用于诊断凝集素受体高表达肿瘤的放射性药物的制作方法

本发明涉及一种基于凝集素受体预靶向策略的肿瘤诊断的放射性药物，尤其涉及一种用于诊断凝集素受体介导的结直肠癌的放射性药物。
背景技术：
：凝集素(Lectin)是一类能与生命体中糖化合物中糖基发生特异性结合的蛋白质，其被研究的历史已超过一百余年。上个世纪90年代，科学家们发现许多胃肠道肿瘤中凝集素表达量远远高于癌周组织。例如Ohannesian等人曾经将21种结直肠癌细胞系进行分子生物学分析，发现有20种均表达凝集素。因此，对于结直肠癌而言凝集素无疑是一个很好的药物作用靶点，可以用于肿瘤的诊断和治疗。亲和素(Avidin)提取自蛋清中，分子量66–69kDa，是一种高度糖基化、带正电荷的蛋白质(pI＝10.5)，含有末端N-乙酰化的葡萄糖及甘露糖残基。这些糖残基能被凝集素特异性识别，并发生高亲和力的结合形成Avidin–Lectin复合物。在生物体内，Avidin可以特异性的结合肿瘤细胞高表达的Lectin，未与Lectin结合的Avidin会重新进入血液循环，被肝吸收并通过肝胆代谢出体外。因此，Avidin可以作为Lectin的特异性配体，用于在体检测Lectin表达水平的靶向分子或特异性载体。核医学分子影像技术，例如正电子发射断层(PET)和单光子发射断层(SPECT)技术，与传统的检测手段相比，具有灵敏度高、无创、快速、实时等诸多优点，在肿瘤早期诊断方面拥有巨大优势。相关研究报道，Lectin(凝集素)受体高度表达于多种肿瘤细胞的表面，尤其在胃肠道肿瘤中，例如结直肠癌，其表达程度与恶性程度呈正相关。因此，对于Lectin受体高度表达的肿瘤而言，其无疑是一个很好的放射性药物作用靶点。目前，针对Lectin的核医学分子探针均以Avidin为设计核心，但此类探针大都分子量过大，结构过于复杂，不利于未来药盒化制备，其次，探针结构中都含有氨基酸例如赖氨酸，这会使得探针与高度表达于远端肾小管部位的megalin蛋白进行结合，导致探针在肾脏部位摄取过多并且滞留时间过长，肿瘤/肾脏比值较低，对位于腹腔部位肿瘤的诊断产生了较大的影响。另外，具体对于结直肠癌而言，以Lectin为靶点的研究大都以结直肠癌腹腔播散模型为主，此类模型与临床实际情况有一定差距，并不能反映药物真实的药代行为。技术实现要素：为了改善现有技术存在的上述问题，本发明提供一种99mTc的放射性标记配合物，所述配合物具有核心鳌合配体，该配体以下式L1或其立体异构体形式为其配体前体：其中：-L-选自如下所示的连接臂：R各自独立的选自H、任选被羟基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤素、-NH2；n为2-8的整数，例如2、3、4、5、6、7、8；s为0-6的整数，例如0、1、2、3、4、5、6；R1为H，-SO3H，-COOH，或所述磺酸、羧酸药学上可接受的盐或酯。根据本发明，上述的配体前体式L1在形成标记配合物时，C＝N双键断裂形成N＝N双键，与锝配位。L1是以联肼尼克酰胺(HYNIC)螯合剂为基础的配体前体。已知HYNIC是一种有效的Tc螯合剂，由于HYNIC只能提供1-2个配位原子参与99mTc络合，因此除了本发明上述定义的核心鳌合配体外，还可具有辅助的协同配体L2和/或L3。作为协同配体L2、L3，其可以相同或不同，均是现有技术中已知可作为99mTc配体的那些，其中常见的协同配体L2、L3包括水溶性膦(例如三苯基膦三间磺酸钠盐TPPTS)，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、N-二(羟乙基)甘氨酸、葡庚糖酸盐、乙二胺-N,N’-二乙酸酯(EDDA)、3-苯甲酰基吡啶(BP)、吡啶-2-偶氮-p-二甲苯胺(PADA)等。根据本发明，所述99mTc包括任意氧化还原态的锝放射性同位素，例如其+6、+5、+4、+3、+2、+1价态，优选99mTc(III)，99mTc(IV)，99mTc(VII)。根据本发明，所述式L1中，R1为其苯环上的取代基，其位置可为腙键的邻、间、对位。优选地，本发明的99mTc的放射性标记配合物中：L1中的连接臂L选自式d结构；优选其中s为2、n为3；R1为-SO3H；协同配体可相同或不同，独立地选自：N-三(羟甲基)甲基甘氨酸、三苯基膦三间磺酸钠盐。作为实例，本发明的核心鳌合配体前体式L1为下式或其立体异构体：作为实例，本发明的标记配合物(简写为99mTc-HYNIC-PEG3-B)为：本发明如上的标记配合物，由于配体的结合协同作用，其在溶液中和体内均保持稳定。