一种人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法与流程

本发明属于3d打印技术和组织工程领域，涉及一种人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法。

背景技术：

组织工程是近年来兴起的一门将生物医学和工程学结合起来的交叉学科，它的核心是构造由细胞和生物相容性材料结合而成的复合体，后将其应用于损伤组织、器官的修复，以恢复其功能。3d打印技术是通过材料累加的方式进行加工制造，相较于传统的加工方式，3d打印技术在复杂结构的制造上拥有较大的优势，同时兼具精准的控制性，它的快速发展为组织工程提供了一种全新的途径，已在生物医疗领域得到了广泛的应用。

人工肌肉支架的研究目的主要为将其用于大块肌肉组织缺损的修复，以恢复肌肉组织的功能；对于骨骼肌细胞，在体外实验培养中，要使其生长分化为人工肌肉组织，需将其按照一定的结构排列起来，如线性结构，并要求线宽在50～200μm范围内。

在现有技术中，人工肌肉组织的制造主要由两种方式:一是用微纳加工的方法，在硅片上刻蚀出大小相等线性排列的凹槽，随后将骨骼肌细胞种植到加工好的硅片上，进行体外培养，从而得到人工肌肉组织；另一种方法是利用静电纺丝等技术制得纤维定向排布的无纺布，将骨骼肌细胞细胞种植于此无纺布上，诱导分化为人工肌肉组织，从而得到人工肌肉支架。

对于上述两种制造方法，均是通过种植肌肉细胞的方式来得到人工肌肉组织，用此种方法，容易出现细胞在硅片或无纺布上分布不均匀的问题，因而难以控制骨骼肌细胞的排列和人工肌肉三维组织结构，从而较难满足细胞分化的要求，与此同时，相较于直接打印，种植过程也较为繁琐。

3d打印在组织工程上的应用为人工肌肉组织的制造提供了新的方法，现应用较多的为挤压打印和喷墨打印，前者能够通过材料累积的方式获得大块人造组织，但由于在打印过程中，材料的挤压会形成较大剪切力，影响细胞存活率，且打印精度较低，后者虽有细胞存活率较高、打印精度高的优势，但难以形成三维结构，无法得到大块人造组织。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点，提供了一种人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法，该制备装置和方法制备得到的人工肌肉支架模型中细胞排布均匀，细胞的存活率高，并且打印精度高。

为达到上述目的，本发明所述的人工肌肉支架模型包括下层支架、上层支架及细胞束层，细胞束层、上层支架及下层支架及自上到下依次分布。

所述细胞束层由若干线性排列的细胞束组成。

下层支架为网状结构，上层支架为板状结构。

本发明所述的人工肌肉支架模型的制造装置包括计算机、第一供料系统、第二供料系统、微滴打印头、挤压打印头、打印平台以及用于带动微滴打印头及挤压打印头移动的三维移动平台，其中，第一供料系统与挤压打印头相连通，第二供料系统与微滴打印头相连通，且挤压打印头及微滴打印头均位于打印平台的正上方，计算机与三维移动平台的控制端、第一供料系统的控制端及第二供料系统的控制端相连接。

本发明所述的人工肌肉支架模型的制造方法包括以下步骤：

1)绘制待打印人工肌肉支架模型的三维模型，然后将待打印人工肌肉支架模型的三维模型输入至计算机中；

2)获取明胶-海藻酸钠混合水凝胶、交联剂及骨骼肌细胞悬液，再将明胶-海藻酸钠混合水凝胶装入第一供料系统中，将骨骼肌细胞悬液装入第二供料系统中；

3)计算机控制第一供料系统，使第一供料系统中的明胶-海藻酸钠混合水凝胶经挤压打印头均匀挤出至打印平台上，同时计算机根据待打印人工肌肉支架模型的三维模型控制挤压打印头移动，完成上层支架及下层支架的打印；

4)将交联剂滴加至上层支架及下层支架上，使明胶-海藻酸钠混合水凝胶中的海藻酸钠与交联剂发生交联，进而使上层支架及下层支架固化；

5)计算机控制第二供料系统，使第二供料系统中的骨骼肌细胞悬液经微滴打印头掉落到上层支架上，同时计算机根据待打印人工肌肉支架模型的三维模型控制微滴打印头移动，完成细胞束层的打印，得人工肌肉支架模型胚体；

6)将步骤5)得到的人工肌肉支架模型胚体放置到培养箱中进行细胞培养，得人工肌肉支架模型。

培养箱中的温度为37℃，培养箱内空气中二氧化碳的体积百分数为5％。

还包括：称取明胶颗粒及海藻酸钠，其中，取明胶颗粒与海藻酸钠的质量比为1:1.2，然后再在40℃的条件下将明胶颗粒加入到dpbs缓冲液中，再用磁力搅拌器以200r/min的转速搅拌，待明胶颗粒完成溶解后再加入海藻酸钠，得明胶-海藻酸钠混合水凝胶，其中，明胶-海藻酸钠混合水凝胶中明胶的质量百分数为5％；明胶-海藻酸钠混合水凝胶中海藻酸钠的质量百分数为6％。

