一种纳米包裹的组织工程支架及其制备方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种纳米包裹的组织工程支架及其制备方法。

背景技术：

骨瘤切除或严重的非愈合性骨折导致的大范围的骨损伤会因为缺乏生长模板而不能自身按原形状再生，这样的骨损伤需要外科手术的帮助来完成骨修复。传统修复严重骨损伤的方法主要是自体移植，异体移植和合成材料移植。自体移植因供体数量有限和供区损伤而受到限制，异体移植和合成材料移植又由于缺乏骨传导信号甚至排异反应等原因未得到很好的应用。

新型的纳米复合骨组织工程支架极具开发和应用潜力。生物可降解高分子聚合物基的组织工程支架因其良好的生物相容性、可降解性和可加工性，很适合作为复合支架的基底。现有研究大多将非金属纳米材料如纳米羟基磷灰石与生物可降解高分子聚合物基骨组织工程支架复合制备纳米复合支架，复合方式多为将纳米材料混合入高分子聚合物中共同加工。此种方式构建的复合支架，纳米材料大多被包裹在支架内部，很难直接发挥纳米材料对细胞的调控作用。而且，纳米材料的添加量可能会影响到支架的加工成型和强度。

与非金属纳米材料相比，金属纳米材料具有增强添加物和活性药物的双重功能，在生物医学领域应用广泛。比如作为磁共振造影剂的超顺磁性γ三氧化二铁已获得FDA认证。近年来，纳米氧化铁也被添加入骨组织工程支架中以提高支架的机械强度和生物活性。添加的铁元素随支架的降解而在局部逐步释放，可提高干细胞线粒体活性和成骨相关基因的表达。γ三氧化二铁赋予支架超顺磁性，可作为磁性标记的生长因子或干细胞的靶目标而实现定向作用。磁性支架在外加磁场的辅助下可固定于植入的骨缺损区，减少移位。纳米金具有良好的纳米表面效应、量子效应以及宏观量子隧道效应，它具有很多良好的化学特性，比如抗氧性和生物相容性，因此在生物医学领域极具应用潜力。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对上述现有技术中将纳米材料大多被包裹在支架内部，很难直接发挥纳米材料对细胞的调控作用、并且纳米材料的添加量会影响支架的加工成型和强度等技术问题，本发明提供一种纳米包裹的组织工程支架及其制备方法，通过层层自组装的方法将金属纳米材料直接包裹在组织工程支架的表面，可以避免纳米材料直接添加进支架、并且纳米包裹层可以显著增加支架的亲水性，在一定程度上提高支架的机械性能并有效提高细胞的黏附性能，提高支架的生物相容性。

技术方案：一种纳米包裹的组织工程支架，所述组织工程支架包括可降解高分子聚合物支架和带电荷的金属纳米材料，所述带电荷的金属纳米材料通过静电吸附力借助带相反电荷的聚电解质交替自组装在可降解高分子聚合物支架表面。

作为优选，所述可降解高分子聚合物支架为聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乙醇酸、聚己内酯、明胶和胶原中的至少一种。

作为优选，所述可降解高分子聚合物支架为致密或疏松多孔结构，成型方法为浇铸法、静电纺丝法或者3D打印法。

作为优选，所述聚电解质为浓度2-20 mg/mL的带正电荷的邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯溶液或者带负电荷的聚苯乙烯磺酸水溶液。

作为优选，所述带电荷的金属纳米材料为表面带电荷修饰物修饰的纳米金、纳米γ三氧化二铁或者纳米α三氧化二铁。

作为优选，所述表面带电荷修饰物为二巯丁二酸、聚葡萄糖山梨醇羧甲醚、柠檬酸或壳聚糖，其中表面修饰物为二巯丁二酸、聚葡萄糖山梨醇羧甲醚和柠檬酸时带负电荷，表面修饰物为壳聚糖时带正电荷，所述表面带电荷修饰物的尺寸为5~100 nm。

本发明的另一个技术方案为所述纳米包裹的组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：

步骤一.将可降解高分子材料熔融后制备成支架，然后采用氮气、氧气、水蒸气或氨气等离子体处理支架使支架表面带电荷，选择氮气、氧气或水蒸气等离子体处理时，支架表面带负电荷，选择氨气等离子体处理时，支架表面带正电荷；

步骤二.将步骤一处理后的支架浸泡在与等离子体处理后的支架表面电荷相反的聚电解质溶液中30~60 min，取出样品后用去离子水清洗，然后用滤纸吸干；

步骤三.将步骤二处理后的支架放入与聚电解质电性相反的带电荷的金属纳米材料溶液中浸泡30~60 min，溶液浓度为0.5~10 mg/mL取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36~48 h；

