一种去壁灵芝孢子粉、颗粒及其制备方法与流程

本发明涉及医药及保健食品
技术领域：
，具体涉及一种去壁灵芝孢子粉颗粒及其制备方法。
背景技术：
：人类对健康观念内涵的认识随着科技水平的发展而进一步深化，世界卫生组织50多个国家医学专家研究发现，对各种疾病最好的治疗还是预防。目前各种医院的检查只能对已经产生的疾病进行诊断，一旦确认有病，也往往会因发现太晚而束手无策，即使通过现代医疗科技手段也难使病人恢复如初。《黄帝内经》有言：“上工治未病，不治已病，此之谓也”，治未病即采取相应的措施，防止疾病的发生发展，是我国传统医学的主要思想。任何疾病只要预防和保养在先，发病的机率就会很低，甚至可以完全化解和避免。预防疾病最重要的手段是增强机体免疫力。而现有的保健药品基本上对于免疫力的调节都靠“补”，即补充各种各样的维生素、氨基酸，服用后也有效果，但停用很短一段时间后，免疫力又会下降，没有达到从根本上改善人体脏器内部环境，使人体自身具备免疫力的功效。灵芝孢子是灵芝在生长成熟期，从灵芝菌褶中弹射出来的极其微小的卵形生殖细胞即灵芝的种子。它凝聚了灵芝的精华，富含灵芝多糖、三萜类、蛋白质、多肽、氨基酸、核苷类化合物、有机锗、微量元素和维生素等多种生物活性物质，具有增强免疫力、抗辐射、清除自由基等多种功能，且药性温和，无副作用，但其表面被坚硬的几丁质纤维素所包围，人体很难充分吸收。目前市面上破壁灵芝孢子粉多通过机械破碎方法获得，人体吸收依旧存在一定困难；另外，破壁灵芝孢子粉中含有大量的几丁质纤维素等，导致破壁灵芝孢子粉中真正的有效成分，如粗多糖、总三萜含量等含量低、吸收难。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种可有效增强免疫力、对辐射危害有辅助保护功能的去壁灵芝孢子粉、颗粒，有效成分如粗多糖、总三萜等含量高，易吸收，方便灵芝孢子粉、颗粒的携带及服用，使人体更有效地吸收营养成分。本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉颗粒，以破壁灵芝孢子粉水提物为活性成分；去壁灵芝孢子粉颗粒中粗多糖含量为10～20g/100g，总三萜含量为4～10g/100g。优选的，去壁灵芝孢子粉的粒径小于0.180mm。本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉的制备方法，包括以下步骤：(1)将破壁灵芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁灵芝孢子水提液；(2)将所述步骤(1)得到的水提液浓缩，得到浓缩药液；(3)将所述浓缩药液干燥，得到干浸膏；(4)将所述干浸膏进行粉碎后过筛，得到去壁灵芝孢子粉。优选的，所述浸泡优选为低温水浸泡，更优选的在-5～20℃水中浸泡；优选的，浸泡1～4小时，更优选的，浸泡2小时。优选的，所述水提为将浸泡液10～60分钟内升温至100～120℃，更优选的为30分钟内升温至100～120℃。优选的，所述的浓缩为减压浓缩，所述减压浓缩的真空度为-0.07～-0.09mpa，所述减压浓缩的温度为60～70℃。优选的，所述的干燥为微波干燥，所述微波干燥的真空度为-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的温度为60～70℃。本发明提供了一种去壁灵芝孢子颗粒的制备方法，包括以下步骤：将上述得到的去壁灵芝孢子粉制粒，得到去壁灵芝孢子颗粒。优选的，制粒为一步制粒；优选的，一步制粒步骤为：上述得到的去壁灵芝孢子粉与水混合，在压力-2.5～-3.0kpa，进风温度60～80℃，出风温度不超过60℃条件下一步制粒。优选的，所述制粒后的灵芝孢子颗粒粒度在12～16目之间。本发明提供了一种破壁灵芝孢子水提液的制备方法，包括以下步骤：将破壁灵芝孢子粉与水混合进行煎煮，破壁灵芝孢子粉与水的质量比为4～6:8～15。优选的，进行2次水提，将4～6重量份的破壁灵芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，滤出药液；将滤出残渣用10重量份的水煎煮，滤出药液。更优选的，进行3次水提，将将4～6重量份的破壁灵芝孢子粉加入提取罐，先用12重量份的水提取1次，滤出药液；将滤出残渣用10重量份的水煎煮2次，滤出药液。优选的，水提温度为80～120℃，每次水提时间为1～2小时。优选的，煎煮后还包括：将所述煎煮得到的物料过滤后离心，得到水提液。优选的，离心时药液的温度为0～4℃，离心转速为2000～4000rpm。有益效果与现有技术相比，本发明以破壁灵芝孢子粉水提物为原料，制备得到去壁灵芝孢子粉、颗粒；在本发明中，所述水提物由破壁灵芝孢子粉、颗粒经水提、浓缩、干燥和粉碎得到。本发明提供的产品最大程度保留了灵芝孢子的有效成分，去除灵芝破壁后产生的几丁质及纤维素外壳，使灵芝孢子粉的有效成分含量大幅度提高，且更易吸收；能够综合提高人体免疫能力，包括提高细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及nk细胞活性等；对辐射危害有辅助保护功能；且对斑马鱼人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中对斑马鱼人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用较强，达到了78％及83％。