所述配合物通过静脉注射后在尿样中回收到完整的该配合物，而没有发现理化降解物，这足以说明所述配合物的稳定性。本发明还提供所述99mTc的放射性标记配合物的制备方法，包括下述步骤：(1)将配体前体L1的溶液、L2的溶液和/或L3的溶液混合后，向混合溶液中加入99mTc源，反应生产所述标记配合物；或者将配体前体L1，配体L2和/或L3溶解在缓冲溶液中，向混合溶液中加入99mTc源，反应生产所述标记配合物；优选地，所述配体前体式L1由以下步骤(2)偶联得到，本领域技术人员应当理解，其中所述L是本发明上述L1定义中的连接臂L除去-NH-之外的结构：(2)本发明99mTc的放射性标记配合物的上述制备方法，均为现有技术已知方法。根据本发明的制备方法，在步骤(1)的标记方法中，利用已知的加入或不加SnCl2的标记法，其中反应温度根据具体反应原料和是否需要加入SnCl2会有所差异，例如15-100℃，如需加热则一般采用水浴或者空气浴加热，反应时间通常为几十分钟至几小时，优选20-60min。配体L1的前体可以用去离子水溶解，而协同配体L2、L3可以根据性质选择相应的缓冲溶液溶解，例如TPPTS、Tricine可选择琥珀酸缓冲液。所述的99mTc源一般是其盐，例如Na99mTcO4。根据本发明的制备方法，通常在步骤(1)的标记结束后，例如用已知的Radio-HPLC法，Sep-Pak反相色谱柱、SephadexG-25柱、YMC-PackODS-AC18分析柱等纯化后计算其标记率。根据本发明的制备方法，在步骤(2)的偶联反应中，所述原料SBZ-HYNIC为已知物质，结构为：所述另一原料可从市场购得，例如BioMatrik(嘉兴博美)公司的系列产品。本发明中R1为其他定义的步骤(2)的偶联剂可由原料SBZ-HYNIC制备获得，例如磺酸基的酯化反应，还可由与具有羧酸苯基的醛发生腙键反应。所述偶联反应在反应物的混合溶液中进行，溶剂可选自如二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAC)、二甲基亚砜(DMSO)等；反应pH值可调节到8-9之间，例如8.5；温度可以为15-50℃，优选接近室温，例如25℃；所述反应的时间可以为2-30小时，反应过程中，可用HPLC检测反应过程并收样。当使用高效液相色谱时，可以在0-5min内使用流动相为体积比为100:0的流动相A：流动相B；之后至35min左右使用流动相为体积比为20:80的流动相A:流动相B；流动相A可以为含0.05％三氟乙酸的去离子水，流动相B可以为含0.05％三氟乙酸的乙腈。本发明经研究发现，本发明99mTc的放射性标记配合物与Avidin具有特异性结合，而Avidin可以特异性的结合肿瘤细胞高表达的Lectin受体，因此，本发明的标记配合物可作为Lectin受体经Avidin预靶向后的核医学显像分子探针。因此，本发明还提供一种核医学分子探针，其为本发明如上定义的99mTc放射性标记配合物。本发明还提供一种药物组合物，所述组合物包含有效量的上述标记配合物。优选地，本发明的药物组合物是一种诊断药物，是一种放射性诊断显像剂。所述放射性诊断显像剂可与Avidin联合使用，在给予受试者Avidin之后，将其直接施用于个体，通过核医学成像设备检测给受试者施用的该配合物所发射的伽马(γ)射线，获得显像图像来诊断。优选地，本发明的药物组合物是一种可注射制剂，其包含上述标记配合物和可注射的载体。优选所述显像剂是指作为SPECT的显像剂。根据本发明，所述药物组合物可包含所述99mTc的放射性标记配合物的一种、两种或更多种。本发明还提供一种药物系统，所述系统包含有效量的99mTc的放射性标记配合物和Avidin。优选地，所述药物系统是一种试剂盒，本发明的标记配合物和Avidin分装在所述试剂盒内。此外，本发明还提供一种便捷制备上述99mTc标记配合物的药盒，所述药盒含有配体前体L1，配体L2和/或L3的混合物的冻干制剂。优选地，所述药盒可以通过将含有配体前体L1，配体L2和/或L3的缓冲溶液冻干至西林瓶中制备获得。在每次进行本发明的标记配合物制备时，只需取出制备好的药盒，加入相应放射性活度的99mTc源，例如Na99mTcO4，在80-120℃，优选100℃水浴，加热10-60分钟，优选20-30分钟，即可制得本发明的标记配合物。