步骤四.将干燥后的支架重复步骤二~步骤三1~6次。

作为优选，所述步骤二中将步骤一处理后的支架浸泡在与等离子体处理后的支架表面电荷相反的聚电解质中30 min。

作为优选，所述步骤三中将步骤二处理后的支架放入与聚电解质电性相反的带电荷的金属纳米材料中浸泡30 min，取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36 h。

作为优选，所述步骤四中将干燥后的支架重复步骤二~步骤三4次。

有益效果：本发明选择生物相容性良好的金属纳米材料包裹组织工程支架制备纳米复合支架，不仅使支架具有增强的机械性能，而且具有增强的成骨活性。还可以通过调节使用纳米材料的种类对纳米复合支架的性能进行调节，如通过包裹磁性纳米材料来赋予支架材料以磁性，通过在一定范围内增加纳米材料包裹层数来增加支架的强度。本发明的纳米包裹组织工程支架适用于各种形貌的高分子聚合物基组织工程支架，显著提高支架的亲水性，可操作性强，能满足临床使用需要，具备推广价值。

附图说明

图1为实施例1中制备的1#、2#和3#支架的扫描电子显微镜图，图中（a）为1# 3D打印的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly（lactic-co-glycolic acid））支架、（b）为2# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的3D打印的PLGA支架、（c）为3# 浸泡负载γ-Fe₂O₃纳米颗粒的3D打印的PLGA支架。

图2为4#电纺支架、5# α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架、6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架和7#金纳米颗粒包裹的电纺支架的表面水接触角示意图，图中a为4#电纺支架的表面接触角，b为5# α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架，c 为6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架，d为7#金纳米颗粒包裹的电纺支架。

图3为实施例2所制备α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架（5#）的透射电子显微镜图。

图4为实施例3中制备的4#电纺支架和6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架的拉伸强度检测的典型应力-应变曲线图，图中a为4#电纺支架，b为6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架。

图5为实施例3中制备的4#电纺支架和6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架的钙结节形成定量检测结果图，图中a为电纺支架，b为γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例 对本发明作进一步描述。

实施例1

本实施例中选用的可降解高分子聚合物支架材料为PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly（lactic-co-glycolic acid）），支架成型方法选用3D打印法。聚电解质为2 mg/mL PDDA（邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯）溶液，带电荷的金属纳米材料为表面带电荷修饰物为聚葡萄糖山梨醇羧甲醚（PSC）修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液（Rosner MH, Auerbach M. Ferumoxytol for the treatment of iron deficiency. Expert Rev Hematol. 2011 Aug;4(4):399-406.）浓度为10mg/mL，平均粒径约为9 nm。

采用上述材料，制备方法如下：

步骤一.将PLGA熔融后用3D打印机打印成6×6×2 mm的支架（标记为1#），纤维直径70 μm，孔径为120 μm，3D打印的PLGA支架（1#）扫描电子显微镜图见图1（a），然后采用氮气等离子体处理3D打印支架，使支架表面带负电荷。

步骤二.将步骤一处理后的支架浸泡在与等离子体处理后的支架表面电荷相反的聚电解质PDDA溶液中30 min，取出样品后用去离子水清洗，然后用滤纸吸干。

步骤三.将步骤二处理后的支架放入与聚电解质电性相反的带电荷的金属纳米材料溶液中浸泡30 min，取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36 h。

所述带电荷的金属纳米材料溶液为PSC修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液（带负电荷），制备方法如下：将聚葡萄糖山梨醇羧甲醚（400 mg，钠盐形式）加入反应瓶中，加入蒸馏水(4 mL)，室温下机械搅拌使原料充分溶解。鼓入氮气并搅拌5 min后，加入六水合三氯化铁（232 mg）和四水合氯化亚铁(114 mg)的水溶液（3 mL），保持氮气鼓入，搅拌15 min。在氮气通入下，滴加28 wt.%的浓氨水（1 mL）调溶液pH至11。启动高频感应加热设备，撤去氮气，80℃下搅拌30 min（搅拌速度为380转每分钟）。向反应溶液中鼓入空气， 80℃下继续搅拌30 min（搅拌速度为380转每分钟）。关闭高频感应加热设备，停止搅拌。待反应体系降至室温，将反应溶液直接转入透析袋（100 kDa的透析袋）中并在注射用水中透析24 h，透析后的溶液进行离心超滤浓缩（100 kDa的超滤管），超滤管内溶液经0.22 μm滤膜过滤1次后，得到PSC修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液。

步骤四.将干燥后的支架重复步骤二~步骤三4次，即完成了四层纳米γ-Fe₂O₃颗粒包裹的支架的制备，制备的γ-Fe₂O₃颗粒包裹的3D打印的PLGA支架（标记为2#）扫描电子显微镜图见图1（b）。

将1#支架直接浸泡在PSC包裹的纳米γ-Fe₂O₃胶体溶液中30 min，取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36h，制得3#支架，扫描电子显微镜图参见图1（c）。

