一种仿生矿化胶原支架的制备方法与流程

本发明属于生物医用材料技术领域，尤其是涉及一种仿生矿化胶原支架的制备方法。

背景技术：

随着经济水平的提高以及种植修复技术的成熟，种植修复所具备的不伤害邻牙，美观舒适等优点，使其在口腔临床得到广泛应用。受植区骨条件对种植体的骨整合有重要意义，因此，因牙体、牙周疾病行牙拔除术后的拔牙窝处理至关重要,。为预防和减少牙槽骨的吸收，可于拔牙窝置入骨组织修复材料行位点保存术，骨组织修复材料在牙槽嵴位点保存术发挥优良的占位与支架作用；此外口腔颌面部囊肿、肿瘤切除术后遗留的无效腔常常是创口延期愈合的主要原因，骨组织修复材料的置入消灭无效腔促使骨结合可获得良好的效果；牙周疾患导致牙槽骨的吸收亦需填充骨组织修复材料以减缓和终止病变的进展。因此骨组织修复材料的需求日益增加。骨组织修复材料中自体骨来源有限且对自身有二次伤害，异体骨可能存在免疫排斥，吸引众多研究人员将目光放在仿生矿化材料修复骨组织缺损上。矿化的胶原支架可作为促进骨再生材料对于口腔疾病的预防与诊疗有着巨大的潜能和意义。

天然骨组织是由约28％的i型胶原纤维和67％羟基磷灰石有序排列所组成的复合体。胶原纤维是由胶原微纤维自组装而成的，原胶原分子互相错开1/4形成阵列形成胶原微纤维,原胶原分子的空隙区部位富含非胶原蛋白,非胶原蛋白修饰胶原纤维，稳定矿化前体，无定形磷酸钙沉积在胶原内，转化为纤维内羟基磷灰石，羟基磷灰石晶体沿着胶原纤维c轴排列，然后逐渐长大。矿化胶原纤维是骨的基本组织单元，具有复杂的分级结构和精密的组装方式，其高度有序的结构使骨组织具有各自独特的硬度、韧性、强度、以及抗折性能。这些优越的性能激励我们研究模拟类似骨的生物材料或者新型功能材料。

在天然骨组织中还含有一些微量元素，这其中主要是锶，其具有双向调节作用，不但有促进骨合成的能力，同时还有阻止骨量丢失的能力。其作用机制在于，可增加碱性磷酸酶的活性，使成骨细胞中的胶原与非胶原蛋白的合成增加，通过刺激成骨细胞而促进骨的形成。同时也能显著影响骨的重吸收，并能直接与破骨细胞作用而抑制其活性，减少骨量的流失。锶还能调节羟基磷灰石的内部结构，提高其硬度，拓宽骨晶体的尺寸，增加骨的强度。掺锶羟基磷灰石更能促进成骨细胞的黏附，增殖，且具有良好的生物相容性，无明显细胞毒性。

非胶原蛋白在生物矿化过程发挥了重要作用，在稳定前体和诱导矿物盐在胶原支架内的成核和分级化自组装起着重要的调控作用，但其供应有限且价格昂贵。因此寻找具有优越性能的仿生类似物以模拟非胶原蛋白作用是十分必要的。羧甲基壳聚糖是水溶性壳聚糖衍生物，与非胶原蛋白类似，亦是一种两性聚电解质，存在两性电离平衡，且具有良好的生物相容性、生物可降解性，价格便宜，在医药、食品、化妆品等领域具有广阔的应用前景。

传统的矿化胶原的方法是先通过胶原自组装过程限定了矿物质成核和生长的框架，小于40nm的钙磷颗粒通过静电作用、毛细作用等作用进入胶原内，形成矿化的胶原纤维，鉴于非胶原蛋白类似物羧甲基壳聚糖的两性聚电解质的特性，因此研发一种新的制备方法，简化了矿化步骤，提高了矿化效率。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明旨在提出一种仿生矿化胶原支架的制备方法，以克服现有技术的不足，本发明采用胶原自组装和矿化协同进行，不仅将矿化制备过程简单化，而且突破无定形磷酸钙的粒径要小于40nm的限制，在酸性条件下，小粒径acp聚集成大粒径acp(>40nm)，亦能沉积在胶原内，形成矿化的胶原。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种仿生矿化胶原支架的制备方法，包括如下步骤，

1)仿生矿化液的制备：用酸将羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物cmc/acp溶液的ph调节至低于cmc的等电点；优选的，酸溶液为盐酸或硝酸；

