本发明涉及兽用生物制品
技术领域：
，进一步涉及疫苗的制备技术，具体涉及番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法。
背景技术：
：番鸭小鹅瘟病是1997年以来在福建省的番鸭饲养区爆发流行，目前全国各养鸭地区均有发生。临床上番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征，发病率50-70％、死亡率40-60％。临床上使用番鸭细小病毒活疫苗及小鹅瘟高免卵黄抗体等均不能控制病情，给养鸭业造成较大的经济损失。禽腺病毒分为ⅰ、ⅱ、ⅲ亚群，目前国内外专家学者主要对ⅰ和ⅲ鸭群进行研究。鸭腺病毒2型属于ⅰ鸭群暂定种，最早是1977年匈牙利的j.f.bouquet等在番鸭中分离的，它与已知的鸡和火鸡的病毒没有关系，但可在鸡和鸭的细胞中生长。近年来国内研究学者利用病毒宏基因组学相继从广东、福建等分离到该病毒，认为该病毒为一种鸭源新病毒。该病主要发生在20-30日龄鸭中，病鸭表现为精神萎靡、沉郁、排浅黄白色粪便，严重的甚至会死亡。病理症状为肝脏肿大、出血、白色点状坏死，胰腺白点坏死，心包积水，法氏囊缩小等。该病传播速度较快，很难清除，给养鸭业造成较大的经济损失。番鸭源细小病毒和腺病毒均是番鸭的重要传染病，并且他们往往混合感染，给养鸭业造成较大的经济损失，然而目前尚无商业化的此类二联疫苗，究其原因是因为这两种抗原作为二联苗免疫动物时，免疫原性相互构成影响，往往难以同时对两种病毒达到免疫效果。技术实现要素：本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，以解决现有技术中缺乏此种疫苗的技术问题。本发明要解决的另一技术问题是现有技术中以番鸭源细小病毒和腺病毒为抗原的二联疫苗难以同时对两种病毒产生有效免疫的技术问题。为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：1)取感染番鸭源鹅细小病毒的、9日龄番鸭，取其肝、脾或肠道组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为细小病毒液；2)取感染鸭2型腺病毒的、16日龄番鸭，取其肝或脾组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为鸭2型腺病毒液；3)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤1)所得的细小病毒液，10-2稀释后接种于9～11日龄非免鸡胚，37℃培养，弃去24h非特异死胚，将24h-120h死胚置于4℃冷藏4-24h，收获尿囊液，将其在鸡胚上盲传3～5代，直至鸡胚出现致死，并且死亡时间控制在96h内，收获死胚尿囊液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的尿囊液待用；4)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤2)所得的鸭2型腺病毒液，而后将其按细胞液体积的0.1-2％接种到长至单层状态的lmh细胞中，37℃培养72-96h，收获病毒，反复冻融3次，盲传3～5代，直至75％细胞出现病变，并且病变时间控制在72h内，收获病毒液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的病毒液待用；5)利用超滤浓缩方法将步骤3)所得产物进行2.5倍体积浓缩，得到细小病毒抗原液；利用超滤浓缩方法将步骤4)所得产物进行2倍体积浓缩，得到鸭2型腺病毒抗原液；6)分别灭活步骤5)所得的细小病毒抗原液和鸭2型腺病毒抗原液；7)将灭活后的细小病毒抗原液和灭活后的鸭2型腺病毒抗原液分别以3500r/min转速离心10min，而后再分别经8层纱布过滤，过滤后等体积混合，再加入混合液体积4％的吐温80，混匀，得到疫苗水相；8)取marcol52白油，向其中加入1.2％(w/v)的硬脂酸铝，混合后加热，至硬脂酸铝完全溶解后向其中加入白油用量6/94(w/w)的司班80，边加热边搅拌至完全溶解，即得疫苗油相；9)将步骤8)所得的疫苗油相与步骤7)所得的疫苗水相按3:2(w/w)的比例混合，乳化，即得到所述番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。作为优选，步骤3)所述病毒效价最高的尿囊液其番鸭源鹅细小病毒效价≥10-5.5eid50/0.1ml。作为优选，步骤4)所述病毒效价最高的病毒液其鸭2型腺病毒效价≥10-6.0tcid50/0.1ml。作为优选，步骤5)所述超滤浓缩方法是利用100kd膜包实施的；更优的，所述100kd膜包是由密理博公司出品的。作为优选，步骤6)中所述灭活包括以下操作：向抗原液中加入甲醛至终浓度为1～2‰(v/v)，摇匀，以180r/min转速、37℃条件下灭活16-20小时。作为优选，步骤9)所述的乳化是利用弗鲁克公司出品的乳化机实施的，具体包括以下操作：取配方量的疫苗油相加入到容器内，开动乳化机至a档，加入配方量的疫苗水相，继续剪切2min，将乳化机置于b档，剪切3min。本发明提供了番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，该技术方案根据番鸭源鹅细小病毒和鸭2型腺病毒的增殖特点和免疫原性设计了有针对性的工艺条件。具体来看，本发明利用鸡胚增殖番鸭源鹅细小病毒，利用lmh细胞增殖腺病毒，将其灭活后制备成安全有效的番鸭源鹅细小病毒和腺病毒二联灭活疫苗。