一种脑膜炎球菌抗原组合及其应用的制作方法

本申请是申请日为2014年6月24日、申请号为201410290161.9、发明名称为“一种脑膜炎球菌抗原组合及其应用”的发明专利申请的分案申请。本发明涉及疫苗领域，尤其涉及脑膜炎球菌重组蛋白疫苗组分及其组合。
背景技术：
：细菌性脑膜炎严重地威胁人类的健康，全球每年死亡病例估计有17万例，而奈瑟脑膜炎球菌是引起细菌性脑膜炎的三种主要病原微生物之一，也是唯一引起流行性脑膜炎(流脑)的致病菌。全球流脑的平均发病率为1-10/10万，病死率10％左右，20％以上患者会留下永久的中枢神经系统损伤。根据荚膜多糖化学结构的不同，脑膜炎球菌可分为13个血清群，主要的致病菌群是a、b、c、y和w135群，可引起95％以上的病例。其他如29e、x等血清群也可致病，但病例数较少，最近在非洲发生小规模的x群流脑流行，中国也发现x群病例。在欧洲、美洲和大洋洲等地区，由b群菌株引起的脑膜炎超过1/3，在应用c群脑膜炎球菌多糖结合疫苗的国家，由b群菌株引起的病例超过了2/3，甚至达到90％(lucidarmej，等.jclinmicrobiol.2009,47(11):3577-3585.)。在中国，通常认为a群和c群是最主要的致病群。但是近年来，从病人和健康人中分离的脑膜炎球菌菌株中，b群为主要致病群的菌株约占1/3。对于a、c、w135和y群来说，用荚膜多糖及荚膜多糖-蛋白结合物制成的多糖疫苗和多糖结合疫苗可以预防。而b群多糖结构与人体组织成分有同源性，不能制成疫苗。目前，只有几种外膜囊泡(omv)疫苗在局部地区使用，这种疫苗的主要成分是i类外膜蛋白pora。该蛋白是脑膜炎球菌亚型分类依据，具有高度变异性，因此omv疫苗仅能用于预防与pora同亚型的菌株。随着基因组学、蛋白组学、逆向疫苗学等的发展，一系列位于细菌表面、能诱导杀菌抗体的疫苗候选蛋白被筛选鉴定出来，主要包括：i类外膜蛋白pora、奈瑟菌黏附素(nada)、h因子结合蛋白(fhbp，其它名称gna1870、lp2086、orf2086、nmb1870、fhbp，具有变异型v1、v2和v3)、肝素结合蛋白(nhba，其它名称gna2132)、奈瑟菌表面蛋白a(nspa)等。由于脑膜炎球菌表面蛋白存在多样性和变异性，往往多抗原的组合才能达到较好、较广的保护效果，试验证据表明，多抗原的组合能发挥互补和协同作用。2013年1月，novartis公司开发的一种b群脑膜炎球菌疫苗被欧盟批准上市，其成分为重组的gna1870-fhbp(变异型v1)融合蛋白、nada-3、nhba-gna2131融合蛋白，以及从nz98/254菌株制备的omv(主要成分为pora1.4)。然而，多抗原疫苗中的各种抗原之间是否存在效价的互相影响以及是否会造成副作用的增大却是疫苗制备过程中潜在的风险。因此，基于脑膜炎球菌表面蛋白的多样性和变异性，如何选择合适的蛋白成为研制b群脑膜炎球菌疫苗，乃至通用型脑膜炎球菌疫苗的挑战。故本领域迫切需要开发一种有效且具有一定覆盖面的b群疫苗。技术实现要素：本发明提供了一种独特的适用于b群脑膜炎的组合疫苗，其能诱导针对多种脑膜炎球菌的杀菌抗体。本发明的第一方面，提供了一种抗原组合，所述的抗原组合包括：h因子结合蛋白变异型1(factorhbindingprotein,variant1,fhbpv1变异型蛋白)、h因子结合蛋白变异型2(factorhbindingprotein,variant2,fhbpv2变异型蛋白)、和肝素结合蛋白(neisserialheparinbindingantigen,nhba蛋白)。在另一优选例中，所述的组合还包括将fhbpv1变异型蛋白、fhbpv2变异型蛋白或nhba蛋白的氨基酸序列分别经过一个或几个氨基酸的取代、删除或添加而形成的衍生蛋白的组合，且所述的衍生蛋白的组合具有激活机体对脑膜炎球菌b群产生免疫应答活性的功能。在另一优选例中，所述的fhbpv1变异型蛋白、fhbpv2变异型蛋白、和nhba蛋白分别包括野生型和突变型。在另一优选例中，所述的fhbpv1变异型蛋白(如seqidno.:1-3)第6-113位氨基酸序列的同源性≥95％。在另一优选例中，所述的fhbpv2变异型蛋白(如seqidno.:4-6)第6-145位氨基酸序列的同源性≥95％。