol)hoat、15.8mg(0.04mmol)hatu和15.7mg(0.03mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)。加入8.6mg(0.07mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到16.7mg(理论值的45％)标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1125[m+h]⁺。

中间体f44

三氟乙酸/n-[(4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-3-基)甲基]-19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f40的合成类似的方式而制备。

25.0mg(0.04mmol)三氟乙酸/3-(氨基甲基)-4-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(1:1)(中间体c24)。

20.5mg(0.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺。

得到21.8mg(理论值的48％)化合物3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.22min；ms(esipos):m/z＝1025[m+h]⁺。

21.0mg(0.02mmol)3-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}-4-[21-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-2,18-二氮杂二十一烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯。

168.3mg(1.48mmol)tfa。

得到17.3mg(理论值的90％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92和0.94min；ms(esipos):m/z＝924[m+h]⁺。

中间体f45

三氟乙酸/n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-赖氨酰胺(1:1)

所述合成是以与中间体f46的合成类似的方式而进行。

22.9mg(0.05mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)。

36.2mg(0.05mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基-l-赖氨酸(中间体l41)。

得到19.8mg(34％)化合物n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.20min；ms(esipos):m/z＝1196[m+h]⁺。

17.0mg(0.01mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺。

得到13.6mg(理论值的79％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝1096[m+h]⁺。

中间体f46

三氟乙酸/n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-赖氨酰胺(1:1)

在氩气和0℃下，将49.0mg(0.05mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸(中间体l40)、7.3mg(0.05mmol)hoat和25.3mg(0.07mmol)hatu加入到溶于2.0mldmf中的25.1mg(0.05mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)中。然后加入18.6μl(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到29.2mg(理论值的37％)化合物n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(3-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺。

lc-ms(方法4):rt＝1.51min；ms(esipos):m/z＝1372[m+h]⁺。

首先将25.2mg(0.02mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酰胺加入到3.0ml二氯甲烷中，并加入83.7mg(0.73mmol)tfa。将反应溶液在室温下搅拌48h。将溶剂在减压下蒸发并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到24.5mg(理论值的96％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝1272[m+h]⁺。

中间体f47

n-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺

将15.2mg(0.01mmol)n-[67-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-65-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37,40,43,46,49,52,55,58,61-二十氧杂-64-氮杂六十七烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酸(中间体l43)溶解于1.0mldmf中，并加入1.5mg(0.01mmol)hoat、5.2mg(0.01mmol)hatu和5.2mg(0.01mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(中间体c40)。加入2.9mg(0.02mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.8mg(理论值的33％)标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝1831[m+h]⁺。

中间体f48

三氟乙酸/n1-(3-氨基丙基)-n1-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-n18-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]-6,9,12,15-四氧杂-3-硫杂十八烷-1,18-二酰胺(1:1)

首先将16.1mg(0.02mmol)[22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十五烷-25-基]氨基甲酸叔丁酯(中间体c18)加入到1.5ml二氯甲烷中，并加入26μl(0.34mmol)tfa。将混合物在室温下搅拌过夜，然后再加入26μl(0.34mmol)tfa。将混合物再次在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于水并冻干。得到10.8mg(理论值的66％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝857[m+h]⁺。

中间体f49

(25s)-25-氨基-22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸/三氟乙酸(1:1)

化合物(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯的合成是以与中间体c16的合成类似的方式而进行。

50.0mg(0.08mmol)中间体c2

20.3mg(0.18mmol)氯乙酰氯

19.0mg(0.19mmol)三乙胺

得到43.1mg(理论值的77％)化合物(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.55min；ms(esipos):m/z＝689[m+h]⁺。

化合物(6s)-9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸的合成是以与中间体c17的合成类似的方式而进行。

38.8mg(0.06mmol)(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸叔丁酯。

19.1mg(0.07mmol)1-硫烷基-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸

45.9mg(0.14mmol)碳酸铯

得到40.7mg(理论值的77％)化合物(6s)-9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.45min；ms(esipos):m/z＝935[m+h]⁺。

化合物(25s)-22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯的合成是以与中间体c18的合成类似的方式而进行。

37.4mg(0.04mmol)(6s)-9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(叔丁氧基羰基)-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3,15,18,21,24-五氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂二十七烷-27-酸。

9.2mg(0.05mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)。

得到23.4mg(理论值的49％)化合物(25s)-22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.47min；ms(esipos):m/z＝1057[m+h]⁺。

标题化合物的合成是以与中间体f38的合成类似的方式而进行。

20.8mg(0.02mmol)(25s)-22-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-25-[(叔丁氧基羰基)氨基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-4,21-二氧代-7,10,13,16-四氧杂-19-硫杂-3,22-二氮杂二十六烷-26-酸叔丁酯。

157.0mg(1.37mmol)tfa。

得到13.0mg(65％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝901[m+h]⁺。

中间体f50

三氟乙酸/1-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环丙烷甲酰胺(1:1)

将15mg(0.024mmol)中间体c5溶解于6.5mldcm中，并加入19mg(0.049mmol)中间体l24、13μln,n-二异丙基乙胺和10mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶四氟硼酸盐。将反应物在室温下搅拌3h，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化，得到2.4mg保护的中间体。

然后将所述中间体溶于1mldcm中并用三氟乙酸去保护。从乙腈/水中冻干得到2.6mg(经两个步骤，理论值的11％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝2.4min。

lc-ms(方法1):rt＝1.25min；ms(esipos):m/z＝819[m+h]⁺。

中间体f51

3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-n-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺(异构体1)

首先将10.0mg(18.079μmol)n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)加入到100μlpbs缓冲液(sigmad8537)和200μlacn中。加入17.1mg(32.543μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化并冻干。得到14.0mg(理论值的75％)目标化合物。

异构体1

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝1039[m+h]⁺。

中间体f52

3-{3-[(3-氨基-2-{[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]甲基}丙基)硫烷基]-2,5-二氧代吡咯烷-1-基}-n-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺(异构体2)

首先将6.5mg(10.694μmol，lc/ms纯度＝91％)n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)加入到100μlpbs缓冲液(sigmad8537)和200μlacn中。加入10.1mg(19.249μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15-氧代-4,7,10-三氧杂-14-氮杂十七烷-1-基]丙酰胺，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型hplc(流动相:acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化并冻干。得到5.0mg(理论值的45％)目标化合物。

异构体2

lc-ms(方法5):rt＝2.87min；ms(esipos):m/z＝1039[m+h]⁺。

中间体f53

n-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(异构体1)

首先将10.0mg(18.079μmol)n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体1)加入到200μlpbs缓冲液(sigmad8537)和400μlacn中。加入8.1mg(32.543μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基双(1h-吡咯-2,5-二酮)，并将混合物在室温下搅拌1h。然后加入300μldmf，并将混合物再搅拌1.5h。将反应溶液通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化并冻干。得到4.0mg(理论值的29％)目标化合物。

异构体1

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝765[m+h]⁺。

中间体f54

n-{3-氨基-2-[({1-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丁基]-2,5-二氧代吡咯烷-3-基}硫烷基)甲基]丙基}-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(异构体2)

首先将5.0mg(9.040μmol)n-[3-氨基-2-(硫烷基甲基)丙基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺盐酸盐(1:1)(异构体2)加入到500μldmf中。加入4.0mg(16.271μmol)1,1'-丁烷-1,4-二基双(1h-吡咯-2,5-二酮)，并将混合物在室温下搅拌16h。将反应溶液通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化并冻干。得到1.1mg(理论值的16％)目标化合物。

异构体2

lc-ms(方法6):rt＝2.41min；ms(esipos):m/z＝765[m+h]⁺。

中间体f55

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{4-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-l-丙氨酰胺

将6.5mg(4.5μmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺溶解于441μl二氯甲烷中，并加入44μl(573.1μmol)三氟乙酸。将反应物在室温下于旋转蒸发仪上浓缩，溶于水和acn中并冻干。得到5.6mg(理论值的94％，根据lc/ms的纯度＝92％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝1100.6[m+h]⁺。

中间体f56

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[(2s)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f50类似的方式而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(eipos):m/z＝708[m+h]⁺。

中间体f57

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[(2r)-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丙-2-基]丁酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f56类似的方式而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(eipos):m/z＝708[m+h]⁺。

中间体f58

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

首先将16.2mg(0.02mmol)三氟乙酸/l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺(1:1)(中间体c41)加入到1.0mldmf中，并加入8.3mg(0.06mmol)n,n-二异丙基乙胺和12.6mg(0.04mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮。将反应混合物在室温下搅拌过夜并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.0mg(理论值的60％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.18min；ms(esipos):m/z＝852[m+h]⁺。

中间体f82

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物的合成是以与中间体f83的合成类似的方式而进行。所使用的外消旋中间体是以与相应的r-异构体中间体类似的方式而获得。

lc-ms(方法2):rt＝7.07min；ms(eipos):m/z＝1236[m+na]⁺。

中间体f83

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

首先将30.0mg(0.06mmol)n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(实施例98)和26.1mg(0.06mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-丙氨酸酯加入到2.0mldmf中，并加入19.4mg(0.19mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入11.5mg(0.19mmol)hoac。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到41.9mg(理论值的79％)化合物9h-芴-9-基甲基[(2s)-1-({3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.44min；ms(esipos):m/z＝763[m+h]⁺。

将37.2mg(0.05mmol)9h-芴-9-基甲基[(2s)-1-({3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸酯溶解于1.5mldmf中，并加入124.6mg(1.46mmol)2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间进行分配，并将有机相用水洗涤两次，用饱和nacl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到14.2mg(理论值的50％)化合物n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝541[m+h]⁺。

将14.1mg(0.03mmol)n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺和11.4(0.03mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酸酯溶解于1.5mldmf中，并加入7.9mg(0.08mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入4.7mg(0.08mmol)hoac。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到15.9mg(理论值的71％)化合物n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝862(m+h)⁺。

将14.9mg(0.02mmol)n-[(9h-芴-9-基甲氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺溶解于1.5mldmf中，并加入44.2mg(0.52mmol)2-氨基乙醇。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物在乙酸乙酯和水之间进行分配，并将有机相用水洗涤两次，用饱和nacl溶液洗涤一次。经硫酸镁干燥后，在减压下蒸发溶剂并将残余物在硅胶上纯化(流动相：二氯甲烷/甲醇10:1)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到5.7mg(理论值的52％)化合物l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝640(m+h)⁺。

将5.5mg(8.6μmol)l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺和6.5mg(6.5μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{27-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-27-氧代-3,6,9,12,15,18,21,24-八氧杂二十七烷-1-基}丙酰胺溶解于1.0mldmf中，并加入0.9mg(8.6mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，并加入0.8mg(0.01mmol)hoac。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到7.7mg(理论值的74％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.10min；ms(esipos):m/z＝1214(m+h)⁺。

中间体f84

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)

首先，在存在11.7mg(0.03mmol)hatu和18μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将16.5mg(0.02mmol)中间体c54溶于5mldmf中并与10.4mg(0.041mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌5min后，将混合物浓缩并将残余物溶于乙腈/水1:1中。用三氟乙酸将ph调节至2并再次浓缩反应物。将残留的残余物通过制备型hplc纯化。得到8mg(理论值的42％)保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.38min；ms(eipos):m/z＝929[m+h]⁺。

将7.6mg(0.008mmol)该中间体溶于3mldmf中，并加入92mg(0.82mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理1h。然后加入31μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。得到3mg(理论值的45％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(eipos):m/z＝707[m+h]⁺。

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝8.15(t,1h),7.9-8.1(m,4h),7.6(m,1h),7.5(s,1h),7.15-7.35(m,6h),6.9-7.0(m,3h),6.85(s,1h),5.6(s,1h),4.9和5.2(2d,2h),4.05和4.2(2d,2h),3.1-3.2(m,4h),2.15(m,2h),0.7和1.45(2m,2h),0.8(s,9h)。

中间体f85

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)

首先，在存在7.8mg(0.02mmol)hatu和12μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.014mmol)中间体c53溶于3.4mldmf中并与7mg(0.027mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应。在室温下搅拌15min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。得到6.6mg(理论值的57％)保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.4min；ms(eipos):m/z＝858[m+h]⁺。

将6.6mg(0.008mmol)该中间体溶于2mldmf中，并加入86mg(0.77mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入44μl乙酸，并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。得到3.3mg(理论值的53％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(eipos):m/z＝636[m+h]⁺。

中间体f86

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由8mg(0.012mmol)中间体c51制备：即通过在存在5.8mg(0.015mmol)hatu和10μln,n-二异丙基乙胺的情况下与4.5mg(0.017mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)反应，随后用三氟乙酸去保护。得到7mg(经两个步骤，理论值的78％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(eipos):m/z＝708[m+h]⁺。

中间体f87

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)丁酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f2类似的方式由16mg(0.025mmol)中间体c49制备：通过在存在edci/hobt和n,n-二异丙基乙胺的情况下与24mg(0.076mmol)中间体l1反应，随后用三氟乙酸去保护。得到3mg标题化合物(经两个步骤，理论值的14％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(eipos):m/z＝694[m+h]⁺。

中间体f88

所述化合物是以与中间体f8类似的方式而制备。

lc-ms(方法5):rt＝2.97min；ms(eipos):m/z＝1006[m+h]⁺。

中间体f89

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由8mg(0.012mmol)中间体c51制备：通过在存在5.8mg(0.015mmol)hatu和10μln,n-二异丙基乙胺的情况下与7.4mg(0.014mmol)中间体l8反应，随后用三氟乙酸去保护。得到10mg(经两个步骤，理论值的78％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(eipos):m/z＝984[m+h]⁺。

中间体f90

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方式由11mg(0.018mmol)中间体c49制备：通过在存在34mg(0.089mmol)hatu和19μln,n-二异丙基乙胺的情况下与13.7mg(0.018mmol)中间体l17反应，随后用三氟乙酸去保护。得到7.5mg(经两个步骤，理论值的35％)。

lc-ms(方法8):rt＝6.78min；ms(eipos):m/z＝1092[m+h]⁺。

中间体f91

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]丁酰胺(1:1)

将9.3mg(0.01mmol)[(2s)-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]氨基甲酸叔丁酯溶解于2ml二氯甲烷中，加入740mg(6.49mmol，0.50ml)三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌1.5h。然后将反应混合物浓缩，并将残余物溶于乙腈和水中并冻干。得到9.2mg(理论值的96％)目标化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(eipos):m/z＝637[m+h]⁺。

中间体f103

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(3-{[(1r)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基](4-甲基苯甲酰基)氨基}丙基)-l-丙氨酰胺

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.019mmol)n-(3-氨基丙基)-n-[(1r)-1-(3-苄基-7-氯-4-氧代-3,4-二氢喹唑啉-2-基)-2-甲基丙基]-4-甲基苯甲酰胺制备：通过在存在8.8mg(0.023mmol)hatu和10μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11.3mg(0.019mmol)中间体l44反应。通过制备型hplc纯化。

产量：8.5mg(理论值的35％)

lc-ms(方法5):rt＝3.82min；ms(eipos):m/z＝1085[m+h]⁺。

中间体f104

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

首先在存在13mg(0.034mmol)hatu和10μln,n-二异丙基乙胺的情况下，使15mg(0.023mmol)中间体c58与11mg(0.036mmol)中间体l1反应。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。得到12.3mg(理论值的63％)保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.3min；ms(eipos):m/z＝837[m+h]⁺。

在第二步中，将该中间体溶解于3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.088mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入26mg(0.088mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到8.1mg(理论值的68％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝693(m+h)⁺。

