本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法。
背景技术
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年攀升，早期诊断及早治疗是改善患者预后的关键，但是肺癌患者在病变早期往往无明显症状，就诊时大多为中晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此从肺癌发生的“起源”着手，探寻高效、特异的早期诊断及治疗的新方法，将会对肺癌的预防、诊断及治疗产生深远的影响。
肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织细胞中存在一群数量极少的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞，所有的肿瘤细胞都是由肿瘤干细胞分化来的。微小rna(mirna，microrna)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测nsclc干细胞相关的mirnas是肺癌早期诊断的一个重要策略。研究表明常见的不同肿瘤类型呈现特征性的mirnas表达谱，这将为肿瘤的组织来源、诊断和治疗提供依据，特征性的mirna表达谱可以作为肿瘤早期诊断和治疗分子标志物，也可判断不同肿瘤的预后、预测治疗效果。多项研究显示mir-155在nsclc中高表达，检测肺组织内的mir-155表达水平能区分肺癌患者与非肺癌患者，而且检测肿瘤组织内的mir-155表达水平能预测患者的肿瘤复发和不良预后风险。肺癌干细胞中mir-155表达高于普通肺癌细胞，如果能够直接携带荧光物质或化疗药物靶定肺癌细胞甚至肺癌干细胞，将有望最终达到早期诊断和根治肺癌的目的。分子信标(molecularbeacon，mb)是基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,fret)原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，实际上是一种呈茎环结构的双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对。未结合目标链时，位于其末端的荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，荧光被淬灭；当分子信标与目标链结合时，分子信标的空间构象发生改变，荧光基团远离猝灭基团，荧光信号恢复，并且结合后不会轻易分离，因此分子信标是一种特异性检测dna、rna和mirna的靶向序列的发夹型核酸探针，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究。
常规分子信标本身易被核酸酶或核结合蛋白降解，存在稳定性差、细胞摄取困难等缺点。而用锁核酸(1ockednucleicacid，lna)修饰碱基，由于几何和立体性质改变，其在较高温度的环境中能稳定存在，抗核酸酶降解的能力显著增强，具有与dna/rna强大的杂交亲和力，且结合后不会轻易分离。利用分子信标的关键是如何获得理想的转运载体，既可有效地保护免于被降解，又可高效地将分子信标递送入宿主细胞发挥靶向识别并结合抑制核酸序列的功能。壳聚糖(chitosan，cs)纳米为天然阳离子多糖，体外及体内实验均证实了壳聚糖作为转移载体的安全性及有效性，其主要特点有：①组织相容性好、免疫原性低，毒性小；②荷正电，易与dna分子自组装结合成纳米复合物，形成稳定的核壳结构，且对dna有保护作用；③制作过程简单、温和，对dna、抗体等生物大分子理化性质影响小；④壳聚糖纳米表面密集的活性氨基基团便于大分子修饰和耦联。
在现有技术中，已有研究表示壳聚糖可携带化学药物递送到肿瘤部位；也有报道壳聚糖纳米携带质粒等基因用于肿瘤的治疗，但同时用于肿瘤基因诊断和治疗的报道较少。现有技术中的分子信标或者壳聚糖纳米等复合物制备方法复杂，工艺条件苛刻，且这些复合物只能用于诊断肺癌的中、晚期，这会使肺癌患者错过最佳治疗时间，影响肺癌患者的治疗，同时这些复合物在用于诊断肺癌的特异性或稳定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一种制备方法简便且可获得特异性高、稳定性好的新思路、新方法的诊断和治疗肺癌的试剂，尤其是早期可以诊断和治疗的肺癌优良试剂。
技术实现要素：
为克服现有技术上的不足,本发明的目的是提供一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，解决现有技术中用于肺癌基因诊断和治疗的药物或试剂的制备方法复杂、工艺条件苛刻且其特异性或稳定性不佳以及只能诊断中、晚期肺癌的问题。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，包括下述步骤：
将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在ph6.0-7.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物；