更优选地，称取上述式L1的配体前体15-25μg，例如20μg；称取N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)7.5-12.5mg，例如10mg；称取三苯基膦三间磺酸钠盐(TPPTS)3.75-6.25mg，例如5mg；称取琥珀酸一定量；吸取水一定量；将以上物质置于西林瓶中并使用氢氧化钠调节pH值至5.5，过滤后冻干得到药盒。本发明还提供所述的标记配合物在制备药物中的用途。根据本发明，所述药物作为显像剂用于诊断血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤，例如在血液、肝、肠、肾、胃、脾、肺、肌肉、骨头等部位的恶性肿瘤。优选那些凝集素Lectin受体高表达的癌症，优选胃肠道癌症，例如结直肠癌，以及由其引发的肝转移。本发明还提供一种诊断血液系统和实体恶性肿瘤，特别是结直肠癌的方法，将有效量的本发明所述的标记配合物施用于有此需求的个体。根据本发明，所述个体可以为哺乳动物，如人类。有益效果本发明经研究发现，本发明的标记配合物与配体亲和素Avidin发生高效的特异性结合，而Avidin可以和肿瘤中高表达的凝集素Lectin特异性结合，且亲和力高于多肽与受体之间的亲和力，略逊于抗原-抗体之间，因此我们利用Avidin将本发明的标记配合物富集在肿瘤部位。另外，我们也证实了所述的标记配合物可作为显像剂用于肿瘤的SPECT成像，通过成像验证了所述标记配合物可以特异性的浓聚在肿瘤部位，具有很强的原位肿瘤成像能力，并体内性质优越。更令人惊讶的是，本发明的标记配合物在生物体内的分布具有非常高的肿瘤/非肿瘤比值。结直肠癌原发部位主要集中在腹腔内，而本发明的99mTc标记配合物作为分子探针，因分子量小，避免了现有技术中显像腹腔本底高的不足。另外，本发明的99mTc标记配合物不但在常用的结直肠癌腹腔播散模型中，肿瘤部位摄取率高，肾脏部位摄取率明显降低，具有优异的肿瘤/肾脏比，而且在诱发结直肠癌模型和肝转移模型中的肿瘤成像，也同样具有很好的肿瘤/肾脏比，这对于结直肠癌的诊断具有重大意义。因此，本发明的标记配合物、预靶向系统包括但不限于以下优点：(1)本发明的标记配合物与Avidin结合迅速，在室温下混合30min便可以互相结合；(2)本发明的预靶向系统与肿瘤细胞结合力强，例如与结直肠癌细胞的结合率为48.23±3.16％；(3)本发明的预靶向系统特异性强，本发明预靶向系统对正常组织器官无明显摄取，但在肿瘤部位具有高摄取率；(4)本发明的预靶向系统体内性质优越，在体内分布具有优异的肿瘤/非肿瘤比值，尤其是肿瘤/肾脏比。术语定义和说明除非另有定义，否则本文所有科技术语具有的涵义与权利要求主题所属领域技术人员通常理解的涵义相同。除非另有说明，本文全文引用的所有专利、专利申请、公开材料通过引用方式整体并入本文。如果本文对术语有多个定义，以本章的定义为准。本文所记载的数值范围，当该数值范围被定义为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“0～10的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数。当该数值范围被定义为“数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点、该范围内的每一个整数以及该范围内的每一个小数。例如，“0～10的数”应当理解为不仅记载了0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的每一个整数，还至少记载了其中每一个整数分别与0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的和。术语“任选/任意”或“任选地/任意地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。术语“C1-6烷基”应理解为优选表示具有1～6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基，表示具有1、2、3、4、5、6个碳原子的直连或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。术语“C1-6烷氧基”中的烷基具有与上述“C1-6烷基”相同的含义。术语“卤素”是指F、Cl、Br、I。术语“磺酸基、羧酸基”应理解为表示如下结构的一价基团-SO3H、-COOH结构。它们的酯基是指羧酸基、磺酸基形成的烷基酯，酰亚胺基酯，烷基如上述“C1-6烷基”的定义。