负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及靶向载体，具体涉及一种负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体及其制备方法和应用。

背景技术：

茶叶中含有大量的多元酚类化合物，这些化合物统称为茶多酚(tea polyphenol，TP)，约占茶叶干重的18-36％。通过对茶多酚的化学成分研究表明，茶多酚的主要成分是儿茶素类化合物，约占茶多酚总量的70％～80％，主要含有儿茶素(C)、表儿茶素(EC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子酸儿茶素(EGC)及表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)等多种活性物质，其中以EGCG含量最高，约占儿茶素总量的50％～60％。目前大量的研究表明EGCG具有抗癌、抗突变、预防和治疗心脑血管系统疾病以及调理内分泌、免疫系统等生物活性，同时对机体内生物代谢酶也具有抑制活性，由此将对机体的肝解毒功能及药物的联合应用产生重要影响。

抗氧化作用一直是茶多酚类物质所具有的重要功能，并作为食品添加剂在广泛使用。除此之外，茶多酚中的主要成分还可以消除体内自由基、延缓机体衰老。近年来，随着人们日益增长的对天然抗氧化剂的需求和信赖，绿茶中的茶多酚因具有极强的自由基清除能力和抗氧化活性，在食品、化妆品等工业中得到了广泛的应用，是一种不可多得的天然抗氧化剂。但由于茶多酚易溶于水，妨碍了它在脂溶性体系中充分发挥效用，因此需对茶多酚中的儿茶素分子进行结构修饰，使其水溶性改性成脂溶性。目前已有研究把茶多酚中的主要儿茶素EGCG作为模型分子，通过与棕榈酰氯的酯化来制备脂溶性的EGCG棕榈酸酯。绿茶多酚作为天然的自由基清除剂及抗氧化剂在天然药物研究与开发上有着很好的应用前景。但由于绿茶多酚易溶于水，妨碍了它在脂质体系中充分发挥效用，因此需要对茶多酚中的儿茶素分子进行结构修饰，在分子中导入长碳链基团使其水溶性改性成脂溶性，以增强在脂质体系中的功效。

金属有机骨架(Metal-organic Frameworks,MOFs)又称多孔配位聚合物，具有比较好的稳定性，较高的比表面积，是近年来研究比较为广泛的多孔材料。金属有机骨架材料一般由特定的金属离子或金属簇与相应的有机配体通过强的配位键连接而成并具有一定的周期性网络结构。金属有机骨架同时包含无机金属和有机分子，因而具备无机材料和有机材料的双重特点。

ZIF系列金属有机骨架材料是由金属和有机配体咪唑及其衍生物生成的具有拓扑结构的固体多孔材料。ZIF-8是由六水硝酸锌和2-甲基咪唑在室温下醇溶液或者水溶液中，快速生成的具有高纯度的晶体。其高温下具有比较好的稳定性，晶体尺寸均一，具有较大的比表面积。此外合成ZIF-8晶体过程中，可加入表面活性剂进行调控，进而得到不同形态、不同尺寸的晶体。目前ZIF-8受到了国内外学者广泛的关注，己有大量的实验和研究正在开发其应用。第一，ZIF-8直径10～500nm，能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞，因结构稳定，能够通过人体代谢排除，故无细胞毒性；第二，ZIF-8具有巨大的比表面积(>600m²·g^-1)和孔体积(>1cm³·g^-1)，从而具有较大载药量，特殊的孔道结构又使其具有药物缓释功能；第三，近年来药物载体的表面修饰及功能化取得了突破性进展，利用功能化的高分子、蛋白质等作为“守门员(Gatekeepers)”来实现药物的控制释放。

叶酸作为用于递送药物的靶向配体已被广泛研究，其可被癌细胞表面上过表达的叶酸受体选择性识别并刺激受体介导的胞吞作用，从而增加肿瘤对药物的摄取，同时减少全身性毒性。因此，叶酸-聚乙二醇被认为是改善药物递送系统以实现满意的肿瘤靶向治疗的有前景的稳定剂之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体，提高了单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的抗氧化效果，既解决了单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯利用率低的问题，又减少了治疗癌症的毒副作用，并且使药物的治疗具有靶向性。

本发明所提供的技术方案为：

一种负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体，包括沸石咪唑类骨架、包埋于沸石咪唑类骨架中的单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯，以及通过酰胺键修饰在沸石咪唑类骨架上的叶酸-聚乙二醇。