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述壳聚糖纳米的粒径≤300nm。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为7：1。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，所述pbs缓冲液的ph为6.0。
在本发明的制备方法中，在步骤a中，漩涡震荡时间为60s。
实施本发明的用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，具有以下有益效果：本发明的用于肺癌基因诊断和治疗的壳聚糖(cs)分子信标(mb)纳米复合物，通过用自组装法合成壳聚糖mir-155(microrna-155)分子信标纳米复合物，该制备方法简便易行且方便工业化生产，所制得的壳聚糖分子信标纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，并可用于肺癌的治疗，抑制作用持续时间长，并可应用于肺癌细胞及肺癌荷瘤鼠活体动物诊断和治疗，具有转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低、抑瘤率高等特点，将为肺癌的基因诊断和治疗提供新思路、新方法和新技术，尤其是针对肺癌的早期诊断；另外目前研究关于细胞和动物活体成像及治疗方面，主要是在蛋白方面研究，而本研究是利用高表达的基因进行成像和治疗，国内外报道几乎没有，属于首创。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法的具体实现作进一步说明：
本发明涉及一种将壳聚糖纳米与分子信标结合，通过识别肺癌细胞或肺癌干细胞内高表达的micro-rna的表达来识别、杀灭癌细胞，通过荧光成像实现对肿瘤细胞甚至肿瘤干细胞的识别功能及持续监测，达到肺癌基因诊断和治疗的目的。为此本发明提供的一种壳聚糖分子信标纳米复合物的制备方法，其具体实施例如下，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1-7为用于肺癌基因诊断和治疗的靶向奥曲肽修饰的壳聚糖分子信标纳米复合物的制备。其中壳聚糖纳米只要为纳米级别均在本发明的保护范围之内，优选为≤300nm，更优选为≤200nm，这样的壳聚糖纳米制备的壳聚糖分子信标纳米复合物具有稳定性好、转染效率高、特异性强的特点。
实施例1：
将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1的比例在ph6.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。
实施例2：
将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比8：1的比例在ph＝6.5的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。
实施例3：
将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比10：1的比例在ph＝7.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡60s，在室温下静置60-120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。
上述实施例中，将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在ph6.0-7.0的pbs缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到壳聚糖分子信标纳米复合物。这个范围内任何组合都不会影响产品，可以任意组合的。
以下实施例为壳聚糖分子信标纳米复合物用于诊断和治疗肺癌的相关实验。
实施例2：液相分子杂交实验
液相分子杂交实验验证设计分子信标序列的正确性和特异性。
根据人的mir-155序列设计并合成锁核酸修饰的mir-155分子信标，同时设计不与任何靶基因结合的随机分子信标序列(randomsequence,rs-mb)作为阴性对照。
其中mir-155mb:
5’-cy5-ccagcg-acc+cct+atca+cgat+tagcattaa-cgctgg-bhq2-3’；
rsmb：
5’-cy5-ccagcg-ac+gcca+atg+acc+tta+agcattaa-cgctgg-bhq2-3’
+n表示碱基由锁核酸结构修饰，cy5代表荧光基团，bhq2代表淬灭基团，划线部分表示分子信标的茎干机构；由上海生物工程公司合成。
配制杂交缓冲液，其中含10mmkcl、5mmmgcl2和10mmtris-hcl。将同浓度的分子信标与靶向序列在杂交缓冲液中充分混合，加入到96孔黑板中，每孔体积250μl，分子信标终浓度为100nmol/l，以杂交缓冲液调零，varioskanflash多功能酶标仪检测每孔的荧光强度，设置激发波长649nm，发射波长670nm，狭缝5nm，检测每组荧光强度。当只有分子信标存在的时候，荧光信号非常低；当靶向序列存在的时候，分子信标茎环结构打开，产生强烈的荧光信号，约为单独分子信标组的50倍；当有不互补序列基因存在的情况下，分子信标仍保持茎环结构，表明分子信标合成的特异性、灵敏性。