术语“酰亚胺”应理解为通式为R-C(O)-N(R)-C(O)-R的结构，例如邻苯二甲酰亚胺、琥珀酰亚胺、N-溴代琥珀酰亚胺、戊二酰亚胺、马来酰亚胺等。术语“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。本发明L1配体含有不对称或手性中心，因此，存在不同的立体异构形式。L1所有立体结构和混合物一样，包括外消旋混合物，作为目前申请的一部分。术语“药学上可接受的盐”是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其它方面上没有不良作用的盐。本申请配体前体L1还包括药学上可以接受的磺酸盐或羧酸盐，例如钠盐、钾盐、钙盐等。药学上可接受的盐是指把母体化合物中的磺酸基或羧酸基转换成盐的形式。本申请药学上可接受的盐可以由母体化合物合成，即母体化合物中的磺酸基或羧酸基与1-4当量的碱在一个溶剂系统中反应。合适的盐列举在Remingtong’sPharmaceuticalScicences,17thed.,MackPublishingCompany,Easton,Pa.,1985,p.1418和JournalofPharmaceuticalScience,66,2(1977)中，例如钠盐。附图说明图1：实施例1中HYNIC-PEG3-B的质谱分析图；图2：实施例1中99mTc-HYNIC-PEG3-B的Radio-HPLC分析图；图3：实施例2的99mTc-HYNIC-PEG3-B/Avidin混合液与单独99mTc-HYNIC-PEG3-B在相同PD-10脱盐柱中的淋洗曲线；图4:实施例3的图4a为FITC-Avidin、FITC-neutrAvidin与LS180-Luci细胞的流式细胞结果图；图4b为定量图，***P<0.001；图5：实施例4的99mTc-HYNIC-PEG3-B在LS180腹腔肿瘤模型中的生物分布数据图(n＝4)。图6：实施例4的99mTc-HYNIC-PEG3-B在不同时间点肿瘤/肾脏比值(n＝4)的定量分析图。图7：实施例5的AOM/DSS诱发结直肠癌动物模型建立时间线；图8：实施例5的AOM/DSS诱发模型鼠与同批正常对照鼠的结直肠白光照片；图9：实施例5的AOM/DSS诱发模型鼠(a)与同批正常对照鼠(b)的肠道组织H&E染色图；图10：实施例5的99mTc-HYNIC-PEG3-B在正常老鼠(normalmice)与AOM/DSS诱发结直肠癌模型鼠(inducedmodel)中的SPECT/CT成像图(白色箭头所指为肿瘤)；图11：实施例5的诱发模型鼠解剖白光照片(a，b)、肠道组织的SPECT/CT成像图(c)与两处结直肠肿瘤的H&E染色图(d，e)(白色箭头所指处为肿瘤)的对比图；图12：实施例6的99mTc-HYNIC-PEG3-B在LS180-Luci结直肠癌肝转移模型中的SPECT/CT图(a)及生物自发光(BLI)显像图(b)(白色箭头所指处为肿瘤)；具体实施方式下文将结合具体实施例对本发明的标记物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。实施例1式III的标记物(简写为99mTc-HYNIC-PEG3-B)的制备HYNIC-PEG3-B的合成HPLC方法：应用安捷伦1260InfinityHPLC设备配制YMC-PackODS-AC18分析柱(250×4.6mml.D.S-5μm，12nm)/半制备柱(250×10mml.D.S-5μm，12nm)，梯度淋洗时间为42min，流速为1mL/min(分析)或4mL/min(收样)，流动A相为去离子水(含0.05％TFA)，流动B相为乙腈(含0.05％TFA)。淋洗梯度为：0min时100％A和0％B，5min时100％A和0％B，35min时20％A和80％B，42min时100％A和0％B。HYNIC-PEG3-B通过NH2-PEG3-B(结构见以下合成路线)的氨基与SBZ-HYNIC的羟基琥珀酰亚胺活化酯偶联得到，合成路线如下所示。准确称取4mgNH2-PEG3-B(9.5μmoL，溶于200μLDMF)置于1.5mLEP管中；准确称取SBZ-HYNIC1.8mg(4.3μmoL，溶于300μLDMF)置于EP管中；混合NH2-PEG3-B溶液与SBZ-HYNIC溶液，加入微量DIEA(约1.5μL)将反应溶液pH值调制8.5至9。室温震荡反应2h。应用HPLC检测反应过程，所用梯度见上述HPLC方法。经HPLC分析可知，在该梯度下，NH2-PEG3-B的保留时间为6.25min，SBZ-HYNIC的保留时间为10.25min。