本发明涉及犬和猫干细胞技术领域，特别涉及一种犬和猫干细胞眼药水、眼用凝胶、眼膏的制备方法及其应用。
背景技术：
间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓、脂肪、脐带或胎盘中的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，又称为基质干细胞或间充质祖细胞。MSCs具有向内、中、外3个胚层包括肌腱、韧带、肝细胞、角膜细胞、神经元细胞、心肌细胞和骨髓基质细胞分化发育的潜能；MSCs表达低水平的主要组织相容性复合物（MHC）Ⅰ类表面分子，不表达MHCⅡ类分子，具有低免疫原性和安全性；MSCs通过调控多种活性淋巴细胞（包括Ｔ 细胞、Ｂ 细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞）发挥免疫调节作用。基于以上特点，MSCs在治疗眼表疾病、视网膜疾病、干眼症等眼科疾病方面显示出了巨大的优势。
MSCs还可以产生和分泌大量的生物活性因子，如干细胞生长因子 ( SCF )、 神经生长因子 ( NGF )、 基质细胞源性生长因子 ( SDF )、 血管内皮细胞生长因子 ( VEGF )、 碱性成纤维细胞生长因子 ( bFGF )、 胰岛素样生长因子 ( IGF )、表皮生长因子( EGF )、 白介素-6 与白介素-7( IL-6 与 IL-7 )、 巨核细胞集落刺激因子( M-CSF )、 肿瘤坏死因子 ( TNF )、 干扰素 ( IFN ) 等80余种活性因子，这些干细胞活性因子具有支持干/祖细胞的增殖与分化、化学趋化、免疫调节、抗细胞凋亡、促进血管发生、抗瘢痕等功能。
MSCs通过自分泌或旁分泌的方式，改善眼部微环境，发挥眼部免疫调节作用，促进内源性干细胞向眼部受损部位进行迁移和分化，并作为种子细胞参与角膜、视网膜、泪腺等眼部受损组织修复与再生，挽救濒临凋亡的眼组织细胞，从而达到修复眼组织、恢复眼组织功能的目的。
技术实现要素：
本发明提供了一种犬、猫干细胞眼用制剂，能够修复犬、猫眼组织、恢复眼组织功能。
本发明的犬、猫干细胞眼用制剂，其特征在于该制剂包括犬、猫MSCs，以及犬、猫干细胞分泌因子。
上述的制剂，还包括视黄酸、牛磺酸、洋地黄苷、七叶亭苷、二甲基亚砜、透明质酸、三氯叔丁醇和灭菌生理盐水。
上述的制剂包括眼药水、眼用凝胶或眼膏。
上述犬、猫干细胞眼用制剂，其特征在于100ml该制剂中包含有以下的组分：
犬猫间充质干细胞：1×105～1×106个；
犬猫干细胞分泌因子：80ml～90ml；
视黄酸：0.5g～1g；
牛磺酸：4g～5g；
洋地黄苷：4mg～6mg；
七叶亭苷：9mg～11mg；
二甲基亚砜：3ml～7ml；
透明质酸：0.3g～2g；
三氯叔丁醇：0.08g～0.1g；
其余量为灭菌生理盐水，并利用NaHCO3调节pH值至7 .0-7 .2。
本发明的主要核心成份是犬、猫MSCs及干细胞分泌因子，且以保持犬、猫MSCs和干细胞分泌因子的活性和功效为前提，以上配方是经过大量的对比试验，不断优化各组分的种类和比例而得出的，任何一种组分的改变或比例的变化，都会导致犬、猫MSCs和干细胞分泌因子活性的降低或丧失。
所述的犬、猫MSCs是从犬、猫的骨髓、脂肪、脐带或胎盘中分离培养，其表面分子CD44强阳性，中国专利申请号201410405353.X公开了犬MSCs的获得方式，猫的获得同于犬。其中，本发明所述的犬、猫干细胞生长因子由共培养犬、猫骨髓间充质干细胞和造血干细胞时，由这两种干细胞共同分泌和释放出来的细胞因子和活性成份。MSCs及其分泌因子可以改善眼部环境，发挥眼部免疫调节作用，促进内源性干细胞向眼部受损部位进行迁移和分化，并作为种子细胞参与角膜、视网膜、泪腺等眼部受损组织修复与再生。视黄酸可以促进眼上皮细胞分化与生长，维持上皮组织的正常角化过程；减少皮脂腺管部位角化过程，促进腺管组织结构的正常化。牛磺酸是一种含硫氨基酸，为成熟视网膜中主要的氨基酸，能促进视网膜生长发育，缓解睫状肌痉挛，牛磺酸在房水和玻璃体中与还原性糖竞争性结合，使玻璃体中蛋白质避免糖化和氧化。洋地黄苷可以增强眼睫状肌的收缩力，特别是对伴有眼肌机能不全的情况；七叶亭苷能增强血管的封闭性，增加虹膜和睫状体中毛细血管的阻力，这两种成份的联合作用使视网膜的血流灌注得到改善。二甲基亚砜保护MSCs及干细胞分泌因子，透明质酸可以促进伤口愈合，同时延长MSCs及干细胞分泌因子的作用效果。三氯叔丁醇抑制细菌生长，起到防腐的作用。