本发明中通过原位包埋法将单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯(PEGCG)封装在沸石咪唑类骨架内，再通过叶酸-聚乙二醇上的羟基与单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架上的氨基形成酰胺键，将叶酸-聚乙二醇修饰在沸石咪唑类骨架的表面。表没食子儿茶素没食子酸酯为茶多酚中的有效成分，通过与棕榈酰氯的酯化来制备脂溶性的PEGCG，它具有强氧化性质能降低细胞中的活性氧水平。沸石咪唑类骨架对于单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯具有保护作用，能够减缓单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯在空气中的氧化速度，从而延长了保持单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯高纯度的时间；其次，叶酸分子修饰在沸石咪唑骨架载体的表面，从而使其具有针对癌细胞的靶向性，能够使其到达肿瘤细胞部位，释放单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯来降低癌细胞的活性氧水平，既能靶向针对癌细胞，又能保护正常细胞的生长。

本发明还提供一种如上述的负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体的制备方法，包括如下步骤：

1)通过原位包埋法将单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯(PEGCG)封装在沸石咪唑类骨架(ZIF-8)中，得到单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体PEGCG@ZIF-8；

2)单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体(PEGCG@ZIF-8)与叶酸-聚乙二醇(FA-PEG)通过酰胺化反应，得到负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体(FA-PEG/PEGCG@ZIF-8)。

本发明的制备方法合成方法简单，该载体中单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的负载量高达20％，提高了药物的利用率和药效。

作为优选，所述步骤1)中原位包埋法包括：

硝酸锌与单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯反应形成配位化合物；

配位化合物与2-甲基咪唑反应得到单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体。

作为优选，所述步骤1)中原位包埋法包括：

硝酸锌与单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯分别配制成甲醇溶液，室温下混合后得到配位化合物体系；进一步优选，所述混合是指搅拌1-5min；所述单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯、六水硝酸锌和无水甲醇的质量比为1：4-6：140-160；

配位化合物体系中加入2-甲基咪唑的甲醇溶液室温下混合，离心清洗干燥后，得到单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体。进一步优选，所述混合是指搅拌15-20min；所述2-甲基咪唑与无水甲醇的投料比为2-5g:10ml。

作为优选，所述步骤1)中单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯、硝酸锌与2-甲基咪唑的质量比为1:5-20:50-200。

作为优选，所述步骤2)中酰胺化反应包括：

将叶酸-聚乙二醇溶解于水中，加入单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体室温下搅拌，离心清洗干燥后，得到负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体。进一步优选，叶酸-聚乙二醇与去离子水的投料比为8-10g:5ml。

作为优选，所述搅拌时间为36-60h。

作为优选，所述叶酸-聚乙二醇与单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯-沸石咪唑类骨架载体的质量比为2:2-3。进一步优选为1:1。

本发明还提供一种如上述的负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体在制备抑制肿瘤细胞增殖药物中的应用。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)本发明中沸石咪唑类骨架对于单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯具有保护作用，能够减缓单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯在空气中的氧化速度，从而延长了保持单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯高纯度的时间，为提高单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的抗氧化效果，建立茶多酚的靶向输送系统及减少器官毒性打下坚实的基础。

(2)本发明中沸石咪唑类骨架直径为10-500nm，能够通过细胞膜的内吞作用进入细胞，且其结构稳定，能够通过人体代谢排除，故无细胞毒性；ZIF-8具有巨大的比表面积和孔体积，从而具有较大载药量，特殊的孔道结构又使其具有药物缓释功能。

(3)本发明中采用叶酸分子修饰在沸石咪唑骨架载体的表面，从而使其具有针对癌细胞的靶向性，能够使其到达肿瘤细胞部位，释放单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯来降低癌细胞的活性氧水平，既能靶向针对癌细胞，又能保护正常细胞的生长，此外还成功保留了单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯对癌细胞的抗氧化作用，对癌细胞具有很好的抑制作用和疗效。