在反应进行2小时后，HPLC检测反应发现13.90min处出现新的紫外吸收峰，并随着反应时间的延长逐渐增高，而原料峰逐渐减小。反应24小时后，原料紫外吸收峰完全消失，使用相同HPLC方法进行收样，收取紫外吸收峰位于13.90min处的物质，放入冻干机冻干，得到白色粉末状物质。经基质辅助激光解离吸收电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定，13.90min处为产物HYNIC-PEG3-B：m/z＝722.34([M+H]+)，C31H43N7O9S2理论分子量为721.84。附图1为产物的质谱分析图。99mTc-HYNIC-PEG3-B的制备利用TPPTS和Tricine一步法对HYNIC-PEG3-B进行99mTc的标记。详细步骤如下：精确称取20μgHYNIC-PEG3-B(1μg/μL溶于去离子水中)、5mgTPPTS(100μg/μL溶于25mM琥珀酸缓冲液中，pH＝5.5)和10mgTricine(100μg/μL溶于25mM琥珀酸缓冲液中，pH＝5.5)加入至1.5mLEP管中。向混合液中加入150μLNa99mTcO4(约1100MBq)。置于空气浴中加热至100℃，反应20min后静置待其冷却至室温。标记结束后，应用Radio-HPLC检测标记率>98％，无需纯化便可用于细胞或动物实验，Radio-HPLC方法与HYNIC-PEG3-B合成HPLC分析方法相同。附图2为所述标记物的Radio-HPLC分析图。Radio-HPLC标记率检测结束后，利用无菌生理盐水将99mTc-HYNIC-PEG3-B稀释至合适浓度以进行相应实验。体内动物实验利用0.22μm滤膜对标记物进行过滤除菌后，再根据实验要求稀释成相应放射性浓度的注射液，注射入动物体内进行实验。实施例299mTc-HYNIC-PEG3-B与Avidin体外结合活性的测定取200μgAvidin，溶于100μLPBS(pH＝7.4),加入37MBq99mTc-HYNIC-PEG3-B，混匀，室温放置0.5h。通过PD-10脱盐柱对99mTc-HYNIC-PEG3-B/Avidin混合液进行分离分析，具体描述如下。首先，应用PBS溶液对PD-10脱盐柱进行5-10遍清洗，清除柱内残存的防腐液。清洗结束后，将柱内剩余PBS排出，随后将混合液加入柱中并待其没入柱内后，取PBS对PD-10脱盐柱进行分批多次淋洗(每次200μL，共18次，3.6mL)，并将淋洗液分别置于1.5mLEP管中(200μL/管)，最后将每个EP管分别置于放射性检测井中测量放射性活度并记录。待99mTc-HYNIC-PEG3-B/Avidin混合液淋洗结束后，用10mLPBS将PD-10脱盐柱清洗干净，随后在该PD-10脱盐柱中应用相同方法对单独的99mTc-HYNIC-PEG3-B进行淋洗。本实验中所得数据应用软件Prism5.0分别进行淋洗曲线的描绘。附图3为淋洗曲线。我们将Avidin与99mTc-HYNIC-PEG3-B在室温混合30min后，利用PD-10脱盐柱对该混合液及单独的99mTc-HYNIC-PEG3-B进行分别淋洗，计算各自的淋洗曲线。根据PD-10脱盐柱原理可知，分子量大的物质会被最先淋洗出来，所需使用的淋洗液体积较小，分子量较小的物质会被后淋洗出来，则所需淋洗体积较大。结果如附图3所示，99mTc-HYNIC-PEG3-B/Avidin混合液的淋洗体积区间为0.8mL-1.6mL，而单独的99mTc-HYNIC-PEG3-B溶液在相同PD-10脱盐柱的淋洗区间为1.4mL-3.0mL，由此可见，Avidin与99mTc-HYNIC-PEG3-B在室温下混合30min便可以互相结合，导致所需淋洗体积明显大于单独的99mTc-HYNIC-PEG3-B。该实验证明了由本发明L1所述的配体得到的放射性核素99mTc的标记物有与Avidin特异性结合的能力，可以用于后续的动物实验。实施例3流式细胞术细胞培养LS180-Luci结直肠癌细胞培养于含有10％胎牛血清(胎牛血清在使用前于56℃水浴锅中进行30分钟灭活)的DMEM(高糖)培养基中。细胞在培养过程中置于湿度饱和，温度为37℃，同时维持5％CO2浓度的恒温细胞培养箱中。细胞培养2到3天进行一次传代，细胞传代需要在无菌操作台中进行操作。传代时首先弃掉培养瓶中旧培养基，用无菌PBS对细胞冲洗一遍，之后加入适量含有EDTA的0.25％的胰蛋白酶对细胞进行消化，放置2分钟后，弃除胰蛋白酶溶液。