雷公藤甲素及其修饰物在抑制B细胞产生抗体中的应用的制作方法

本发明涉及雷公藤甲素及其修饰物在免疫抑制作用中的用途，尤其涉及雷公藤甲素及其修饰物在抑制B细胞产生抗体中的应用，属于医学领域。

背景技术：

移植术后排斥反应是影响移植物存活时间的主要原因，排斥反应分为细胞介导排斥反应和抗体介导排斥反应(AMR),与T细胞介导的细胞性排斥反应相比，B细胞参与的移植术后急性或慢性AMR治疗效果差、患者预后不佳，属于难治性排斥反应，因此，如何抑制B细胞产生抗体，一直是移植免疫领域亟需解决的难题。器官移植(肾移植、皮肤移植、肺移植等)后发生的急性AMR主要由循环抗体(DSA)所致，治疗效果差，预后不佳，属于难治性急性排斥反应。

雷公藤甲素是从中药雷公藤中提取的单体，目前发现其具有四大功能：抗肿瘤、抗生殖、抗炎和免疫抑制，其免疫抑制作用早有报道，已应用于临床的中成药：可治疗风湿、关节炎、皮肤病、免疫相关性肾炎等，但是雷公藤甲素在对B细胞产生抗体方面的影响未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足之处而提供一种雷公藤甲素及其修饰物在抑制B细胞产生抗体中的应用，所述雷公藤甲素及其修饰物能抑制B细胞产生抗体，为制备抑制B细胞产生抗体的药物提供依据。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：雷公藤甲素及其修饰物在抑制B细胞产生抗体中的应用。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述抗体为B细胞产生的抗体。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述雷公藤甲素修饰物为柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯。柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯在小鼠体内可代谢为雷公藤甲素发挥作用。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯抑制B细胞产生抗体的使用方法为皮下注射。

采用剂量为1mg/kg体重的柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯对受体Balb/c小鼠进行皮下注射，发现注射柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯的小鼠中的循环抗体水平明显低于注射生理盐水的小鼠中的循环抗体水平，表明柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯可抑制B细胞产生抗体。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述雷公藤甲素抑制B细胞产生抗体的使用浓度为0.04ng/ml-4μg/ml。雷公藤甲素的浓度在0.04ng/ml-4μg/ml时，不影响B细胞活性，可用来探索雷公藤甲素对B细胞凋亡的影响。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述雷公藤甲素抑制B细胞产生抗体的使用浓度为4ng/ml。雷公藤甲素在浓度为4ng/ml时，对B细胞的凋亡没有影响，且能进一步用于探讨雷公藤甲素对B细胞分化及功能的研究。

另一方面，本发明公开一种雷公藤甲素及其修饰物在用于制备抑制B细胞产生抗体的药物中的应用。

另一方面，本发明公开一种用于抑制B细胞产生抗体的药物，所述药物包括雷公藤甲素或其修饰物。所述药物可抑制B细胞产生抗体，可用于临床上抗体介导的急慢性排斥反应的治疗以及抗体相关的自身免疫疾病的治疗。

作为对上述技术方案的进一步改进，所述药物还包括药学上可接受的载体。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明实验结果首次证实在不同品系皮肤移植致敏的小鼠中，雷公藤甲素能抑制循环抗体DSA的产生，并进一步体外实验证实雷公藤甲素能抑制B细胞产生抗体。由此可见，雷公藤甲素及其修饰物可抑制B细胞产生抗体，能够为制备抑制B细胞产生抗体的药物提供依据。

附图说明

图1为注射柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯和生理盐水的小鼠在皮肤移植后不同时间内循坏DSA的滴度变化曲线图，其中图(A)为IgG的平均荧光强度变化情况，图(B)为IgM的平均荧光强度变化情况；

图2为利用流式细胞术检测不同浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照处理组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19+细胞的细胞凋亡图；

图3为利用流式细胞术检测4ng/ml浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19+细胞8天后CD138+CD27++浆细胞的比例统计图；

图4为利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测免疫球蛋白的产生情况的柱形统计图；

图5为检测雷公藤甲素(TPL)对免疫球蛋白高变区VH3多样性的影响的柱形统计图；

图6为利用RT-PCR实验检测不同种类免疫球蛋白的表达量的柱形统计图。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例及附图对本发明作进一步说明。