在另一优选例中，所述的nhba蛋白(如seqidno.:7-9)第27-87位氨基酸序列的同源性≥85％。在另一优选例中，所述的抗原组合中，fhbpv1变异型蛋白的序列如seqidno.:1-3所示；和/或所述fhbpv2变异型蛋白的序列如seqidno.:4-6所示；和/或所述nhba蛋白的序列如seqidno.:7-9所示。在另一优选例中，所述抗原组合中的蛋白均来自脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)。本发明第二方面，提供了一种分离的多核苷酸组合，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸分别编码本发明第一方面所述抗原组合中的抗原。在另一优选例中，所述的多核苷酸组合中的多核苷酸序列如seqidno.:10-18所示，分别编码seqidno.:1-9的蛋白。本发明第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明第二方面所述的多核苷酸组合中的多核苷酸。在另一优选例中，所述的载体为表达载体。在另一优选例中，所述的载体中可含有一个或多个本发明第二方面所述多核苷酸组合中的多核苷酸。本发明第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或所述的宿主细胞的染色体整合有本发明第二方面所述的多核苷酸组合。本发明第五方面，提供了一种获得本发明第一方面所述抗原组合的方法，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得本发明第一方面所述的抗原组合。本发明第六方面，提供了一种本发明第一方面所述抗原组合的用途，用于制备预防脑膜炎球菌性脑膜炎的疫苗组合物。在另一优选例中，所述的疫苗组合物包括本发明第一方面所述的抗原组合，以及疫苗学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的抗原组合还可用于作为载体蛋白用于制备多糖-蛋白结合疫苗。在另一优选例中，所述多糖可以来自奈瑟脑膜炎球菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌、伤寒沙门菌、a群链球菌、b群链球菌；多糖可以来自于荚膜多糖、脂多糖、脂寡糖。本发明第七方面，提供了一种疫苗组合物，所述的疫苗组合物包括本发明第一方面所述的抗原组合，和疫苗学上可接受的载体。在另一优选例中，所述的疫苗学上可接受的载体包括铝佐剂、mf59、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、cpg佐剂、卡介菌核糖核酸、单磷酰脂a。在另一优选例中，所述的疫苗组合物还可以用于制备联合疫苗。在另一优选例中，所述的联合疫苗还包括a群、c群、y群或w135群疫苗，hib结合疫苗、肺炎球菌结合疫苗、百日咳白喉破伤风疫苗、伤寒vi多糖结合疫苗、副伤寒多糖结合疫苗，组成多价脑膜炎球菌疫苗和/或联合疫苗。在另一优选例中，所述的疫苗组合物还可以包含nada、nspa、feta。在另一优选例中，所述的疫苗组合物，fhbpv1变异型蛋白、fhbpv2变异型蛋白、nhba蛋白之间的比例为1：(0.5-2)：(0.5-2)，优选为1:1:1(按有效成分的重量计)本发明第八方面，提供了一种制备本发明第七方面所述疫苗组合物的方法，包括步骤：将本发明第一方面所述的抗原组合与疫苗学上可接受的载体混合，从而获得本发明第七方面所述的疫苗组合物。在另一优选例中，所述的抗原组合中的抗原通过基因重组或化学合成获得。本发明第九方面，提供了一种预防脑膜炎球菌性脑膜炎的方法，向所需要的对象施用本发明疫苗组合物。在另一优选例中，所述的需要的对象包括哺乳动物，较佳地，为人、小鼠、大鼠、兔。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了fhbp-1、fhbp-2和nhba等3种蛋白基因的pcr扩增产物电泳图谱。图2显示了重组表达fhbp-1、fhbp-2和nhba3种蛋白的重组质粒的双酶切鉴定图谱。图3显示了纯化的重组fhbp-1、fhbp-2和nhba蛋白sds-page电泳图谱。