向培养瓶中加入新的培养基后用无菌滴管将细胞从培养瓶内壁上吹打下来，并在培养基中吹打均匀。将细胞加入新的培养瓶，并在适宜条件下进行培养。FITC-Avidin/FITC-neutrAvidin的合成准确称取Avidin2mg(3μmol，溶于200μLpH＝8.5的Na2HPO4)置于1.5mLEP管中；准确称取1mgNHS-FITC溶于50μLDMSO中；将二者均匀混合，4℃，反应8h后，经PD-10脱盐柱进行纯化。PD-10脱盐柱纯化步骤为：将PD-10柱用PBS冲洗5-10遍，直至柱中不存在PBS后，加入1mL待纯化的样品FITC-Avidin，至样品全部流入柱内后，加入1.5mLPBS，应用EP管在柱子下方接收纯化后的样品。将纯化后的样品FITC-Avidin进行紫外分光光度计测定。分别测定样品在280nm和490nm处的吸收值，经计算后，1个Avidin分子上大概链接有5个FITC分子，浓度约为1mg/mL。FITC-neutrAvidin的制备过程同上。流式细胞分析将1×107LS180-Luci结直肠癌细胞接种于培养皿中，DMEM(高糖)培养基孵育过夜至细胞贴壁。待细胞贴壁后，弃去培养基，冰PBS清洗3次。neutrAvidin为Avidin的一种变体，不具备与Lectin结合的能力，因此本实验选取neutrAvidin作为对照。实验共分为两组，FTIC-Avidin孵育组和FITC-neutrAvidin对照组。于贴壁有LS180-Luci细胞的培养皿中分别加入10mL(10μg/mL)FITC-Avidin或FITC-neutrAvidin孵育96h。随后弃去孵育液，冰PBS清洗3遍，应用含EDTA的0.05％胰酶将细胞消化并置于1.5mL离心管中，1000转/分钟离心，离心结束后利用冰PBS进行清洗，重复三次。冰PBS清洗结束后，各组分别加入1mLPBS重悬细胞，过筛移入流式管，使用流式细胞仪(BectonDickinson，Germany)进行分析。流式细胞术结果见附图4。如附图4b，在相同的孵育条件下，FITC-Avidin与LS180-Luci细胞的结合率为48.23±3.16％，而FITC-neutrAvidin与LS180-Luci细胞的结合率仅为1.47±0.56％，明显低于FITC-Avidin。NeutrAvidin为Avidin的变体物质，neutrAvidin与Avidin相比缺少糖化学结构，不具备有与Lectin结合的能力。因此，本实验利用FITC-neutrAvidin作为阴性对照，证明了FITC-Avidin可以通过特异性靶向Lectin受体与LS180-Luci肿瘤细胞进行结合。实施例4本发明的标记物99mTc-HYNIC-PEG3-B的生物分布实验动物模型建立LS180人结肠癌细胞购自ATCC(Manassas,VA)。LS180培养于含10％FBS的DMEM高糖细胞培养基。细胞在37℃，含5％CO2的培养箱中常规传代培养。4-5周龄雌性BALB/c裸鼠购自北京大学医学部实验动物部，每只于腹腔接种1×106个LS180肿瘤细胞用于生物分布和显像，所有动物实验操作均遵循北京大学医学部动物使用规定。肿瘤细胞接种7天后，肿瘤模型可以用于生物分布实验。生物分布实验荷LS180肿瘤裸鼠体重均在20-25g，将其随机分为四组，每组4只。每只裸鼠经腹腔注射200μg预靶向药物Avidin(溶于100μL生理盐水)。预靶向四小时后，四组小鼠经尾静脉注射222kBq(6μCi)的99mTc-HYNIC-PEG3-B以评价其在体内的生物分布特性。在注射后0.5h、1h、2h、4h后将动物处死，取血液及主要脏器，称重并测量放射性cpm计数，经衰变校正后计算每克组织的百分注射剂量(％ID/g)。生物分布结果表示为平均值±标准偏差(means±SD,n＝4)。实验结果见附图5以及附图6。本实验证明，经Avidin预靶向后，99mTc-HYNIC-PEG3-B在腹腔肿瘤中具有很高的肿瘤/非肿瘤比值，并且定量分析99mTc-HYNIC-PEG3-B在LS180结直肠癌腹腔播散肿瘤模型中的不同时间点肿瘤/肾脏比值(n＝4)分别为，0.5小时为(0.56±0.15)、1小时为(3.78±0.86)、2小时为(6.99±2.61)、4小时为(1.47±0.16)，可见具有非常高的肿瘤/肾脏比值。