附图说明

图1为实施例1中制备的PEGCG的紫外光谱图；

图2为ZIF-8的紫外光谱图；

图3为FA-PEG的紫外光谱图；

图4为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的紫外光谱图；

图5为实施例1中制备的PEGCG的红外图谱谱图；

图6为ZIF-8的红外图谱谱图；

图7为FA-PEG的红外图谱谱图；

图8为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的红外图谱谱图；

图9为ZIF-8的透射电镜图；

图10为实施例2中制备的PEGCG@ZIF-8的透射电镜图；

图11为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的透射电镜图；

图12为ZIF-8的XRD图；

图13为实施例2中制备的PEGCG@ZIF-8的XRD图；

图14为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的XRD图；

图15为ZIF-8的细胞毒性结果图；

图16为实施例1中制备的PEGCG的细胞毒性结果图；

图17为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的细胞毒性结果图；

图18为PEGCG的活性氧效果图；

图19为FA-PEG/PEGCG@ZIF-8作用HeLa细胞后的活性氧效果图；

图20为PEGCG@ZIF-8作用HeLa细胞后的自噬流荧光图；

图21为FA-PEG/PEGCG@ZIF-8作用HeLa细胞后的自噬流荧光图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：制备PEGCG

(1)将10mmol EGCG(4.58g)加入到100ml丙酮中，并在40℃的水浴中加热。

(2)完全溶解后，将2.46g碳酸钠加入到溶液中。

(3)在搅拌下向溶液中滴加20mmol的棕榈酰氯，混合物在水浴条件下的塞好的烧瓶中进行。

(4)反应6小时后，过滤反应混合物并用100ml去离子水洗涤，加入100ml乙酸乙酯萃取混合物。

(5)用去离子水洗涤有机相2次。之后，上层有机相用无水硫酸钠干燥并减压浓缩，得到黄色粉状产物PEGCG。

所得的PEGCG的结构式如下所示：

实施例2：制备FA-PEG/PEGCG@ZIF-8

(1)将40mg单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯溶于4ml甲醇，与0.25g/mL六水硝酸锌甲醇溶液0.8mL溶液混合，室温下搅拌5min，利用硝酸锌的锌离子和单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯形成配位键；

(2)加入10ml 2-甲基咪唑的甲醇(0.2g/mL)，室温下继续搅拌15min，2-甲基咪唑与配位化合物的锌离子形成ZIF-8；

(3)在11000rmp的转速下离心20min，再分别用无水乙醇和去离子的混合溶液洗涤三遍洗去未反应的试剂，真空干燥，即得到PEGCG@ZIF-8载体；

(4)将50mg叶酸-聚乙二醇溶入5ml去离子水；

(5)加入50mg PEGCG@ZIF-8载体，超声震荡均匀，室温下搅拌36h；

(6)离心洗涤除去未反应的叶酸-聚乙二醇，并真空干燥，即得到FA-PEG/PEGCG@ZIF-8载体，该载体中单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的负载量高达20％。

实施例3：制备FA-PEG/PEGCG@ZIF-8

(1)将10mg单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯溶于4ml甲醇，与0.25g/mL六水硝酸锌甲醇溶液0.8mL溶液混合，室温下搅拌5min，利用硝酸锌的锌离子和单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯形成配位键；

(2)加入10ml 2-甲基咪唑的甲醇(0.2g/mL)，室温下继续搅拌15min，2-甲基咪唑与配位化合物的锌离子形成ZIF-8；

(3)在11000rmp的转速下离心20min，再分别用无水乙醇和去离子的混合溶液洗涤三遍洗去未反应的试剂，真空干燥，即得到PEGCG@ZIF-8载体；

(4)将50mg叶酸-聚乙二醇溶入5ml去离子水；

(5)加入50mg PEGCG@ZIF-8载体，超声震荡均匀，室温下搅拌36h；

(6)离心洗涤除去未反应的叶酸-聚乙二醇，并真空干燥，即得到FA-PEG/PEGCG@ZIF-8载体，该载体中单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的负载量高达20％。

实施例4：制备FA-PEG/PEGCG@ZIF-8

(1)将40mg单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯溶于4ml甲醇，与0.25g/mL六水硝酸锌甲醇0.8mL溶液混合，室温下搅拌5min，利用硝酸锌的锌离子和单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯形成配位键；

(2)加入10ml 2-甲基咪唑的甲醇溶液(0.4g/mL)，室温下继续搅拌15min，2-甲基咪唑与配位化合物的锌离子形成ZIF-8；

(3)在11000rmp的转速下离心20min，再分别用无水乙醇和去离子的混合溶液洗涤三遍洗去未反应的试剂，真空干燥，即得到PEGCG@ZIF-8载体；

(4)将50mg叶酸-聚乙二醇溶入5ml去离子水；

(5)加入50mg PEGCG@ZIF-8载体，超声震荡均匀，室温下搅拌36h；

(6)离心洗涤除去未反应的叶酸-聚乙二醇，并真空干燥，即得到FA-PEG/PEGCG@ZIF-8载体，该载体中单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的负载量高达20％。