图4显示了重组fhbp-1、fhbp-2和nhba蛋白兔血清特异性抗体测定结果。图5显示了重组fhbp-1、fhbp-2和nhba免疫兔血清与细菌结合的facs试验结果(紫色填充的区域为阴性对照，未填充的红色/蓝色曲线为免疫血清检测结果)。图6显示了重组fhbp-1a/b、fhbp-2a/b、nhba-a/b、及其组合免疫血清对细菌的杀菌力试验结果。图7显示了重组fhbp-1c、fhbp-2c、nhba-c、fhbp-1c+fhbp-2c+nhba-c免疫兔血清在乳鼠被动免疫保护试验中的结果。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现了，将来自于脑膜炎球菌的fhbp蛋白的v1、v2变异型以及nhba蛋白共同组合，组成的抗原能够有效地在体内形成抗脑膜炎球菌b群的免疫，且这种免疫效果呈明显的协同效应。此外，实验证明，将这三种蛋白共同组合使用形成的疫苗能够具有良好的菌株覆盖能力，且鉴于脑膜炎球菌不具备群特异性，本发明疫苗组合物也可在一定程度上覆盖到a群和c群为主要致病群的脑膜炎球菌中，因此，本发明疫苗组合物可用作广谱的抗脑膜炎球菌疫苗。在此基础上，完成了本发明。fhbp蛋白fhbp是一种膜表面脂蛋白，许多脑膜炎球菌的菌株都带有其基因，也发现不携带该基因的菌株(lucidarmej，等.clin.vaccineimmunol.2011,18(6):1002-1014.)。根据氨基酸序列的不同，该蛋白可以分为3种变异型(v1变异型、v2变异型和v3变异型)，其中v2变异型与v3变异型具有一定的交叉保护作用，而它们与v1变异型之间交叉保护作用弱。变异型1、变异型2和变异型3基因分别编码280个左右氨基酸残基。相同变异型的fhbp蛋白的氨基酸同源性最低可达约90％，不同变异型的fhbp蛋白之间的氨基酸同源性可低至62％。可用于本发明的fhbpv1变异型蛋白没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的fhbpv1变异型蛋白。优选地，可用于本发明抗原组合或疫苗组合的fhbp蛋白中，fhbpv1变异型的序列可选自seqidno.:1-3，也可包括将seqidno.:1-3进行一个或几个氨基酸添加、删除或取代的氨基酸序列，更优选地，可以是与野生型fhbpv1变异型蛋白(如seqidno.:1-3序列)的第6-113位氨基酸同源性保持在90％以上，较佳地为95％以上的蛋白的序列。可用于本发明的fhbpv2变异型蛋白没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的fhbpv2变异型蛋白。优选地，可用于本发明抗原组合或疫苗组合的fhbp蛋白中，fhbpv2变异型的序列可选自seqidno.:4-6，也可包括将seqidno.:4-6进行一个或几个氨基酸添加、删除或取代的氨基酸序列，更优选地，可以是与野生型fhbpv2变异型蛋白(如seqidno.:4-6序列)的第6-145位氨基酸同源性保持在90％以上，较佳地为95％以上的蛋白的序列。nhba蛋白nhba是奈瑟菌属特有的一种脂蛋白，几乎在所有的菌株上表达，但nhba蛋白氨基酸序列具有一定的变异性，因此针对nhba的单一疫苗往往无法覆盖大范围的菌株。nhba基因编码的氨基酸残基数约420-500个，不同的nhba蛋白之间，除单个或多个位点的氨基酸变异外，还存在单个氨基酸或短肽的插入或缺失。不同的nhba蛋白的氨基酸同源性可低至60％。可用于本发明的nhba没有特别限制，可以为任何野生型或突变型的nhba变异型蛋白。由于野生型nhba蛋白的同源性较低，因此一般与seqidno.:7-9所示的nhba蛋白同源性大于60％，优选大于70％，更优选地大于80％的突变型nhba也可用于本发明的抗原组合或疫苗组合。更优选地，可以是与野生型nhba蛋白(如seqidno.:7-9序列)的第27-87位氨基酸同源性保持在85％以上，较佳地为90％以上的蛋白的序列。抗原组合本发明同时提供了一种含有多蛋白的抗原组合。其中，所述的抗原组合中的蛋白来自于脑膜炎球菌。如本文所用，术语“本发明蛋白”指的是本发明抗原组合中一种或多种的蛋白总称。