而且，本发明提供的产品为粉剂、颗粒剂，方便携带及服用，使人体可更有效地吸收灵芝孢子中的营养成分。附图说明图1为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用表型图；图2为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用图；图3为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用图；图4为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用表型图；图5为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用图；图6为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用图；图7为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用表型图；图8为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用；图9为去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用图。具体实施方式本发明提供了一种去壁灵芝孢子粉、颗粒，以破壁灵芝孢子粉水提物为活性成分；去壁灵芝孢子粉颗粒中粗多糖含量为10～20g/100g，总三萜含量为4～10g/100g。本发明提供的去壁灵芝孢子粉、颗粒的粒径优选小于0.180mm，更优选为0.100～0.160mm。本发明还提供了一种去壁灵芝孢子粉的制备方法，包括以下步骤：(1)将破壁灵芝孢子粉浸泡，水提，得到破壁灵芝孢子水提液；(2)将所述步骤(1)得到的水提液浓缩，得到浓缩药液；(3)将所述浓缩药液干燥，得到干浸膏；(4)将所述干浸膏进行粉碎后过筛，得到去壁灵芝孢子粉制粒。本发明中，所述浸泡优选为低温水浸泡，更优选的在-5～20℃水中浸泡；优选的，浸泡1～4小时，更优选的，浸泡2小时。优选的，所述水提为将浸泡液10～60分钟内升温至100～120℃，更优选的，30分钟内升温至100～120℃。将破壁灵芝孢子粉进行水提，得到水提液。水提还具有熟化灭菌的作用。在本发明中，所述破壁灵芝孢子粉可以市售常规品种，也可自制，破壁采用的方式有机械破壁，机械破壁又划分为振动磨破壁、超音速气流粉碎破壁还有剪切式挤压破壁；所述水提优选为：将破壁灵芝孢子粉与水混合进行煎煮，得到水提液。在本发明中，所述破壁灵芝孢子粉与水的质量比优选为4～6:8～15，更优选为5：12。在本发明中，所述水提的次数优选为三次，具体为将上次煎煮得到的药渣再与水混合依次进行两次煎煮，将三次煎煮得到的滤液合并，得到提取液。在本发明中，一次煎煮的时间优选为2小时；将滤出残渣用10重量份的水煎煮2次，每次2小时，滤出药液。在本发明中，所述水提的温度优选为80～120℃，更优选为90～100℃；所述水提的时间优选为每次1～4小时，更优选的为每次2小时；在本发明中，所述煎煮后优选将所述煎煮得到的物料过滤后离心，得到水提液。在本发明中，所述过滤也可以是板框过滤；所述离心的转速优选为2000～4000rpm，更优选为2500～3000rpm。得到水提液后，本发明将所述水提液浓缩，得到浓缩药液。在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩；所述减压浓缩的真空度优选为-0.07～-0.09mpa，所述减压浓缩的温度优选为60～70℃。本发明中，减压浓缩的时间以密度为控制，所述减压浓缩后的密度优选为1.05～1.15更优选的为1.08～1.12，最优选为1.10。。得到浓缩药液后，本发明将所述浓缩药液干燥，得到干浸膏。在本发明中，所述干燥优选为微波干燥；所述微波干燥的真空度优选为-0.07～-0.09mpa，所述微波干燥的温度优选为60～70℃；优选的，微波功率为30kw。在本发明中，微波干燥的时间以水分控制，最优选的水分控制在2％-7％，更优选的为3-6％，最优选为4％。得到干浸膏后，本发明将所述干浸膏粉碎后过筛，得到去壁灵芝孢子粉水提物。在本发明中所述的粉碎采用本领域常规的粉碎方法即可，具体的在本发明实施例中采用粉碎机进行，过筛收集筛下组分；所述粉碎的过程中过筛的目数优选的为60～100目，更优选的为80目。得到去壁灵芝孢子粉后，本发明将所述去壁灵芝孢子粉制粒，得到去壁灵芝孢子颗粒。在本发明中，所述制粒优选为一步制粒；所述制粒优选沸腾制粒机；所述制粒的过程优选为：将所述去壁灵芝孢子粉与水混合，在压力-2.5～-3.0kpa，进风温度60～80℃，出风温度不超过60℃条件下一步制粒；更优选为：设定风机频率26hz，进风温度55-60℃，将原料加入流化床中，通过向上运动的热空气进行加热，使物料保持良好的悬浮状态，混合10分钟，将粘合剂(水)通过喷雾系统进行制粒，进风温度设置60℃左右，控制物料温度35-55℃，雾化压力内层压力1.5-2.5kg/cm2，外层压力1.5-2.5kg/cm2，开始制粒时，设定蠕动泵的转速200-250rpm，渐成颗粒后设定转速150-200rpm；制粒结束后进行物料干燥，设定进风温度80-85℃左右，风机频率30-35hz，直至物料温度达到55℃-60℃左右，停止加热，物料温度降至40℃左右停机，出料；制粒车间内，温度控制在18℃-26℃，湿度控制在45％-65％。