利用本发明制备的番鸭源鹅细小病毒和腺病毒二联灭活疫苗产生抗体早，保护率高。本发明制备的疫苗一次接种可以预防两病，解决了番鸭因疫苗多次接种而造成的应激反应。具体实施方式以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。因此，用“大约”、“左右”等语言所修正的数值不限于该准确数值本身。在一些实施例中，“大约”表示允许其修正的数值在正负百分之十(10％)的范围内变化，比如，“大约100”表示的可以是90到110之间的任何数值。此外，在“大约第一数值到第二数值”的表述中，大约同时修正第一和第二数值两个数值。在某些情况下，近似性语言可能与测量仪器的精度有关。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂耗材，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值；以下实施例中的％，如无特别说明，均为质量百分含量。1.病毒的分离和鉴定1.1番鸭源鹅细小病毒的分离和鉴定从福建省漳州番鸭场9日龄发病番鸭中收集病料，取其肝、脾和肠道，将组织研磨，8000rpm离心10min，取上清对其vp3基因进行pcr扩增，并进一步进行测序鉴定，证明该病毒为番鸭源小鹅瘟病毒，命名为mgpv-fj-2016。1.2番鸭腺病毒的分离和鉴定从广东省番鸭场16日龄发病番鸭的收集病料，取其肝和脾脏进行研磨，8000rpm离心10min，取上清对其hexon蛋白基因进行pcr扩增，并进一步进行测序鉴定，证明该病毒为鸭腺病毒2型，命名为dadv-2-gd-2016。2.病毒的增殖(1)mgpv-fj-2016种毒的增殖利用0.22um滤器将步骤1)中离心后的mgpv-fj-2016病毒上清进行过滤，10-2稀释后接种于9～11日龄非免鸡胚(无小鹅瘟抗体)，37℃培养。弃去24h非特异死胚，将24h-120h死胚置于4℃冷蛋4-24h。收获尿囊液，将其在鸡胚上盲传3～5代，直至鸡胚出现致死，并且死亡时间控制在96h内，收获死胚尿囊液命名为p1。按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，结果见表1，将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价应≥10-5.5eid50/0.1ml。表1病毒含量测定结果(10neid50/0.1ml)p1p2p3p4p5p6p7p84.04.835.55.835.835.55.835.52.1.1dadv-2-gd-2016种毒的增殖利用0.22um滤器将步骤1)中离心后的dadv-2-gd-2016病毒上清进行过滤，待lmh细胞长至单层时，按细胞液体积的0.1-2％接种病毒，37℃培养72-96h，收获病毒，反复冻融3次。盲传3～5代，直至75％细胞出现病变，并且病变时间控制在72h内，收获病毒命名为p1。按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，结果见表2，将效价最高代次的毒用于疫苗的制备。由病毒含量测定结果规定疫苗用毒效价应≥10-6.0tcid50/0.1ml。表2病毒含量测定结果(10ntcid50/0.1ml)p1p2p3p4p5p6p7p85.06.06.386.56.386.386.56.03.疫苗的制备3.1病毒的浓缩利用超滤浓缩方法(密理博公司100kd膜包)分别将mgpv-fj-2016和dadv-2-gd-2016进行2.5倍和2倍浓缩，用于二联疫苗的制备。3.2病毒的灭活分别将两种细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至1-2‰(v/v)，充分摇匀毒液，以180r/min转速，37℃条件下灭活16-20小时；3.3疫苗的制备3.3.1水相的制备分别将灭活后的两病毒液以3500r/min离心10min，再经8层纱布过滤。将处理后的两种病毒液以1：1的体积比混合，再按混合毒液体积的4％加入吐温-80，充分混匀。3.3.2油相的制备marcol52白油94份，加入1.2％(w/v)的硬脂酸铝，混合后加热，至硬脂酸铝完全溶解后加入司班-806份，边加热边搅拌至完全溶解，即得油相。3.3.3乳化取3份油相加入到容器内，开动剪切机(fluko)至a档，缓慢加入2份水相，继续剪切2min，将剪切机置于b档，剪切3min即可。4.疫苗的安全性检验将疫苗分别进行1次超剂量(1ml)和单剂量重复接种(0.2ml×2)的安全试验。观察14天，试验鸡均无任何局部和全身不良反应，表明上述疫苗安全性良好5.疫苗效力检验5.1血清学方法检验取1日龄番鸭20只，分为2组，每组10只鸡，第1组经腿部肌肉注射0.2ml疫苗，第2组注射磷酸盐缓冲液0.2ml作为对照，同样条件下饲养，免疫后每周采血，分离血清，直至免疫后第8周，利用琼脂糖扩散试验(agp)对特异性抗体进行检测，结果见表3。表3疫苗免疫后抗体水平测定结果(nlog2)5.2免疫攻毒法检验取1日龄肉鸡40只，分为4组，每组10只鸡，第1组和第2组分别经腿部肌肉注射0.2ml疫苗，第3组和第4组不免疫作为攻毒对照，同样条件下饲养。免疫后第14d，取第1组和第3组分别攻击gpv强毒，0.2ml/羽，攻毒后14d剖检，观察组织病变，确定保护率，见表2。免疫后21d，第2组和第4组分别攻击dadv强毒，0.2ml/羽，攻毒后7d剖检，观察组织病变，确定保护率，见表4。表4攻毒保护率结果以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12