2)仿生矿化胶原支架的制备：将步骤1)得到的酸性羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物溶液与酸溶解的i型胶原混合后放入透析袋内，封口后置于pbs缓冲液中，自组装和矿化2～5天后，透析袋内添加碱性cmc/acp溶液，更换透析袋外的pbs缓冲液，处理1～3天后，将透析袋置于去离子水中透析10h～72h，多次更换去离子水后将透析袋内溶液离心获得胶原凝胶，最后将凝胶冷冻干燥获得仿生矿化胶原支架。

本发明使用的羧甲基壳聚糖，是优异性能的非胶原蛋白仿生类似物，cmc与非胶原蛋白类似，是一种两性聚电解质，可利用其特性于酸性条件下稳定矿化前体，引导胶原矿化。

优选的，步骤1)中，羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物(cmc/acp)溶液中，含cmc为2～5mg/ml，k2hpo4为1mm～6mm，cacl2·2h2o浓度为2mm～10mm；ca/p摩尔比＝1：1～2：1；且用hcl调节ph低于3。步骤1)中所述的cmc/acp溶液ph为6～8，缓慢滴加hcl至混合体系ph低于3。透射电镜可观察到所得的acp纳米颗粒粒径大约在10～100nm。

所述的hcl调节cmc/acp溶液的ph时，随着ph降低，溶液中有沉淀析出，达到等电点区(3～5)沉淀最多，随后沉淀逐渐溶解。ph<3，cmc/acp溶液较清澈。

优选的，羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物溶液的制备步骤为，常温下，将羧甲基壳聚糖加入去离子水中搅拌至完全溶解后，加入k2hpo4，得到a溶液，将cacl2·2h2o水溶液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物(cmc/acp)溶液；步骤1)中羧甲基壳聚糖为n-羧甲基壳聚糖、o-羧甲基壳聚糖、n,o-羧甲基壳聚糖中的一种或两种以上，其水溶液粘度30～200，等电点大约在3～5。

优选的，步骤2)中，酸溶解的i型胶原与cmc/acp溶液按照体积比为1：1～1：5混合；i型胶原用酸溶解，所使用的酸包括0.1-0.5m盐酸、硝酸或醋酸中的一种或两种以上；优选的，所述i型胶原为ⅰ型鼠尾胶原、牛皮胶原、猪皮胶原、鱼皮胶原。

优选的，步骤1)得到的酸性羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物溶液中无定形磷酸钙的粒径为10～100nm。

优选的，步骤2)中，透析袋的截留分子量为1000～14000；pbs缓冲液的缓冲范围为7.2～7.4；随着透析袋内外离子的平衡，透析袋内ph逐渐升高，胶原分子逐步自组装，同时亦与acp结合，包裹在胶原纤维内的acp逐渐向hap转化并生长，形成具有严格等级结构的矿化的胶原。

自组装和矿化2～4天后，添加的碱性cmc/acp溶液的量为透析袋内溶液体积的1/2-2倍；胶原凝胶在-20～-40℃下冷冻24～48h后冻干获得仿生矿化胶原支架；优选的，碱性cmc/acp溶液的ph为8～12。

优选的，步骤1)中，用无定形磷酸锶或无定形碳酸锶代替无定型磷酸钙。

优选的，配制羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物溶液包括如下步骤，羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物溶液的制备步骤为，常温下，将羧甲基壳聚糖加入去离子水中搅拌至完全溶解后，加入k2hpo4，得到a溶液，将srcl2·6h2o水溶液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物(cmc/asp)溶液；

优选的，羧甲基壳聚糖为n-羧甲基壳聚糖、o-羧甲基壳聚糖、n,o-羧甲基壳聚糖中的一种或两种以上。

优选的，羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物(cmc/asp)溶液中，含cmc为2～5mg/ml，k2hpo4为1mm～10mm，srcl2·6h2o浓度为5mm～20mm；sr/p摩尔比为1：1～2：1；且用hcl调节ph低于3；

步骤1)得到的酸性羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物溶液中无定形磷酸锶的粒径为5～50nm。

优选的，配制羧甲基壳聚糖-无定形碳酸锶纳米复合物溶液包括如下步骤，常温下，将羧甲基壳聚糖加入去离子水中搅拌至完全溶解后，加入na2co3，得到a溶液，将srcl2·6h2o水溶液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形碳酸锶纳米复合物(cmc/asc)溶液；

优选的，羧甲基壳聚糖为n-羧甲基壳聚糖、o-羧甲基壳聚糖、n,o-羧甲基壳聚糖中的一种或两种以上。

优选的，羧甲基壳聚糖-无定形碳酸锶纳米复合物(cmc/asc)溶液中，含cmc为2～5mg/ml，k2hpo4为1mm～10mm，srcl2·6h2o浓度为5mm～20mm；sr/p摩尔比为1：1～2：1；且用hcl调节ph低于3；