实施例3：凝胶阻滞分析
将壳聚糖纳米和mir-155mb于pbs缓冲溶液(ph6.0)中，按不同的质量比(wcs：wmir-155mb)进行混合，wmir-155mb或wmir-155mb固定质量为2μg并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，利用凝胶电泳分析。研究表明随着壳聚糖纳米质量的增加，mir-155mb的量逐渐减少，当质量比为7:1和10:1时，壳聚糖与mir-155mb基本上完全结合。
实施例4：包封率测定
将壳聚糖纳米和mir-155分子信标于pbs缓冲溶液中，按不同的质量比(wcs：wmir-155mb)进行混合，总体积为300μl，mir-155mb终浓度为200nm，并迅速漩涡振荡60s，室温放置60min，于高速离心机上20000rpm离心60分钟，取上清在紫外分光光度计上检测mir-155mb的浓度，并计算包封率。计算公式为：包封率ee％＝(w总-w游)/w总×100％。研究表明随着壳聚糖质量的增加，包封率逐渐增强，在质量比为7:1和10:1时达到最大，约为95％左右，这与凝胶阻滞分析结果较一致。
实施例5：荧光屏蔽实验
由上海生工公司合成mir-155cy5probes:5，-cy5-ttaatgctaatcgtgataggggt-3’，用同样的方法将不同质量比的壳聚糖纳米和mir-155-cy5(2μg)荧光探针进行自组装，酶标仪检测荧光强度。研究表明随着壳聚糖纳米质量的增加，荧光强度逐渐减弱，在质量比为7:1和10:1时荧光强度最低，表明壳聚糖可以包裹mir-155-cy5探针，与dna结合形成核壳结构，可以有效的保护dna免受外界的干扰，并与凝胶阻滞分析、包封率测定结果较一致。
实施例6：壳聚糖分子信标纳米复合物理化性质分析
用同样的方法按照质量比为7:1的比例制备壳聚糖分子信标纳米复合物，将壳聚糖纳米和壳聚糖分子信标纳米复合物分别滴在铜片上，室温静止10分钟，2％磷钨酸染色1分钟，通过透射电镜检测壳聚糖及壳聚糖分子信标纳米复合物，用纳米粒度分析仪检测壳聚糖纳米及壳聚糖分子信标纳米粒径及zeta电位(malvern3000hs，uk)(tem,philipstecnai10)，并通过dnasei实验验证合成壳聚糖分子信标纳米复合物的稳定性，按照dnasei试剂盒(碧云天)操作，分子信标的终浓度为100nm。在反应液中，37℃10分钟后，加入edta，65℃，10分钟终止反应，酶标仪测定各孔荧光强度。
透射电镜表明壳聚糖以及壳聚糖分子信标纳米复合物粒径较小，分布均匀，大小分别约为20nm、30nm，与纳米粒度分析仪结果较一致。zeta电位表明壳聚糖纳米及复合物为正电荷，因为细胞膜带负电，利于细胞的结合和吞噬；cs-mb纳米复合物电荷有所降低可能与dna结合后抵消了部分壳聚糖纳米的正电荷有关。dnasei实验表明壳聚糖分子信标纳米复合物在酶的作用下呈现非常低的荧光信号，表明cs-mb纳米复合物稳定性极佳，能够抵抗核酸酶的降解。
实施例7：商品化的siport脂质体转染试剂(ambion,usa)转染分子信标检测非小细胞肺癌(nsclc)细胞(a549、spc-a1)及肺癌干细胞(lcsc)mir-155的表达
将细胞接种至细胞培养皿(激光共聚焦显微镜专用)中，细胞贴壁后用pbs充分漂洗，3min×3次，充分去除碎片和死亡细胞；siport转染试剂按照说明书操作，用optimemi培养基稀释(1:20稀释)，每个培养皿取5μl的siport转染试剂稀释，室温孵育10min；用optimemi培养基配制400nm的mir-155分子信标和随机序列分子信标；取等体积稀释后的siport转染试剂和稀释后的mir-155分子信标和随机序列分子信标(阴性对照)，mir-155分子信标和随机序列分子信标的终浓度为200nm，各培养皿中均加200μl上述稀释后的mir-155分子信标和随机序列分子信标；细胞培养箱内孵育120min；pbs漂洗3min×3次；各培养皿中加300μl的hoechst33342染色液复染20min；pbs漂洗3min×3次，各培养皿中加入适量pbs后在激光共聚焦显微镜下检测拍照，拍完照片后用1mlripa裂解液裂解细胞，取100ul加入到96孔板中，每组细胞6个复孔，酶标仪检测荧光强度。以表达人mir-155的前列腺癌(pc-3)细胞作为阳性对照，同时以不表达人mir-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌ct-26细胞作为阴性对照，以cd133、cd338做为肺癌干细胞的表面标志物，流式细胞仪从a549细胞中分选cd133和cd338的双阳性细胞为肺癌干细胞(cd133+cd338+)，同时采用qrt-pcr的方法检测nsclc细胞及肺癌干细胞(cd133+cd338+)内mir-155的表达。研究表明表明在表达mir-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而在不表达mir-155的vero细胞、ct-26细胞未检测到红色荧光，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，综上表明设计合成的mir-155分子信标能够很好的检测高表达mir-155的癌细胞。同样方法检测发现荧光信号在12小时达高峰，持续24小时后荧光信号逐渐衰竭。