中间体f105

n²-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]-l-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f32类似的方式由中间体c5和中间体l46制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.82min；ms(eipos):m/z＝766[m+h]⁺。

中间体f106

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n5-氨基甲酰基-n-[4-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f104类似的方式由中间体c53和中间体l47制备。

hplc(方法11):rt＝1.85min；

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝983(m+h)⁺。

中间体f107

三氟乙酸/(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体c49制备：通过在存在14mg(0.037mmol)hatu和21μln,n-二异丙基乙胺的情况下与22.3mg(0.049mmol)中间体l48反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13mg(经两个步骤，理论值的60％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f108

三氟乙酸/(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f104类似的方式由20mg(0.027mmol)中间体c53和24mg(0.054mmol)中间体l48制备。得到3mg(经两个步骤，理论值的14％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(eipos):m/z＝747[m+h]⁺。

中间体f109

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)

将17mg(0.026mmol)中间体c57溶于3mldmf中，并在存在14μln,n-二异丙基乙胺的情况下与7mg(0.027mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮反应。在室温下搅拌15min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。得到7mg(理论值的33％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.29min；ms(esipos):m/z＝777和779(m+h)⁺。

将该中间体溶于1ml二氯甲烷中并用1ml三氟乙酸去保护。浓缩并从乙腈/水中冻干后，得到6mg(理论值的88％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝677/679(m+h)⁺。

中间体f110

n-(溴乙酰基)-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f109类似的方式由16mg(0.023mmol)中间体c5和17mg(0.025mmol)中间体l49制备。得到6mg(经两个步骤，理论值的24％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.93min；

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝933和935(m+h)⁺。

中间体f111

三氟乙酸/(1s,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.022mmol)中间体c5制备：通过在存在12.5mg(0.032mmol)hatu和19μln,n-二异丙基乙胺的情况下与16mg(0.044mmol)中间体l50反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13mg(经两个步骤，理论值的67％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f112

三氟乙酸/(1s,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体c49制备：通过在存在14mg(0.037mmol)hatu和21μln,n-二异丙基乙胺的情况下与18mg(0.049mmol)中间体l50反应，随后用三氟乙酸去保护。得到12mg(经两个步骤，理论值的51％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f113

三氟乙酸/(1s,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体c53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)hatu和17μln,n-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体l50反应，随后用在2mldmf中的133mgdabco去保护。通过hplc纯化得到4mg(经两个步骤，理论值的24％)。

lc-ms(方法5):rt＝2.77min；ms(eipos):m/z＝747[m+h]⁺。

中间体f114

三氟乙酸/(1r,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.022mmol)中间体c5制备：通过在存在12.6mg(0.032mmol)hatu和19μln,n-二异丙基乙胺的情况下与16mg(0.044mmol)中间体l51反应，随后用三氟乙酸去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的53％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f115

三氟乙酸/(1r,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.024mmol)中间体c49制备：通过在存在13mg(0.035mmol)hatu和21μln,n-二异丙基乙胺的情况下与18mg(0.047mmol)中间体l51反应，随后用三氟乙酸去保护。得到12mg(经两个步骤，理论值的51％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f116

三氟乙酸/(1r,3r)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由11mg(0.014mmol)中间体c53制备：通过在存在8mg(0.021mmol)hatu和12μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.028mmol)中间体l51反应，随后用在2mldmf中的87mgdabco去保护。通过hplc纯化得到3.3mg(经两个步骤，理论值的28％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(eipos):m/z＝747[m+h]⁺。

中间体f117

三氟乙酸/n-[(3s)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-n-{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

标题化合物是根据肽化学的经典方法由中间体c49制备。首先，在存在hatu的情况下，将c49与9h-芴-9-基甲基肼甲酸酯偶联。然后用在dmf中的哌啶除去fmoc保护基团，并在存在hatu的情况下将得到的酰肼与6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸偶联。在最后一步中，用在二氯甲烷中的tfa除去boc保护基团。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(eipos):m/z＝722[m+h]⁺。

中间体f118

三氟乙酸/n-[(3s)-3-氨基-4-{2-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]肼基}-4-氧代丁基]-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2-羟基乙酰胺(1:1)

在第一步中，标题化合物是以与中间体f3类似的方式由15mg(0.019mmol)中间体c53制备：通过在存在hatu的情况下与市售的6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰肼偶联。然后用在dmf中的142mgdabco除去fmoc保护基团。通过hplc纯化得到3mg(理论值的19％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.90min；ms(eipos):m/z＝721[m+h]⁺。

中间体f119

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}丁酰胺(1:1)

将29mg(0.044mmol)中间体c58溶于3.4mldmf中，并加入36mg(0.087mmol)中间体l52、25mg(0.065mmol)hatu和19μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。得到26.4mg(理论值的73％)所述中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝820和822(m+h)⁺。

将该中间体溶解于3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入6.5mg(0.048mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌4h。加入13.9mg(0.048mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到14.4mg(理论值的58％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝676和678(m+h)⁺。

中间体f120

三氟乙酸/(1s,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.015mmol)中间体c5制备：通过在存在8.4mg(0.022mmol)hatu和13μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.03mmol)中间体l53反应，随后用三氟乙酸去保护。得到7.5mg(经两个步骤，理论值的59％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f121

三氟乙酸/(1s,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.016mmol)中间体c49制备：通过在存在9mg(0.024mmol)hatu和14μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11.5mg(0.031mmol)中间体l53反应，随后用三氟乙酸去保护。得到9mg(经两个步骤，理论值的61％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f122

三氟乙酸/(1s,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体c53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)hatu和17μln,n-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体l53反应，随后用在3mldmf中的202mgdabco去保护。通过hplc纯化得到4mg(经两个步骤，理论值的24％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(eipos):m/z＝747[m+h]⁺。

中间体f123

三氟乙酸/(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.015mmol)中间体c5制备：通过在存在8.4mg(0.022mmol)hatu和13μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11mg(0.030mmol)中间体l54反应，随后用三氟乙酸去保护。得到4mg(经两个步骤，理论值的31％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f124

三氟乙酸/(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.016mmol)中间体c49制备：通过在存在9mg(0.024mmol)hatu和14μln,n-二异丙基乙胺的情况下与11.5mg(0.031mmol)中间体l54反应，随后用三氟乙酸去保护。得到9mg(经两个步骤，理论值的66％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(eipos):m/z＝748[m+h]⁺。

中间体f125

三氟乙酸/(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.019mmol)中间体c53制备：通过在存在11mg(0.029mmol)hatu和17μln,n-二异丙基乙胺的情况下与14mg(0.038mmol)中间体l54反应，随后用在3mldmf中的127mgdabco去保护。通过hplc纯化，得到3mg(经两个步骤，理论值的17％)。

lc-ms(方法4):rt＝1.08min；ms(eipos):m/z＝769[m+na]⁺。

中间体f126

n-(溴乙酰基)-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f110类似的方式由18mg(0.027mmol)中间体c49和21mg(0.027mmol)中间体l49制备。得到8.7mg(经两个阶段，理论值的30％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.94min；

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝933和935(m+h)⁺。

中间体f127

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2s)-2-甲氧基丙酰基]氨基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

将12mg(0.015mmol)中间体c59溶解于2.4mldmf中，并加入14.6mg(0.046mmol)中间体l1、6mg(0.031mmol)1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、5.9mg(0.039mmol)1-羟基-1h-苯并三唑水合物和8μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将混合物浓缩并将残余物通过制备型hplc纯化。得到11mg(理论值的70％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝942(m+h)⁺。

将11mg(0.011mmol)该中间体溶于2mldmf中，并加入123mg(1.1mmol)1,4-二氮杂双环[2.2.2]辛烷。将反应物在超声波浴中处理2h。然后加入63μl乙酸并将反应物在高真空下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。得到2mg(理论值的22％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(eipos):m/z＝721[m+h]⁺。

hplc(方法11):rt＝1.95min。

中间体f128

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-d-丙氨酰基)-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方式由3mg(0.005mmol)中间体c5制备：通过在存在2.5mg(0.007mmol)hatu和3μln,n-二异丙基乙胺的情况下与2.5mg(0.003mmol)中间体l55反应，随后用三氟乙酸去保护。得到1.4mg(经两个步骤，理论值的32％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(eipos):m/z＝1077[m+h]⁺。

中间体f129

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸

标题化合物是以与中间体f128类似的方式通过以下方式由10mg(0.016mmol)中间体c49制备：通过在存在12mg(0.031mmol)hatu和14μln,n-二异丙基乙胺的情况下与19mg(0.024mmol)中间体l56反应，随后用三氟乙酸去保护。得到13.5mg(经两个步骤，理论值的70％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(eipos):m/z＝1117[m+h]⁺。

中间体f142

r/s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将20.0mg(23.7μmol)r/s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和13.4mg(26.04mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于1.0mldmf中，并加入4.8mg(47.34μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入3.6mg(0.06mmol)乙酸并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到12.4mg(理论值的44％)化合物r/s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.30min；ms(esipos):m/z＝1129(m+h)⁺。

将10.0mg(8.85μmol)r/s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-高半胱氨酸溶解于三氟乙醇中，并加入3.1mg(22.71μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入3.9mg(0.01mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物短暂搅拌，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物用少量水冻干。得到7.6mg(理论值的78％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝983(m+h)⁺。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ[ppm]＝0.50(m,1h),0.81(s,9h),1.49(m,1h),1.89(m,1h),2.05(m,1h),2.29-2.43(m,4h),2.45-2.55(m,2h),2.58-2.74(m,2h),3.10-3.20(m,2h),3.21-3.40(m,2h),3.42-3.54(m,16h),3.55-3.65(m,4h),4.28(m,1h),4.91(dd,1h),5.18(dd,1h),5.60(s,1h),6.95(m,1h),7.00(s,2h),7.15-7.38(m,7h),7.53(s,1h),7.68(m,1h),8.00(m,2h)。

中间体f143

三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)

首先将30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯和13.5mg(0.07mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸加入到2.0ml的甲醇(带有一滴水)中。加入23.0mg(0.17mmol)碳酸钾。将反应混合物在50℃下搅拌4h。向反应混合物中加入乙酸乙酯。将有机相用饱和nacl溶液洗涤并经硫酸镁干燥。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到54.2mg(理论值的90％)化合物11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝1106(m+h)⁺。

首先将54.0mg(0.07mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸和16.7mg(0.09mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到3.0ml乙腈中，并加入75.0mg(0.58mmol)n,n-二异丙基乙胺。加入60.0mg(0.09mmol)t3p(50％，在乙腈中)并将混合物在室温下搅拌过夜。用水淬灭反应并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到42.8mg(理论值的68％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝866(m+h)⁺。

将20.0mg(0.02mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.7mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜，然后加入10.1mg(0.04mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，并将混合物搅拌10min。加入水(0.1％tfa)，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到9.2mg(理论值的48％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝722(m+h)⁺。

中间体f144

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)

首先将50.0mg(0.1mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体c15)加入到2.0ml二氯甲烷中，并加入22.7mg(0.22mmol)三乙胺和49.3mg(0.22mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰氯(中间体l60)wisv1648-1-1。

将反应混合物在室温下搅拌过夜。每2h(三次)加入1个当量的中间体l60和1.2个当量的三乙胺，然后将混合物在室温下搅拌过夜。将该步骤再重复两次。在减压下除去溶剂并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到30.9mg(理论值的43％)化合物[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.51min；ms(esipos):m/z＝706(m+h)⁺。

将24.6mg(0.04mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解于3.0ml二氯甲烷中，加入79.5mg(0.7mmol)tfa并将混合物在室温下搅拌6h。再加入79.5mg(0.7mmol)tfa并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下除去溶剂并将残余物与二氯甲烷一起共蒸馏三次。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到24.2mg(理论值的97％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.02min；ms(esipos):m/z＝606(m+h)⁺。

中间体f145

三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]己酰胺

首先将90.0mg(0.15mmol){3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸叔丁酯(中间体c16)和43.6mg(0.23mmol)6-(乙酰基硫烷基)己酸加入到9.0ml的甲醇(带有一滴水)中，并加入73.9mg(0.54mmol)碳酸钾。将反应混合物在室温下搅拌4h，然后加入乙酸乙酯。将有机相用水/饱和nacl溶液洗涤并用饱和nacl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过硅胶进行色谱分离(流动相：二氯甲烷/甲醇100:2)。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到98.7mg(理论值的83％)化合物9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.44min；ms(esipos):m/z＝701(m+h)⁺。

首先将20.0mg(0.03mmol)9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸和6.5(0.04mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到1.5ml乙腈中，并加入23.6mg(0.04mmol)t3p和29.5mg(0.23mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入水。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂并将残余物在高真空下干燥。得到16.7mg(理论值的99％)化合物[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.40min；ms(esipos):m/z＝823(m+h)⁺。

将14.8mg(0.02mmol)[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(6-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-6-氧代己基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯溶解于1.5ml二氯甲烷中，并加入41.0mg(0.36mmol)tfa。将反应混合物在室温下搅拌过夜。

然后，再加入两次tfa，每次41.0mg(0.36mmol)，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于1,4-二噁烷和水中并冻干。得到2.9mg(理论值的19％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝723(m+h)⁺。

中间体f146

r/s-[2-([(3s)-3-氨基-3-羧基丙基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将25.0mg(28.12μmol)r/s-[(8s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]高半胱氨酸(中间体c12)和15.9mg(30.93μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于2.0mldmf中，并加入11.4mg(112.48μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入7.6mg(0.13mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.9mg(理论值的59％)化合物r/s-[(8s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.26min；ms(esipos):m/z＝1173(m+h)⁺。

将11.8mg(8.23μmol)r/s-[(8s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8-羧基-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基]-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸溶解于三氟乙醇中，并加入1.7mg(12.35μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入3.6mg(0.01mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物短暂搅拌，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.8mg(理论值的62％)标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝1.20min；ms(esipos):m/z＝1029(m+h)⁺。

中间体f147

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9-氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)

首先将15.0mg(0.03mmol)9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十八烷-18-酸(中间体c13)加入到1.5ml乙腈中，加入22.1mg(0.17mmol)n,n-二异丙基乙胺，然后加入17.7mg(0.03mmol)t3p。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入9.5mg(0.03mmol)三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)(中间体l59)。将反应混合物在室温下搅拌半夜，并用水淬灭。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.8mg(理论值的57％)化合物[19-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.40min；ms(esipos):m/z＝911(m+h)⁺。

将14.2mg(0.02mmol)[19-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10,18-二氧代-3,6-二氧杂-16-硫杂-9,19-二氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸叔丁酯溶解于1.5ml二氯甲烷中，加入35.5mg(0.31mmol)tfa，并将混合物在室温下搅拌过夜。再加入71.0mg(0.62mmol)tfa，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到14.0mg(理论值的97％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝811(m+h)⁺。

中间体f148

三氟乙酸/6-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}亚磺酰基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]己酰胺(1:1)

标题化合物是在中间体f145的合成中作为副产物形成。得到8.1mg(理论值的53％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.25min；ms(esipos):m/z＝739[m+h]⁺。

中间体f149

三氟乙酸/r/s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸(1:1)

首先将20.0mg(24.94μmol)r/s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]高半胱氨酸(中间体c14)和14.1mg(27.44μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺加入到1.0mldmf中，并加入5.1mg(49.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物搅拌过夜。加入3.7mg(0.06mmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.2mg(理论值的67％)化合物r/s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.23min；ms(esipos):m/z＝1086(m+h)⁺。

