调控SENP1磷酸化修饰化合物和SIRT3SUMO化修饰化合物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及SENP1磷酸化修饰化合物和SIRT3SUMO化去修饰化合物及其应用，具体涉及SENP1的S180位点的磷酸化修饰以及对线粒体SIRT3的SUMO化修饰的调控在细胞线粒体代谢相关生理和病理中的作用及其应用。

背景技术：

线粒体是细胞中重要的能量代谢与参与细胞代谢调控的细胞器。它由外至内可分为外膜、膜间隙、内膜和基质四个区域。在生理和病理情况下，线粒体的数量、形状和细胞内的位置都会发生动态改变，并且这种改变与线粒体的功能有关。近年的研究表明，线粒体的这些改变与细胞线粒体对能量需求、营养供应或代谢改变有关。比如T细胞被抗原刺激分化增殖为效应性T细胞时，线粒体形状通过Fission过程变小和变成球型，而进一步分化为记忆性T细胞时，线粒体形状则通过Fusion变大和变成长型(Buck et al.,2016)。Fission使线粒体变小和变成球形，能够增加线粒体有氧糖酵解、三羧酸循环流(TCA flux)等，这些代谢活性的改变有利于效应性T细胞的分化扩增；而Fusion过程则增加线粒体的脂肪酸的beta-氧化代谢活性，有助于记忆性T细胞(T memory)的成活(Buck et al.,2016)。这些研究说明线粒体的动态变化能够影响到线粒体的代谢、进而影响到细胞的功能。

蛋白质的SUMO修饰是一个动态和可逆的过程(Cheng,et al.2004)。SUMO修饰过程是由活化酶(E1)、接合酶(E2)和连接酶(E3)三个酶相继作用来完成的。被SUMO修饰的靶蛋白现已报道有数百种之多。大多数SUMO修饰的蛋白质位于细胞核内，包括转录因子，转录共调节因子，参与染色质重塑的蛋白和信号转导分子等。SUMO修饰可通过调节这些靶蛋白质的定位、稳定和活性来影响细胞内众多的生物学过程。蛋白质SUMO修饰的调控主要由去SUMO化修饰蛋白酶SENP家族成员所介导的去SUMO化过程来调控。能够发生SUMO修饰的蛋白质主要位于细胞质和细胞膜中，但目前对于线粒体内蛋白能否发生SUMO修饰还未见报道。SENP家族包括6个成员：SENP1-3、SENP5-7(Cheng，2008)。大多数SENP分布在细胞核内，SENP3和SENP5定位于核仁，SENP6遍及整个核质。在它们氨基酸序列的C端是序列高度相似和保守的酶活性区域，而N端序列各异，一般认为它们调控底物特异性。由于SENP是重要的SUMO修饰调节因子，它们的表达或活性高低与底物的SUMO修饰水平密切相关，因而SENP被认为是调控蛋白质SUMO修饰的一个重要调控因子，也是生理和病理情况下作用于蛋白质SUMO修饰的重要靶标(Cheng,et al.2004)。外界信号通过SENP与其底物形成的一个信号调控通路参与对许多细胞生物学活性过程进行调控。但目前对于外界信号如何调控SENP的活性进而影响参与的细胞活性还不甚了解。

Sirtuin家族共有七个成员(SIRT1-7),它依赖NAD+作为辅酶，发挥去乙酰化酶或ADP-核糖基转移酶的活性，参与许多重要生命过程的调控，诸如糖脂代谢、衰老、应激反应、炎症反应、肿瘤和心血管疾病等。其中，SIRT3是一种位于线粒体基质中的去蛋白乙酰化酶(Dittenhafer-Reed et al.，2015)。超过50％的线粒体蛋白包括许多参与代谢过程的酶能够发生乙酰化修饰，乙酰化修饰是线粒体蛋白活性调控的一种重要机制。而SIRT3是这些线粒体蛋白的主要的去乙酰化修饰酶，它能够调控这些线粒体蛋白的乙酰化修饰水平，进而影响其在线粒体中的功能。SIRT3的缺失能使线粒体中ROS增加，与衰老、听力损伤和癌症发生有密切关系。但在生理与病理情况下，如何调控SIRT3的活性及其参与的线粒体代谢过程还不太清楚。

技术实现要素：

本发明提出了线粒体中NAD依赖的去乙酰化酶SIRT3能够发生SUMO修饰，而SUMO修饰能抑制SIRT3的活性。所述SUMO修饰位点位于人SIRT3第288位的赖氨酸(小鼠SIRT3是第223位赖氨酸)，利用基因编辑技术突变这一SUMO修饰位点或下调这一位点的SUMO修饰均能够显著激活SIRT3的去乙酰化活性，并进而调控其参与的线粒体代谢，包括促进线粒体的脂肪酸氧化和氧化磷酸化活性，能够促进 T细胞成活、促进记忆性T细胞的抗肿瘤活性、促进血液干细胞的造血功能和减肥等。

本发明还通过建立SIRT3SUMO位点突变(K223R)的小鼠进一步提出了SIRT3SUMO修饰调控免疫细胞的活性，SIRT3K223R小鼠的 T细胞在体外成活时间延长，淋巴细胞包括记忆性T细胞显著增多。对小鼠肿瘤模型观察表明SIRT3K223R的记忆性T细胞的抗肿瘤免疫活性显著增强。因此，T细胞中SIRT3SUMO化修饰K288位点或调控SIRT3的SUMO化修饰的因子将是调控T细胞活性及抗肿瘤免疫的新靶点。