表征试验1：紫外光谱检测

将干燥后的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8(实施例2中制备)、FA-PEG、PEGCG(实施例1中制备)和ZIF-8溶解于PBS缓冲溶液中，测试其上清液的紫外光谱。

紫外图谱(UV/vis)分别如附图1～4所示，图1为PEGCG的紫外光谱图，图2为ZIF-8的紫外光谱图，图3为FA-PEG的紫外光谱图，图4为实施例2中制备的FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的紫外光谱图。

单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯在273nm的特征吸收峰并没有出现在FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的紫外光谱图中，同时FA-PEG的两个特征吸收峰出现在了FA-PEG/PEGCG@ZIF-8紫外光谱图中。这说明，在FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的结构中，叶酸接在了ZIF-8的表面，而PEGCG被包埋在了ZIF-8内部。

表征试验2：红外光谱检测

(1)将FA-PEG，PEGCG(实施例1中制备)，ZIF-8，FA-PEG/PEGCG@ZIF-8(实施例2中制备)进行干燥处理，然后放入研钵中，加入适量并略多于待测药品质量的KBr，研磨均匀使混合物研磨到粒度小于2μm，以免散射光影响，之后放入干燥机中进行干燥处理，在油压机上用40MPa左右的压力将混合物压成透明薄片，上机测定；

(2)红外图谱(FTIR)分别如附图5～8所示，图5为PEGCG的红外图谱谱图，图6为ZIF-8的红外图谱谱图，图7为FA-PEG的红外图谱谱图，图8为FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的红外图谱谱图。

图6显示了ZIF-8中的特征基团-C＝C-在1570处的吸收峰和-N＝C-在1420处的吸收峰；图7在3570，1650，1600处有吸收峰代表有-COOH；图5上有特征吸收峰3300，代表苯酚类的吸收峰；合成后的图8，在3570处有吸收峰代表叶酸羧酸上的-H，载体上接上了叶酸-聚乙二醇；在1420处有吸收峰代表有ZIF-8的-N＝C-，且不存在图5中的特征吸收峰，是说明药物被包封在载体内部。

表征试验3：透射电镜检测

ZIF-8、PEGCG@ZIF-8(实施例2中制备)和FA-PEG/PEGCG@ZIF-8(实施例2中制备)的透射电镜图如附图9～11所示，图9为沸石咪唑类骨架(ZIF-8)，图10为负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的沸石咪唑类骨架(PEGCG@ZIF-8)，图11为负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体(FA-PEG/PEGCG@ZIF-8)。

从透射电镜图中可以看出沸石咪唑类骨架为八面体，且大小在纳米级别；图9和图10相比可知，单独合成ZIF-8与负载药物后的ZIF-8，八面体晶型更为明显，且粒径减小，并不再黏连。相比图10与图11可见，接叶酸前后的PEGCG@ZIF-8大小晶型基本保持不变，比较稳定。

表征试验4：X射线衍射检测

ZIF-8、PEGCG@ZIF-8和FA-PEG/PPEGCG@ZIF-8X射线衍射图如附图12-14所示，图12为沸石咪唑类骨架(ZIF-8)，图13为负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的沸石咪唑类骨架(PEGCG@ZIF-8)，图14为负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体(FA-PEG/PEGCG@ZIF-8)，由图12-14得出，负载单取代表没食子儿茶素没食子酸酯棕榈酸酯的叶酸靶向载体仍然保持着沸石咪唑类骨架的晶型结构。

性能试验1：细胞毒性检测

将PEGCG、FA-PEG/PEGCG@ZIF-8进行紫外灯灭菌处理，分别溶于超纯水，并定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为200μg/mL的溶液。采用浓度梯度逐级稀释法用DMEM培养基将PEGCG、FA-PEG/PEGCG@ZIF-8溶液稀释到所需浓度(0.1，0.5，1，2，5，10，15，20μg/ml)。

(1)取对数期生长的HeLa细胞，用0.25％胰蛋白酶消化单层细胞制成单细胞悬浮液(培养基：DMEM+10％FCS)，在96孔板的细胞测试孔中加入20μL细胞悬液，1×10⁴细胞/孔，将细胞放入CO2培养箱(37℃，5％的CO2)中培养16-18h，达到完全贴壁；

