本发明涉及二氢杨梅素在抗甲型流感病毒药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
流感作为一种病毒性传染病严重威胁人类的健康和阻碍社会经济的发展。甲型流感病毒每年引起全球的感染病例多达上亿人次，具有高致病率和高致死率的特点。历史上共爆发了四次流感病毒引起的大流行，都是由动物源性流感病毒跨越了宿主屏障所致。1997年，香港发生人感染禽流感病毒h5n，1导致人类呼吸道疾病和死亡的疫情并蔓延至多个国家，致死率更是高达50％，加剧了人们对于高致病禽流感病毒的恐慌。在2013年3月，中国首次出现人感染h7n9病例，并快速进展为肺炎、呼吸衰竭、呼吸窘迫综合征，死亡、病死率约为40％。截止到2017年6月，全球报告感染h7n9共1538例，中国内地就报告732例，而且两例h7n9感染者病毒已发生变异。流感的防治，尤其是药物的防治已是迫在眉睫。
迄今为止，临床上使用的抗流感病毒药物主要是：m2离子通道抑制剂(金刚烷胺、金刚烷乙胺)；na抑制剂(奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦)；广谱的rna聚合酶抑制剂(利巴韦林、法匹拉韦)，但在抗病毒药物使用过程中逐渐产生耐药株，还有考虑到这些药物产生的神经毒性，使得人们迫切的寻找新型的抗甲型流感病毒药物和策略。
甲型流感病毒是由ha、na、m、ns、pa、pb1、pb2、np八个全基因组构成，其中pa、pb1、pb2构成了rna聚合酶，介导着病毒的转录和复制。由于甲型流感病毒的表面抗原极易突变，科研工作者将重心转移至高度保守的rna聚合酶上，设计和开发相应的抑制剂，成为抗流感药物研究的一个新方向。。流感病毒rna聚合酶复合体是由pb1、pb2和pa三个亚基组成，其中pb2亚基多功能碱性蛋白，由759个氨基酸组成，具有一个特异的亲核序列区，其作用是在病毒基因组转录时，参与识别招募宿主mrna的5’端帽子结构作为转录的引物，pb2cap的结合位点位于318～483位氨基酸残基区域。pb2与宿主细胞mrnas的5’端帽状结构的结合是转录病毒mrna的起始步骤，如果我们能找到一类能与pb2帽状结构结合位点更紧密结合的小分子，这类小分子能竞争性地占据pb2帽状结构结合位点，那么便能从源头阻断流感病毒在体内的复制。
近年来，有不少研究发现，很多黄酮、鞣酸、生物碱及萜类化合物具有不同程度的抗流感作用，因此天然来源的单体化合物是抗流感药物的重要来源。我们前期研究发现黄酮多酚类的小分子中药单体能够有效的抗甲型流感病毒，如黄芩苷、槲皮素、木犀草素等。二氢杨梅素是一种藤茶类黄酮类化合物，广泛存在于葡萄科蛇葡萄属植物中，研究发现二氢杨梅素具有抗肿瘤、抗氧化、降血压、抑制体内血栓形成等多种药理活性。
技术实现要素：
本发明的目的在于从天然产物中发现一种新型的抗流感病毒抑制剂。所述的二氢杨梅素，具有显著的抗甲型流感病毒的活性，可以作为新的抗流感病毒药物和先导化合物进行开发，具有广泛的应用前景。具体地，本发明发现二氢杨梅素能够抑制甲型流感病毒，能特异性地破坏pb2cap和宿主细胞帽状结构的相互结合，影响病毒的复制，可作为新型抗甲型流感先导化合物进行研发。
在本发明的技术方案中所述的二氢杨梅素的结构如式i所示，
所述二氢杨梅素可抑制甲型流感病毒h1n1和h3n2在宿主细胞中的复制。
所述二氢杨梅素能靶向流感病毒的pb2cap蛋白，从而抑制其与宿主细胞帽状结构的结合及vrnp的活性，可用于制备成抗甲型流感病毒的药物。
所述二氢杨梅素与流感病毒pb2cap蛋白结合的位点为432位的组氨酸(his432)，357位的组氨酸(his357)，404位的苯丙氨酸(phe404)，323位的苯丙氨酸(phe323)，361位的谷氨酸(glu361)，376位的赖氨酸(lys376)，363位的苯丙氨酸(phe363)，429位的天冬酰胺(asn429)，可抑制vrnp活性与流感病毒复制，从而发挥抗流感病毒作用。
所述二氢杨梅素可制成多种药学上可接受的剂型，如片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊、口服液、注射液等，用于流感的治疗。