本发明所述的干细胞及分泌因子眼用制剂可用于犬、猫常规眼科手术后，快速修复、重建和再生眼科各组织，恢复眼部功能和视力。对于角膜溃疡，视网膜疾病、干眼症，角膜炎，结膜炎，葡萄膜炎等有较好的治疗效果，对于早期的青光眼和白内障也具有一定的辅助治疗作用。
具体实施方式
实施例1：犬、猫干细胞眼用制剂，包括犬、猫MSCs，以及犬、猫干细胞分泌因子。
实验发现，在所述的制剂中，犬、猫MSCs，以及犬、猫干细胞分泌因子的联合使用相对于它们单独使用，在修复、重建和再生眼科各组织，恢复眼部功能和视力具有显著增效的作用。
具体试验情况表述如下：
以上病例都是在同等条件下进行的对比试验，在实际的应用中应考虑个体差异和眼部疾病的严重程度。
实施例2：配100ml犬、猫干细胞眼用制剂，其中包括：
犬猫间充质干细胞：1×106个；
犬猫干细胞分泌因子：90ml；
视黄酸：0.5g；
牛磺酸：5g；
洋地黄苷：5mg；
七叶亭苷：10mg；
二甲基亚砜：5ml；
透明质酸：0.3g；
三氯叔丁醇：0.1g；
其余量为灭菌生理盐水，并利用NaHCO3调节pH值至7 .0-7 .2。
本实施例所述的制剂为眼药水，该眼药水加入酚红指示剂，呈粉红色。
治疗案例：本实施例的眼药水治疗犬角膜炎、结膜炎。德国牧羊犬，2岁，雌性， 就诊前1周，曾诊断为单侧结膜炎，眼结膜充血、潮红，经诺氟沙星滴眼液治疗后，未见效果，且病情略有发展，角膜出现浑浊，经再次诊断为犬单侧角膜炎、 结膜炎。在对患犬实施抗菌消炎措施的同时，实施犬干细胞眼药水进行治疗，往患眼内滴注2～3滴，每天3次，3天后患犬眼角膜、结膜炎症状基本消失，隔两天复检，患眼炎症症状完全消失，随访1周，未见复发。相比常规消炎治疗疗效显著，疗程缩短，不复发。
实施例3：配100g犬、猫干细胞眼用制剂，其中包括：
犬猫间充质干细胞：1×106个；
犬猫干细胞分泌因子：90ml；
视黄酸：0.5g；
牛磺酸：4g；
洋地黄苷：5mg；
七叶亭苷：10mg；
二甲基亚砜：5ml；
透明质酸：2g；
三氯叔丁醇：0.1g；
其余量为灭菌生理盐水，并利用NaHCO3调节pH值至7 .0-7 .2。
本实施例所述的制剂为眼用凝胶，该眼用凝胶加入酚红指示剂，呈粉红色。
治疗案例：本实施例的眼药凝胶治疗犬角膜溃疡。本地杂交犬，雌性，6岁，该犬病程已有1周，精神沉郁，食欲废绝，体温39.8℃，患犬一侧眼羞明、流泪，眼睛分泌物异常增多，且分泌物使患眼上下眼睑粘连，经生理盐水冲洗，检查患眼发现，结膜充血，角膜表面有较大面积溃疡灶，确诊为犬角膜溃疡。首先对患眼用温生理盐水彻底清洗， 再在角膜、结膜表面涂抹红霉素软膏，随后使用干细胞眼用凝胶，每天3次，每次以覆盖角膜溃疡灶为宜，同时全身应用抗生素，连续治疗1周，角膜溃疡灶明显变小，结膜颜色正常，精神有明显好转，食欲正常。按照上述方法，再用犬干细胞眼用凝胶治疗3天，角膜溃疡消失，患犬恢复健康，随访1周，未见复发。对于犬角膜溃疡的治疗，常规治疗在抗菌消炎的同时，需要做上下眼睑缝合术，1周后再拆线，创口愈合速度慢，而使用干细胞眼用凝胶后，快速修复角膜溃疡灶，无需做眼睑缝合手术，省时省力，愈合良好。
实施例4：配100g犬、猫干细胞眼用制剂，其中包括：
犬猫间充质干细胞：1×106个；
犬猫干细胞分泌因子：85ml；
视黄酸：0.5g；
牛磺酸：4g；
洋地黄苷：5mg；
七叶亭苷：10mg；
二甲基亚砜：3ml；
透明质酸：1g；
凡士林：2g；
羊毛脂：10g；
三氯叔丁醇：0.1g；
其余量为灭菌生理盐水，并利用NaHCO3调节pH值至7 .0-7 .2。
本实施例所述的制剂为眼膏，该眼膏加入酚红指示剂，呈粉红色。
上述实施例中的制剂为眼膏时，先将凡土林和羊毛脂加热到70-75℃。将灭菌生理盐水加热到70-75℃，两者混合均匀，搅拌降温。当温度下降到36-39℃时，加入其余组份，混合均匀即可。
治疗案例1：本实施例的眼膏治疗犬瞬膜腺增生。北京犬，雄性，8岁，犬瞬膜腺增生，采用手术切除法。常规麻醉保定，肌注846麻醉剂0.05ml/kg体重，待犬进入麻醉期，将犬病眼向上，侧卧于保定架上，固定头部。清洗眼分泌物后用弯头止血钳夹住增生根部2min，切除增生肿块，充分止血。术后双眼点滴氯霉素眼药水进行抗菌消炎，再使用犬干细胞眼膏每天3次。2天后伤口完全愈合，比常规疗程缩短2-3天。
治疗案例2：本实施例的眼膏治疗犬眼球脱出。博美犬，雄性，2岁，犬打架后眼球脱出，麻醉固定犬头部，用混有青霉素的生理盐水将眼球上的污物冲洗干净。用灭菌纱布将眼球轻轻压入眼眶内，结节缝合上下眼睑。用氯霉素眼药水进行抗菌消炎，再使用犬干细胞眼膏每天3次，直至炎症消失，对于术后眼部组织的修复效果良好，且患犬视力未受到影响。