(2)用移液枪吸出96孔板内的培养基，将200μL含有不同浓度PEGCG或FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的培养基加入测试孔中，空白对照组分别加入相应的培养基和无菌水。所有对照组及待检测组均平行5次。继续将细胞培养在CO2培养箱(37℃，5％的CO2)中4h；

(3)弃去培养基，每孔分别加入100μL 5mg/mL的MTT溶液，继续在CO2培养箱(37℃，5％的CO2)培养4h；

(4)翻板弃去上清液，每孔加入100μL DMSO。在震荡器上震荡5min后，采用酶标仪于570nm波长处测溶液吸光度OD值；

根据下式计算细胞在不同表面活性剂溶液中的成活率(V)：

V＝(A-A0)/(AC-A0)

其中：

V是细胞的存活率(％)；

A是经待测药物溶液培养后细胞的OD值；

A0是用灭菌水替代PEGCG或FA-PEG/PEGCG@ZIF-8后细胞的OD值，此时细胞生长率为0；

Ac是培养液中不加PEGCG或FA-PEG/PEGCG@ZIF-8时细胞的OD值，此时细胞生长率为100％。

细胞毒性实验结果图如图15～17所示，图15为ZIF-8的细胞毒性结果图；图16为PEGCG的细胞毒性结果图；图17为FA-PEG/PEGCG@ZIF-8的细胞毒性结果图。

根据图15可以得到ZIF-8的细胞毒性非常小，细胞存活率均在80％-90％之间；图16相比于图17，PEGCG作用后的细胞存活率高于FA-PEG/PEGCG@ZIF-8作用后的细胞存活率，这表明接了叶酸的载体负载的药物能够增强药物的毒性，从而对癌细胞有更强的靶向性。

性能试验2：细胞内活性氧检测

将PEGCG，FA-PEG/PEGCG@ZIF-8进行紫外灯灭菌处理，分别溶于超纯水，并定容于50mL容量瓶中，配制成浓度为200μg/mL的溶液。采用浓度梯度逐级稀释法用DMEM培养基将PEGCG，FA-PEG/PEGCG@ZIF-8溶液稀释到所需浓度。

收集各组HeLa细胞，将dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)探针用无血清培养液稀释，终浓度为10μmol·L^-1，分装于1.5mL的EP管。细胞收集后，预冷PBS洗涤细胞2次，1000rpm，5min，离心，倒去上清，将细胞悬浮于稀释好的dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)溶液中，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3-5min颠倒一下，之后用无血清培养液洗涤细胞3次，上机检测，激发波长488nm，发射波长525nm。所有数据通过仪器软件被收集、储存和分析。

PEGCG具有较高的抗氧化活性，而癌细胞较正常细胞相比具有更高的ROS水平，PEGCG通过降低癌细胞的ROS水平来达到抑制癌细胞的增殖的作用。结果显示，图19和18中，FA-PEG/PEGCG@ZIF-8作用后的HeLa的活性氧水平远远低于PEGCG作用后的HeLa细胞。ROS水平的降低说明，同样质量的PEGCG进入细胞内，并且大大降低细胞的ROS水平，抑制了癌细胞的正常繁殖。

性能试验3：细胞内自噬流检测

取对数生长期的HeLa细胞，调整细胞密度为1×10⁵个·ml^-1接种于24孔板，过夜贴壁后，加入mRFP-GFP双标腺病毒孵育4h，继续用DMEM孵育24h使mRFP-GFP表达，并加入ZIF-8、PEGCG、PEGCG@ZIF-8、FA-PEG/PEGCG@ZIF-8孵育，设阴性对照组，每组设2个复孔，继续培养24h后除去含血清培养基，PBS洗2次，4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2次，置于激光共聚焦显微镜下观察和摄片。

mRFP-GFP-LC3双标腺病毒可以用来实时监测自噬(流)，mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。与空白对照组的HeLa细胞对比，PEGCG@ZIF-8组(图20)和FA-PEG/PEGCG@ZIF-8组(图21)的HeLa细胞红色荧光与黄色荧光的比例更大，这说明，其LC3蛋白更多，而且其绿色荧光的强度说明了在FA-PEG/PEGCG@ZIF-8组中，细胞的自噬体和溶酶体发生融合，也就是说自噬流进一步发生，由ZIF-8负载的PEGCG具有更为显著的促进自噬的效果，从而具有更强的抑制癌细胞繁殖的效果。