土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法及其在抗胰腺癌方面的应用与流程

本发明属于中药领域，具体是一种土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法及其在抗胰腺癌方面的应用。

背景技术：

菊科(asteraceae)旋覆花属(inulal.)植物约有100余种，主要分布于欧洲、非洲及亚洲，以地中海地区为主。我国旋覆花属有20余种和多个变种，其中一部分是广泛分布种；我国的特有种主要集中于西部和西南部。旋覆花属多个种植物常供药用。

土木香(inulaheleniuml.)为菊科旋覆花属植物，在我国具有多年用药历史，现被我国2015版药典收载。土木香，味辛、苦、温，归肝、脾经，具有健脾和胃、行气止痛等功效，常用于胸胁、脘腹胀痛，呕吐泻痢，胸胁挫伤，岔气作痛，胎动不安等治疗。

土木香含有多个倍半萜内酯类成分，且为其指标性有效成分，2015版药典规定，土木香以干燥品计算，含土木香内酯及异土木香内酯的总和不得低于2.2％。迄今为止，虽然文献报道，对菊科旋覆花属植物进行了较系统的化学成分研究，已从该属多个种的药用植物中，提取、分离得到了一系列倍半萜内酯类化合物，并且鉴定了其化学结构；文献亦报道了多个倍半萜内酯类化合物的多种生物活性，如：驱虫作用，抗菌作用等。但迄今未有对菊科旋覆花属植物中含有的倍半萜内酯类成分的有效部位的研究报道，亦没有提供一种工艺科学合理，有效部位性能稳定、药效物质较明确、生物活性高的土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，及其在临床较难治疗的胰腺癌方面的应用。

目前，在提取溶剂及方法方面，文献“土木香化学成分的研究”(赵永明；土木香化学成分的研究；天然产物研究与开发；2009年第21卷)公开了土木香中倍半萜内酯类成分的提取方法，该研究用99％的乙醇回流提取。99％的乙醇在提取土木香脂溶性较强的倍半萜内酯方面具有明显优势，且能最大限度避免极性较大的非倍半萜内酯类杂质的引入，但99％的乙醇成本高，高浓度的乙醇亦不适合工业化生产，存在一定的技术缺陷。

文献“土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺”(张乐；土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺；天然产物研究与开发；2015年第27卷)公开了土木香主要倍半萜内酯的提取、纯化方法，包括用95％的乙醇加热回流提取。该法在一定程度上能高效提取出土木香中倍半萜内酯类成分，但回流提取能耗高，且可能对稳定性较差的倍半萜内酯类成分造成破坏，存在一定的技术缺陷。

在萃取溶剂及纯化方面，文献“土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺”(张乐；土木香内酯与异土木香内酯的提取与纯化工艺；天然产物研究与开发；2015年第27卷)公开了土木香主要倍半萜内酯的提取、纯化方法，并优化了提取工艺。该方法在纯化主要指标性成分时，未对95％的土木香乙醇提取物进行萃取及粗分离，直接上硅胶柱分离，会引入大量非倍半萜内酯类成分，且影响硅胶的分离效能。

硕士论文“治疗ibs有效部位土木香总内酯的制备工艺及质量标准研究”(张乐；上海交通大学，2014级硕士生)公开了土木香总内酯的制备工艺，但其总内酯中包含的倍半萜内酯类成分较多，倍半萜内酯类成分为一类“天然迈克尔反应受体分子”，特别极性较大的该类成分易与体内一些关键蛋白、酶发生不可逆结合，存在潜在毒性，存在一定技术缺陷。

在土木香倍半萜内酯有效部位提取方法方面，冷浸法、回流提取法、超临界流体萃取法均有应用。冷浸法提取效率低，提取溶剂用量大；回流提取法可能会造成一些热敏性倍半萜内酯类成分的降解，能耗亦大；超临界流体萃取法提取效率高，但设备昂贵，高压下操作，亦对人员、厂房等要求高，会增加生产成本。

在土木香倍半萜内酯纯化工艺方面，硅胶柱层析法应用较多。该法对土木香倍半萜内酯的分离、纯化具有一定优势。文献报道的多是某些倍半萜内酯单体的分离、纯化方法，较少涉及土木香倍半萜内酯有效部位。有文献报道亦提到了利用硅胶柱层析纯化土木香总内酯，但该总内酯成分复杂，药效物质不明确。