如本文所用，术语“抗原”是指能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性。如本文所用，术语“fhbpv1变异型蛋白、fhbpv2变异型蛋白和nhba蛋白的组合”、“抗原组合”、“本发明蛋白组合”、“本发明组合”可互换使用，指的是将本发明蛋白或其衍生蛋白三者共同组合形成的抗原混合物。如本文所用，术语“fhbpv1变异型”、“fhbp变异型1”、“变异型1”可互换使用，指的是脑膜炎球菌b群的fhbp蛋白的v1变异型。术语“fhbpv2变异型”、“fhbp变异型2”、“变异型2”可互换使用，指的是脑膜炎球菌b群的fhbp蛋白的v2变异型。此外，所述抗原组合还可以是以下序列构成的组合：即具有激活机体对脑膜炎球菌b群产生免疫应答活性的、seqidno：1-9所示序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-5个(通常为1-4个，更佳地1-3个，最佳地1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3-4个以内，更佳地为1-2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。本发明还包括所述的抗原组合的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”、“衍生蛋白”和“类似物”是指基本上保持激活机体对脑膜炎球菌b群产生免疫应答活性的蛋白。本发明的蛋白的片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)本发明蛋白与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6his等标签序列融合而形成的衍生蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物可以是野生型的，也可以是突变型的，这些均属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与seqidno.:1-9的氨基酸序列分别相比，有至多5个，较佳地至多3-4个，更佳地至多1-2个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表1最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu发明还提供本发明抗原组合的类似物。这些类似物与天然本发明抗原组合的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然l-氨基酸的残基(如d-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。多核苷酸在本发明中，术语“多核苷酸”、“编码序列”可互换使用，均指编码本发明蛋白的dna序列，可以全部人工合成，然后将其拼接在一起，形成编码本发明蛋白的dna序列。也可以将编码本发明蛋白的多核苷酸分别进行人为的组合，以用于导入质粒，并生产重组的本发明蛋白的组合。如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在dna聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的dna链的寡居核苷酸的总称。引物可以是天然的rna、dna，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如lna或zna等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3’端与模板互补的引物的5’端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。在获得了编码本发明新蛋白的dna序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的蛋白。如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。