将17.6mg(0.02mmol)r/s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}{3-[(叔丁氧基羰基)氨基]丙基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]高半胱氨酸溶解于1.5ml二氯甲烷中，加入37.0mg(0.32mmol)tfa，并将混合物在室温下搅拌过夜。再加入74.0mg(0.64mmol)tfa，并将混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到16.0mg(理论值的90％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝986(m+h)⁺。

中间体f150

三氟乙酸/n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-[2-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)乙基]-l-丙氨酰胺(1:1)

在氩气和0℃下，将在1.0mldmf中的10.0mg(0.02mmol)三氟乙酸/[3-({[(2-氨基乙基)硫烷基]乙酰基}{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体c20)用12.1mg(0.02mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l25)、2.2mg(0.02mmol)hoat和7.6mg(0.02mmol)hatu进行处理。然后加入5.5μl(0.03mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应物在室温下搅拌过夜。加入1.8μlhoac，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ,流速：50ml/min,mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.4mg(理论值的48％)化合物n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法4):rt＝1.60min；ms(esipos):m/z＝687.5[m+2h]²⁺。

首先将9.5mg(0.01mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(9-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-4,10-二氧代-3-氧杂-12-硫杂-5,9-二氮杂十四烷-14-基)-l-丙氨酰胺加入到1.0ml二氯甲烷中，加入15.8mg(0.14mmol)tfa，并将混合物搅拌过夜。再加入31.6mg(0.28mmol)tfa，并将混合物搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物溶于少量水中并冻干。得到10.2mg(理论值的98％)标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝637.5[m+2h]²⁺。

中间体f151

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(3-{(2s)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-l-丙氨酰胺

首先将5.0mg(0.01mmol)(2s)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-n-甲氧基-n-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2h)-甲酰胺加入到1.0ml乙腈中，并加入7.7mg(0.06mmol)n,n-二异丙基乙胺和9.8(0.02mmol)t3p。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入9.1mg(0.02mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l44)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.3mg(理论值的35％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.02min；ms(esipos):m/z＝989[m+h]⁺。

中间体f152

n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-(3-{(2s)-5-(2,5-二氟苯基)-3-[甲氧基(甲基)氨基甲酰基]-2-苯基-2,3-二氢-1,3,4-噻二唑-2-基}丙基)-l-丙氨酰胺

首先将5.0mg(0.01mmol)(2s)-2-(3-氨基丙基)-5-(2,5-二氟苯基)-n-甲氧基-n-甲基-2-苯基-1,3,4-噻二唑-3(2h)-甲酰胺加入到1.0ml乙腈中，并加入7.7mg(0.06mmol)n,n-二异丙基乙胺和9.8(0.02mmol)t3p。将混合物在室温下搅拌5min，然后加入11.8mg(0.02mmol)n-[31-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-29-氧代-4,7,10,13,16,19,22,25-八氧杂-28-氮杂三十一烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l25)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.7mg(理论值的34％)标题化合物。

lc-ms(方法4):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1165[m+h]⁺。

中间体f153

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[(2s)-2-羟基丙酰基]氨基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

所述合成是以与中间体f104类似的方式由中间体c60进行。

lc-ms(方法1):rt＝1.1min；ms(esipos):m/z＝707(m+h)⁺。

中间体f154

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f2类似的方式由10mg(0.015mmol)中间体c8和15mg(0.022mmol)中间体l6制备。

hplc(方法11):rt＝1.91min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝1077(m+h)⁺。

中间体f155

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在8.7mg(0.023mmol)hatu和17μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将14mg(0.019mmol)中间体c61与15mg(0.021mmol)中间体l61偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到13mg(经两个步骤，理论值的59％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝1076(m+h)⁺。

中间体f156

n-(溴乙酰基)-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，根据肽化学的经典方法由n2-[(苄氧基)羰基]-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸制备三肽衍生物2-(三甲基甲硅烷基)乙基l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-(叔丁氧基羰基)-l-赖氨酸酯(使用edci/dmap与2-(三甲基甲硅烷基乙醇进行酯化，氢解，在存在hatu的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联，再进行氢解)。

将84mg(0.163mmol)该中间体溶于2.5mldmf中，并加入58mg(0.244mmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮。在室温下搅拌10min后，将混合物浓缩，将残余物溶于乙腈/水1:1中，并将混合物用三氟乙酸调节至ph2并用制备型hplc纯化。浓缩适当的级分后，将残余物溶于15ml浓度为5％的三氟乙酸在dcm中的溶液并在室温下搅拌2h。然后将混合物在稍微冷却下浓缩，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。经两个步骤，得到53mg(理论值的50％)该中间体。

lc-ms(方法1):rt＝0.72min；ms(esipos):m/z＝537和539(m+h)⁺。

对于标题化合物的合成，将18mg(0.027mmol)该中间体溶于4mldmf中，并加入16mg(0.025mmol)中间体c61以及19mghatu和9μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，加入几滴三氟乙酸，并将反应物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并从乙腈/水1:1中冻干后，将所得中间体溶解于3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入4.8mg(0.035mmol)氯化锌后，将反应物在50℃下搅拌2.5h。然后加入10mg(0.035mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸，并将反应物用乙腈/水稀释并过滤。通过制备型hplc进行纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，经两个步骤得到3.2mg(理论值的13％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.94min；

lc-ms(方法5):rt＝2.79min；ms(esipos):m/z＝932和934(m+h)⁺。

中间体f163

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n6-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在hatu的情况下，将37mg(0.056mmol)中间体c58与41mg(0.056mmol)中间体l61偶联，随后用氯化锌去封闭(如对于中间体f119所述的)。得到12mg(经两个步骤，理论值的19％)标题化合物。

hplc(方法11):rt＝1.49min；

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝1005(m+h)⁺。

中间体f164

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n6-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f155类似的方式通过以下方法制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将20mg(0.030mmol)中间体c58与27mg(0.033mmol)中间体l62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。

hplc(方法11):rt＝1.92min；

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝1091(m+h)⁺。

中间体f165

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f155类似的方式通过以下方法制备：在存在hatu的情况下，将15mg(0.021mmol)中间体c61与18mg(0.023mmol)中间体l62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝1162(m+h)⁺。

中间体f166

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n⁶-{[(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，三氟乙酸/(1r,3s)-3-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)是根据肽化学的经典方法由市售的(1r,3s)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸制备：通过使用edci/dmap与苄醇进行酯化，随后在dcm中用tfa除去叔丁氧基羰基保护基团。

将51mg(0.076mmol)该中间体溶于6mldmf中，并在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与50mg(0.076mmol)中间体c58偶联。通过制备型hplc纯化后，将该中间体溶于甲醇中并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化2h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型hplc纯化。从二噁烷中冻干，得到21mg(经两个步骤，理论值的34％)(1r,3s)-3-{[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。

标题化合物是以与中间体f155类似的方式通过以下方法制备：在存在hatu的情况下，将10.5mg(0.013mmol)该中间体与11.4mg(0.014mmol)中间体l62偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型hplc纯化得到8.6mg(经两个步骤，理论值的48％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝1203(m+h)⁺。

中间体f167

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1r,3s)-3-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f129类似的方式由11mg(0.016mmol)中间体c5制备：通过在存在12mg(0.032mmol)hatu和14μln,n-二异丙基乙胺的情况下与20mg(0.024mmol)中间体l56反应，随后用三氟乙酸去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的46％)。

lc-ms(方法4):rt＝1.13min；ms(eipos):m/z＝1117[m+h]⁺。

中间体f168

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n⁶-{[(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，三氟乙酸/(1r,2s)-2-氨基环戊烷甲酸苄酯(1:1)是根据肽化学的经典方法由市售的(1r,2s)-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]环戊烷甲酸来制备：通过使用edci/dmap与苄醇进行酯化，随后在dcm中用tfa除去叔丁氧基羰基保护基团。

将102mg(0.305mmol)该中间体溶于12mldmf中，并在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与100mg(0.152mmol)中间体c58偶联。通过制备型hplc纯化后，将该中间体溶于甲醇中并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化2h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到70mg(经两个步骤，理论值的59％)(1r,2s)-2-{[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]氨基}环戊烷甲酸。

然后通过以下方式制备标题化合物：在存在9.5mg(0.025mmol)hatu和18μln,n-二异丙基乙胺的情况下将20mg(0.013mmol)该中间体与16.6mg(0.023mmol)中间体l61偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化，得到9.3mg(经两个步骤，理论值的30％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝1116(m+h)⁺。

中间体f169

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n⁶-{[(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)环戊基]羰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f168类似的方式由中间体c58和l62进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝1202(m+h)⁺。

中间体f170

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基-n⁶-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-d-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与其非对映异构体中间体f23类似的方式而制备。

hplc(方法11):rt＝1.9min；

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝1092(m+h)⁺。

中间体f171

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-d-丙氨酰基)-n²-{n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f155类似的方式由中间体c62和l61进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝1076(m+h)⁺。

中间体f172

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-咪唑-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-l-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方式由10mg(0.013mmol)中间体c63制备：通过在存在5.5mg(0.014mmol)hatu和11μln,n-二异丙基乙胺的情况下与9mg(0.014mmol)中间体l63偶联，随后通过在三氟乙酸/二氯甲烷1:1的溶液中搅拌2.5小时来去保护。得到11mg(经两个步骤，理论值的72％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(eipos):m/z＝1049[m+h]⁺。

中间体f173

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-l-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方式由15mg(0.018mmol)中间体c64制备：通过在存在7.7mg(0.02mmol)hatu和16μln,n-二异丙基乙胺的情况下与12mg(0.02mmol)中间体l63偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到12mg(经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(eipos):m/z＝1048[m+h]⁺。

中间体f174

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[4-苄基-1-(2,5-二氟苯基)-1h-吡唑-3-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-l-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f172类似的方式由中间体c57和l63制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(eipos):m/z＝1049[m+h]⁺。

中间体f175

三氟乙酸/n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在6.7mg(0.018mmol)hatu和9μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将11mg(0.013mmol)中间体c64与3.4mg(0.016mmol)6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酸偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到8mg(经两个步骤，理论值的69％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.35min；ms(eipos):m/z＝893[m+h]⁺。

中间体f176

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷-15-基]丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在3.5mg(0.009mmol)hatu和4μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将5mg(0.006mmol)中间体c64与2mg(0.007mmol)3-(2-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(其制备记载于中间体l15中)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到2mg(经两个步骤，理论值的35％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(eipos):m/z＝839[m+h]⁺。

中间体f177

三氟乙酸/(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f168类似的方式制备，但使用中间体l1代替中间体l61。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(eipos):m/z＝804[m+h]⁺.

中间体f178

三氟乙酸/(1r,2s)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-n-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}环戊烷甲酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体f177类似的方式制备，但使用中间体l52代替中间体l1。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(eipos):m/z＝787和789[m+h]⁺。

中间体f179

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己基]丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在13mg(0.034mmol)hatu和16μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将15mg(0.023mmol)中间体c58与6mg(0.025mmol)1-(6-氨基己基)-1h-吡咯-2,5-二酮偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到8.5mg(经两个步骤，理论值的46％)标题化合物。

lc-ms(方法6):rt＝2.22min；ms(eipos):m/z＝692[m+h]⁺。

中间体f180

n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-n2-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在7mg(0.018mmol)hatu和6μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将9.6mg(0.012mmol)中间体c64与5mg(0.013mmol)中间体l64偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到3.1mg(经两个步骤，理论值的28％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(eipos):m/z＝822[m+h]⁺。

中间体f192

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-l-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

将60mg(0.091mmol)中间体c58溶于8mldmf中，并在存在42mg(0.11mmol)hatu和64μln,n-二异丙基乙胺的情况下与45mg(0.100mmol)中间体l65偶联。通过制备型hplc纯化后，将该中间体溶于10ml乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化45min。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到24.5mg(经两个步骤，理论值的31％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-l-丙氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.17min；ms(eipos):m/z＝844[m+h]⁺。

然后通过以下方式制备标题化合物：通过在存在5.4mg(0.014mmol)hatu和8μln,n-二异丙基乙胺的情况下将10mg(0.012mmol)该中间体与2mg(0.013mmol)市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸中间体偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到3.5mg(经两个步骤，理论值的33％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

中间体f193

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f192类似的方式由3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸/n-环己基环己胺(1:1)进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

中间体f194

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物是由实施例98通过以下步骤制备：首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1小时来除去z保护基团，然后通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应将去保护的中间体转化成标题化合物(如对于中间体f58所述的)。

lc-ms(方法1):rt＝1.19min；ms(esipos):m/z＝851[m+h]⁺。

中间体f195

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-n'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在40mg(0.1054mmol)hatu和61μln,n-二异丙基乙胺的情况下，在8mldmf中，将26mg(0.035mmol)中间体c65与18mg(0.07mmol)市售的三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化，得到16mg(经两个步骤，理论值的43％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝721(m+h)⁺。

¹h-nmr(500mhz,dmso-d6):δ＝7.99(t,1h),7.95(t,1h),7.6-7.75(m,4h),7.5(s,1h)7.2-7.4(m,6h),6.8-7.0(m,4h),5.63(s,1h),4.9和5.2(2d,2h),4.26和4.0(2d,2h),3.3-3.6(m,4h),3.15-3.25(m,3h),2.85-3.0(m,2h),2.2-2.3(m,4h),0.64和1,49(2m,2h),0.81(s,9h)。

中间体f196

三氟乙酸/2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基-n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酸酯(1:1)

首先，将15mg(0.023mmol)中间体c58溶于4mldmf中，并在存在13.0mg(0.034mmol)hatu和16μln,n-二异丙基乙胺的情况下与8.2mg(0.025mmol)中间体l67反应。在室温下搅拌30min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。合并适当的级分并蒸发溶剂后，将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到4.3mg(理论值的20％)保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.35min；ms(eipos):m/z＝852[m+h]⁺。

如对于中间体f119所述，将4.3mg(4.5μmol)所述中间体溶解于1ml三氟乙醇中并用3.65mg(27μmol)氯化锌去保护。通过制备型hplc纯化得到1mg(经两个步骤，理论值的25％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝708(m+h)⁺

中间体f204

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

首先，在存在17mg(0.046mmol)hatu和20μln,n-二异丙基乙胺的情况下，使25mg(0.038mmol)中间体c58与16.5mg(75％纯的)(0.038mmol)中间体l68反应。在室温下搅拌60min后，将混合物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。得到18.3mg(理论值的56％)保护的中间体。

lc-ms(方法1):rt＝1.32min；ms(eipos):m/z＝851[m+h]⁺。

在第二步中，将该中间体溶解于3ml2,2,2-三氟乙醇中。加入12mg(0.086mmol)氯化锌，并将反应物在50℃下搅拌2h。然后加入25mg(0.086mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸和2ml浓度为0.1％的三氟乙酸水溶液。将反应物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到11mg(理论值的62％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝707(m+h)⁺。

中间体f205

三氟乙酸/1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n⁵-氨基甲酰基-l-鸟氨酸酯(1:1)

所述合成是通过以下方法进行：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将25mg(0.034mmol)中间体c61与29mg(0.041mmol)中间体l69偶联，随后在标准压力下用活性碳上的钯(10％)氢化，然后在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌除去2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基羰基保护基团。hplc纯化得到11mg(经四个步骤，理论值的26％)。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝1061(m+h)⁺。

中间体f206

三氟乙酸/1-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]哌啶-4-基n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酯(1:1)

所述合成是以与中间体f205类似的方式进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝975(m+h)⁺。

中间体f207

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f155类似的方式而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝1020(m+h)⁺。