上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
综上所述，本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1.二氢杨梅素均能抑制甲型流感病毒h1n1和h3n2对细胞的感染，具有广谱的抗病毒活性。
2.二氢杨梅素对细胞的毒性较小，对mdck细胞和a549细胞的cc50分别是505.1±12.8、328.5±4.315μm。二氢杨梅素对甲型流感病毒h1n1和h3n2的ic50分为15.18±0.92，23.33±4.83μm，安全指数分别是33.3和21.7，可作为安全有效的抗流感病毒药物进行开发。
3.二氢杨梅素作用于流感病毒pb2蛋白的帽子结合区域，能竞争性抑制pb2蛋白与宿主mrna5’端帽状结构的结合，阻止流感病毒的转录复制。
附图说明
图1二氢杨梅素细胞毒性检测。a.二氢杨梅素对mdck细胞的毒性；b.二氢杨梅素对a549细胞的毒性。
图2二氢杨梅素抗甲型流感病毒的活性。a.二氢杨梅素对不同甲型流感病毒株的抑制活性；b.二氢杨梅素抑制甲型流感病毒引起的细胞病变；c.二氢杨梅素抑制甲型流感病毒引起的空斑形成。
图3二氢杨梅素抑制流感病毒在细胞中的复制。a.二氢杨梅素抑制流感病毒在mdck细胞中np蛋白的表达；b.二氢杨梅素抑制流感病毒在mdck细胞中np蛋白的表达；c.二氢杨梅素降低病毒在mdck细胞中npmrna的表达水平。
图4二氢杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。
图5二氢杨梅素作用于流感病毒感染后阶段。
图6二氢杨梅素抑制流感病毒的前期复制。
图7二氢杨梅素能与pb2cap蛋白浓度依赖性结合。a.fp实验证明二氢杨梅素能够与pb2cap蛋白浓度依赖性结合；c.spr实验证明二氢杨梅素与pb2cap蛋白有结合作用。
图8二氢杨梅素对流感病毒vrnp的活性的影响。
图9二氢杨梅素与pb2cap蛋白的分子对接。
具体实施方式
为了更好地理解本发明的内容，下面结合实验和结果对二氢杨梅素在抗甲型流感病毒中的应用进一步说明。
本发明所用的材料细胞与病毒
犬肾上皮细胞(mdck细胞)、人肺癌上皮细胞(a549)和293t细胞在含10％胎牛血清，100u/l青霉素、链霉素的dmem或1640培养基进行培养。甲型流感病毒a/pr/8/34(h1n1)、h1n1fm-1和a/aichi/2/68(h3n2)选择8-9天的鸡胚传代扩增，-80℃保存。质粒a/thailand/kan353/2004-ha、a/thailand/kan353/2004-na和pnl4-3r-e-luc用于h5n1假病毒的制备。其中pnl4-3r-e-luc是在pnl4-3进行移码突变使其不表达env蛋白和vpr蛋白，并插入荧光素酶报告基因的一个重组质粒。phw2k-pb1、phw2k-pb2、phw2k-pa、phw2k-np和ppoli-flu以及hrluc-tk用于mini-replicon试验，其中phw2k-pb1、phw2k-pb2、phw2k-pa、phw2k-np在细胞转染后形成rnp复合物。其中所有与活病毒相关试验是在生物安全2级或3级设施中进行。
实施例1二氢杨梅素的细胞毒性检测
二氢杨梅素对细胞毒性的检测采用mtt法，从而确定药物的作用浓度。具体方法如下:
mdck或a549细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至单层，用不含血清的dmem或1640梯度稀释二氢杨梅素后加入到96孔板中，每孔200μl，继续培养48h。弃培养上清，每孔加入100μl含0.5mg/mlmtt的1640或dmem培养基，37℃孵育4h。采用多功能酶标仪(geniospro,tecan,us)检测570nm处吸光度。以细胞的存活率作为二氢杨梅素对mdck或a549细胞的毒性的指标。
细胞存活率(％)＝e/n×100