代表性的状态包括(但并不限于)：能在真核细胞如cho、cos系列等真核细胞中表达的载体，能在酿酒酵母或毕氏酵母中表达的载体，能在家蚕等昆虫细胞中表达的载体以及原核表达载体。在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是家蚕细胞。在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。药物组合物和疫苗组合物本发明还提供了预防脑膜炎球菌(尤其是b群)的药物组合物，所述的药物组合物可以是治疗性的或预防性的。一种优选的组合物是预防性的疫苗组合物，尤其是含有针对脑膜炎球菌fhbpv1变异型蛋白、fhbpv2变异型蛋白、nhba蛋白的疫苗组合物。这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)isa720佐剂；(3)福氏佐剂等。疫苗组合物(包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。一种疫苗方式是dna疫苗，即含有编码本发明抗原组合的编码序列的dna疫苗。施用方式通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或乳化液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。本发明有益效果：本发明疫苗组合物中特定的抗原组合可以有效地激活机体对b群脑膜炎球菌的免疫应答，从而对b群进行有效地免疫，且该种组合具有明显的协同效应。此外，本发明疫苗组合物对临床上不同的菌株表现出一定的广谱覆盖能力，因此可以用作广谱的脑膜炎球菌疫苗。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。实施例1重组表达工程菌的构建从3株脑膜炎球菌临床分离株培养物提取基因组，通过pcr分别扩增不含编码推测的信号肽序列的第一种fhbp(命名为fhbp-1，即变异型1)、第二种fhbp(命名为fhbp-2，即变异型2)和nhba基因。pcr扩增正向引物与反向引物列在下表中，正向引物和反向引物分别引入ndei和bamhi(fhbp)或者nhei和bamhi(nhba)的限制性酶切位点，以下划线显示。重组fhbp和nhba蛋白分别以his-tag融合的形式在大肠杆菌中表达以质粒pet-28a(novagen)为表达载体。fhbp-1和fhbp-2的克隆：用rtaqdna聚合酶(takara公司)从细菌基因组dna进行pcr。pcr反应条件是：95℃5min；95℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃延伸8min。扩增产物和表达载体pet-28a(novagen公司)用ndei和bamhi进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用dna凝胶回收试剂盒回收目的片段，经t4dna连接酶(fermentas公司)连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，挑取阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。将鉴定正确质粒转化大肠杆菌bl21(de3)。nhba的克隆：用rtaqdna聚合酶(takara公司)从细菌基因组dna进行pcr。pcr反应条件是：95℃5min；95℃1min，58℃1min，72℃2min，35个循环；72℃延伸8min。扩增产物和表达载体pet-28a(novagen公司)用nhei和bamhi进行双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，用dna凝胶回收试剂盒回收目的片段，经t4dna连接酶(fermentas公司)连接，转化感受态大肠杆菌dh5α，挑取阳性克隆，提取质粒进行双酶切鉴定和测序鉴定。将鉴定正确的质粒转化大肠杆菌bl21(de3)。fhbp-1和fhbp-2和nhba基因pcr扩增产物电泳图谱见图2，产物分子量大小分别为760bp、760bp、1400bp左右。