中间体f209

r-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将93.9mg(0.78mmol)l-半胱氨酸悬浮于93.0mg(1.11mmol)碳酸氢钠和0.9ml水的溶液中。加入溶解于6.0ml异丙醇中的70.0mg(0.11mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体c70)和202.3mg(1.33mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯。将反应混合物在50℃下搅拌90min。加入水(0.1％tfa)，并将反应物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水；0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.9mg(理论值的59％)化合物r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝717(m+h)⁺。

将86.0mg(0.1mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)和58.5mg(0.11mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺溶解于4.0mldmf中，并加入20.9mg(0.21mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入15.5mg(0.26mmol)hoac，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到68.6mg(理论值的59％)化合物r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法6):rt＝2.88min；ms(esipos):m/z＝1115(m+h)⁺。

将46.4mg(0.04mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入17.0mg(0.13mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。再加入8.5mg(0.07mmol)二氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌过夜。加入36.5mg(0.13mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.4mg(理论值的43％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝971(m+h)⁺。

中间体f210

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-d-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f209的合成类似的方式使用d-半胱氨酸制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝971(m+h)⁺。

中间体f211

三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-n-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]丙酰胺(1:1)

首先将30.0mg(0.05mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体c70)与5.5mg(0.05mmol)3-硫烷基丙酸一起加入到0.5ml的甲醇(带有一滴水)中。然后加入23.0mg(0.17mmol)碳酸钾，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入乙酸乙酯，并将有机相用水洗涤一次，用饱和nacl溶液洗涤一次。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到30.3mg(理论值的86％)化合物11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.39min；ms(esipos):m/z＝702(m+h)⁺。

首先将30.0mg(0.04mol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸和9.8mg(0.06mmol)1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮盐酸盐(1:1)加入到2.0ml乙腈中，并加入44.2mg(0.34mmol)n,n-二异丙基乙胺。加入35.4mg(0.06mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到22.0mg(理论值的63％)化合物2-(三甲基硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z＝824(m+h)⁺。

将22.0mg(0.03mol)2-(三甲基硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3-{[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]氨基}-3-氧代丙基)硫烷基]乙酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入9.1mg(0.07mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入19.5mg(0.07mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.0mg(理论值的71％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝680(m+h)⁺。

中间体f212

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10-氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9-氮杂十五烷-15-酰胺(1:1)

首先将28.8mg(0.04mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)与18.3mg(0.05mmol)三氟乙酸/1-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)(中间体l59)一起加入到1.9ml乙腈中。然后加入42.4mg(0.33mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入33.9mg(0.05mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.7mg(理论值的26％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[16-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.44min；ms(esipos):m/z＝812(m+h)⁺。

将10.7mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[16-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-10,15-二氧代-3,6-二氧杂-13-硫杂-9,16-二氮杂十九烷-19-基]氨基甲酸酯溶解于0.8ml三氟乙醇中，并加入8.0mg(0.06mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入17.1mg(0.06mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esipos):m/z＝768(m+h)⁺。

中间体f213

三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)

首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l1)一起加入到1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的35％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.39min；ms(esipos):m/z＝881(m+h)⁺。

将11.9mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基-[13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-n,n,n’,n’-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝2.75min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

中间体f214

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先将111.7mg(0.30mmol)(2s)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到3.0mldmf中，并加入46.1(0.30mmol)hobt、96.6mg(0.30mmol)tbtu和38.9mg(0.30mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于116.3mg(0.9mmol)n,n-二异丙基乙胺和3.0mldmf中的250.0mg(0.30mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到257.0mg(理论值的80％)化合物(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2s)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.55min；ms(esipos):m/z＝1071(m+h)⁺。

在氩气下，首先将24.6mg(0.11mmol)乙酸钯(ii)加入到5.0ml二氯甲烷中，并加入33.2mg(0.33mmol)三乙胺和254.3mg(2.19mmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于5.0ml二氯甲烷中的234.1mg(0.22mmol)(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(2s)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器(cardboardfilter)过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在不加热的情况下，在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到177.5mg(理论值的85％)化合物l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝846(m+h)⁺。

首先将20.0mg(20.83μmol)l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与11.8mg(22.91μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.5mldmf中，并加入6.3mg(62.49μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.4mg(0.07mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到19.1mg(理论值的74％)化合物n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝1244(m+h)⁺。

将17.5mg(14.06μmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入11.5mg(84.37μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入24.7mg(0.08mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的63％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝1100(m+h)⁺。

中间体f215

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[({[(2r)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

首先将14.9mg(0.02mmol)n-乙酰基-s-[2-([3-(l-丙氨酰基氨基)丙基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(实施例229)和7.1mg(0.02mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基-n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸酯加入到1.0mldmf中，并加入5.7mg(0.06mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.5mg(0.08mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.3mg(理论值的78％)化合物n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[({[(2r)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝919(m+h)⁺。

将11.1mg(0.01mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[({[(2r)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-l-丙氨酰胺溶解于5.0ml乙醇中，加入1.0mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在室温、标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过硅藻土过滤，并将滤饼用乙醇/thf/水混合物洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的69％)化合物l-缬氨酰基-n-{3-[({[(2r)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-l-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝785(m+h)⁺。

首先将7.3mg(8.12μmol)l-缬氨酰基-n-{3-[({[(2r)-2-乙酰氨基-2-羧基乙基]硫烷基}乙酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}-l-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)与4.6mg(8.93μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到0.5mldmf中，并加入2.5mg(24.36μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入4.4mg(0.03mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝1183(m+h)⁺。

中间体f216

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将30.2mg(0.06mmol)n,n'-双[(苄氧基)羰基]-l-胱氨酸加入到2.0ml水和2.0ml异丙醇中，并加入56.7mg(0.20mmol)tcep。将反应混合物在室温下搅拌30min。然后加入溶解于2.0ml异丙醇中的50.0mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(氯乙酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯(中间体c70)以及122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后再加入122.2mg(0.48mmol)1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将混合物用乙酸乙酯稀释，并将有机相用水和饱和碳酸氢钠溶液萃取并用饱和nacl溶液洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.1mg(理论值的64％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(苄氧基)羰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝851(m+h)⁺。

首先将16.5mg(0.05mmol)4-甲基苯磺酸/β-丙氨酸苄酯(1:1)与14.0mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺一起加入到1.5ml乙腈中。将反应混合物在室温下搅拌3min，然后加入溶解于1.5ml乙腈中的30.8mg(0.04mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(苄氧基)羰基]-l-半胱氨酸、23.4mg(0.18mmol)n,n-二异丙基乙胺和29.9mg(0.05mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。所得化合物为s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(苄氧基)羰基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.59min；ms(esipos):m/z＝1012(m+h)⁺。

将43.8mg(43.3μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(苄氧基)羰基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸苄酯溶解于8.0ml乙醇中，加入4.4mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在室温、标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物如刚才所述再处理两次。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝788(m+h)⁺。

首先将14.5mg(16.1μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)与9.1mg(17.7μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0mldmf中，并加入4.9mg(48.2μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.4mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.9mg(理论值的50％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.28min；ms(esipos):m/z＝1186(m+h)⁺。

将14.1mg(11.9μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。再加入9.7mg(71.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在70℃下搅拌4h。加入20.8mg(0.07mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到6.2mg(理论值的44％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.82min；ms(esipos):m/z＝1042(m+h)⁺。

中间体f217

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸加入到1.5mldmf中，并加入7.5mg(0.05mmol)hobt、15.5mg(0.05mmol)tbtu和6.2mg(0.05mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.5mldmf中的40.0mg(0.05mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)和18.7mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝854(m+h)⁺。

将10.9mg(12.8μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的65％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝710(m+h)⁺.

中间体f218

n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-γ-谷氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将22.9mg(0.06mmol)(4s)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到2.0mldmf中，并加入9.4mg(0.05mmol)hobt、19.8mg(0.06mmol)tbtu和8.0mg(0.06mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.0mldmf中的51.2mg(0.06mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸(中间体c71)和23.9mg(0.19mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4s)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.52min；ms(esipos):m/z＝1070(m+h)⁺。

在氩气下，首先将3.9mg(0.02mmol)乙酸钯(ii)加入到1.0ml二氯甲烷中，并加入5.3mg(0.05mmol)三乙胺和254.3mg(2.19mmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于1.0ml二氯甲烷中的18.6mg(0.02mmol)(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-{[(4s)-5-(苄氧基)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酰基]氨基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸。在减压和不加热的情况下蒸发溶剂。将残余物溶于乙腈中，通过注射器过滤器过滤并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.0mg(理论值的66％)化合物l-γ-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.14min；ms(esipos):m/z＝846(m+h)⁺。

首先将15.0mg(15.6μmol)l-γ-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与8.8mg(17.2μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0mldmf中，并加入4.7mg(46.9μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.3mg(0.06mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.2mg(理论值的70％)化合物n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-γ-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法4)rt＝1.24min；ms(esipos):m/z＝1244(m+h)⁺。

将13.8mg(11.1μmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-γ-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇，并加入9.1mg(66.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入19.4mg(0.07mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min,mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(理论值的50％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝1100(m+h)⁺。

中间体f235

三氟乙酸/n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-{4-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基甲酰基]苯基}-l-丙氨酰胺(1:1)

将120.0mg(0.22mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯(参见中间体c11的合成)和52.1mg(0.28mmol)4-硝基苯甲酰氯溶解于8.0ml二氯甲烷中，并加入28.4mg(0.28mmol)三乙胺。将反应混合物在室温下搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。得到97.7mg(理论值的64％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.54min；ms(esipos):m/z＝705(m+h)⁺。

将97.0mg(0.14mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(4-硝基苯甲酰基)氨基]丙基}氨基甲酸酯溶解于5.0ml乙醇中，加入9.7mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化5h。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到87.4mg(理论值的88％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸酯.

lc-ms(方法1):rt＝1.47min；ms(esipos):m/z＝675(m+h)⁺。

首先将59.3mg(0.09mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{3-[(4-氨基苯甲酰基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]丙基}氨基甲酸酯和25.5mg(0.11mmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酸与68.1mg(0.53mmol)n,n-二异丙基乙胺一起加入到5.0ml乙腈中。缓慢加入72.7mg(0.11mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到52.2mg(理论值的68％)化合物[(2s)-1-{[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.48min；ms(esipos):m/z＝880(m+h)⁺。

将23.9mg(0.03mmol)[(2s)-1-{[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]氨基}-1-氧代丙-2-基]氨基甲酸苄酯溶解于3.0ml乙酸乙酯中，加入2.4mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化2h。将反应混合物通过纸过滤器过滤，并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。在减压下蒸发溶剂。残余物不经进一步纯化即用于下一合成步骤。得到20.1mg(理论值的90％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-([4-(l-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝746(m+h)⁺。

首先将20.0mg(0.03mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-([4-(l-丙氨酰基氨基)苯甲酰基]{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基)丙基]氨基甲酸酯与14.9mg(0.04mmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酸酯一起加入到2.0mldmf中，并加入5.4mg(0.05mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到化合物n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.49min；ms(esipos):m/z＝979(m+h)⁺。

将17.0mg(17.4μmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺溶解于2.5ml乙酸乙酯中，加入1.7mg活性碳上的钯(10％)，并将混合物在标准压力下氢化过夜。将反应混合物通过纸过滤器过滤，并将滤饼用乙酸乙酯洗涤。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.3mg(理论值的60％)化合物l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法1):rt＝1.15min；ms(esipos):m/z＝845(m+h)⁺。

首先将15.3mg(0.01mmol)l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺与7.9mg(0.02mmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到2.4mldmf中，并加入1.9mg(0.02mmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入1.4mg(0.02mmol)乙酸。将反应混合物直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.7mg(理论值的70％)化合物n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺。

将11.7mg(0.01mmol)n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-γ-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-缬氨酰基-n-[4-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[3-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丙基]氨基甲酰基)苯基]-l-丙氨酰胺溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入3.9mg(0.03mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入8.3mg(0.03mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.4mg(理论值的47％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝1100(m+h)⁺。

中间体f236

(2r)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-4-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丁酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f192类似的方式由(2r)-4-{[(苄氧基)羰基]氨基}-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]丁酸/n-环己基环己胺(1:1)进行。

lc-ms(方法4):rt＝1.1min；ms(esipos):m/z＝751(m+h)⁺。

中间体f238

三氟乙酸/n-{(2s)-1-氨基-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙-2-基}-n'-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙基]琥珀酰胺(1:1)

将18mg(0.025mmol)中间体c72溶于6mldmf中，并在存在11.3mg(0.03mmol)hatu和22μln,n-二异丙基乙胺的情况下与7.5mg(0.03mmol)三氟乙酸/1-(2-氨基乙基)-1h-吡咯-2,5-二酮(1:1)偶联。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水1:1中冻干。得到15mg(理论值的67％)中间体。

lc-ms(方法4):rt＝1.71min；ms(eipos):m/z＝873[m+na]⁺。

然后通过在4ml三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述)而由该中间体制备标题化合物。通过制备型hplc纯化得到8.5mg(理论值的63％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝707(m+na)⁺。

中间体f239

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将7.5mg(0.05mmol)(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸加入到1.5mldmf中，并加入7.5mg(0.05mmol)hobt、15.5mg(0.05mmol)tbtu和6.2mg(0.05mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于1.5mldmf中的40.0mg(0.05mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)和18.7mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺，并将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.2mg(理论值的25％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝854(m+h)⁺。

将10.9mg(12.8μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入10.4mg(76.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入22.4mg(0.08mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到7.5mg(理论值的65％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝710(m+h)⁺。

中间体f240

三氟乙酸/3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺(1:1)

首先将27.5mg(0.04mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)与15.9mg(0.05mmol)三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l1)一起加入到1.8ml乙腈中。然后加入32.4mg(0.31mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入32.4mg(0.05mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.9mg(理论值的35％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.39min；ms(esipos):m/z＝881(m+h)⁺。

将11.9mg(0.01mol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基-[13-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-16-基]氨基甲酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入5.5mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入11.8mg(0.04mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.4mg(理论值的60％)标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝2.75min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

中间体f241

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[n-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}乙基)丁酰胺(1:1)

标题化合物是以与中间体c66类似的方式通过与市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联并随后用氯化锌去封闭而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(eipos):m/z＝733和735[m+h]⁺。

中间体f242

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f104类似的方式进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝707(m+h)⁺。

中间体f243

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]丁酰胺(1:1)

标题化合物的合成是以与中间体f242类似的方式进行。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝737(m+h)⁺。

中间体f244

n-{2-[(s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺

首先将100mg(约0.101mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]-l-半胱氨酸(中间体c73)加入到88ml二甲基甲酰胺中，并加入107mg(约0.15mmol)n-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(中间体l73)、46mg(0.12mmol)hatu和88μl(0.50mmol)。将反应混合物在室温下搅拌15分钟。向混合物中加入水/二氯甲烷，然后将有机相用水和盐水洗涤，经硫酸镁干燥，在旋转蒸发仪上浓缩并在高真空下干燥。残余物不经进一步纯化即进一步使用。得到92mg(59％，纯度72％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.59min；ms(esipos):m/z＝1096(m+h)⁺。

在氩气下，将40mg(0.30mmol)氯化锌加入到91mg(约0.06mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[(9r)-4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,10,15-三氧代-9-{[3-(三甲基甲硅烷基)丙酰基]氨基}-7-硫杂-4,11,14-三氮杂二十烷-1-基]氨基甲酸酯在1.45ml三氟乙醇中的溶液。将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入30mg(0.22mmol)氯化锌，并将混合物在室温下再搅拌1h。加入52mg(0.18mmol)edta，在室温下搅拌10分钟后，将混合物用水/乙腈稍微稀释并通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度)纯化。得到17mg(31％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.80min；ms(esipos):m/z＝808(m+h)⁺。