在本发明中，所述制粒制得颗粒粒度在12～16目之间，水分≤4％；更优选的，粒度为14目。下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1将4重量份破壁灵芝孢子粉与48重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一滤渣；将得到的第一滤渣与40重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二滤渣；将得到的第二滤渣与44重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度为-0.09mpa和温度为65℃的条件下减压浓缩到密度为1.15，得到浓缩药液；将浓缩药液在真空度为-0.08mpa、温度为65℃的条件下进行微波干燥，到含水量为6％，得到干浸膏；将干浸膏粉碎后过80目筛，得到去壁灵芝孢子粉；本发明在获得破壁灵芝孢子粉后，将破壁灵芝孢子粉与水混合，在压力-2.5kpa，进风温度60℃，出风温度50℃条件下，进行14目制粒，得到去壁灵芝孢子颗粒。本发明所获得的去壁灵芝孢子粉及颗粒的总多糖含量为15.2g/100g，总三萜含量为5.87g/100g，去壁灵芝孢子粉的提取率高于市面上常见破壁灵芝孢子粉。实施例2将5重量份破壁灵芝孢子粉与55重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一滤渣；将得到的第一滤渣与50重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二滤渣；将得到的第二滤渣与60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度为-0.09mpa和温度为65℃的条件下减压浓缩到密度为1.10，得到浓缩药液；将浓缩药液在真空度为-0.08mpa、温度为65℃的条件下进行微波干燥到含水量为4％，得到干浸膏；将干浸膏粉碎后过80目筛，得到去壁灵芝孢子粉；本发明在获得破壁灵芝孢子粉后，将破壁灵芝孢子粉与水混合，在压力-2.8kpa，进风温度65℃，出风温度55℃条件下，进行15目制粒，得到去壁灵芝孢子颗粒。本发明所获得的去壁灵芝孢子粉、颗粒的总多糖含量为15.8g/100g，总三萜含量为6.19g/100g，去壁灵芝孢子粉的提取率高于市面上常见破壁灵芝孢子粉。实施例3将6重量份破壁灵芝孢子粉与72重量份的水混合浸泡，在80℃下水提2h，得到第一提取液和第一滤渣；将得到的第一滤渣与60重量份的水混合在99℃下煎煮2h，得到第二提取液和第二滤渣；将得到的第二滤渣与60重量份的水混合在98℃下煎煮2h，得到第三提取液；将第一提取液、第二提取液和第三提取液合并后在真空度为-0.09mpa和温度为65℃的条件下减压浓缩到密度为1.12，得到浓缩药液；将浓缩药液在真空度为-0.08mpa、温度为65℃的条件下进行微波干燥到含水量为3％，得到干浸膏；将干浸膏粉碎后过80目筛，得到去壁灵芝孢子粉；本发明在获得破壁灵芝孢子粉后，将破壁灵芝孢子粉与水混合，在压力-3.0kpa，进风温度70℃，出风温度60℃条件下，进行16目制粒，得到去壁灵芝孢子颗粒。本发明所获得的去壁灵芝孢子粉、颗粒的总多糖含量为15.4g/100g，总三萜含量为6.94g/100g，去壁灵芝孢子粉的提取率高于市面上常见破壁灵芝孢子粉。实施例4骨髓有核细胞实验设置去壁灵芝孢子粉、颗粒及阴性对照组，阴性对照组给予同等容积的去离子水。各组小鼠灌胃给样品，每天一次，每次用量1.00g/kg·bw/d，连续20天，进行60co-γ射线照射，照射后第3天进行骨髓有核细胞实验，结果见表1。表1骨髓有核细胞实验结果组别动物数(只)溶血空斑数(个/106脾细胞)骨髓有核细胞数(107/ml)阴性对照组1095±281.47±0.31实施例110132±232.01±0.45由表1可以看出，实施例1中的去壁灵芝孢子粉、颗粒能够显著增加溶血空斑数和骨髓有核细胞数，提高细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能及nk细胞活性，对辐射危害有辅助保护功能。急性毒性试验：按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行急性毒性试验，雌、雄性小鼠急性经口mtd大于20000mg/kg·bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属无毒级。微核试验：按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行微核试验，设受试物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3个剂量组，对小鼠灌胃。