重组质粒双酶切鉴定图谱见图3，可见分子量大小分别为760bp、760bp、1400bp左右的酶切片段。实施例2发酵培养重组fhbp-1和fhbp-2的发酵培养。将重组质粒转化bl21(de3)感受态，挑取平板上的单克隆菌落，接种至5ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，第二天转接250ml含卡那霉素的lb液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至600nm光吸收值a600值为0.6，加入iptg至终浓度为0.6mmol/l，继续振荡培养5小时，6000rpm离心10分钟，收集菌体。重组nhba的发酵培养。将重组质粒转化bl21(de3)感受态，挑取平板上的单克隆菌落，接种至5ml含有卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养过夜，第二天转接250ml含卡那霉素的lb液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养至600nm光吸收值a600值为0.6，加入iptg至终浓度为0.1mmol/l，继续振荡培养6小时，6000rpm离心10分钟，收集菌体。实施例3目的蛋白纯化用镍柱平衡缓冲液重悬菌体液并置于冰水混合物中，超声波破菌。破菌后，离心收获上清液。上清液经ni2+亲和层析柱纯化得到粗产物，重组fhbp-1和fhbp-2经凝胶过滤层析进一步纯化，重组nhba经cm离子柱进一步纯化。纯化后的重组fhbp-1、fhbp-2和nhba蛋白的sds-page电泳图谱见图4。纯化的蛋白保存于-20℃备用。实施例4动物免疫将纯化得到的重组fhbp-1、fhbp-2、nhba、fhbp-1+fhbp-2+nhba分别加入弗氏佐剂，免疫家兔，注射剂量为200μg/每种蛋白/只。免疫三次，间隔两周。第一剂为弗氏完全佐剂，第二剂和第三剂为弗氏不完全佐剂。末次免疫后两周采血，分离血清，于-20℃保存备用。同时设立未免疫组和佐剂对照组。实施例5特异性抗体滴度测定采用间接elisa法测定免疫血清中的特异性igg滴度，即：以纯化的重组fhbp-1、fhbp-2、nhba分别包被酶标板；洗板和封闭后，加入系列稀释的待检血清，于37℃反应1小时；洗板，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg酶标抗体(kpl公司)，37℃反应30分钟；洗板，加入tmb显色5-10分钟后终止反应，在酶标仪(moleculedevice公司)上读取450nm光吸收值a450。以未免疫组血清为阴性对照，以阴性对照血清a450平均值的2.1倍作为cut-off值，判断阴/阳性反应。阳性反应最高稀释度即为待检样品的抗体滴度，计算各组样品的几何平均滴度(geometrymeantiter，gmt)。重组fhbp-1、fhbp-2、nhba免疫兔的抗体滴度结果见图5，3种重组蛋白均可诱导兔产生高滴度的特异性抗体。实施例6facs试验将新鲜培养的脑膜炎球菌菌液用10％小牛血清-pbs稀释至1×109个/ml，按1:50比例加入重组fhbp-1、fhbp-2、nhba免疫兔血清，混匀后于4℃孵育1小时；离心收集菌体，用1％小牛血清-pbs洗涤，重悬；加入fitc标记驴抗兔igg抗体(biolegend公司)，混匀后于4℃孵育40分钟，离心收集菌体，同上洗涤，用pbs重悬菌体，转入流式细胞管，在流式细胞仪(bd公司)上检测。设阴性血清(佐剂对照组)和阳性血清(全菌体免疫兔血清)对照。重组fhbp-1、fhbp-2、nhba免疫兔血清对fhbp变异型1和变异型2脑膜炎球菌的facs试验结果见图6。可见重组fhbp-1免疫血清与fhbp变异型1菌株出现阳性反应；同样地，重组fhbp-2免疫血清与fhbp变异型2菌株出现阳性反应；而重组fhbp-1或fhbp-2免疫血清与fhbp变异型不同的细菌结合强度较弱或呈阴性反应；重组nhba蛋白免疫血清对2个菌株呈现结合强度不同的阳性反应。结果表明，重组fhbp-1、fhbp-2和nhba能诱导兔产生特异性抗体并结合到细菌的表面，fhbp蛋白具有变异型特异性，nhba具有较好的交叉反应。