中间体f245

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-n'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在15mg(0.04mmol)hatu和9μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.0135mmol)中间体c65与8mg(0.027mmol)中间体l1在8mldmf中偶联，随后在三氟乙醇用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述)。通过制备型hplc纯化得到8.8mg(经两个步骤，理论值的58％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝778(m+h)⁺。

中间体f247

三氟乙酸/4-[(2-{[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-2-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)

将14mg(0.018mmol)中间体c66溶解于14mldcm中，加入10.1mg(0.037mmol)2-溴-1-乙基吡啶鎓四氟硼酸盐(bep)并以一次少量的方式加入总共250μl吡啶，ph保持在5和6之间。然后用乙酸将ph调节至4，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。合并适当的级分，冻干并干燥，得到4mg(理论值的21％)保护的中间体，然后将其用氯化锌在氨基官能团处去保护。hplc纯化并冻干得到3mg(理论值的72％)标题化合物，其为无色泡沫状物形式。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝805和807(m+h)⁺。

中间体f248

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]乙基}丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在hatu的情况下，将10mg(0.015mmol)中间体c58与5mg(0.017mmol)中间体l12偶联，随后用氯化锌去保护。得到6.5mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝680(m+h)⁺。

中间体f254

三氟乙酸/(3s)-4-[(2-{[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-3-溴-4-氧代丁酸甲酯(1:1)

标题化合物是以与中间体247类似的方式通过以下方法制备：通过将15mg(0.02mmol)中间体c66与21mg(0.099mmol)(2s)-2-溴-4-甲氧基-4-氧代丁酸偶联(其是如(j.org.chem.200,65,517-522)中所述由(2s)-2-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁酸盐酸盐(1:1)合成)。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝805和807(m+h)⁺。

中间体f255

r/s-(n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基})高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先将13.1mg(0.04mmol)(2s)-5-(苄氧基)-2-{[(苄氧基)羰基]氨基}-5-氧代戊酸加入到1.0mldmf中，并加入5.4mg(0.04mmol)hobt、11.4mg(0.04mmol)tbtu和4.6mg(0.04mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于12.9mg(0.1mmol)n,n-二异丙基乙胺和1mldmf中的30.0mg(0.04mmol)r/s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c11)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到32mg(73％)化合物4-[2-[[(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2s)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.53min；ms(esipos):m/z＝1084(m+h)⁺。

将41.4mg(0.038mmol)4-[2-[[(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基]-[3-(2-三甲基甲硅烷基乙氧基羰基氨基)丙基]氨基]-2-氧代乙基]硫烷基-2-[[(2s)-5-苄氧基-2-(苄氧基羰基氨基)-5-氧代-戊酰基]氨基]丁酸溶解于10ml乙醇中，加入4.2mgpd/c，并将混合物在标准压力下氢化。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用乙醇洗涤。在减压和不加热的情况下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x40；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到21.1mg(56％)化合物r/s-(l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.11min；ms(esipos):m/z＝860(m+h)⁺。

首先将20.4mg(20.94μmol)r/s-(l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)与11.8mg(23.04μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-{15-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-15-氧代-3,6,9,12-四氧杂十五烷-1-基}丙酰胺一起加入到1.0mldmf中，并加入4.2mg(41.88μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入3.1mg(0.05mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(36％)化合物r/s-(n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.66min；ms(esipos):m/z＝1259(m+h)⁺。

将9.4mg(7.47μmol)r/s-(n-[19-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十九烷-1-酰基]-l-α-谷氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基))高半胱氨酸溶解于1.5ml三氟乙醇中，并加入6.1mg(44.81μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入13.1mg(0.05mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.9mg(75％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝1114(m+h)⁺。

中间体f256

三氟乙酸/n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁基}-n'-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙基]琥珀酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.014mmol)中间体c65和9.6mg(0.027mmol)三氟乙酸/n-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护(如对于中间体f119所述的)。通过制备型hplc纯化得到8mg(经两个步骤，理论值的64％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝822(m+h)⁺。

中间体f257

r-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将50.0mg(0.06mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)和29mg(0.07mmol)3-[2-[2-[2-[2-[[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基]丙酸(中间体l74)溶解于3.0mldmf中，并加入27.3mg(0.07mmol)hatu和23.3mg(0.18mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(26％)化合物r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法6):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1101(m+h)⁺。

将17mg(0.02mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基]-l-半胱氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.05mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入13.5mg(0.05mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.6mg(46％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝957(m+h)⁺。

中间体f258

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-[3-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-3-氧代丙基]丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：使用hatu将中间体c58与三氟乙酸/[2-(β-丙氨酰基氨基)乙基]氨基甲酸苄酯(1:1)偶联，随后氢解，然后与1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，最后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝747和749(m+h)⁺。

中间体f259

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[n-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

将75mg(0.114mmol)中间体c58溶于12.5mldmf中，并在存在65mg(0.11mmol)hatu和79μln,n-二异丙基乙胺的情况下与78mg(0.171mmol)中间体l75偶联。通过制备型hplc纯化后，将该中间体溶于20ml乙醇中，并在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后将催化剂滤出，在减压下除去溶剂，并将产物通过制备型hplc纯化。从乙腈/水1:1中冻干，得到63mg(经两个步骤，理论值的64％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-n-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-2-({[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}氨基)丁酰基]-d-丙氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.16min；ms(eipos):m/z＝844[m+h]⁺。

然后如上所述，在存在hatu的情况下，将40mg(0.047mmol)该中间体与n-[(苄氧基)羰基]甘氨酸偶联，然后再一次氢解去保护。

然后通过以下方法制备标题化合物：在存在4μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将10mg(0.012mmol)该中间体与7.7mg(0.032mmol)市售的1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮偶联，随后在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型hplc纯化(如对于中间体f119所述的)，得到1.3mg标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝777和779(m+h)⁺。

中间体f260

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n²-{n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是以与中间体f155类似的方式而制备。

lc-ms(方法1):rt＝0.81min；ms(esipos):m/z＝1020(m+h)⁺。

中间体f261

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙基)丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在hatu的情况下，将20mg(0.03mmol)中间体c58与25.8mg(0.061mmol)中间体l77偶联，随后用氯化锌去保护。得到11.9mg(经两个步骤，理论值的47％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝722和720(m+h)⁺。

中间体f262

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先将30mg(36μmol)s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)与16.9mg(40μmol)3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-n-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]丙酰胺一起加入到1.5mldmf中，并加入10.9mg(108μmol)4-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后加入7.58mg(0.13mmol)乙酸。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到33.4mg(理论值的80％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1027(m+h)⁺。

将32.8mg(32μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-{3-[2-(2-{[3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸溶解于3.0ml三氟乙醇中，并加入26.1mg(192μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2h。加入56.0mg(0,192mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物冻干。得到22.9mg(理论值的71％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝883(m+h)⁺。

中间体f263

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将30.0mg(0.036mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)和9.8mg(0.04mmol)n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酸(中间体l78)溶解于1.0mldmf中，并加入16.4mg(0.04mmol)hatu和14.0mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.2mg(13％)化合物n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法6):rt＝1.31min；ms(esipos):m/z＝925(m+h)⁺。

将11.3mg(0.011mmol)n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-β-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.0mg(0.04mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入10.7mg(0.04mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(40％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝781(m+h)⁺。

中间体f264

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将30.0mg(0.036mmol)r-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)和12.2mg(0.04mmol)n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酸(中间体l79)溶解于1.0mldmf中，并加入16.4mg(0.04mmol)hatu和14.0mg(0.11mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到8.9mg(24％)化合物n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法6):rt＝1.38min；ms(esipos):m/z＝981(m+h)⁺。

将15.3mg(0.015mmol)n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-β-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入6.3mg(0.045mmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌2小时。加入13.5mg(0.045mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.1mg(62％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.92min；ms(esipos):m/z＝837(m+h)⁺。

中间体f265

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺(1:1)

首先将30.0mg(42.7μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)和25.3mg(55.6μmol)三氟乙酸/n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体l82)加入到1.9ml乙腈中，并加入60μl(340μmol)n,n-二异丙基乙胺和33μl(56μmol)2,4,6-三丙基-1,3,5,2,4,6-三氧杂三磷杂环己烷2,4,6-三氧化物(2,4,6-tripropyl-1,3,5,2,4,6-trioxatriphosphinane2,4,6-trioxide)(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到26.7mg(理论值的60％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.40min；ms(esipos):m/z＝1025(m+h)⁺。

将25.3mg(24.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,10,21-三氧代-14,17-二氧杂-7-硫杂-4,11,20-三氮杂二十六烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入20.2mg(148μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入43.3mg(148μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到23.4mg(理论值的95％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝881(m+h)⁺。

中间体f266

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,13-二氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12-二氮杂十八烷-18-酰胺(1:1)

首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)与22.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/n-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙基}-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l83)一起加入到1.9ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到20.5mg(理论值的49％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.38min；ms(esipos):m/z＝969(m+h)⁺。

将19.1mg(19.7μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[19-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,13,18-三氧代-6,9-二氧杂-16-硫杂-3,12,19-三氮杂二十二烷-22-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入16.1mg(118μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入34.6mg(118μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.9mg(理论值的75％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝825(m+h)⁺。

中间体f267

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将13.4mg(33.3μmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸(中间体l74)加入到1.0mldmf中，并加入9.3μl(54.4μmol)n,n-二异丙基乙胺和12.6mg(33.3μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.7μl(27.7μmol)n,n-二异丙基乙胺和1.0mldmf中的25.0mg(27.7μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(参见中间体f216的合成)。将反应混合物在室温下搅拌90分钟。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的19％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸。

lc-ms(方法5):rt＝4.44min；ms(esipos):m/z＝1172(m+h)⁺。

将6.70mg(5.71μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酰基-β-丙氨酸溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.67mg(34.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入10mg(34.3μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.4mg(理论值的67％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝1028(m+h)⁺。

中间体f268

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-28-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-6,23-二氧代-10,13,16,19-四氧杂-3-硫杂-7,22-二氮杂二十八烷-1-酰胺(1:1)

首先将30.0mg(0.043mmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)与30.2mg(0.056mmol)三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)(中间体l84)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入60μl(0.34mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入33μl(0.056mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到27.9mg(理论值的59％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.41min；ms(esipos):m/z＝1114(m+h)⁺。

将25.6mg(23.0μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-32-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-5,10,27-三氧代-14,17,20,23-四氧杂-7-硫杂-4,11,26-三氮杂三十二烷-1-基]氨基甲酸酯溶解于2.5ml三氟乙醇中，并加入18.8mg(138μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入40.3mg(138μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到22.2mg(理论值的88％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝969(m+h)⁺。

中间体f269

4-{[(8r,14r)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)

首先将17.0mg(0.0195mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-l-半胱氨酸(中间体c77)与4.99mg(0.0253mmol)n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(中间体l1)一起加入到1.0ml乙腈中。然后加入27μl(0.16mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入15μl(0.025mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入水(2.0ml)。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.5mg(理论值的46％)化合物4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.47min；ms(esipos):m/z＝1052(m+h)⁺。

将8.3mg(7.89μmol)4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-23-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌6h。加入6.45mg(47.3μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌过夜。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.10mg(理论值的14％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝852(m+h)⁺。

中间体f270

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-n'-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)琥珀酰胺(1:1)

在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体c78)加入到1.0mldmf中，并加入8.0μl(45.8μmol)n,n-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)n,n-二异丙基乙胺和1.0mldmf中的8.54mg(27.4μmol)三氟乙酸/n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l1)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到14.7mg(理论值的77％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法5):rt＝1.33min；ms(esipos):m/z＝835(m+h)⁺。

将13.2mg(15.8μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{4-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-4-氧代丁酰基}氨基)丙基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.9mg(94.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入27.7mg(94.6μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.9mg(理论值的83％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝691(m+h)⁺。

中间体f271

4-{[(20r,26r)-25-(3-氨基丙基)-26-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-27,27-二甲基-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-20-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将19.4mg(22.2μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-l-半胱氨酸(中间体c77)加入到2.0mldmf中，并加入21.7mg(44.4μmol)三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l74)、12μl(67μmol)n,n-二异丙基乙胺和16.9mg(44.4μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.1mg(理论值的66％)化合物4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。

lc-ms(方法4):rt＝1.79min；ms(esipos):m/z＝1250(m+na)⁺。

将18.1mg(14.7μmol)4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-35-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-6,12,17,34-四氧代-5,21,24,27,30-五氧杂-14-硫杂-7,11,18,33-四氮杂-2-硅杂三十五烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.0mg(88.4μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入25.8mg(88.4μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到12.3mg(理论值的73％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝1028(m+h)⁺。

中间体f272

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-n'-[17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-16-氧代-3,6,9,12-四氧杂-15-氮杂十七烷-1-基]琥珀酰胺(1:1)

在氩气下，首先将15.0mg(22.9μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十五烷-15-酸(中间体c78)加入到1.0mldmf中，并加入8.0μl(45.8μmol)n,n-二异丙基乙胺和10.4mg(27.4μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.0μl(22.9μmol)n,n-二异丙基乙胺和1.0mldmf中的13.4mg(27.4μmol)三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到15.8mg(理论值的68％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[23-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.35min；ms(esipos):m/z＝1011(m+h)⁺。

将15.1mg(14.9μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[23-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,19,22-三氧代三氧代-6,9,12,15-四氧杂-3,18,23-三氮杂二十六烷-26-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入12.2mg(89.6μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入26.2mg(89.6μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.3mg(理论值的70％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝867(m+h)⁺。

中间体f273

三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,19-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18-二氮杂二十四烷-24-酰胺(1:1)

在氩气下，首先将20.0mg(28.5μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)加入到1.0mldmf中，并加入10.0μl(57.0μmol)n,n-二异丙基乙胺和13.0mg(34.2μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于5.0μl(28.5μmol)n,n-二异丙基乙胺和1.0mldmf中的16.7mg(34.2μmol)三氟乙酸/n-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷-1-基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(1:1)(中间体l85)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到18.6mg(理论值的62％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.37min；ms(esipos):m/z＝1057(m+h)⁺。

将17.1mg(16.2μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基[25-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,19,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,18,25-三氮杂二十八烷-28-基]氨基甲酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入13.2mg(97.0μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入28.4mg(97.0μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到9.80mg(理论值的59％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝913(m+h)⁺。

中间体f274

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先将13.9mg(0.0167mmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)与7.07mg(0.0217mmol)n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸(中间体l86)一起加入到2.0ml乙腈中。然后加入23μl(0.13mmol)n,n-二异丙基乙胺，并逐滴加入13μl(0.022mmol)t3p(50％，在乙酸乙酯中)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.70mg(理论值的19％)化合物n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.34min；ms(esipos):m/z＝1024(m+h)⁺。

将10.6mg(10.3μmol)n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入8.46mg(62.1μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入18.1mg(62.1μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的54％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.69min；ms(esipos):m/z＝880(m+h)⁺。

中间体f275

n-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-l-α-谷氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

首先将39.0mg(55.6μmol)11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-酸(中间体c69)加入到4.0mldmf中，加入41.6mg(111μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-l-谷氨酸酯盐酸盐(1:1)(中间体l89)、29μl(170μmol)n,n-二异丙基乙胺和42.3mg(111μmol)hatu，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌1小时，用乙酸淬灭并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.1mg(理论值的93％)化合物1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-l-谷氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.71min；ms(esipos):m/z＝1021[m+h]⁺