受试物微核试验结果为阴性。精子畸形试验：按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行精子畸形试验，设受试物2.5、5.0、10.0g/kg·bw3个剂量组，对雄性小鼠灌胃。受试物精子畸形试验结果为阴性。ames试验：按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行ames试验，采用平板掺入法，测试剂量为5000、1000、200、40和8μg/皿。受试物ames试验结果为阴性。大鼠30天喂养试验：按《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)进行大鼠30天喂养试验，雌性设4.06、2.63、1.18g/kg·bw/d(相当于人体推荐量的122倍、79倍、35倍)三个剂量组，雄性设3.79、2.45、1.13g/kg·bw/d(相当于人体推荐量的114倍、74倍、34倍)三个剂量组。受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；血液学指标及生化指标显示，各项指标均在正常范围，各脏器病理组织学检查未见与受试样品有关的病理改变。实验结果表明：去壁灵芝孢子粉剂、颗粒剂大鼠30天喂养试验各剂量组各项指标均未观察到有害作用。由以上实施例可知，本发明所述去壁灵芝孢子粉、颗粒中有效成分总多糖的含量为10～20g/100g，总三萜的含量为4～10g/100g，相比现有技术中的灵芝孢子粉中有效成分的含量有了极大的提高，使得有效成分易吸收，安全无毒，能够有效增强机体免疫力；并且去壁灵芝孢子粉、颗粒剂的剂型使得其携带和服用非常方便。实验动物1.野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共330尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天(330尾用于样品抗肺腺癌作用评价)。2.野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共480尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天(330尾用于样品抗肺腺癌作用评价，150尾用于抗肺腺癌作用评价重复实验)。3.野生型ab品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。共660尾，每实验组为30尾，年龄为受精后2天(330尾用于样品抗淋巴癌作用评价，330尾用于样品抗淋巴癌作用评价重复实验)。饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1l反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μs/cm；ph为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/lcaco3)，实验动物使用许可证号为：syxk(浙)2012-0171。饲养管理符合国际aaalac认证的要求。实验药物样品去壁灵芝孢子粉，褐色粉末，批号为16042301，溶于超纯水中，常温干燥保存，由浙江寿仙谷医药股份有限公司，2016年05月10日接收。临用前用超纯水配制，现配现用。硫酸长春新碱，白色粉末，lot#k1306055，购于阿拉丁，阴凉柜保存。临用时用二甲基亚砜(dmso)配制成5mm母液，最终工作液中dmso浓度为0.1％。顺铂，黄色粉末，lot#k1520124，购于阿拉丁，阴凉柜保存。临用时用二甲基亚砜(dmso)配制成50mm母液，最终工作液中dmso浓度为0.1％。仪器与试剂电动聚焦连续变倍荧光显微镜(az100，nikon公司)；解剖显微镜(szx7，olympus，japan)；与显微镜相连的相机(tk-c1481ec)；精密电子天平(cp214，奥豪斯)；6孔板(nestbiotech)；甲基纤维素(aladdin,shanghai,china)。实施例5去壁灵芝孢子粉、颗粒抗胃癌作用评价1.浓度组别实验1组模型对照组实验2组阳性对照药顺铂50μm实验3组样品28μg/ml实验4组样品83μg/ml实验5组样品250μg/ml2.浓度确定依据样品在35℃的mtc均为250μg/ml；根据项目方案，样品抗肿瘤评价浓度设置为：28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。3.模型制作用红色荧光染料(cm-dil)标记人胃癌(sgc-7901)细胞，以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人胃癌移植瘤模型。4.实验方法4.1确定最大耐受浓度(mtc)随机选取野生型ab品系斑马鱼于六孔板中，分别水溶给予样品，浓度均分别为10、100、250、500、1000和2000μg/ml，同时设置正常对照组。供试品处理期间，每天对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼；供试品处理斑马鱼2天后，观察记录斑马鱼的运动状态和死亡情况，确定供试品对斑马鱼的mtc。