实施例7杀菌力试验采用实施例1-3的方法分别制备了抗原组合中的其他同源性蛋白，其中第一组(组a)的fhbp-1(记为fhbp-1a)、fhbp-2(记为fhbp-2a)和nhba(记为nhba-a)的氨基酸序列分别对应seqidno.:1、seqidno.:4和seqidno.:7；另一组(组b)的fhbp-1(记为fhbp-1b)、fhbp-2(记为fhbp-2b)和nhba(记为nhba-b)的氨基酸序列分别对应seqidno.:2seqidno.:5seqidno.:8。采用实施例4的方法免疫兔制备免疫血清。参照国标gb16884—1997，流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则，附录b—流脑血清学诊断方法，b3—杀菌力试验方法，进行免疫血清抗体的杀菌力试验。将经56℃30分钟灭活处理的待检血清，在96孔细胞培养板中作系列稀释，每孔25μl，加入等体积乳兔补体、新鲜培养的脑膜炎球菌菌液，混匀后于37℃孵育1小时；加入50μlttc琼脂培养基，混匀后于37℃烛缸内孵育过夜，观察结果。同时设阳性血清(诊断血清或全菌体免疫兔血清，对相应的血清群菌株有杀菌作用)对照、补体对照、细菌生长对照。补体对照和细菌生长对照的各孔应出现众多的红色点状小菌落。与补体对照孔比较，所试样品孔菌落数减少70％及以上判为杀菌阳性，以出现杀菌阳性的血清最高稀释度为杀菌抗体的最高滴度，计算各组样品的几何平均滴度(gmt)。gmt≥1:8为杀菌力阳性。7.1常见的脑膜炎球菌的选择本实验选择了临床上常见的典型脑膜炎球菌6株(包括fhbp变异型1和fhbp变异型2)，并测定在这6株菌株表达的fhbp和nhba与本实验对应的免疫用fhbp和nhba之间的氨基酸序列同源性，结果如下：抗原菌株1菌株2菌株3菌株4菌株5菌株6fhbp-189％69％72％96％69％68％fhbp-267％99％91％69％99％98％nhba85％86％68％99％96％69％7.2采用fhbp-1a/b、fhbp-2a/b、nhba-a/b及其组合对6株脑膜炎球菌的杀菌力试验结果见图6：对fhbp变异型1菌株(菌株1和菌株4)，fhbp-1(fhbp-1a和fhbp-1b)、nhba(nhba-a和nhba-b)、fhbp-1+fhbp-2+nhba(fhbp-1a+fhbp-2a+nhba-a和fhbp-1b+fhbp-2b+nhba-b)组均为杀菌力阳性；fhbp-2(fhbp-2b)组对菌株4为杀菌力阳性。对fhbp变异型2菌株(菌株2、菌株3、菌株5和菌株6)，fhbp-1组(fhbp-1a)对菌株2为杀菌力阳性；fhbp-2组(fhbp-2a和fhbp-2b)对菌株2和菌株5为阳性；nhba组(nhba-a和nhba-b)对菌株2、菌株3和菌株5为阳性；fhbp-1+fhbp-2+nhba(fhbp-1a+fhbp-2a+nhba-a以及fhbp-1b+fhbp-2b+nhba-b)组对4个菌株均为杀菌力阳性。由此可见，单独fhbp-1、fhbp-2或nhba免疫组均不能完全覆盖到6个菌株，但组合在一起，对6个菌株均显示杀菌力阳性，除菌株5外，gmt均与单独免疫组相当或高于单独免疫组，显示了良好的互补和协同作用。结论：对两种不同的fhbp-1、fhbp-2、nhba及其组合fhbp-1+fhbp-2+nhba，加弗氏佐剂免疫兔血清对6株脑膜炎球菌的杀菌力试验结果(见图6)显示：对菌株1、菌株2、菌株4、菌株5，fhbp-1和fhbp-2蛋白显示了变异型特异性，单独fhbp组对相同变异型菌株具有良好的杀菌作用，gmt均≥1:8。对菌株3和菌株6，fhbp-1或fhbp-2诱导的杀菌力gmt均<1:8，单独免疫不能对这两个菌株形成保护；但是加入nhba后，即使单独nhba组的gmt<1:8(如菌株6所示)，3种抗原组合在一起(即fhbp-1+fhbp-2+nhba组)gmt均≥1:8为杀菌力阳性。fhbp通常具有变异型特异性，但对某些相同变异型菌株也可能免疫保护性不足；单独fhbp-1、fhbp-2或nhba免疫组均不能完全覆盖到6个菌株，但组合在一起，对6个菌株均显示杀菌力阳性。