实施例5AOM/DSS诱发结直肠癌小鼠的SPECT/CTAOM/DSS诱发结直肠癌小鼠模型建立AOM/DSS诱发结直肠癌动物模型建立参考相关文献[1,2]建立时间线如附图7所示，过程简略描述如下：选取20只4-5周龄雄性Balb/c小白鼠，于0天腹腔注射10mg/kgAOM注射液,随后饲喂2.5％DSS饮水7天(0天-7天)，之后改为正常饮水14天(7天-21天)，至此为1个循环，重复此循环3次，至第80天，取部分老鼠处死、解剖并观察结直肠部位是否有肿瘤存在，拍照并取肿瘤组织，应用4％多聚甲醛固定，用于石蜡切片，进行H&E染色分析。同时，饲养同批10只4-5周龄雄性Balb/c小白鼠作为对照组。于0天，利用生理盐水代替AOM注射液进行腹腔注射，随后正常饮水，至80天，取部分老鼠处死、解剖并观察结直肠部位，拍照并取肠道组织，应用4％多聚甲醛固定，用于石蜡切片，进行H&E染色分析。AOM/DSS诱发结直肠癌模型是一种建立在炎症基础上的肿瘤模型，通过致癌剂(AOM)和至炎剂(DSS)模拟人类结直肠肿瘤发生发展的过程。腹腔注射AOM，可以促使老鼠肠道正常细胞发生DNA甲基化，极大程度上加大了细胞在增殖过程中发生DNA错误配对的几率，随后三个周期的2.5％DSS饮水饲喂，破坏老鼠结直肠肠粘膜表层细胞，加之肠道存在有大量菌群，导致形成结直肠炎，进一步促进肿瘤的发生与生长。在模型建立过程中，2.5％DSS饮水的饲喂可导致老鼠出现明显的脓血便，并且与同批饲养的正常老鼠相比，体重有所下降，证明2.5％DSS的饮水可导致老鼠结直肠炎的发生。在80天模型建立结束后，我们选取了部分模型鼠及对照组老鼠进行处死、解剖，观察结直肠部位情况。如附图8所示，模型鼠与同批正常老鼠相比，直肠肠道长度明显缩短，并且可见突出肠腔的息肉状肿物形成。随后，我们将息肉状肿物和同批正常老鼠相应位置的肠组织取出，置于4％多聚甲醛中固定，进行石蜡切片，通过H&E染色进行组织分析。如附图9所示，对照组老鼠肠道组织镜下可见腺上皮细胞大小、形态正常，未见异型细胞，未见肿瘤形成。而在模型鼠肠道组织中发现，正常腺体结构消失，细胞大小、形态不一，细胞极向消失，并且出现大量炎症细胞浸润，明显可见肿瘤组织。AOM/DSS诱发结直肠癌小鼠SPECT/CT成像AOM/DSS诱发结直肠癌模型SPECT/CT成像过程流程如下：第一日，进行无Avidin预靶向成像。取诱发模型鼠，于尾静脉注射37MBq99mTc-HYNIC-PEG3-B，2h后，进行SPECT/CT核医学成像。第二日，进行Avidin预靶向成像。取第一日同只诱发模型鼠以及同批饲养的正常老鼠，分别腹腔注射200μgAvidin进行预靶向，4h后，尾静脉注射37MBq99mTc-HYNIC-PEG3-B，2h后进行SPECT/CT核医学成像。活体成像结束后，将老鼠处死，解剖并拍照，将全部肠道组织取出，并利用生理盐水将肠内容物清洗干净，随后进行肠道SPECT/CT核医学成像。成像结束后，将肿瘤组织取出，置于4％多聚甲醛溶液中固定，用于石蜡切片，H&E染色分析。我们建立了AOM/DSS诱发结直肠癌肿瘤模型，探究Avidin/99mTc-HYNIC-PEG3-B预靶向系统对结直肠原发肿瘤的成像检测能力。结果如附图10所示，第一日，无Avidin预靶向的SPECT/CT成像实验结果表明(附图10c)，99mTc-HYNIC-PEG3-B经尾静脉注入诱发模型鼠体内后，仅在膀胱处检测到明显的放射性信号，腹腔及其他正常组织器官无放射性信号。第二日，同一只诱发模型鼠经过Avidin预靶向后进行成像实验(附图10b)，与第一日所得结果相比，除膀胱外，腹腔中下部出现了两处明显的放射性信号浓聚。成像后，解剖该只模型鼠，见直肠处存有两处明显隆起部分(附图11-a，b)。将全部肠道取出，并利用PBS将肠道内容清除，随后进行肠道SPECT/CT离体成像，可见隆起部分放射性凝聚明显，正常肠道组织无放射性信号(附图11-c)。最后，将隆起的肠组织取出，置于4％福尔马林溶液固定，进行石蜡切片、H&E染色，确定两处均为肿瘤组织(附图11-d，e)。随后，为了进一步验证Avidin/99mTc-HYNIC-PEG3-B对肿瘤成像的特异性，我们在同批饲养的正常老鼠体内进行了Avidin预靶向的SPECT/CT成像实验，结果如附图10-a。99mTc-HYNIC-PEG3-B在正常小鼠的肠道组织及组织器官无明显摄取，只存在于膀胱中。本实验结果说明：经过Avidin对诱发模型鼠进行预靶向后，99mTc-HYNIC-PEG3-B可以特异性的浓聚在结直肠处的肿瘤部位，具有很强的原位肿瘤成像能力，并体内性质优越，具有较高的肿瘤/非肿瘤比值。实施例6LS180-Luci结直肠癌肝转移的SPECT/CT及生物自发光显像LS180-Luci结直肠癌肝转移模型建立LS180-Luci结直肠癌肝转移模型建立采取脾被膜注射-脾保留法，详细方法参照相关文献[3]。