4.2样品去壁灵芝孢子粉抗胃癌作用评价使用cm-dil标记人胃癌(sgc-7901)细胞，以显微注射的方式移植到2dpf野生型ab品系斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植模型；将注射了sgc-7901细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，以水溶给药方法分别给予样品28、83和250μg/ml浓度，阳性对照药顺铂50μm浓度，同时设置模型对照组，每孔(浓度组)30尾斑马鱼，每孔容量为5ml。将各实验(浓度)组斑马鱼继续置于35℃培养，2天后，每个实验(浓度)组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康nis-elementsd3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算癌细胞荧光强度，以荧光强度分别评价样品对斑马鱼胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用，并用以下公式计算肿瘤抑制作用。根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线；统计学分析采用方差分析和dunnett’st-检验，p<0.05为显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。特别说明：野生型ab系斑马鱼本身并不产生红色荧光，cm-dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后，在一定波长下能激发产生红色荧光，荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关，荧光强度总和越大，癌细胞数量越多。5.实验结果5.1mtc根据表2，样品在500μg/ml到1000μg/ml浓度范围内斑马鱼均出现死亡；因此确定样品对斑马鱼的mtc为250μg/ml，评价实验浓度均选取28μg/ml(1/9mtc)、83μg/ml(1/3mtc)和250μg/ml(mtc)。表2.供试品“浓度-死亡率”统计表5.2样品去壁灵芝孢子粉抗胃癌作用评价阳性对照药顺铂在50μm浓度下斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤细胞荧光强度值总和为237655像素，与模型对照组比较(368978像素)p<0.001，肿瘤抑制作用为36％，显示顺铂对斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤的生长有明显抑制作用。样品在28、83和250μg/ml的浓度下斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为173669、126373和83004像素，与模型对照组比较p<0.001&p<0.001&p<0.001，肿瘤抑制作用分别为53％、66％和78％。详见表3、图1、图2和图3。表3.样品对斑马鱼人胃癌(sgc-7901)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：与模型对照组比较，*p<0.05，***p<0.001实施例6去壁灵芝孢子粉、颗粒抗淋巴癌作用评价1.浓度组别实验1组模型对照组实验2组阳性对照药长春新碱5μm实验3组样品28μg/ml实验4组样品83μg/ml实验5组样品250μg/ml2.浓度确定依据同实施例5。3.模型制作用红色荧光染料(cm-dil)标记人淋巴癌(ramos)细胞，以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人淋巴癌移植瘤模型。4.实验方法使用cm-dil标记人淋巴癌(ramos)细胞，以显微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人淋巴癌移植模型；将注射了人淋巴癌细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，以水溶给药方法分别给予样品28、83和250μg/ml浓度，阳性对照药长春新碱5μm浓度，同时设置模型对照组，每孔(浓度组)30尾斑马鱼，每孔容量为5ml。将各实验组斑马鱼继续置于35℃培养，2天后，每个实验组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康nis-elementsd3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算癌细胞荧光强度，以荧光强度评价样品对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用，并用以下公式计算肿瘤抑制作用。根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线；统计学分析采用方差分析和dunnett’st-检验，p<0.05为显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。