实施例2

本实施例中选用的可降解高分子聚合物支架材料为PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly（lactic-co-glycolic acid））、PCL（聚己内酯，Polycaprolactone）、Gel（明胶，Gelatin），支架成型方法选用静电纺丝法，即为对比例4#。聚电解质为2mg/mL PDDA（邻苯二甲酸二乙二醇二丙烯酸酯）溶液，带电荷的金属纳米材料为表面带电荷修饰物为DMSA（二巯丁二酸，Dimercaptosuccinic acid）修饰的α-Fe₂O₃胶体溶液（Sun J, Su Y, Wang C, Gu N. The investigation of frequency response for the magnetic nanoparticulate assembly induced by time-varied magnetic field. Nanoscale Res Lett. 2011 Jul 14;6:453.），浓度为2.55 mg/mL，平均粒径50纳米。

采用上述材料，制备方法如下：

步骤一.制备电纺支架，制备方法如下：分别称取0.45 g PLGA，0.45 g PCL，0.1 g Gel溶于7.3 g TFE（三氟乙醇，2,2,2-Trifluoroethanol），加入10 μL冰醋酸，磁力搅拌24 h，制备形成总质量分数为12 %的混合溶液备用。取5 mL混合溶液，用静电纺丝装置（纺丝参数为：电压16 kV，出液速度0.8 mL/h，极距15 cm的条件下，相对湿度≤50%，室内温度约20℃）制备形成纤维膜，完成后将膜从收集板上取出，放置于恒温真空干燥箱中干燥72 h，最终完成电纺支架的制备，制备的电纺支架标记为4#，然后采用氮气等离子体处理电纺支架。

步骤二.将步骤一处理后的电纺支架浸泡在与等离子体处理后的支架表面电荷相反的聚电解质PDDA溶液中30 min，取出样品后用去离子水清洗，然后用滤纸吸干。

步骤三.将步骤二处理后的支架放入与聚电解质电性相反的带电荷的金属纳米材料溶液中浸泡30 min，取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36 h。

所述带电荷的金属纳米材料溶液为DMSA修饰的纳米α-Fe₂O₃溶液（带负电），制备方法如下：将纳米α-Fe₂O₃颗粒稀释至约1g/L，调节pH为2.7，加入反应瓶中。称取铁质量1/4的DMSA超声溶解于DMSO（二甲基亚砜）溶液中，然后加入至纳米α-Fe₂O₃溶液中搅拌反应5h。反应结束后离心洗涤样品，反复离心去上清。离心结束后调节溶液pH为10，超声使其稳定，然后调回pH为中性。将溶液装入透析袋中，用透析夹夹住袋口，放入装有双蒸水的烧杯中，搅拌24h。透析后即可得到稳定的DMSA/α-Fe₂O₃水溶液。

步骤四.将干燥后的支架重复步骤二~步骤三4次，即完成了四层纳米α-Fe₂O₃颗粒包裹的电纺支架的制备，制备的α-Fe₂O₃颗粒包裹的电纺支架（标记为5#）的透射电子显微镜图参见图3。

实施例3

制备过程同实施例2，区别在于所述带电荷的金属纳米材料溶液为表面带电荷修饰物聚葡萄糖山梨醇羧甲醚（PSC）修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液（（Rosner MH, Auerbach M. Ferumoxytol for the treatment of iron deficiency. Expert Rev Hematol. 2011 Aug;4(4):399-406.），浓度为10 mg/mL，平均粒径约为9 nm，制备的γ-Fe₂O₃颗粒包裹的电纺支架标记为6#。

所述PSC修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液（带负电荷）的制备方法如下：将聚葡萄糖山梨醇羧甲醚（400 mg，钠盐形式）加入反应瓶中，加入蒸馏水(4 mL)，室温下机械搅拌使原料充分溶解。鼓入氮气并搅拌5 min后，加入六水合三氯化铁（232 mg）和四水合氯化亚铁(114 mg)的水溶液（3 mL），保持氮气鼓入，搅拌15 min。在氮气通入下，滴加28 wt.%的浓氨水（1 mL）调溶液pH至11。启动高频感应加热设备，撤去氮气，80℃下搅拌30 min（搅拌速度为380转每分钟）。向反应溶液中鼓入空气， 80℃下继续搅拌30 min（搅拌速度为380转每分钟）。关闭高频感应加热设备，停止搅拌。待反应体系降至室温，将反应溶液直接转入透析袋（100 kDa的透析袋）中并在注射用水中透析24 h，透析后的溶液进行离心超滤浓缩（100 kDa的超滤管），超滤管内溶液经0.22 μm滤膜过滤1次后，得到PSC修饰的纳米γ-Fe₂O₃溶液。