交联剂为质量百分浓度为4％的氯化钙溶液。

还包括：配制质量百分浓度为10％的明胶溶液，并用针筒式滤膜过滤器过滤所述明胶溶液，再在滤液中加入细胞c2c12，然后再吹打均匀，得骨骼肌细胞悬液，其中，骨骼肌细胞悬液中细胞的密度为1x10⁶/ml。

所述挤压打印头的喷嘴为点胶针头，其中，点胶针头的直径为160μm～1.2mm，打印过程中点胶针头的移动速度为5mm/s～15mm/s，第一供料系统中明胶-海藻酸钠混合水凝胶的供给速率为500μl/min～2ml/min，打印过程中的温度为37℃。

本发明具有以下有益效果：

本发明所述的人工肌肉支架模型以及其制备装置和方法在具体操作时，采用挤压打印方式与微滴打印方式相结合实现对人工肌肉支架模型的打印，具体的，在制备时，采用挤压打印方式通过材料的累加分别打印出上层支架及下层支架，然后再采用微滴打印方式精确控制细胞排布及人工肌肉三维组织结构完成细胞束层的打印，从而使制造得到的人工肌肉支架模型中细胞排布均匀，且细胞的存活率高，并且打印精度较高。

附图说明

图1为本发明中人工肌肉支架模型的主视图；

图2为本发明中人工肌肉支架模型的侧视图；

图3为本发明中人工肌肉支架模型的仰视图；

图4为本发明的结构示意图。

其中，1为细胞束层、2为上层支架、3为下层支架、4为明胶-海藻酸钠混合水凝胶、5为骨骼肌细胞悬液、6为微滴打印头、7为挤压打印头、8为第二供料系统、9为打印平台、10为第一供料系统。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参考图1，本发明所述的人工肌肉支架模型包括下层支架3、上层支架2及细胞束层1，细胞束层1、上层支架2及下层支架3及自上到下依次分布；所述细胞束层1由若干线性排列的细胞束组成；下层支架3为网状结构，上层支架2为板状结构，细胞束的线宽为50～200μm。

本发明所述的人工肌肉支架模型的制造装置包括计算机、第一供料系统10、第二供料系统8、微滴打印头6、挤压打印头7、打印平台9以及用于带动微滴打印头6及挤压打印头7移动的三维移动平台，其中，第一供料系统10与挤压打印头7相连通，第二供料系统8与微滴打印头6相连通，且挤压打印头7及微滴打印头6均位于打印平台9的正上方，计算机与三维移动平台的控制端、第一供料系统10的控制端及第二供料系统8的控制端相连接。

本发明所述的人工肌肉支架模型的制造方法包括以下步骤：

1)绘制待打印人工肌肉支架模型的三维模型，然后将待打印人工肌肉支架模型的三维模型输入至计算机中；

2)获取明胶-海藻酸钠混合水凝胶4、交联剂及骨骼肌细胞悬液5，再将明胶-海藻酸钠混合水凝胶4装入第一供料系统10中，将骨骼肌细胞悬液5装入第二供料系统8中；

3)计算机控制第一供料系统10，使第一供料系统10中的明胶-海藻酸钠混合水凝胶4经挤压打印头7均匀挤出至打印平台9上，同时计算机根据待打印人工肌肉支架模型的三维模型控制挤压打印头7移动，完成上层支架2及下层支架3的打印；

4)将交联剂滴加至上层支架2及下层支架3上，使明胶-海藻酸钠混合水凝胶4中的海藻酸钠与交联剂发生交联，进而使上层支架2及下层支架3固化；

5)计算机控制第二供料系统8，使第二供料系统8中的骨骼肌细胞悬液5经微滴打印头6掉落到上层支架2上，同时计算机根据待打印人工肌肉支架模型的三维模型控制微滴打印头6移动，完成细胞束层1的打印，得人工肌肉支架模型胚体；

6)将步骤5)得到的人工肌肉支架模型胚体放置到培养箱中进行细胞培养，得人工肌肉支架模型。

培养箱中的温度为37℃，培养箱内空气中二氧化碳的体积百分数为5％。

还包括：称取明胶颗粒及海藻酸钠，其中，取明胶颗粒与海藻酸钠的质量比为1:1.2，然后再在40℃的条件下将明胶颗粒加入到dpbs缓冲液中，再用磁力搅拌器以200r/min的转速搅拌，待明胶颗粒完成溶解后再加入海藻酸钠，得明胶-海藻酸钠混合水凝胶4，其中，明胶-海藻酸钠混合水凝胶4中明胶的质量百分数为5％；明胶-海藻酸钠混合水凝胶4中海藻酸钠的质量百分数为6％。

交联剂为质量百分浓度为4％的氯化钙溶液。

还包括：配制质量百分浓度为10％的明胶溶液，并用针筒式滤膜过滤器过滤所述明胶溶液，再在滤液中加入细胞c2c12，然后再吹打均匀，得骨骼肌细胞悬液5，其中，骨骼肌细胞悬液5中细胞的密度为1x10⁶/ml。

所述挤压打印头7的喷嘴为点胶针头，其中，点胶针头的直径为160μm～1.2mm，打印过程中点胶针头的移动速度为5mm/s～15mm/s，第一供料系统10中明胶-海藻酸钠混合水凝胶4的供给速率为500μl/min～2ml/min，打印过程中的温度为37℃。