e为药物组的吸光度，n为细胞对照组的吸光度。
试验结果：二氢杨梅素细胞毒性小，生物安全性高
结果如图1所示，二氢杨梅素对两种细胞的毒性较小。本发明的实验研究中选用的药物浓度在100μm以内，是在安全无毒性浓度范围内。
实施例2二氢杨梅素体外抗甲型流感病毒的活性检测
本发明体外抗病毒实验中涉及多种亚型的甲型流感病毒，包括h1n1和h3n2，具体方法如下：
mdck细胞按2×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100tcid50的pr8感染细胞，每孔100μl，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入dmem(含1μg/mltpck)梯度稀释的二氢杨梅素，每孔200μl，继续培养48h。结合mtt法和空斑实验，反映二氢杨梅素的抗病毒活性通过二氢杨梅素对细胞的保护作用来测定，包括观察二氢杨梅素抑制病毒引起的细胞病毒现象(cpe)和检测细胞的存活率，并进一步计算半数有效浓度ic50。
试验结果：二氢杨梅素可抑制流感病毒的感染
试验结果：图2a表明，二氢杨梅素对甲型流感病毒h1n1和h3n2有明显的抑制作用，对h1n1和h3n2这两种毒株的半数有效浓度ic50分为15.18±0.92，23.33±4.83μm，选择性安全指数分别33.27和21.7(表1)。图2b所示，100tcid50的病毒液在感染细胞48h后能引起明显的细胞病变，二氢杨梅素对细胞能产生保护作用。图2c表明，二氢杨梅素能够浓度依赖性的抑制空斑的形成。
表1二氢杨梅素抗甲型流感病毒活性
实施例3二氢杨梅素对甲型流感病毒复制的抑制实验
为了评估二氢杨梅素对流感病毒复制的抑制作用，本发明采用间接免疫荧光法、q-pcr以及westernblotting三种方法，分别从基因和蛋白的表达水平上检测二氢杨梅素对病毒复制的影响。具体方法如下：
间接免疫荧光法：mdck细胞按5×104/孔接种于48孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100tcid50的pr8感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入dmem(含1μg/mltpck)梯度稀释的二氢杨梅素，每孔500μl，继续培养24h。此后，用4％的多聚甲醛固定20min后对np蛋白和细胞核染色，随机选取多个视野拍下np蛋白的表达情况；
q-pcr及westernblot：mdck细胞按4×105/孔接种于6孔板中，在37℃，5％co2的恒温细胞培养箱中培养至单层。用100tcid50的pr8感染细胞，每孔1ml，37℃孵育1h后，弃病毒液，加入dmem(含1μg/mltpck)梯度稀释的二氢杨梅素，每孔1ml，继续培养24h后，用1mltrizol充分裂解细胞并提取总rna，样品用于q-pcr；或用70-80μl含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的ripa裂解液冰上裂解细胞并提取总蛋白，样品用于westernblot实验。
试验结果:二氢杨梅素可抑制流感病毒在细胞中的复制。
图3a和图3b是检测病毒np在mdck细胞中的表达情况。从结果可以看出，二氢杨梅素能够显著地降低病毒np蛋白的表达水平，且具有浓度依赖性。图3c是采用q-pcr的方法检测病毒npmrna的表达情况，与病毒对照组比较，二氢杨梅素能够抑制np基因mrna的表达量，且随着浓度的增加，抑制作用越明显。该结果与间接免疫荧光法以及westernblotting结果相一致。每个实验独立重复3次，用one-wayanova的统计学分析方法进行分析。每个实验独立重复3次，用one-wayanova的统计学分析方法进行分析。
实施例4二氢杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。