实施例4

制备过程同实施例2，区别在于所述带电荷的金属纳米材料溶液为表面带电荷修饰物柠檬酸修饰的纳米金溶液（Wang P, Sun J, Lou Z, Fan F, Hu K, Sun Y, Gu N. Assembly-Induced Thermogenesis of Gold Nanoparticles in the Presence of Alternating Magnetic Field for Controllable Drug Release of Hydrogel. Adv Mater. 2016 Dec;28(48):10801-10808.），浓度为0.5mg/mL，平均粒径18 nm，制备的金纳米颗粒包裹的电纺支架标记为7#。

柠檬酸修饰的纳米金溶液的制备：250 mL的三颈瓶中加入95 mL的去离子水和1 mL 浓度为0.01 g/mL的氯金酸三水合物，溶液加热到沸点。然后，在溶液中加入4 mL浓度为0.01g/mL的柠檬酸钠，继续加热25 min再冷却到室温，在这个过程中持续强力搅拌。然后，将溶液体积调到100 mL，在10000 rpm反复离心十次以提纯备用。

对实施例1~4制备的支架进行性能测试，具体测试过程如下：

1. 形貌检测

将3D打印的PLGA（聚乳酸-羟基乙酸共聚物，poly（lactic-co-glycolic acid））支架（1#）、γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的3D打印的PLGA支架（2#）和浸泡负载γ-Fe₂O₃纳米颗粒的3D打印的PLGA支架（3#）干燥喷金后，使用扫描电子显微镜观察其形貌（参见图1）。从图中可以看出，与1#未包裹的支架的光滑表面相比，包裹后的2#支架明显可见表面粗糙的包裹层，但包裹层仅在支架表面，支架空隙仍然干净、通透，几乎保持原孔径大小。

将1#支架直接浸泡在PSC包裹的纳米γ-Fe₂O₃胶体溶液中30 min，取出后用去离子水清洗，然后冷冻干燥36h，制得3#支架，扫描电子显微镜图参见图1（c），从图中可以看出这样接枝的纳米材料填充了支架的原有孔隙，纳米材料无法只包裹在支架表面。

将实施例2中制备的α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架（5#）包埋后切片，使用透射电子显微镜观察，透射电子显微镜图参见图3。从图中可以看出，在电纺支架纤维周壁上布满了短棒状的α-Fe₂O₃纳米颗粒，形成环状。包裹层的厚度约在70-100nm，相邻纤维间分界清晰，无纳米材料。

2. 表面水接触角检测

将电纺支架（4#）、α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架（5#）、γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架（6#）和金纳米颗粒包裹的电纺支架（7#）置于水平载玻片上，滴加直径为1 μL的水滴，用接触角仪(SL200B，上海梭伦科技有限公司)在室温下检测样品的表面水接触角。具体如下：同一样品上随机选取3个点，以蒸馏水静滴法进行测试，每种样品测试5张。拍摄照片后定量检测表面水接触角。测定结果参见图2，图中a为4#电纺支架的表面接触角，b为5# α-Fe₂O₃纳米颗粒包裹电纺支架，c 为6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架，d为7#金纳米颗粒包裹的电纺支架。从图中可以看出，纳米包裹的电纺支架与未包裹的电纺支架相比，其表面接触角显著减小，亲水性增强。

3. 强度检测

将实施例3中最终制备的6# γ-Fe₂O₃纳米颗粒包裹的电纺支架样品和步骤一制备的4#电纺支架分别制成50×10 mm的长条状试样，使用万能材料测试仪Instron R3365测试其抗压强度，跨距为40 mm。将测试样品的长、宽、高数据输入测试软件，以10 mm/min 的拉伸速率及10 N 的拉伸力持续加载，直至样品断裂。拉伸强度检测的典型应力-应变曲线见图4。从检测结果可以看出，6#纳米γ-Fe₂O₃包裹的电纺支架的弹性模量（b）与未包裹的4#电纺支架（a）相比显著增加。

4. 细胞形成钙化结节的染色和定量检测

分别取最终制备的样品和步骤一制备的电纺支架进行烘干消毒，然后加入培养基中，37℃预孵育后，进行细胞实验。接种复苏后生长旺盛的大鼠脂肪干细胞。细胞骨向诱导21天后，用茜素红法对钙化结节进行染色，吸弃原培养基，用1×PBS（磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffer saline）冲洗，用10 vt.%福尔马林在室温固定30 min，再用1×PBS冲洗一次，用2%茜素红染料室温避光染色45 min。用1×PBS冲洗2次。然后用10 wt.%的氯化十六烷基吡啶溶解后进行定量检测，溶解15 min，用酶标仪在波长550 nm读取吸光度值。具体测定结果参见图5。从检测结果可以看出，纳米γ-Fe₂O₃包裹的电纺支架的钙化结节形成量（b）显著与未包裹的电纺支架（a）相比显著增加。