过程简略描述如下：取4-5周龄BALB/c(nu/nu)裸鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠75mg/kg进行麻醉，麻醉后取上腹右侧切口入腹，进腹后沿胃大弯侧暴露脾脏，眼科无齿镊辅助医用棉棒将脾脏拉出至切口外，29G胰岛素注射针从近脾下级处贴脾被膜进针约5mm，缓慢注射0.05mL(5×106)LS180-Luci结直肠癌肿瘤细胞悬液至脾被膜下，可见注射处脾脏颜色变浅且肿胀，注射后用75％酒精浸润的医用棉棒压迫注射点2min，止血并杀灭溢出的肿瘤细胞，确认无出血后，将脾脏还纳入腹腔，酒精棉棒消毒切口周围皮肤并关腹，将模型鼠置于SPF级环境饲养。模型建立2周后，腹腔注射100μLLuciferin(3mg/100μL)，10min后，应用小动物IVIS光学成像系统进行生物自发光成像，确定肝脏部位肿瘤转移情况。LS180-Luci结直肠癌肝转移模型的SPECT/CT和生物自发光成像(BLI)我们通过脾被膜注射-脾保留方法建立了LS180-Luci结直肠癌肝转移模型，并应用IVIS小动物光学系统进行生物自发光(BLI)成像确定肿瘤生长情况，待肿瘤到达合适大小，进行Avidin/99mTc-HYNIC-PEG3-BSPECT/CT实验。如结果附图12所示，老鼠全身除膀胱处放射性浓聚较多外，左侧肝脏部位也可见明显的放射性信号聚集，随后BLI实验证实，于裸鼠肝脏左叶下缘存在有明显的结直肠癌转移灶，与SPECT/CT所得结果相对应。本实验证实，Avidin在注射入体内4h后，可明显滞留于肝部的转移肿瘤病灶处，并特异性摄取99mTc-HYNIC-PEG3-B对该转移病灶进行清晰地SPECT/CT成像，同时具有很高的肿瘤/非肿瘤比值，以上结果证明Avidin/99mTc-HYNIC-PEG3-B系统能够用于结直肠癌肝转移病灶的诊断。表1附图10的中间成像与附图12中肿瘤、肾脏探针摄取程度(％ID)及肿瘤/肾脏比值诱发肿瘤模型(n＝4)肝转移肿瘤模型(n＝4)肿瘤摄取(％ID)4.41±0.505.73±1.17肾脏摄取(％ID)1.99±0.692.21±0.63肿瘤/肾脏2.43±0.922.91±1.44实施例799mTc-HYNIC-PEG3-B的药盒化步骤1准确称取实施例1制备得到的HYNIC-PEG3-B20μg。步骤2准确称取N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)10mg。步骤3准确称取三苯基膦三间磺酸钠盐(TPPTS)5mg。步骤4准确称取琥珀酸29.55mg。步骤5准确吸取水1mL。步骤6准确称取氢氧化钠17mg。步骤7将以上物质置于10mL西林瓶中，震荡溶解、过滤后置于冷冻干燥机中冻干，得到产品药盒。步骤899mTc-HYNIC-PEG3-B制备过程：(1)取制备好的药盒1支；(2)用注射器吸取1mL10–30mCi的Na99mTcO4注射入药盒中，震荡混匀；(3)将药盒置于水浴中100℃加热20-30min。(4)待反应结束后将药盒取出，置于室温冷却，随后取样利用Radio-HPLC分析，分析步骤、方法与实施例1的手动标记一致，与HYNIC-PEG3-B合成HPLC分析方法相同。制备成药盒后标记率与实施例1结果相同。参考文献：[1]TanakaT,KohnoH,SuzukiRetal.Anovelinflammation-relatedmousecoloncarcinogenesismodelinducedbyazoxymethaneanddextransodiumsμLfate.CancerSci.2003,94(11):965-973[2]NeufertC,BeckerCandNeurathMF.Aninduciblemousemodelofcoloncarcinogenesisfortheanalysisofsporadicandinflammation-driventumorprogression.NatProtoc.2007,2(8):1998-2004[3]PriceJE.Spontaneousandexperimentalmetastasismodels:nudemice.MethodsMolBiol.2014,1070:223-233以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3