本发明采用h5n1假病毒体系检测二氢杨梅素对流感病毒进入靶细胞的影响。h5n1假病毒体系是指用流感病毒包膜蛋白的a/thailand/kan353/2004-ha和a/thailand/kan353/2004-na质粒以及hiv的核心蛋白pnl4-3r-e-luc质粒共转染293t细胞，组装成的假病毒含有包膜蛋白血凝素ha，介导病毒的吸附入侵，且无病毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全性高，可以在生物安全2级实验室完成。具体方法如下：
mdck细胞按1×104/孔接种于96孔板中，在37℃，5％co2细胞培养箱中培养至80～90％。将50μl倍比稀释的二氢杨梅素与50μl的假病毒在37℃下孵育30min。30min后，将病毒与二氢杨梅素的混合物共同加入到96孔板中，在37℃，5％co2细胞培养箱中继续培养。48h后，弃培养上清，按照荧光素酶检测试剂盒说明书操作，检测病毒的感染能力，每孔加入50μl的细胞裂解液，至于振荡器上振荡20min，接着吸取40μl96孔板中的细胞裂解液，加入到96孔平底荧光素酶检测板中，然后同时加入40μl的荧光素酶底物；用酶标仪测荧光素酶的化学发光值。根据化学发光值的大小，判断二氢杨梅素抑制病毒吸附进入的活性。
化合物抑制率(％)＝[1-(e-n)/(p-n)]×100
其中，e代表实验组的化学发光值，n代表阴性对照组的化学发光值，p代表阳性对照组的化学发光值。化合物的半数抑制浓度(ic50)作为化合物的抗流感病毒活性的指标。阳性对照药为cl-385319。
试验结果:二氢杨梅素不影响流感病毒进入靶细胞。
为了研究二氢杨梅素是否影响病毒的吸附入侵。从图4实验结果所示二氢杨梅素不能抑制h5n1假病毒感染靶细胞，表明二氢杨梅素不作用于流感病毒进入靶细胞的阶段。
实施例4二氢杨梅素对流感病毒生命周期的影响。
为了确定二氢杨梅素干扰流感病毒生命周期中的哪个阶段，我们采用不同的给药方式，包括感染前给药、感染后给药、全程给药进行研究。方法如下：mdck细胞接种100tcid50的甲型流感病毒后，采用三种不同的加药方式，感染前给药(pre-treatment)指病毒与二氢杨梅素孵育30min后再加入细胞感染1h，而后更换新鲜的不含二氢杨梅素的维持液；感染后给药(postinfection)指病毒感染细胞后加入二氢杨梅素；全程给药(entiretreatment)指病毒、二氢杨梅素与细胞共孵育1h后替换成新鲜的含二氢杨梅素的维持液。病毒感染细胞48小时后，用上述1-3的方法检测二氢杨梅素的抗病毒作用。
试验结果:二氢杨梅素作用于流感病毒感染后的阶段。
图5表明二氢杨梅素对病毒感染后的抑制率高于病毒感染前，表明了二氢杨梅素主要作用于病毒感染后的阶段。
实施例6二氢杨梅素对病毒转录复制的影响
为了确定二氢杨梅素干扰病毒生命周期中的哪个阶段，本发明通过改变二氢杨梅素作用方式和时间进行研究。具体方法如下：
在病毒单轮复制期间，按照病毒感染细胞后的时间间隔(0-1，1-3，3-5，5-8，8-10h)，加入含二氢杨梅素的维持液于细胞中，其他时间加入不含化合物的维持液然后在病毒感染10h后，收集样品，采用westernblot检测病毒蛋白np的表达。二氢杨梅素加入细胞中的时间如图6所示。
试验结果:二氢杨梅素作用于病毒的复制前期
病毒的单轮复制期间(0-10h)的不同时间间隔给药，二氢杨梅素在1-3h能够明显得抑制流感病毒np蛋白的表达，表明二氢杨梅素作用于病毒的复制前期而发挥抗病毒的作用。
实施例7二氢杨梅素能够竞争性地结合pb2cap
我们采用荧光能量偏振转移(fp)和表面等离子共振(spr)测定了二氢杨梅素与pb2cap蛋白的结合。
fp实验：将pb2cap蛋白与fitc-m7gtp的混合液加入到96孔黑板，每孔50μl中，室温下孵育30min；用缓冲液将二氢杨梅素进行2倍倍比稀释后加入上述溶液，每孔50μl，室温下孵育1h；最后用多功能酶标仪测定荧光偏振值。