在氩气下，首先将7.60mg(33.9μmol)乙酸钯(ii)加入到3.0ml二氯甲烷中，并加入14μl(100μmol)三乙胺和110μl(680μmol)三乙基硅烷。将反应混合物在室温下搅拌5min，并加入溶解于3.0ml二氯甲烷中的69.2mg(67.7μmol)1-苄基-5-[2-(三甲基甲硅烷基)乙基]-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-l-谷氨酸酯。将反应混合物在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过纸板过滤器过滤，并将滤饼用二氯甲烷洗涤。在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到38.4mg(理论值的61％)化合物(19s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.53min；ms(esipos):m/z＝931(m+h)⁺。

首先将10.0mg(10.7μmol)(19s)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-19-{3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十烷-20-酸(中间体c69)加入到1.0mldmf中，加入6.73mg(21.5μmol)n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺/2,2,2-三氟乙烷-1,1-二醇(1:1)(中间体l1)、5.6μl(32μmol)n,n-二异丙基乙胺和8.17mg(21.5μmol)hatu，并将混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物在室温下搅拌3小时，用乙酸淬灭，并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到6.90mg(理论值的58％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基n2-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-l-α-谷氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.57min；ms(esipos):m/z＝1110[m+h]⁺

将6.90mg(6.21μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基n²-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-l-α-谷氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入5.1mg(37.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入10.1mg(74.4μmol)二氯化锌，将反应混合物在50℃下搅拌过夜并在室温下搅拌72h。加入54.5mg(186μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.4mg(理论值的39％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝866(m+h)⁺。

中间体f276

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，首先将9.08mg(28.9μmol)3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酸(中间体l87)加入到1.0mldmf中，并加入8.33μl(48.2μmol)n,n-二异丙基乙胺和11.0mg(28.9μmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10min。然后加入溶解于4.67μl(24.1μmol)n,n-二异丙基乙胺和1.0mldmf中的20.0mg(27.7μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体c71)。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.70mg(理论值的19％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法12):rt＝2.47min；ms(esipos):m/z＝1013(m+h)⁺。

将13.9mg(13.7μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-{3-[2-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙氧基)乙氧基]丙酰基}-l-半胱氨酸溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入5.6mg(41.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌30分钟。加入24.1mg(82.4μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10.8mg(理论值的80％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.58min；ms(esipos):m/z＝869(m+h)⁺。

中间体f277

n-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-d-丙氨酸酯(1:1)(中间体c80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.57min；ms(esipos):m/z＝1008(m+h)⁺。

将5.80mg(5.75μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸酯溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入4.70mg(34.5μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌5h。加入20.2mg(69.0μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.70mg(理论值的34％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.90min；ms(esipos):m/z＝764(m+h)⁺。

中间体f278

n-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

将10.0mg(9.98μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-d-丙氨酸酯(1:1)(中间体c80)和2.77mg(11.0μmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入3.3μl(30μmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌过夜。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.50mg(理论值的54％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-d-丙氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.51min；ms(esipos):m/z＝1024(m+h)⁺。

将5.50mg(5.36μmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-d-丙氨酸酯溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入4.39mg(32.2μmol)二氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌4h。加入28.2mg(96.5μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，并将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.70mg(理论值的56％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝781(m+h)⁺。

中间体f279

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n-[3-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}[({(2r)-2-羧基-2-[(3-羧基丙酰基)氨基]乙基}硫烷基)乙酰基]氨基)丙基]-l-丙氨酰胺

将12.2mg(14μmol)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-l-半胱氨酸(中间体c77)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入11.4mg(83.8μmol)二氯化锌。将反应混合物在50℃下搅拌3h。加入24.5mg(83.8μmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.60mg(理论值的42％)化合物4-{[(1r)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝673(m+h)⁺。

将10.0mg(12.7μmol)4-{[(1r)-2-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)-1-羧基乙基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)和7.41mg(12.7μmol)2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酯(中间体l88)溶解于1.5ml二甲基甲酰胺中，并加入4.4μl(25μmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌2h。加入2.0μl(35μmol)乙酸，并将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.20mg(理论值的39％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.11min；ms(esipos):m/z＝1036(m+h)⁺。

中间体f280

三氟乙酸/n-[2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)乙基]-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯甲酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方式由中间体c64制备：通过与市售的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝755(m+h)⁺。

中间体f281

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[n-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，通过肽化学的经典方法制备修饰的氨基酸结构单元n-(溴乙酰基)-β-丙氨酸和2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸酯。然后在存在hatu和吗啉的情况下将这些偶联。然后使用浓度为10％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到中间体2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-{[n-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}-d-丙氨酸酯。

最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体c58偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.87min；ms(esipos):m/z＝791和793(m+h)⁺。

中间体f282

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(3-{[n-(溴乙酰基)甘氨酰基]氨基}丙基)丁酰胺(1:1)

首先，通过肽化学的经典方法由甘氨酸叔丁酯和溴代乙酸酐制备中间体三氟乙酸/n-(3-氨基丙基)-n2-(溴乙酰基)甘氨酰胺(1:1)。

最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体c58偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝747和749(m+h)⁺。

中间体f283

n-[(2r)-2-({(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}氨基)-2-羧基乙基]-n²-(溴乙酰基)-l-α-天冬酰胺/三氟乙酸(1:1)

首先，由(2s)-2-氨基-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐制备修饰的氨基酸结构单元(2s)-2-[(溴乙酰基)氨基]-4-氧代-4-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丁酸和溴代乙酸酐，并由市售的3-{[(苄氧基)羰基]氨基}-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸/n-环己基环己胺(1:1)制备氨基酸结构单元2-(三甲基甲硅烷基)乙基-3-氨基-n-(叔丁氧基羰基)-d-丙氨酸酯。在存在hatu和吗啉的情况下将这两种结构单元偶联，然后使用浓度为5％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团，并由此得到中间体三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-n-{(2r)-2-氨基-3-氧代-3-[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]丙基}-n2-(溴乙酰基)-l-α-天冬氨酸酯(1:1)。

最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和4-甲基吗啉的情况下，将该中间体与中间体c58偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝835和837(m+h)⁺。

中间体f284

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将中间体l80与市售的(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为16％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。

最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体c58偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法12):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝984.45(m+h)⁺。

中间体f285

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-[(18-溴-17-氧代-4,7,10,13-四氧杂-16-氮杂十八烷-1-酰基)氨基]-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，将中间体l80用市售的溴代乙酸酐酰化，然后使用浓度为20％的三氟乙酸的二氯甲烷溶液除去叔丁氧基羰基保护基团，得到甲硅烷基乙基酯保护基团。

最后，通过以下方法制备标题化合物：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将该中间体与中间体c58偶联，随后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.85min；ms(esipos):m/z＝967和969(m+h)⁺。

中间体f286

1-[(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}-d-丙氨酰基)氨基]-3,6,9,12-四氧杂十五烷-15-酸/三氟乙酸(1:1)

首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将中间体l91与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联，然后使用浓度为12.5％的tfa的dcm溶液除去boc保护基团。在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下将所得中间体与中间体c58偶联，然后通过用氯化锌去保护而转化为标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝984(m+h)⁺。

中间体f288

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-({n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丝氨酰基}氨基)-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，偶联35mg(39μmol)中间体c74与n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丝氨酸(其已经预先由o-叔丁基-l-丝氨酸叔丁酯和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸制备)。用氯化锌去保护并通过hplc纯化，得到14mg(理论值的38％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.43min；ms(esipos):m/z＝824.34(m+h)⁺。

中间体f289

n²-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-n⁶-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-d-赖氨酸/三氟醋酸盐(1:1)

首先，通过肽化学的经典方法由n⁶-[(苄氧基)羰基]-n²-(叔丁氧基羰基)-d-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-n⁶-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-d-赖氨酸酯(1:1)。

然后，在存在hatu和4-甲基吗啉的情况下，将12.5mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体c58偶联。用氯化锌去保护并通过hplc纯化，得到14mg(理论值的53％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝779(m+h)⁺。

中间体f290

n²-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-n⁶-(溴乙酰基)-d-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先，通过肽化学的经典方法由n⁶-[(苄氧基)羰基]-n²-(叔丁氧基羰基)-d-赖氨酸制备三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基-n6-(溴乙酰基)-d-赖氨酸酯(1:1)。

然后，在存在hatu和4-甲基吗啉的情况下，将12mg(25μmol)该中间体与15mg(23μmol)中间体c58偶联。用氯化锌去保护并通过hplc纯化，得到7mg(理论值的36％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.86min；ms(esipos):m/z＝762和764(m+h)⁺。

中间体f291

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-n-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-丙氨酰胺

标题化合物是通过以下方法由实施例m9制备：首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去z保护基团，然后通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联而将去保护的中间体转化成标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.21min；ms(esipos):m/z＝777(m+h)⁺。

中间体f293

n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-3-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)苯甲酰基]氨基}-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)

将35mg(39μmol)中间体c74溶解于4mldmf中，并在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，与13.5mg(43μmol)市售的1-(3-{[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]羰基}苯基)-1h-吡咯-2,5-二酮偶联。用氯化锌去保护并通过hplc纯化，得到12mg(理论值的34％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝799(m+h)⁺。

中间体f294

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-缬氨酰基-n-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-丙氨酰胺

在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体c76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。

将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于dmf中，并加入13mg(0.039mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和7μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将反应物浓缩，并将残余物通过hplc纯化。得到9mg(理论值的45％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝895(m+h)⁺。

中间体f295

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-n-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-丙氨酰胺

在室温、氢标准压力下，将溶解于12ml甲醇中的41mg(0.05mmol)中间体c76经10mg活性碳上的钯(10％)氢化1h。然后，将催化剂滤出，并在减压下除去溶剂。得到32mg(理论值的92％)去保护的中间体。

将15mg(0.022mmol)该中间体溶解于4mldmf中，并加入10mg(0.039mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮和7μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌2h后，将反应物浓缩，并将残余物通过hplc纯化。得到10mg(理论值的56％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝821(m+h)⁺。

中间体f296

三氟乙酸/(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-{2-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)磺酰基]乙基}丁酰胺(1:1)

标题化合物是通过以下方法由中间体l81制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与中间体c58偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下，在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化30min而除去z保护基团。然后，通过以下方法将去保护的中间体转化成标题化合物：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝785(m+h)⁺。

中间体f297

s-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体1)

在氩气下，将15mg(0.11mmol)氯化锌加入到36mg(0.03mmol，纯度68％)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸(中间体c92)在0.74ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌7h。然后加入32mg(0.11mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到6.4mg(理论值的25％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝792(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f298

s-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(异构体2)

在氩气下，将19mg(0.14mmol)氯化锌加入到45mg(0.04mmol，71％纯的)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸(中间体c91)在0.94ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入42mg(0.14mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到5.7mg(理论值的18％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.96min；ms(esipos):m/z＝791(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f299

s-(2-{(3-氨基丙基)[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]氨基}-2-氧代乙基)-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

向88.0mg(0.09mmol)s-{11-[(r)-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基](环己基)甲基]-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基}-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-半胱氨酸(中间体c84)在1.88ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入76.8mg(0.57mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入164.6mg(0.57mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸钠干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到31mg(理论值的35％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.82min；ms(esipos):m/z＝792(m+h)⁺。

中间体f300

(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-n-(2-{[(2r)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)丁酰胺

在氩气下，向7mg(0.08mmol)2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2r)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)丙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}氨基甲酸酯(中间体c100)在0.2ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入11mg(0.08mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入14mg(0.05mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到1.6mg(理论值的27％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.88min；ms(esipos):m/z＝707(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f302

s-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(吡咯烷-3-基甲基)氨基]-2-氧代乙基}-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸三氟乙酸酯(1:1)(异构体1)

在氩气下，向56.9mg(58.2mmol，纯度85％)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-半胱氨酸(中间体c94)在1.4ml2,2,2-三氟乙醇中的混合物中加入31.7mg(0.23mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌3h。然后加入68.0mg(0.23mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到7mg(理论值的13％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝736(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f305

n-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-22-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-6,17-二氧代-n-(吡咯烷-3-基甲基)-10,13-二氧杂-3-硫杂-7,16-二氮杂二十二烷-1-酰胺/三氟乙酸(1:1)(异构体2)

向24.80mg(0.02mmol)3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-24-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,19-三氧代-12,15-二氮杂-5-硫杂-2,9,18-三氮杂二十四烷-1-基]吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(中间体c99)在0.65ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入13.42mg(0.10mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌8h。然后加入28.78mg(0.10mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。向反应混合物中加入乙酸乙酯，并将有机相用水和用饱和nacl溶液反复洗涤。将有机相经硫酸镁干燥，并在减压下蒸发溶剂。将残余物通过制备型hplc纯化。得到10mg(理论值的44％)标题化合物。

lc-ms(方法5):rt＝3.11min；ms(esipos):m/z＝907(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f306

n⁶-(n-{(2s)-2-氨基-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丁酰基}-β-丙氨酰基)-n2-{n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-β-丙氨酰基}-l-赖氨酸/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在16.7mg(0.044mmol)hatu和15μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将24mg(0.029mmol)中间体c61与30mg(0.035mmol)中间体l99偶联，随后如对于中间体f119所述在三氟乙醇中用氯化锌去保护。通过制备型hplc纯化，得到19mg(经两个步骤，理论值的52％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝1091(m+h)⁺。

中间体f307

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-{(5r,14r)-13-[(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

将8.90mg(8.88μmol)三氟乙酸/2-(三甲基甲硅烷基)乙基3-氨基-n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-d-丙氨酸酯(1:1)(中间体c80)和2.31mg(9.77μmol)1-(2-溴乙酰氧基)吡咯烷-2,5-二酮溶解于1ml二甲基甲酰胺中，并加入2.9μl(27μmol)n-甲基吗啉。将反应混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.80mg(理论值的65％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.57min；ms(esipos):m/z＝1008(m+h)⁺。

将2-(三甲基甲硅烷基)乙基n-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14-硫杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十七烷-17-基)-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸酯(31.9mg，31.6μmol)和l-半胱氨酸(7.66mg，63.2μmol)溶解于3.0mldmf中，并在室温下搅拌过夜。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到28.1mg(理论值的76％)化合物s-[(19r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法12):rt＝2.52min；ms(esipos):m/z＝1049[m+h]⁺

将s-[(19r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(13.5mg，11.6μmol)溶解于1.0mldmf中，加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酯(6.76mg，11.6μmol)(中间体l88)和n,n-二异丙基乙胺(4.0μl，23μmol)，并将混合物在室温下搅拌1h。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到11.1mg(理论值的68％)化合物n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-[(19r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法14):rt＝7.38min；ms(esipos):m/z＝1412[m+h]⁺

将n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-s-[(19r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-19-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-5-氧杂-14-硫杂-7,11,18,21-四氮杂-2-硅杂二十三烷-23-基]-l-半胱氨酸(9.40mg，6.65μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(5.44mg，39.9μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(5.44mg，39.9μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(23.4mg，79.8μmol)加入反应混合物中(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到5.60mg(理论值的66％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝1168(m+h)⁺。

中间体f308

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n-[(12r,19r)-19-氨基-4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-12,19-二羧基-5,10,15-三氧代-7,17-二硫杂-4,11,14-三氮杂十九烷-1-基]-l-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

将n-[3-({2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}硫烷基)丙酰基]-3-[(溴乙酰基)氨基]-d-丙氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.7mg，14.5μmol)和n-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-半胱氨酸(3.84mg，14.5μmol)溶解于1.5mldmf中并在室温下搅拌过夜。

然后加入n,n-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.40mg(理论值的48％)化合物s-{(5r,14r)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-n-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esipos):m/z＝949[m+h]⁺