在土木香倍半萜酯应用方面，文献报道多集中在驱虫、抗菌等方面。其在癌症治疗方面有报道，但以白血病为主，且较多文献报道主要集中在：土木香某倍半萜内酯单体体外对人源肿瘤细胞的生长抑制活性，药效物质明确的土木香倍半萜内酯有效部位，对较难治疗的人源胰腺癌细胞的抑制活性鲜有文献报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述问题，提供一种科学合理，工艺操作简单的菊科旋覆花属植物土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法。所述倍半萜内酯有效部位药效物质明确，纯度高，几个土木香内酯协同，符合中药多组分、多靶点协同发挥药效的优势及特点，其对胰腺癌的体外抑制活性亦预示其具有重要的应用价值。

本发明采用的技术方案是：

一种土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法，所述方法包括：

(1)取土木香药材粉碎，过筛，以75～95％(v/v)乙醇水溶液浸泡24～48h后用75～95％乙醇水溶液渗漉提取，收集渗漉液；所述75～95％乙醇水溶液总用量为土木香药材质量的10～20倍(即乙醇水溶液用量为10～20ml/g土木香药材)；渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。本发明采用渗漉法在常温下操作，亦不会造成热敏性有效成分的破坏或降解。所用土木香药材为土木香(inulaheleniuml.)的根，被2015版中国药典收载，价廉易得；

(2)步骤(1)渗漉液浓缩回收乙醇，所得浸膏用3～10倍量的水混悬后(即水用量为3～10ml/g浸膏)，再用浸膏3～10倍量(即乙酸乙酯用量为3～10ml/g浸膏)的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液，萃取液回收溶剂，得到土木香的乙酸乙酯提取物；乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚，能够将土木香提取物中倍半萜内酯类成分萃取完全；乙酸乙酯萃取，亦剔除了土木香醇提物中极性较大的非倍半萜内酯类杂质，且乙酸乙酯毒性较小，工业生产亦符合绿色、环保等理念。

(3)乙酸乙酯提取物上正相氧化铝或100～200目硅胶柱，以石油醚和乙酸乙酯体积比30～0:1的混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，收集石油醚和乙酸乙酯体积比20～16:1的洗脱液。洗脱溶剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱溶剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、药理活性好的土木香倍半萜内酯有效部位。高效液相色谱检识，及体外抑制胰腺癌活性追踪显示：土木香倍半萜内酯类成分几乎全部位于由体积比为20～16:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得土木香有效部位中倍半萜内酯类活性成分含量更高，分布更加集中，配合常规植化研究，亦明确了该有效部位的药效物质。

(4)洗脱液用旋转蒸发仪在40～45℃减压回收溶剂，得到所述土木香倍半萜内酯有效部位，该有效部位主要由：土木香内酯、异土木香内酯、alloalantolactone等三个倍半萜内酯类成分组成。

优选的，步骤(1)浸泡和渗漉所用溶剂为95％乙醇。该提取溶剂的性质非常适合于提取土木香的根茎和/或根，能够更加高效、完全地获取药用部位中的倍半萜内酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非倍半萜内酯类杂质被提取出来。

优选的，步骤(3)所用洗脱剂为石油醚和乙酸乙酯体积比20～16:1的混合溶剂。

本发明土木香倍半萜内酯有效部位可与市售或者常用的载体结合，可用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗胰腺癌的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

与现有的技术相比，本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法制得的倍半萜内酯有效部位，生物活性强，含有多个在生物医药领域具有广阔应用前景的土木香倍半萜内酯小分子。有效部位，多个成分之间具有“多组分、多靶点”的协同作用，能够一定程度上代表药材的整体药效，并且，该有效部位，药效物质明确，纯度高，质量可控，具有剂量小、使用方便等优点，有别于传统中药“粗、大、黑”的落后应用形式。本发明利用系统溶剂法及正相色谱法，分离、纯化得到了富含倍半萜内酯的有效部位。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。正相色谱适合进行工业化生产，制得的有效部位纯度更高。本发明土木香有效部位的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，适于工业化大生产。

按照本发明方法制备得到的土木香倍半萜内酯有效部位，在体外实验显示出了较好的抗肿瘤活性。特别是对人源胰腺癌细胞株，具有显著的增殖抑制作用和转移抑制作用，因此可以通过进一步的实验将此类化合物应用于抗胰腺癌药物的研究。