因此，当本发明蛋白联用时，可以显示出良好的互补和协同作用。此外，实验发现同源性与杀菌力的强弱虽然有一定的关联度，但三者联用却能覆盖各种不同变异型的菌株，均有阳性的杀菌效果。实施例8动物被动免疫保护试验采用常规方法制备重组的第三组抗原组合蛋白(组c)，分别是fhbp-1(记为fhbp-1c(seqidno.:3))、fhbp-2蛋白(记为fhbp-2c(seqidno.:6))，以及nhba蛋白(记为nhba-c(seqidno.:9)，并免疫兔制备免疫血清。取7日龄乳鼠(nih小鼠)，腹腔注射经56℃30分钟灭活的重组fhbp-1c、fhbp-2c、nhba-c、fhbp-1c+fhbp-2c+nhba-c免疫兔血清，2-3小时后，腹腔注射100μl新鲜培养的脑膜炎球菌菌液(含细菌数105个)；3小时后，采心血，涂10％羊血半综合培养基，于37℃烛缸内孵育过夜，观察结果，计算每ml血液中的细菌数(cfu/ml)。每组2-3只乳鼠，同时设阳性对照(全菌体免疫血清)和阴性对照(阴性血清)。对fhbp变异型1菌株和fhbp变异型2菌株的试验结果见图7。结果：对fhbp变异型1菌株，阳性对照组细菌数(cfu)明显低于阴性对照组，而重组fhbp-1c和nhba-c组均显示了比阳性对照组更好的保护作用，前者血液中细菌检出数<10cfu/ml，后者3只兔中有2只细菌检出数<10cfu/ml；重组fhbp-2c组未见保护作用。对fhbp变异型2菌株，阳性对照组细菌数<10cfu/ml，明显低于阴性对照组，重组fhbp-2c和nhba-c组细菌检出数均<10cfu/ml，显示了良好的保护作用；重组fhbp-1c组未见保护作用。结果表明，重组fhbp蛋白的变异形式所产生的免疫血清对相同变异型菌株有保护作用，重组nhba蛋白的变异形式所产生免疫血清有一定的交叉保护作用，而fhbp-1+fhbp-2+nhba组合达到最佳保护效果。由此可见，fhbp蛋白以及nhba蛋白的变异形式也能够起到同样的保护效果。实施例9临床分离株的fhbp基因扩增与测序设计如下引物，从脑膜炎球菌培养物提取的核酸中扩增fhbp基因，pcr反应条件是：95℃5min；95℃1min，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。经1％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，经纯化后测序。在奈瑟菌序列分型网站http://pubmlst.org/neisseria/，对测定的序列进行分析，结果发现，从某地分离的50个临床菌株中，均能扩增到fhbp基因，其中13株属于变异型1，占26％；36株属于变异型2，占72％；1株属于变异型3，占2％。正向引物：cggctagcatgactaggagcaaacctgt(seqidno.:25)反向引物：cgggattcgaacggtaaattatcgtgtt(seqidno.:26)讨论在杀菌力试验中，fhbp诱导的抗体对某些相同变异型菌株可能滴度较低，或者呈阴性，可能的原因至少有：该菌株表达的fhbp量较低，不足以引发杀菌反应；或者该菌株表达的fhbp与疫苗中的fhbp存在序列上的变异，导致交叉反应不足或没有。由于发现某些菌株并不表达fhbp，因此补充其它免疫原性强、交叉保护作用广的抗原组成疫苗，并进行优化组合，方可以得到更佳的菌株覆盖率。尽管nhba在迄今所有的临床分离株中都能检测到，但不同菌株之间的基因序列和氨基酸序列变异较大，理论上不难预计，由于nhba的变异、表达量较低等原因，单独nhba蛋白诱导的免疫应答提供的保护作用不足。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海生物制品研究所有限责任公司<120>一种脑膜炎球菌抗原组合及其应用<130>p2017-0280<160>26<170>patentinversion3.5<210>1<211>255<212>prt<213>脑膜炎奈瑟球菌(neisseriameningitidis)<400>1cysserserglyglyglygly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