实施例8：壳聚糖分子信标纳米复合物(cs-mb)检测nsclc细胞及lcsc细胞mir-155的表达
按前述方法合成的cs-mb纳米复合物，同样的细胞贴壁后用pbs充分漂洗，3min×3次，每个细胞培养皿内加入optimemi培养基稀释的cs-mb纳米复合物，终浓度为200nm。37℃孵育120min，pbs漂洗3min×3次；各培养皿中加300μlhoechst33342染色液复染20min；pbs漂洗3min×3次，各培养皿中加入适量pbs后在激光共聚焦显微镜下检测拍照，拍完照片后用酶标仪检测荧光强度。以表达mir-155的pc-3细胞作为阳性对照，同时以不表达人mir-155的非洲绿猴肾细胞vero细胞、小鼠结肠癌ct-26细胞作为阴性对照。实验结果表明在表达mir-155的肺癌细胞及肺癌干细胞中可以看到较强的红色荧光，且在干细胞内荧光信号更高，定位在细胞浆，而不表达mir-155的vero细胞、ct-26细胞未检测到红色荧光，实验结果同siport脂质体转染结果。且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，并和商品化的siport脂质体转染试剂相比，荧光信号强度更高。同样方法检测荧光信号强度及持续时间发现荧光信号在6小时达高峰，持续48小时后荧光信号逐渐衰竭，表明壳聚糖纳米携带分子信标具有转染效率高、缓释效应、稳定性高、持续时间长的特点。
实施例9细胞抑制实验
mtt实验检测壳聚糖分子信标纳米cs-mir-155mb对hek293及a549细胞的杀伤作用，以cs-rsmb作为阴性对照，同时以空白壳聚糖纳米作为对照。取对数生长期hek293及a549细胞一瓶，常规接种于96孔培养皿内，于37℃、5％co2孵箱中孵育24小时后可见细胞贴壁生长，以等体积完全培养液代替壳聚糖纳米或壳聚糖分子信标纳米复合物作为空白对照。37℃、5％co2孵箱中孵育48小时；培养48小时后吸取旧的培养液，mtt实验检测细胞抑制率，抑制率＝1-od490(实验组-空白组)/od490(对照组-空白组)×100％，计算各组细胞的抑制率。研究表明cs-mir-155mb能够显著抑制a549、spc-a1肺癌细胞的生长。
通过实施例7、8、9进行荧光强度及肿瘤细胞抑制率分析：商品化siport脂质体转染试剂、壳聚糖分子信标纳米复合物相比，壳聚糖分子信标纳米复合物荧光信号强度更强，转染效率更高，和细胞内mir-155结合更快，持续时间更长，通过抑制mir-155的功能达到抑制、杀灭肿瘤细胞的目的。用同样的方法，二种材料转染肺癌细胞后，流式细胞仪分析细胞的转染效率，同样表明壳聚糖分子信标纳米复合物表现了更高的转染效率。综上表明壳聚糖分子信标纳米复合物不仅显示了更强的荧光强度，而且转染效率更高，细胞抑制率更强，且用酶标仪检测到的荧光信号强度与qrt-pcr结果趋势一致，表明可以通过分子信标识别癌细胞高表达的mir-155，达到早期识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的，同时通过抑制mir-155的功能达到抑制、杀灭肿瘤细胞的目的。。
实施例10：动物水平尾静脉注射壳聚糖分子信标纳米复合物(cs-mb)检测其对肺癌细胞的识别、诊断及治疗作用
建立a549肺癌细胞皮下移植瘤动物模型，通过尾静脉直接注射壳聚糖分子信标纳米复合物(即cs-rsmb、cs-mir155mb，浓度2μm，体积100μl)，以尾静脉注射cs-rsmb、空白壳聚糖纳米、生理盐水作为阴性对照组，实验结果表明cs-mir155mb组中可以见到强烈的荧光信号，且与肿瘤的大小分布较一致，而cs-rsmb组(阴性对照组)未见到红色荧光信号，由于肺癌组织内存在极少量的干细胞，表明分子信标可以和肿瘤细胞甚至可能和肿瘤干细胞内的mir-155结合，从而导致荧光信号的产生，且荧光持续时间长，24小时荧光信号强度达到最大。成像后将皮下移植瘤取出，冰冻切片观察，可以发现cs-mir155mb组可表现出强烈的荧光信号，荧光信号来自与肿瘤细胞内的mir-155结合，表明壳聚糖分子信标纳米复合物可以通过与肿瘤细胞内的mir-155的结合达到更佳地识别肿瘤细胞的目的；同时表明可以通过识别癌细胞或癌干细胞高表达的mir-155，达到识别肺癌细胞或肺癌干细胞的目的。同样方法建立裸鼠皮下移植瘤模型，2周后每隔48小时通过尾静脉直接注射壳聚糖分子信标纳米复合物，(cs-mir155mb，浓度2μm，体积100μl)，同时设置cs-rsmb对照组、生理盐水组、空白壳聚糖纳米组，2周后观察肿瘤直径大小变化。并称重，体重减轻率＝(cs-rsmb组肿瘤质量-cs-mir155mb组肿瘤质量)/cs-rsmb对照组肿瘤质量×100％。实验表明尾静脉注入壳聚糖分子信标纳米复合物后，cs-mir155mb组肿瘤直径及肿瘤体积均明显降低。
需要说明的是，在实施例中出现的浓度单位“mm”表示“mmol/l”；“nm”表示“nmol/l”；“μm”表示“μmol/l”。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进或变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围之内。