步骤1)得到的酸性羧甲基壳聚糖-无定形碳酸锶纳米复合物溶液中无定形碳酸锶的粒径为5～50nm。

本发明还提供一种如上所述的方法制备得到的仿生矿化胶原支架在骨缺损修复材料中的应用。

天然骨组织具有典型的高度复杂分级结构，如今众多学者致力于对天然骨组织的研究和模拟，以研究出具有优越性能的新型仿生矿化胶原材料来解决对骨移植材料供不应求的现状。骨的有机基质为ⅰ型胶原，羟基磷灰石沉积在胶原内形成复合体，非胶原蛋白在调控胶原矿化起到至关重要的作用，非胶原蛋白存在等电点，羧甲基壳聚糖(cmc)是两性聚电解质，因此羧甲基壳聚糖溶液在低于等电点时净电荷为正，在低于等电点时通过-nh3⁺…po4^3-配位作用，亦可稳定矿化前体，使胶原矿化。而且cmc具有良好的生物相容性、可降解性、无毒副作用的钙磷稳定剂，引导纤维内外协同矿化。酸性矿化液与分子状态下的胶原在酸性条件下结合，升高ph可促进矿化前体向晶体状态转化，同时胶原自组装亦需要升高ph，所以本发明采用羧甲基壳聚糖稳定的矿化液-胶原混合液在从低ph的环境下逐渐升高ph，自组装和矿化同时进行形成矿化的胶原纤维，该新型的矿化方法在国内外尚未有相关系统报道。

相对于现有技术，本发明所述的仿生矿化胶原支架的制备方法，具有以下优势：

(1)本发明所述方法制备的仿生矿化胶原支架，为具有高度复杂分级结构的矿化材料，孔区和重叠区周期性相互交替，羟基磷灰石有序结合在胶原纤维的孔区，沿着胶原纤维长轴生长，构建与天然骨组织成分和结构相似的骨移植材料。胶原分子自组装的同时羟基磷灰石在胶原内沉积成核生长，形成晶体有序沉积的矿化的胶原纤维。

(2)本发明所述的方法可制备出具有天然胶原纤维的特征性横纹结构(d＝67nm)，羟基磷灰石晶体有规律地沉积在胶原孔区成核生长。

(3)本发明采用钙磷稳定剂羧甲基壳聚糖(cmc)，与非胶原蛋白更类似，为两性聚电解质，当溶液ph低于cmc等电点时净电荷为正，可通过静电作用吸引磷酸根离子从而稳定acp，当溶液ph高于cmc等电点时净电荷为负，可通过静电作用吸引钙离子而稳定acp，因此将ph调节至cmc等电点之下，亦能稳定acp。而且cmc有生物相容性、天然无毒副作用等优良性能，容易获得且价格低廉。

(4)本发明采用酸性羧甲基壳聚糖稳定的acp，其颗粒粒径为10～100nm，由于胶原自组装和矿化的协同进行，突破了胶原矿化对acp粒径的<40nm的限制。透析袋内酸性条件下的acp与处于分子状态下的胶原直接接触，构建胶原自组装和矿化同时进行的前提条件，透析袋置于pbs缓冲液内，透析袋内外正负离子逐渐趋于平衡，为胶原创造一个从低ph逐渐升高的环境，随着ph的升高，胶原分子自组装成胶原纤维，并且沉积在胶原内的无定形磷酸钙逐渐向羟基磷灰石转化。

(5)本发明采用的矿化液亦可用srcl2·6h2o代替cacl2·2h2o，或同时用na2co3代替k2hpo4，其原理与cacl2·2h2o相同，利用其优越性能制备硬度、强度较高的胶原支架。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的cmc溶液，在不同ph下的浑浊度。