将s-{(5r,14r)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-5-羧基-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-1-基}-n-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(7.50mg，7.05μmol)溶解于1.0mldmf中，并加入2,5-二氧代吡咯烷-1-基n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸酯(4.11mg，纯度82％，7.05μmol)(中间体l88)和n,n-二异丙基乙胺(2.5μl，14μmol)。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到4.30mg(46％)化合物n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n-[(8r,15r)-23-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-l-丙氨酰胺。

lc-ms(方法14):rt＝6.47min；ms(esipos):m/z＝1312[m+h]⁺

将n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n-[(8r,15r)-23-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-8,15-二羧基-2,2-二甲基-6,12,17,22-四氧代-5-氧杂-10,20-二硫杂-7,13,16,23-四氮杂-2-硅杂二十六烷-26-基]-l-丙氨酰胺(4.00mg，3.05μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(2.49mg，18.3μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h，然后向其中加入乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(5.34mg，18.3μmol)，将反应混合物搅拌10min，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.50mg(理论值的64％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.00min；ms(esipos):m/z＝1168[m+h]⁺

中间体f309

4-{[(11r,17r)-16-(3-氨基丙基)-17-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-18,18-二甲基-6,6-二氧化(dioxido)-2,10,15-三氧代-6λ⁶,13-二硫杂-3,9,16-三氮杂十九烷-11-基]氨基}-4-氧代丁酸/三氟乙酸(1:1)

首先将s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(4-叔丁氧基-4-氧代丁酰基)-l-半胱氨酸(50.0mg，57.3μmol)(中间体c77)和三氟乙酸/{2-[(2-氨基乙基)磺酰基]乙基}氨基甲酸苄酯(1:1)(27.5mg，68.7μmol)(中间体l81)加入到4.0mldmf中，并加入hatu(26.1mg，68.7μmol)和n,n-二异丙基乙胺(30μl，170μmol)。将反应混合物在室温下搅拌10min，然后通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到53.9mg(81％)化合物4-{[(12r)-17-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ6,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.54min；ms(esipos):m/z＝1141[m+h]⁺

在氩气下，首先将乙酸钯(ii)(5.12mg，22.8μmol)加入到3.0mldcm中，加入三乙胺(9.5μl，68μmol)和三乙基硅烷(73μl，460μmol)，并将混合物搅拌5min。然后加入在2.0mldcm中的4-{[(12r)-17-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}26,26-二甲基-7,7-二氧化-3,11,16,22-四氧代-1-苯基-2,23-二氧杂-7λ⁶,14-二硫杂-4,10,17,21-四氮杂-26-硅杂二十七烷-12-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(52.1mg，45.6μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，然后与2.0ml水混合。在减压下蒸发溶剂。向残余物中加入乙腈，将混合物过滤并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到43.4mg(85％)化合物三氟乙酸/4-{[(16r)-23-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丙酸叔丁酯(1:1)。

lc-ms(方法1):rt＝1.21min；ms(esipos):m/z＝1007[m+h]⁺

首先将三氟乙酸/4-{[(16r)-23-氨基-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17-三氧代-5-氧杂-14,21λ⁶-二硫杂-7,11,18-三氮杂-2-硅杂二十三烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(1:1)(20.0mg，17.8μmol)和(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸(3.32mg，21.4μmol)加入到2.0mldmf中，并加入hatu(8.14mg，21.4μmol)和n,n-二异丙基乙胺(9.3μl,54μmol)。

将反应混合物在室温下搅拌10min。将反应混合物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到17.4mg(85％)化合物4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ6-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯。

lc-ms(方法1):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝1144[m+h]⁺

将4-{[(16r)-11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-26-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,2-二甲基-21,21-二氧化-6,12,17,25-四氧代-5-氧杂-14,21λ⁶-二硫杂-7,11,18,24-四氮杂-2-硅杂二十六烷-16-基]氨基}-4-氧代丁酸叔丁酯(15.9mg，13.9μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。加入二氯化锌(11.4mg，83.4μmol)，并将反应混合物在50℃下搅拌1h。将乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(73.2mg，250μmol)加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到10mg(理论值的68％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.45min；ms(esipos):m/z＝944[m+h]⁺

中间体f310

三氟乙酸/n-[(8r,14r)-13-(3-氨基丙基)-14-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-15,15-二甲基-2,7,12-三氧代-10-硫杂-3,6,13-三氮杂十六烷-8-基]-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-酰胺(1:1)

首先将s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(100mg，120μmol)(中间体c70)和1-[(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(44.1mg，132μmol)加入到3.0mldmf中，并加入4-甲基吗啉(40μl，360μmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜，用乙酸(420μmol)淬灭并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到69.4mg(理论值的62％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法12):rt＝2.61min；ms(esineg):m/z＝933[m-h]^-

首先将s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-(14-氧代-2,5,8,11-四氧杂十四烷-14-基)-l-半胱氨酸(27.0mg，28.9μmol)加入到2.0mldmf中，并加入n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺(11.4mg，57.7μmol)(中间体l1)、n,n-二异丙基乙胺(15μl，87μmol)和hatu(22.0mg，57.7μmol)。将反应混合物在室温下搅拌3h并通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到13.7mg(理论值的43％)化合物2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16r)-21-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯。

lc-ms(方法12):rt＝2.54min；ms(esipos):m/z＝1114[m+h]⁺

将2-(三甲基甲硅烷基)乙基{(16r)-21-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-16-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基甲酰基]-14,20-二氧代-2,5,8,11-四氧杂-18-硫杂-15,21-二氮杂二十四烷-24-基}氨基甲酸酯(13.7mg，12.3μmol)溶解于2.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(10.1mg，73.8μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(21.6mg，73.8μmol)加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％tfa)。通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)直接进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到7.30mg(理论值的47％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝970[m+h]⁺

中间体f311

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

首先将1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-酸(10.8mg，18.7μmol)(中间体l97)加入到1.0mldmf中，加入n,n-二异丙基乙胺(5.4μl，31.2μmol)和hatu(7.10mg，18.7μmol)，并将混合物搅拌10min。然后加入溶解于1.0mldmf和n,n-二异丙基乙胺(2.7μl，15.6μmol)中的s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(12.9mg，15.6μmol)(中间体c71)。将反应混合物在室温下搅拌2h，然后通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水/0.1％tfa)直接纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到3.5mg(18％)化合物s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-l-半胱氨酸。

lc-ms(方法1):rt＝1.30min；ms(esineg):m/z＝1276[m-h]^-

将s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,30-二氧代-6,9,12,15,18,21,24,27-八氧杂-3-氮杂三十烷-30-基]-l-半胱氨酸(3.50mg，2.74μmol)溶解于1.0ml三氟乙醇中，并加入二氯化锌(6.25mg，16.4μmol)。将反应混合物在50℃下搅拌4h。将乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸(47μl，16μmol)加入反应混合物(其被搅拌10min)，然后加入水(0.1％tfa)。直接通过制备型rp-hplc(柱：reprosil125x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水，0.1％tfa)进行纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到2.0mg(理论值的59％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝1133(m+h)⁺。

中间体f312

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-缬氨酰基-n-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(l-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-l-丙氨酰胺/三氟乙酸(1:1)

标题化合物是通过以下方法由中间体c103制备：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酸偶联。在下一步中，通过在室温、氢标准压力下在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去z保护基团。然后通过以下方式将去保护的中间体转化成标题化合物：通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酸偶联，最后用氯化锌去保护并通过制备型hplc纯化。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝992(m+h)⁺。

中间体f313

s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)

在氩气下，向55.0mg(0.14mmol)1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2-氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-酸在2.60mldmf中的溶液中加入16.9mg(0.13mmol)n,n-二异丙基乙胺和50.0mg(0.13mmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入40.0mg(0.05mmol)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-l-半胱氨酸(中间体c107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型hplc纯化。得到10mg(理论值的13％，纯度82％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.36min；ms(esipos):m/z＝1145(m+h)⁺。

向10.9mg(7.8mmol，纯度82％)s-[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酸在0.85ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入4.3mg(0.03mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入9.1mg(0.03mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型hplc纯化。得到2.3mg(理论值的26％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt0.89min；ms(esipos):m/z＝781(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f314

三氟乙酸/3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3s,4r)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}-n-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)丙酰胺

在氩气下，向50.0mg(0.04mmol)3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)在3.14mldmf中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol)n,n-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入27.29mg(0.09mmol)n-(2-氨基乙基)-2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰胺-三氟乙酸(1:1)(中间体l1)的溶液，并将混合物在室温下搅拌15分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。将残余物通过制备型hplc纯化。得到41mg(理论值的68％，纯度66％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.55min；ms(esineg):m/z＝959(m-h+na)^-。

向41.1mg(0.03mmol，纯度66％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3r,4r)-3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-14-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十四烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.54ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入24.7mg(0.18mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2.5h。然后加入53.0mg(0.18mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型hplc纯化。得到10mg(理论值的36％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt0.89min；ms(esipos):m/z＝781(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f315

s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-l-半胱氨酸

在氩气下，向50.0mg(0.07mmol)3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酸(中间体l100)在3.5mldmf中的溶液中加入18.02mg(0.14mmol)n,n-二异丙基乙胺和31.82mg(0.09mmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入50.0mg(0.07mmol)n-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体c107)的溶液，并将混合物在室温下搅拌2h。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到49mg(理论值的21％，纯度31％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.30min；ms(esipos):m/z＝1022(m+h)⁺。

向49.0mg(0.015mmol，纯度31％)s-(11-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-2,2-二甲基-6,12-二氧代-5-氧杂-7,11-二氮杂-2-硅杂十三烷-13-基)-n-{3-[5-(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)-1,2,4-噁二唑-3-基]丙酰基}-l-半胱氨酸在0.5ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入8.0mg(0.06mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入17.2mg(0.06mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型hplc纯化。得到3mg(理论值的21％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.91min；ms(esipos):m/z＝877(m+h-cf3co2h)⁺。

中间体f316

三氟乙酸/n-{2-[(3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3s,4r)-4-氟吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酰基)氨基]乙基}-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺(1:1)

在氩气下，向50.0mg(0.04mmol，纯度65％)3-{[2-({(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}{[(3r,4r)-4-氟-1-{[2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基]羰基}吡咯烷-3-基]甲基}氨基)-2-氧代乙基]硫烷基}丙酸(中间体106)在3.0mldmf中的溶液中加入16.89mg(0.13mmol)n,n-二异丙基乙胺和33.13mg(0.087mmol)hatu。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。随后，加入37.2mg(0.09mmol，纯度70％)n-(2-氨基乙基)-6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰胺乙酸盐(1:1)(中间体l73)的溶液，并将混合物在室温下搅拌7分钟。加入水，并将混合物用二氯甲烷萃取。将有机相经硫酸镁干燥，在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。残余物不经纯化即进一步使用。得到57mg(理论值的77％，纯度59％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝2.60min；ms(esipos):m/z＝981(m+h)⁺。

向56.0mg(0.03mmol，纯度59％)2-(三甲基甲硅烷基)乙基(3r,4r)-3-[2-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-18-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-3,8,13-三氧代-5-硫杂-2,9,12-三氮杂十八烷-1-基]-4-氟吡咯烷-1-甲酸酯在2.8ml2,2,2-三氟乙醇中的溶液中加入36.0mg(0.27mmol)氯化锌，并将反应混合物在50℃下搅拌2h。然后加入78.3mg(0.27mmol)edta，并将混合物搅拌15分钟。将反应混合物通过制备型hplc纯化。得到16mg(理论值的44％，纯度85％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝837(m+h-acoh)⁺。

用于合成apdc或adc前体(中间体系列q)的一般方法

上述f系列的中间体(f1-f305)可根据方案1转化成apdc前体q。在apdc前体分子中释放豆荚蛋白酶可裂解的三肽的n-末端氨基的情况下，其可在最后一步中用各种结构的取代的酰基基团或烷基基团进行修饰以改善性能特性。

本文中描述一种示例性方法：

将0.037mmol除f194和f294之外的合适中间体f1-f305或其适当保护的前体溶于1-20ml(优选5-10ml)合适的溶剂(例如dmf、dmso、dcm、氯仿、甲苯、thf、甲醇或其混合物)中，并加入0.039mmoln-末端修饰的三肽衍生物(例如中间体l92)，以及0.041mmol标准偶联试剂(例如hatu、edci/hobt、bep等)和0.11mmol标准碱(例如n,n-二异丙基乙胺、三乙胺、4-甲基吗啉等)。在室温下搅拌5min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。在减压下浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。

当所连接的三肽衍生物的所述n-末端修饰是保护基团时，其可随后像前体分子中仍然存在的任何保护基团一样通过已知的方法分离，例如优选地通过氢解分离z保护基团，通过酸水解分离boc保护基团，通过碱水解分离fmoc保护基团或通过氟化物或用氯化锌分离teoc基团。

最后，可将如此释放的氨基酰化或烷基化以改善性能特性，例如用胺反应性基团(如活性酯、酰氯、异氰酸酯等)，或通过在存在标准偶联试剂(例如hatu、edci/hobt、bep等)和标准碱(例如n,n二异丙基乙胺、三乙胺、4-甲基吗啉等)的情况下与羧酸衍生物偶联。如果分子中仍然存在其他保护基团，则其可在最后一步中除去。

方案1：

[a)：hatu，dmf，n,n-二异丙基乙胺，室温或edci，hobt，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温；b)h2，10％pd-c，meoh，室温；c)r22-cooh，edci，hobt，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温或r²²-cooh，hatu，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温或r²²-coosu，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温]

此外，其他中间体可根据方案2和3转化成豆荚蛋白酶可裂解的adc前体。

方案2：

[a)：hatu，dmf，n,n-二异丙基乙胺，室温或edci，hobt，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温；b)h2，10％pd-c，meoh，室温；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温]

方案3：

[a)：hatu，dmf，n,n-二异丙基乙胺，室温或edci，hobt，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温；b)h2，10％pd-c，meoh，室温；c)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮，n,n-二异丙基乙胺，dmf，室温]

作为方案1-3中所示的苄氧基羰基基团的替代物，可以使用在肽化学中确认的其他保护基团，并可通过同样已知的相应方法连接它们。保护基团策略的选择是根据本领域技术人员已知的与分子中存在的其他结构单元的相容性有关的要求进行。如果分子中仍然存在其他保护基团，则它们可在最后一步中除去。

所述合成的顺序还可以任选地重新排列。

此外，在接头结构l1-l2的上下文中的蛋白反应性基团可以在权利要求书的范围内变化。

中间体q1

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

将30mg(0.037mmol)中间体f104溶于6mldmf中，并加入16mg(0.039mmol)中间体l92、15.5mg(0.041mmol)hatu和0.11mmoln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到21.5mg(理论值的53％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝1083(m+h)⁺。

中间体q2

n-乙酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

将30mg(0.037mmol)中间体f104溶于6mldmf中，并加入14mg(0.045mmol)中间体l93、15.5mg(0.041mmol)hatu和0.112mmoln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌5min后，再加入1.5mghatu和0.01mmoln,n-二异丙基乙胺，并将混合物在室温下再搅拌10min。然后将混合物用2滴三氟乙酸酸化并在减压下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到12.2mg(理论值的33％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.94min；ms(esipos):m/z＝991(m+h)⁺。

中间体q3

n-(3-羧基丙酰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

将15mg(0.019mmol)中间体f104溶于5mldmf中，加入9.7mg(0.02mmol)中间体l94、8.5mg(0.022mmol)hatu和0.056moln,n-二异丙基乙胺，并将混合物在室温下搅拌5min。然后将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到5.7mg(理论值的27％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.17min；ms(esipos):m/z＝1149(m+h)⁺。