spr实验：将待测二氢杨梅素通过光交联仪器固定于3d光交联芯片上，室温点样；采用plexarrayht生物分子相互作用分析仪室温下检测二氢杨梅素与pb2cap蛋白的相互作用：pb2cap蛋白先用0.05％pbs-t(ph7.0)稀释到250nm，500nm，1000nm，不同浓度的蛋白样品作为分析物以2μl·s-1的速度通过分析仪；结合时间为300s，解离时间为300s，选用甘氨酸盐酸(ph2.0)作为重生液对芯片进行重生，流速为3μl·s-1；采用plexerade软件对实验结果进行分析与处理，用origin8.0软件进行作图。
试验结果:fp试验结果表明二氢杨梅素能够竞争性地结合pb2cap，且呈浓度依赖性(图7a)。spr试验进一步表明二氢杨梅素能够与pb2cap蛋白结合，结合常数kd值为8.28×10-6mol/l(图7b)。
实施例8二氢杨梅素对vrnp活性的影响
本实验采用反向遗传技术，将pb1、pb2、pa、np四种构建的质粒在293t细胞进行共转染形成vrnp复合物，验证二氢杨梅素是否通过抑制pb2cap的活性抑制rnp的活性。具体方法如下：
mini-replicon实验:293t细胞以2×105个/孔接种于24孔板，待细胞长至90％左右，根据lipofectamine2000转染试剂说明书进行质粒的转染。将25μl含有50ngphw2k-pb1、phw2k-pb2、phw2k-pa、phw2k-np和ppoli-flu以及10nghrluc-tk的空白dmem培养基加入到25μl含有1μglipofectamine2000的空白dmem培养基中，将形成的转染复合物加入到细胞培养上清中，继续培养5h，更换新鲜的含化合物以及10％fbs的dmem培养液；继续培养24h后，弃培养上清，按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书进行检测，具体的操作如下：每孔加入100μl的被动裂解液，振荡器后取20μl的细胞裂解液到96孔白色荧光素酶检测板中；每孔加入50μl的荧光素酶底物，立即用多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶的荧光值；每孔加入50μl配制好的终止反应液，立即用多功能酶标仪检测海肾萤光素酶的荧光值；rna聚合酶的活性用萤火虫萤光素酶的荧光值与海肾萤光素酶的荧光值的比值来表示，根据比值计算出化合物对rna聚合酶的抑制率：
抑制率(％)＝(rrnp-fsample)/(frnp-fblank)×100％
试验结果:二氢杨梅素影响流感病毒vrnp的活性
通过对病毒的pb1、pb2、pa以及np四种蛋白转染293t细胞，本发明发现二氢杨梅素能够抑制病毒vrnp的活性(图8)，且具有浓度依赖性。结合图7结果说明了二氢杨梅素是通过与pb2cap蛋白的结合作用，抑制vrnp的活性，从而影响病毒的复制。
实施例9分子对接分析二氢杨梅素与pb2cap蛋白的结合
本发明从proteindatabank上下载pb2cap蛋白(pdb编号：4cb4，分辨率：
试验结果:二氢杨梅素通过与pb2cap结构中的保守型氨基酸残基的结合，影响vrnp的活性，抑制病毒的转录和复制。
结合以上的研究结果，二氢杨梅素作用于病毒的复制前期，通过与pb2cap蛋白作用抑制流感病毒的复制。于是，本发明采用autodock软件模拟二氢杨梅素与pb2cap蛋白的结合。结果如图9所示，二氢杨梅素分子与pb2cap蛋白的结合位点分别是432位的组氨酸(his432)、357位的组氨酸(his357)、404位的苯丙氨酸(phe404)、323位的苯丙氨酸(phe323)、361位的谷氨酸(glu361)、376位的赖氨酸(lys376)形363位的苯丙氨酸(phe363)以及429位的天冬酰胺(asn429)，经由分析，所结合的氨基酸残基中大多是高保守的，如表2所示。
表2二氢杨梅素与pb2cap结合位点的保守性分析
综合以上所述的结果，二氢杨梅素具有抗甲型流感病毒的作用，且二氢杨梅素抗病毒作用机制是与pb2cap蛋白的结合从而抑制rna聚合酶的活性，从而影响流感病毒的复制。因此，二氢杨梅素作为新的抗流感病毒药物和先导化合物，具有毒性低、活性高、价廉易得、机制明确的特点，具有很好的应用前景。