其中，图中的数字，代表ph值。

图2为本发明实施例1制备的cmc/acp纳米颗粒，透射电镜(tem)观察；

图3为本发明实施例1制备的胶原纤维矿化时间为1小时的透射电镜(tem)观察；

图4为本发明实施例1制备的胶原纤维矿化时间为3天的透射电镜(tem)观察；

图5为本发明实施例1制备的胶原纤维矿化时间为5天的透射电镜(tem)观察；

图6为本发明实施例1制备的胶原纤维(矿化3天)，场发射扫描电镜(sem)观察。

图7为本发明实施例1制备的胶原支架图片。

图8为本发明实施例2制备的cmc/asp纳米颗粒，透射电镜(tem)观察。

图9为本发明实施例2制备的胶原纤维(矿化3天)，透射电镜(tem)观察。

图10为本发明实施例3制备的胶原纤维(矿化3天)，透射电镜(tem)观察。

图11为对比例1制备的胶原纤维，透射电镜(tem)观察。

图12为对比例2制备的胶原纤维，透射电镜(tem)观察。

具体实施方式

除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下面结合实施例来详细说明本发明。

实施例1

(1)在常温磁力搅拌器的充分搅拌下，向30ml去离子水中加入的o-羧甲基壳聚糖(粘度：45，mw：13700，等电点3.6)200mg，待完全溶解后，加入41.76mgk2hpo4，得到a溶液；在10ml去离子水中加入58.8mgcacl2·2h2o，形成b液；在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，将b液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形磷酸钙纳米复合物(cmc/acp)溶液；用hcl调节cmc/acp溶液ph为2。透射电镜表征结构如图2所示，无定形磷酸钙纳米颗粒大小约为40-100nm。saed显示为无同心圆特征环。

(2)将透析袋在体积分数为50％酒精浸泡30分钟，去离子水冲洗，一端封口，取1mlⅰ型鼠尾胶原放入透析袋，取3ml上述酸性的cmc/acp溶液，置于截留分子量为8000～14000透析袋，混合均匀。封口后放入15mlpbs缓冲液中，矿化1小时，此时ph约为2.6，透射电镜表征如图3所示，可见胶原自组装过程，此时羟基磷灰石沿着c轴沉积。矿化3天，此时ph约为6，透射电镜表征如图4所示，可见胶原自组装完成，羟基磷灰石有序地沉积在孔区。3天后再次制备cmc/acp溶液，用naoh调节其ph为11，取3ml置于透析袋内，更换透析袋外的pbs缓冲液。2天后观察。表征结果如图5，6，图5可见羟基磷灰石晶体沿着胶原纤维长轴生长。saed可见晶体衍射环。图6可见胶原纤维直径大约为600nm，将透析袋置于去离子水中透析10h～72h，多次更换去离子水后将透析袋内溶液离心获得胶原凝胶，最后将凝胶冷冻干燥获得仿生矿化胶原支架。胶原支架如图7所示。

实施例2

在常温磁力搅拌器的充分搅拌下，向30ml去离子水中加入的o-羧甲基壳聚糖(粘度：45，mw：13700，等电点3.6)200mg，待完全溶解后，加入62.7mgk2hpo4，得到a溶液；在10ml去离子水中加入160.2mgsrcl2·6h2o，形成b液；在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，将b液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形磷酸锶纳米复合物(cmc/asp)溶液；用hcl调节cmc/asp溶液ph为2。透射电镜表征结构如图8所示，cmc/asp纳米颗粒大小约为5-50nm。

将透析袋在50％酒精浸泡30分钟，去离子水冲洗，一端封口，取1mlⅰ型鼠尾胶原放入透析袋，取3ml上述酸性的cmc/asp液，置于截留分子量为8000～14000透析袋，混合均匀。封口后放入15mlpbs缓冲液，矿化3天，表征结果如图9。

实施例3

在常温磁力搅拌器的充分搅拌下，向30ml去离子水中加入的o-羧甲基壳聚糖(粘度：45，mw：13700，等电点3.6)200mg，待完全溶解后，加入25.44mgna2co3，得到a溶液；在10ml去离子水中加入106mgsrcl2·6h2o，形成b液；在常温和磁力搅拌器的充分搅拌下，将b液逐滴加入到a液中，形成羧甲基壳聚糖-无定形碳酸锶纳米复合物(cmc/asc)溶液；用hcl调节cmc/asc溶液ph为2。

将透析袋在50％酒精浸泡30分钟，去离子水冲洗，一端封口，取1mlⅰ型鼠尾胶原放入透析袋，取3ml上述酸性的cmc/asp溶液，置于截留分子量为8000～14000透析袋，混合均匀。封口后放入15mlpbs缓冲液，矿化3天，表征结果如图10。

对比例1

该对比例提供的是胶原自组装后再于中性矿化液中矿化。

将酸溶解的ⅰ型鼠尾胶原置于pbs缓冲液中，pbs缓冲液每天换一次，3天后用铜网蘸取自组装完成的胶原，干燥后漂在中性的cmc/acp矿化液3天。表征结果如图11，可见纤维内羟基磷灰石晶体沉积，纤维外无定形磷酸钙聚集。

对比例2

该对比例提供的是中性的cmc/acp溶液矿化胶原。

以与实施例1基本相同的方式进行，区别在实施例1步骤(2)仿生矿化液(cmc/acp溶液)的配制后不调节ph，将其与酸溶解的ⅰ型鼠尾胶原混合后将ph调节为7。表征结果如图12，可见周期性横纹，无明显的羟基磷灰石晶体沉积。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。