将该中间体溶解于2ml2,2,2-三氟乙醇中。加入2.6mg(0.019mmol)氯化锌，并将混合物在50℃下搅拌45min。随后，加入5.6mg(0.019mmol)乙二胺-n,n,n',n'-四乙酸，并将混合物用3ml乙腈/水9:1稀释。然后加入10μl三氟乙酸，并将混合物在室温下搅拌10min，然后在减压下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分并将残余物从乙腈/水中冻干，得到3.1mg(理论值的62％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.93min；ms(esipos):m/z＝1049(m+h)⁺。

中间体q4

三氟乙酸/n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-[(11s,15r)-15-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-14-乙醇酰基-16,16-二甲基-6,6-二氧化-2,10-二氧代-6λ⁶-硫杂-3,9,14-三氮杂十七烷-11-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)(1:1)

将5mg(0.006mmol)中间体f296溶于3mldmf中，并加入2.8mg(0.007mmol)中间体l92，以及2.3mg(0.006mmol)hatu和0.017mmoln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌15min后，将混合物用2滴三氟乙酸酸化并浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到0.93mg(理论值的13％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝1175(m+h)⁺。

中间体q5

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

将55mg中间体c101中的混合物溶于33mldmf中，并加入27.5mg(0.067mmol)中间体l92，以及28mg(0.073mmol)hatu和32μln,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌10min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。

首先将如此获得的粗产物加入到4mlthf中，并加入2ml水和0.375ml2m的氢氧化锂溶液。将混合物在室温下搅拌1h，然后用1n的盐酸中和并在减压下浓缩。将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到10.2mgn-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)。

lc-ms(方法1):rt＝1.09min；ms(esipos):m/z＝904(m+h)⁺。

在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去z保护基团，从而得到7.5mg(理论值的87％)l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)。

lc-ms(方法1):rt＝0.80min；ms(esipos):m/z＝770(m+h)⁺。

将3.75mg(0.005mmol)l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)溶于4mldmf中，并加入1.72mg(0.007mmol)1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮和1.2μl(0.007mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.3mg(理论值的29％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.03min；ms(esipos):m/z＝907(m+h)⁺。

中间体q6

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

将3.75mg(0.005mmol)在f5中所述的l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(1s)-3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-羧基丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)中间体溶于4mldmf中，并加入2.2mg(0.007mmol)1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮和1.2μl(0.007mmol)n,n-二异丙基乙胺。将反应混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并将残余物通过制备型rp-hplc(柱：reprosil250x30；10μ，流速：50ml/min，mecn/水)纯化。在减压下蒸发溶剂，并将残余物在高真空下干燥。得到1.9mg(理论值的27％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.04min；ms(esipos):m/z＝981(m+h)⁺。

中间体q7

n-乙酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-({3-[(溴乙酰基)氨基]丙基}氨基)-1-氧代丁-2-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)

将4.1mg(0.005mmol)中间体f282溶于1mldmf中，并加入1.7mg(0.005mmol)中间体l93、2.2mg(0.006mmol)hatu和0.6μl4-甲基吗啉。在室温下搅拌60min后，将反应物浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.2mg(理论值的24％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.98min；ms(esipos):m/z＝1045和1047(m+h)⁺。

中间体q8

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-[(20r)-25-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,19,25-三氮杂二十八烷-28-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)

将6.80mg(6.35μmol)s-{2-[(3-氨基丙基){(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}氨基]-2-氧代乙基}-n-[1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18-二氧代-6,9,12,15-四氧杂-3-氮杂十八烷-18-基]-l-半胱氨酸/三氟乙酸(1:1)(中间体f257)和2.71mg(6.63μmol)n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬酰胺(中间体l92)溶解于1.0mldmf中，并加入2.66mg(6.98μmol)hatu和3.3μl(19μmol)n,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌45min后，将混合物用4μl三氟乙酸酸化并通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到1.20mg(理论值的14％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.08min；ms(esipos):m/z＝1346(m+h)⁺。

中间体q9

将5mg(0.0062mmol)中间体f104溶于2mldmf中，并加入2.2mg(0.0068mmol)中间体l95、4.7mg(0.012mmol)hatu和5个当量n,n-二异丙基乙胺。在室温下搅拌1h后，将反应物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到2mg(理论值的32％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.28min；ms(esipos):m/z＝997(m+h)⁺。

中间体q10

将5mg(0.0062mmol)中间体f104溶于2mldmf中，并加入2.2mg(0.0068mmol)中间体l96、5.9mg(0.016mmol)hatu和4个当量4-甲基吗啉。在室温下搅拌2h后，将混合物在减压下浓缩，并将残余物通过制备型hplc纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到2.5mg(理论值的41％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.99min；ms(esipos):m/z＝991(m+h)⁺。

中间体q11

n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)

以与中间体q9类似的方式，将7mg(0.0087mmol)中间体f104与中间体l103偶联。得到3.5mg(理论值的34％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.83min；ms(esipos):m/z＝1068(m+h)⁺。

中间体q12

n-异烟酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)

以与中间体q9类似的方式，将8mg(0.0092mmol)中间体f104与中间体l104偶联。得到6mg(理论值的46％)标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.71min；ms(esipos):m/z＝1054(m+h)⁺。

中间体q13

n-{[2-(2-甲氧基乙氧基)乙氧基]乙酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n<sup>1</sup>-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

以与中间体q9类似的方式，将7mg(0.0087mmol)中间体f104与中间体l105偶联。得到4.6mg(理论值的47％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.97min；ms(esipos):m/z＝1109(m+h)⁺。

中间体q14

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-谷氨酰胺

lc-ms(方法1):rt＝1.15min；ms(esipos):m/z＝1097(m+h)⁺。

该中间体是以与中间体q1类似的方式而制备。

中间体q15

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-α-天冬酰胺

以与中间体q1类似的方式，将10mg(0.012mmol)中间体f104与中间体l106偶联。随后，通过用氯化锌裂解三甲基甲硅烷基乙基酯来制备标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.1min；ms(esipos):m/z＝1085(m+h)⁺。

以与中间体q1类似的方式，以下中间体q16-q22是用相应的中间体前体制备：

中间体q16

n-[(苄氧基)羰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝1111(m+h)⁺。

中间体q17

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-l-缬氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

lc-ms(方法1):rt＝1.13min；ms(esipos):m/z＝1111(m+h)⁺。

中间体q18

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1s)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

标题化合物是通过以下方法由化合物c111开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l107偶联，随后在三氟乙醇中通过氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.89min；ms(esipos):m/z＝1107[m+h]⁺。

中间体q19

n-[(苄氧基)羰基]-l-丙氨酰基-甘氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

lc-ms(方法1):rt＝1.06min；ms(esipos):m/z＝1069(m+h)⁺。

中间体q20

n-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-[(20r)-25-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}-20-羧基-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)-2,18,24-三氧代-6,9,12,15-四氧杂-22-硫杂-3,19,25-三氮杂二十八烷-28-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)

在0℃下，将47.2mg(0.0559mmol)中间体l102溶于0.50mldmf中，并加入7.2mg(0.053mmol)hoat以及20.2mg(0.0532mmol)hatu和74.1μl(0.425mmol)n,n-二异丙基乙胺。在0℃下搅拌5min后，加入在dmf(0.5ml)中的57.0mg(0.0532mmol)中间体f257。在0℃下搅拌2h后，加入水(1.0ml)和acn(1.5ml)。将混合物通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度＝1:2→2:1)纯化两次。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到9.0mg(理论值的9.5％)标题化合物。

lc-ms(方法14):rt＝5,43min；ms(esipos):m/z＝1783.8643(m+h)⁺。

中间体q21

n-(38-氧代-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-十二氧杂三十八烷-38-基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n1-[(2s)-4-{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(2-{[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]氨基}乙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

在0℃下，将57.5mg(0.0713mmol)中间体f104溶于0.80mldmf中，并加入61.2mg(0.0727mmol)中间体l102以及27.6mg(0.0727mmol)hatu和74.5μl(0.428mmol)n,n-二异丙基乙胺。在0℃下搅拌30min后，加入水(1.0ml)和acn(1.5ml)。将混合物通过制备型hplc(流动相：acn/水+0.1％tfa，梯度＝45％→85％)纯化。浓缩适当的级分，并将残余物从乙腈/水中冻干。得到39mg(理论值的36％)标题化合物。

lc-ms(方法14):rt＝5,44min；ms(esipos):m/z＝1519.7598(m+h)⁺。

中间体q22

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(l-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)

标题化合物是通过以下方法由化合物c103开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去z保护基团，然后在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下使去保护的中间体与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮在dmf中反应。在最后一步中，通过氯化锌进行去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.84min；ms(esipos):m/z＝1078[m+h]⁺。

中间体q23

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

标题化合物是通过以下方法由化合物m9开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l92偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去z保护基团，然后如在中间体q6中所述的通过与1,1'-[(1,5-二氧代戊烷-1,5-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.89min；ms(esipos):m/z＝938[m+h]⁺。

中间体q24

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n<sup>1</sup>-{3-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]丙基}-l-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是通过以下方法由化合物m9开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l92偶联。在下一步中，通过在室温、标准氢气压力下在乙醇中经活性碳上的钯(10％)氢化30分钟而除去z保护基团，然后通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝1.01min；ms(esipos):m/z＝863[m+h]⁺。

中间体q25

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-1-[(3-{[(5s)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是通过以下方法由化合物c108开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在dcm-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去z保护基团，然后通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1h-吡咯-2,5-二酮反应，最后通过氯化锌去保护而将去保护的中间体转化成标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.46min；ms(esipos):m/z＝1106[m+h]⁺。

中间体q26

n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-1-[(3-{[(5s)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)三氟乙酸盐(1:1)

标题化合物是以与中间体q25类似的方式制备。

lc-ms(方法12):rt＝1.55min；ms(esipos):m/z＝1162[m+h]⁺。

中间体q27

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1s)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

标题化合物是通过以下方法由化合物c109开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l107偶联，随后通过氯化锌去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.95min；ms(esipos):m/z＝1107[m+h]⁺。

中间体q28

n-[(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1s)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

标题化合物是通过以下方法由化合物c110开始制备：首先在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下与中间体l92偶联。在下一步中，通过在标准氢气压力、室温下在dcm-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去所有的保护基团，然后通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物。

lc-ms(方法12):rt＝1.74min；ms(esineg):m/z＝1161[m-h]^-。

中间体q29

n-{5-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-5-氧代戊酰基}-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1s)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

在存在30mghatu和34μln,n-二异丙基乙胺的情况下，将40mg(39μmol)中间体c110在9mldmf中与19.6mg(47mmol)中间体l92偶联。随后，通过在标准氢气压力、室温下在甲醇中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去所有的保护基团，然后通过在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下与1-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-1h-吡咯-2,5-二酮反应而将去保护的中间体转化成标题化合物，将其通过制备型hplc纯化。

lc-ms(方法1):rt＝0.9min；ms(esipos):m/z＝1181(m+h)⁺。

中间体q30

n-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}-n-甲基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-[(3-{[(1s)-1,3-二羧基丙基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)

首先，三氟乙酸/4-硝基苄基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-l-天冬氨酸酯(1:1)是通过以下方式制备：通过在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将n-(叔丁氧基羰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酸与4-硝基苄基l-天冬氨酸酯氢溴酸盐(1:1)在dmf中偶联，然后在dcm中用三氟乙酸对氨基去保护。

lc-ms(方法1):rt＝0.43min；ms(esipos):m/z＝410(m+h)⁺。

在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下将该中间体与n-(叔丁氧基羰基)-n-甲基-l-丙氨酸在dmf中偶联。随后，通过在dcm-甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化而分离对硝基苄基酯。

lc-ms(方法1):rt＝0.55min；ms(esipos):m/z＝460(m+h)⁺。

在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将如此获得的中间体与中间体c110在dmf中偶联。随后，通过与4个当量氯化锌在三氟乙醇中在50℃下一起搅拌1h而分离boc保护基团。

lc-ms(方法1):rt＝1.07min；ms(esipos):m/z＝1235(m+h)⁺。

将44mg(32μmol)该中间体与25.4mg(195μmol)6-氧代己酸(其已经预先通过文献方法(j.org.chem.1993,58,2196)制备)在20ml甲醇中混合，并加入7.8μl乙酸和29mg(313μmol)硼烷-吡啶复合物。将混合物在室温下搅拌1h，然后在减压下浓缩，并通过制备型hplc纯化。得到25mg(理论值的56％)(6s,13s,16s,19s,22s,25s)-16-(2-氨基-2-氧代乙基)-13-{2-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]乙基}-6-[(苄氧基)羰基]-19,22,25,26-四甲基-3,8,12,15,18,21,24-七氧代-1-苯基-2-氧杂-7,11,14,17,20,23,26-七氮杂三十二烷-32-酸。

将24.5mg(0.018mmol)该中间体溶解于6mldmf中，加入34mg(0.27mmol)1-羟基吡咯烷-2,5-二酮、16μln,n-二异丙基乙胺，并分次加入总量为50mg(0.13mmol)的hatu。在室温下搅拌2h后，将反应溶液用tfa调节至ph3-4，然后浓缩并通过制备型hplc纯化。得到23mg(87％)保护的中间体，然后将其溶于10ml乙醇中。在加入活性碳上的钯(10％)后，在标准氢气压力下除去苄基酯基团，并在滤出催化剂后，将剩余的溶液浓缩，然后将残余物从乙腈/水9:1中冻干，得到20mg(理论值的95％)标题化合物。

lc-ms(方法1):rt＝0.82min；ms(esipos):m/z＝1266(m+h)⁺。

中间体q31

三氟乙酸/n-(吡啶-4-基乙酰基)-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-1-({2-[(n²-乙酰基-l-赖氨酰基)氨基]乙基}氨基)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)(1:1)

标题化合物是通过以下方法制备：在存在n,n-二异丙基乙胺的情况下，使中间体c112与中间体l103在dmf中进行hatu偶联，随后通过在50℃下在三氟乙醇中与6个当量氯化锌一起搅拌30分钟而分离boc保护基团。

lc-ms(方法1):rt＝0.76min；ms(esipos):m/z＝1101(m+h)⁺。

中间体q32

n²-乙酰基-l-赖氨酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-{(2s)-1-[(3-{[(5s)-5-氨基-5-羧基戊基]氨基}-3-氧代丙基)氨基]-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-氧代丁-2-基}-l-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)

首先，在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，将中间体c108与中间体l92在dmf中偶联。在下一步中，通过在氢标准压力、室温下在dcm/甲醇1:1中经活性碳上的钯(10％)氢化1小时而除去z保护基团。随后，通过以下方法将去保护的中间体转化成标题化合物：在存在hatu和n,n-二异丙基乙胺的情况下，与中间体l109在dmf中反应，随后通过在50℃下在三氟乙醇中与12个当量氯化锌搅拌90min而去保护。

lc-ms(方法12):rt＝1.17min；ms(esineg):m/z＝1137(m-h)^-。

中间体q33

n²-乙酰基-l-赖氨酰基-l-丙氨酰基-l-丙氨酰基-n¹-[(2s)-4-[{(1r)-1-[1-苄基-4-(2,5-二氟苯基)-1h-吡咯-2-基]-2,2-二甲基丙基}(乙醇酰基)氨基]-1-{[2-(l-γ-谷氨酰基氨基)乙基]氨基}-1-氧代丁-2-基]-l-天冬酰胺(aspartamide)/三氟乙酸(1:1)