附图说明

图1是倍半萜内酯alloalantolactone的化学结构式；

图2是倍半萜内酯土木香内酯的化学结构式；

图3是倍半萜内酯异土木香内酯的化学结构式；

图4是土木香倍半萜内酯有效部位细胞增殖实验结果；

图5是土木香倍半萜内酯有效部位划痕实验结果；

图6是土木香倍半萜内酯有效部位侵袭实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：实施例1：

本土木香倍半萜内酯有效部位的制备方法包括下述步骤：

a、提取：土木香药材打粉，过40目筛备用。取土木香药材粗粉10kg，加适量95％乙醇冷浸24h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的15倍量(总计用去95％的乙醇150l)。

b、萃取：将步骤a得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，加水混悬至2l，用2l的乙酸乙酯、2l的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到土木香乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过体外抗胰腺癌活性追踪，土木香倍半萜内酯有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，得到土木香乙酸乙酯提取物370.2g。

c、柱层析：取上述土木香乙酸乙酯提取物约200g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱溶剂洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为28l(约4个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30︰1，25︰1，20︰1，18︰1，16︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗胰腺癌活性追踪，高效液相色谱检识，土木香倍半萜内酯有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯20～16︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到土木香倍半萜内酯有效部位161.6g。

d、土木香倍半萜内酯有效部位药效物质研究：按照常规植化研究方法，通过反相中压柱层析、制备型高效液相柱层析，从制备所得土木香倍半萜内酯有效部位中分离鉴定了三个倍半萜内酯类化合物：alloalantolactone、土木香内酯、异土木香内酯。

取上述制备的土木香倍半萜内酯有效部位约10mg，精密称定，用甲醇定容至2ml容量瓶中，配成约5mg/ml的样品，样品10000r/min离心10min，取上清液，备用。取上述样品供试液，进行hplc-ms分析，色谱仪为安捷伦1260，质谱仪为安捷伦6460。色谱条件为：流速0.3ml/min，洗脱体系：乙腈-水，洗脱条件：65％乙腈，等度洗脱，进样量5μl。

实施例2：

a、提取：取土木香药材10kg，加10倍量(100l)95％乙醇，回流提取，每次提取时间为2h，共提取2次，合并两次提取液。总计用去95％的乙醇200l。

b、萃取：将步骤a得到的提取液减压浓缩至无醇味，加水混悬至2l，分别用2l的乙酸乙酯、2l的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到土木香乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液，通过体外抗胰腺癌活性追踪，土木香倍半萜内酯有效成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到土木香乙酸乙酯提取物397.4g。

c、柱层析：取上述土木香乙酸乙酯提取物约200g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为28l(约4个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30︰1，25︰1，20︰1，18︰1，16︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗胰腺癌活性追踪，高效液相色谱检识，土木香倍半萜内酯有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯20～16︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到土木香倍半萜内酯有效部位151.5g。

实施例2提取溶剂较实施例1多了5倍量；回流提取，能耗大大增加；高温下提取4h，亦可能造成热敏性倍半萜内酯的降解。有效部位的得率较实施例1略低，可见渗漉法对有效部位的提取效率较回流提取法高。回流提取法在约85℃操作，若工业大生产，其能源消耗对生产成本的增加，亦将不容忽视。

实施例3：

a、提取：土木香药材打粉，过40目筛备用。取土木香药材粗粉10kg，加适量95％乙醇冷浸24h后渗漉提取，提取溶剂体积相当于药材质量的15倍量(总计用去95％的乙醇150l)，收集渗漉液。

b、冷冻干燥：将步骤a得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，稠浸膏采用冷冻干燥法干燥，得到冻干粉468.4g。

c、柱层析：取上述土木香醇提取物的冻干粉约200g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱溶剂均由石油醚和乙酸乙酯组成且体积均为28l(约4个柱体积)，各个洗脱溶剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30︰1，25︰1，20︰1，18︰1，16︰1，5︰1，2︰1，1︰1，0︰1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分，通过体外抗胰腺癌活性追踪，高效液相色谱检识，土木香倍半萜内酯有效成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯20～16︰1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到土木香倍半萜内酯有效部位132.4g。

实施例3亦用95％的乙醇渗漉提取，但醇提物未进行系统溶剂法萃取粗分离，醇提物中含水，正相硅胶柱层析一定必须将提取物中水分蒸干，故增加了稠浸膏冷冻干燥的工序。醇浸膏按照实施例1或2相同的柱层析工艺纯化时，由于醇浸膏中含有较多的非倍半萜内酯类杂质，故有效部位得率较实施例1或2有明显降低。在对各洗脱流分进行体外抑制人源胰腺癌活性追踪时，流分的抑制活性亦有较显著下降。

实施例4：

实施例1所得土木香乙酸乙酯提取物，直接进行体外抑制人源胰腺癌活性测试；并对其进行hplc分析。结果显示：乙酸乙酯提取物抑制活性，较实施例1所得土木香倍半萜内酯有效部位活性显著下降。高效液相分析也显示，乙酸乙酯提取物色谱峰较多，需花较多精力去阐明其物质基础。