特别说明：野生型ab系斑马鱼本身并不产生红色荧光，cm-dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后，在一定波长下能激发产生红色荧光，荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关，荧光强度总和越大，癌细胞数量越多(lietal.2011)。5.实验结果阳性对照品长春新碱在5μm浓度下对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤细胞荧光强度为153919像素，与模型对照组比较(228110像素)p<0.001，肿瘤抑制作用为33％，显示长春新碱对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的生长有明显抑制作用。样品在28、83和250μg/ml的浓度下对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为40284、40166和37884像素，与模型对照组比较，3个浓度组p均<0.001，肿瘤抑制作用为82％、82％和83％。详见表4、图4、图5和图6。表4.样品去壁灵芝孢子粉对斑马鱼人淋巴癌(ramos)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：与模型对照组比较，***p<0.001实施例7去壁灵芝孢子粉、颗粒抗肺腺癌作用评价1.浓度组别实验1组模型对照组实验2组阳性对照药顺铂50μm实验3组样品28μg/ml实验4组样品83μg/ml实验5组样品250μg/ml2.浓度确定依据同实施例5。3.模型制作用红色荧光染料(cm-dil)标记人肺腺癌(a549)细胞，以显微注射的方式移植到斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人肺腺癌移植瘤模型。4.实验方法使用cm-dil标记人肺腺癌(a549)细胞，以显微注射的方式移植到野生型ab品系2dpf斑马鱼卵黄囊内，每尾移植约200个细胞，建立斑马鱼人肺腺癌(a549)移植模型；将注射了a549细胞的斑马鱼放置于35℃培养至3dpf。在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼，随机分配至6孔板中，以水溶给药方法分别给予样品样品28、83和250μg/ml浓度，阳性对照药顺铂50μm浓度，同时设置模型对照组，每孔(浓度组)30尾斑马鱼，每孔容量为5ml。将各实验(浓度)组斑马鱼继续置于35℃培养，2天后，每个实验(浓度)组随机选10尾斑马鱼在荧光显微镜下进行观察、拍照并保存图片；利用尼康nis-elementsd3.10高级图像处理软件进行图像分析，计算癌细胞荧光强度，以荧光强度评价样品对斑马鱼肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用，并用以下公式计算肿瘤抑制作用。根据移植瘤的生长抑制作用绘制浓度效应曲线；统计学分析采用方差分析和dunnett’st-检验，p<0.05为显著性差异；提供具有代表性的实验图谱。特别说明：野生型ab系斑马鱼本身并不产生红色荧光，cm-dil标记的细胞注射到斑马鱼卵黄囊后，在一定波长下能激发产生红色荧光，荧光强度总和与癌细胞的数量成正相关，荧光强度总和越大，癌细胞数量越多(lietal.2011)。5.实验结果阳性对照药顺铂在50μm浓度下对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤细胞荧光强度值总和为137287像素，与模型对照组比较(203330像素)p<0.001，肿瘤抑制作用为32％，显示顺铂对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤的生长有明显抑制作用。样品在28、83和250μg/ml的浓度下对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤细胞荧光强度值总和分别为161737、147640和140415像素，与模型对照组比较，28μg/ml组p<0.05，肿瘤抑制作用分别为20％；83μg/ml组p<0.01，肿瘤抑制作用为27％；250μg/ml组p<0.001，肿瘤抑制作用为31％。详见表5、图7、图8和图9。表5.样品去壁灵芝孢子粉对斑马鱼人肺腺癌(a549)移植瘤的抑制作用(n＝10)注：与模型对照组比较，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001试验结果表明：本实验浓度条件下，本发明的去壁灵芝孢子粉、颗粒对斑马鱼人胃癌移植瘤、人肺腺癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤均有抑制作用，其中对斑马鱼人胃癌移植瘤和人淋巴癌移植瘤的抑制作用较强。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12