实施例1体内实验

实验方法：实验分为2组，实验组和对照组，皆行C3h→Balb/c皮肤移植(H2k→H2d)，每组6只。实验组利用修饰后的雷公藤甲素即可注射用柠檬酸二甲胺乙酰雷公藤甲素酯(货号MC002)，其在小鼠体内代谢为雷公藤甲素发挥作用，对受体Balb/c小鼠皮下注射，剂量为1mg/Kg，频次为隔天一次；对照组为注射等量生理盐水，相同频次。两组小鼠在皮肤移植后2、4、6、8、12、16、24、28天留取血标本，检测标本中DSA强度并进行组间比较，结果如图1所示。

其中DSA检测方法为：取供体完整脾脏，磨碎过滤后获取脾脏细胞，于HBSS中重悬至细胞浓度为10⁶，同100ul受体备用血清于冰面共孵育30min，洗涤重悬细胞后进行荧光标记染色；细胞后上流式细胞仪分析荧光强度，确定循环DSA滴度变化。

实验结果：由图1可知，实验组DSA水平明显低于对照组，具体统计学差异，可证明雷公藤甲素能抑制小鼠皮肤移植致敏后DSA的产生，由于AMR主要是由于DSA所致，所以雷公藤甲素有可能对AMR具有防治作用。

实施例2体外实验

本发明申请人考虑当前雷公藤甲素对B细胞的作用，目前尚无体外的实验研究可供参考，因此在预实验阶段进行了浓度探索，参考雷公藤甲素在其他细胞中使用的浓度，并以不影响B细胞活性为前提下，探索0.04ng/ml-4μg/ml区间浓度的雷公藤甲素对B细胞凋亡的影响，利用不同浓度(0.04ng/ml-4μg/ml)的雷公藤甲素(TPL)和对照处理组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19⁺细胞，即B细胞8天，并利用流式细胞术检测PI⁺(碘化丙啶)的浓度，用于检测细胞凋亡数。结果如图2所示，当雷公藤甲素在浓度为4ng/ml时，对B细胞的凋亡没有影响，且能进一步用于探讨雷公藤甲素对B细胞分化及功能的研究，即雷公藤甲素(TPL)体外处理B细胞的最宜浓度为4ng/ml。

利用流式细胞术检测4ng/ml浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19⁺细胞8天后，获得CD27⁺⁺CD138⁺浆细胞的比例。结果如图3所示，雷公藤甲素处理组CD27⁺⁺CD138⁺浆细胞的比例显著低于对照组，差异有统计学意义，提示雷公藤甲素可明显抑制B细胞转化为CD27⁺⁺CD138⁺浆细胞。

利用4ng/ml浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19⁺细胞8天，利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测免疫球蛋白的产生情况，以观察雷公藤甲素(TPL)对B细胞抗体产生的影响。结果如图4所示，雷公藤甲素处理组抗体滴度水平，包括IgM、IgA和IgG等显著低于对照组，差异具有统计学意义，提示雷公藤甲素可明显抑制B细胞产生抗体。

利用4ng/ml浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19⁺细胞8天，在含有100μl培养基的培养皿里，收集培养密度为2x10⁵B细胞的上清液用于检测雷公藤甲素(TPL)对免疫球蛋白高变区VH3多样性的影响。结果如图5所示，雷公藤甲素处理组免疫球蛋白高变区VH3多样性指数显著低于对照组，差异有统计学意义，提示雷公藤甲素可明显抑制免疫球蛋白高变区VH3多样性。

利用4ng/ml浓度的雷公藤甲素(TPL)和对照组二甲基亚砜(DMSO)处理纯化的外周血CD19⁺细胞8天，在含有100μl培养基的培养皿里，收集培养密度为2x10⁵B细胞的上清液，利用RT-PCR实验检测不同种类免疫球蛋白的表达量。结果如图6所示，雷公藤甲素处理组相比于对照组，可显著降低不同亚型的抗体水平，包括IgM、IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG4和IgG4等，差异有统计学意义，提示雷公藤甲素可显著抑制B细胞产生抗体。

上述结果证实：雷公藤甲素在体外能明显抑制B细胞产生抗体。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。