实施例5

以氧化铝为填料，乙酸乙酯提取物上正相柱进行分离，结果显示有效部位得率与实施例1接近，故正相柱填料用氧化铝及100～200目硅胶均可。

实施例6：土木香倍半萜内酯有效部位体外抗胰腺癌实验：

a、仪器与试剂：

胎牛血清，0.25％胰酶-edta，pbs：美国lifetechnologies公司；

rmpi-1640、dmem培养基：吉诺生物医药技术有限公司；

srb粉末:美国sigmaaldrich公司；

co2培养箱：美国thermoscientific公司；

spectramaxm3酶标仪：美国moleculardevices公司；

细胞培养板：美国corning公司；

anexinfitc/pi双染试剂盒：美国bd公司；

bdmatrigel基底膜基质胶(8.0μm)侵袭室：美国bd公司。

b、实验步骤：

1)细胞增殖实验(srb法)

a.消化胰腺癌细胞(cfpac1、sw1990、capan-2和panc-1细胞)，将3～5×10³个细胞/100μl/孔接种于96孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养24h后进行下一步试验；

b.分组:空白对照；土木香倍半萜内酯有效部位阳性对照；1、2、4和8μg/ml药物处理组；c.用含不同浓度药物的培养基预处理胰腺癌细胞，48h后，吸弃含药培养基；每孔加入60μl预冷的10％三氯乙酸置于4℃冰箱固定1h。用水洗5遍后烘干，加入由1％冰醋酸配制的4mg/ml的磺酰罗丹明b(sulforhodamineb，srb)溶液50μl，染色20min。弃去srb染液用1％冰醋酸洗5遍，烘干后加入150μl10mmtris-base，轻微振荡使晶体完全溶解，用酶标仪于515nm处测定每孔的吸光度(od值)，计算3个复孔的平均值和标准差。抑制率＝(1-给药孔平均光密度值/对照组平均光密度值)×100％。根据抑制率计算药物对肿瘤细胞的半数抑制浓度(ic50)，ic50用origin软件计算。实验重复3次，ic50取mean±sd。

2)细胞迁移实验(划痕法)

a.消化胰腺癌细胞，将5×10⁵个细胞/2ml/孔接种于6孔细胞培养板中，37℃、5％co2培养待细胞90％融合后进行下一步试验，划痕，pbs洗去漂浮细胞，显微镜观察并拍照；

b.分组:空白对照；土木香倍半萜内酯有效部位阳性对照；2、4和8μg/ml药物处理组；

c.用含不同浓度药物的培养基预处理胰腺癌细胞，24h后，显微镜下观察给药组细胞和对照组细胞痕迹修复情况，拍照，分析。

3)细胞侵袭实验(trans-well法)

a.消化胰腺癌细胞，将1×10⁵个细胞/0.2ml/孔接种于24孔细胞培养板bdmatrigel基底膜基质胶(8.0μm)侵袭室的上室中(培养基不含血清)，下室加入0.5ml含血清的培养基，37℃、5％co2培养6h待细胞铁壁后进行下一步试验；b.分组:空白对照；土木香倍半萜内酯有效部位阳性对照(4μg/ml)药物处理组；c.用含不同浓度药物的培养基处理胰腺癌细胞，24h后，甲醇固定20分装，结晶紫染色30分装，pbs漂洗，用棉花棒擦去上室中的细胞，显微镜下观察给药组细胞和对照组细胞痕侵袭情况，拍照，分析。

c、实验结果：

1)在胰腺癌cfpac1、sw1990、capan-2和panc-1四个细胞株，所制备的土木香倍半萜内酯有效部位均呈现较好的抗肿瘤活性，见表1和图4所示。

表1：土木香倍半萜内酯有效部位的ic50值(mean±sd，n＝3)

2)通过划痕实验得到的结果可知，所制备的土木香倍半萜内酯有效部位对cfpac1细胞表现出了较好的抑制细胞迁移的作用，且具有较好的浓度相关性。如图5所示。

2)通过侵袭实验得到的结果可知，所制备的土木香倍半萜内酯有效部位对cfpac1细胞表现出了较好的抑制细胞侵袭的作用。如图6所示。

本发明制备得到的土木香倍半萜内酯有效部位可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗胰腺癌的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。

本发明土木香倍半萜内酯有效部位，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的土木香倍半萜内酯有效部位配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中，ph通常约5～8，较佳的ph约为6～8，ph可根据所选辅料、基质及治疗疾病病症的不同而有所变化。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于)：肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明土木香倍半萜内酯有效部位可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡糖糖和其它辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的土木香倍半萜内酯有效部位，还可以与其它抗胰腺癌药物协同使用。

当本发明土木香倍半萜内酯有效部位被用做药物时，可将治疗有效剂量的土木香倍半萜内酯有效部位施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，而且在大多数情况下不超过50mg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。

本发明中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。