本发明提出了SENP1是线粒体SIRT3特异性去SUMO修饰酶，去除SIRT3的SUMO修饰，进而显著增强SIRT3的活性。在代谢应激因素的作用下，SENP1从细胞质转运入线粒体内，催化SIRT3的去SUMO化，从而激活SIRT3的去乙酰化活性并降低线粒体中蛋白质的乙酰化水平，改变线粒体的代谢活性，特别是促进线粒体的脂肪酸氧化和氧化磷酸化活性等。因此，SENP1是SIRT3重要的上游调控因子(称为SENP1-SIRT3调控轴)。本发明进一步提出了在应激条件下，SIRT3K288位点突变或者激活SENP1去除SIRT3的SUMO化修饰均能够激活SIRT3参与调控的脂肪酸氧化，从而使细胞的能量代谢由基于葡萄糖的氧化磷酸化转变为以脂肪酸氧化磷酸化为主，这对于细胞克服这种代谢应激所造成的损伤是十分重要的。本发明所述应激条件包括由于葡萄糖供应减少而导致的细胞饥饿，一些代谢产物和一些细胞因子等能够调控SENP1的S180磷酸化，从而通过SENP1-SIRT3轴调控线粒体代谢和功能。

其中，SENP1进入细胞线粒体的调控机制为，SENP1第180位的丝氨酸(S180)发生磷酸化修饰，SENP1转运入线粒体，并进而激活SIRT3。其中，代谢应激因素(如饥饿)能够促进激活的AMPK对SENP1第180位的丝氨酸(S180)进行磷酸化修饰，促进SENP1移位进入线粒体基质。而干预AMPK或者突变S180这一位点使得SENP1不能发生磷酸化修饰，都将阻止SENP1转运入线粒体内，造成SENP1在线粒体内的定位减少，亦不能启动对SIRT3的去SUMO化和线粒体代谢活性的调控。本发明通过亚细胞组分分离，荧光定位和免疫胶体金等实验方法，提出了人源的SUMO特异性蛋白酶SENP1能够定位在线粒体基质中。此外，饥饿条件等应激条件能促进更多的SENP1进入线粒体。本发明通过质谱技术鉴定到SENP1能够发生磷酸化修饰，磷酸化位点是第180位的丝氨酸(S180)。进一步的实验证明SENP1第180位发生磷酸化修饰是其能够进入线粒体的关键步骤。在饥饿等条件刺激下，细胞内AMP依赖的蛋白激酶AMPK被激活，AMPK直接对SENP1的S180位点进行磷酸化修饰，促使SENP1移位进入线粒体，降低线粒体内蛋白的SUMO化修饰，如SIRT3，加强线粒体脂肪酸氧化作用，促进ATP，乙酰辅酶A和酮体的生成，从而提高线粒体应对环境应激的能力。因此，SENP1S180位的磷酸化修饰是一种新的调控线粒体功能的重要方式。基于这些结果，同时针对线粒体功能完善与否与多种代谢性和免疫性疾病发生的重要联系，本发明将为研究线粒体疾病提供新的策略和治疗靶点。

本发明还提出了以SENP1的S180位点磷酸化为标志，来筛选促进SENP1S180位点磷酸化的化合物，这些化合物可以通过SENP1调控SIRT3SUMO修饰参与的线粒体代谢活性及相关生理和病理的功能，从而具有应用前景。因此，促进SENP1S180位点磷酸化修饰的因子通过调控SENP1-SIRT3轴在生理和病理过程中有重要的应用前景。与现有技术相比，本发明显著的有益效果在于：

本发明首次提出了SIRT3的SUMO修饰位点，以及SENP1-SIRT3轴的信号调控路径，研究了其在线粒体代谢和抗肿瘤免疫方面的重要意义。这一调控能够影响线粒体代谢，影响巨噬细胞和T细胞的活化，以及对肿瘤免疫和肿瘤生长的影响。本发明将进一步促进对于线粒体代谢中免疫细胞活性调控中作用的认识。本发明解析了SENP1-SIRT3轴对细胞代谢和肿瘤免疫抑制形成中的作用与机制，能够启发新的激活细胞代谢和肿瘤免疫的策略。

本发明还提出了促进SENP1发生磷酸化的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、治疗线粒体代谢功能相关疾病的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了促进SENP1第180位的丝氨酸发生磷酸化的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了促进SENP1从细胞质转运入线粒体内的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了蛋白激酶AMPK在制备SENP1的S180位点磷酸化修饰的药物，SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了蛋白激酶AMPK激活剂在制备促进SENP1的S180位点磷酸化修饰的药物，SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了促进SIRT3去乙酰化活性的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了促进SIRT3去SUMO修饰化或能够突变SIRT3SUMO修饰化位点的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明还提出了促进SIRT3第288位的赖氨酸SUMO修饰位点去SUMO修饰化或突变SIRT3第288位的赖氨酸SUMO修饰化位点的化合物在制备SIRT3的去乙酰化活性激活剂、调控线粒体代谢功能的药物、预防和/或治疗肿瘤的药物、或预防和/或治疗免疫相关疾病的药物中的应用。

本发明中，所述线粒体代谢功能相关疾病包括肥胖、肿瘤、衰老、神经退行性疾病等。

本发明中，所述治疗线粒体代谢功能相关疾病包括促进线粒体线粒体中脂肪酸氧化和氧化磷酸化。

本发明中，所述肿瘤、肥胖、慢性病毒性感染性疾病、神经退行性疾病等。

本发明中，所述预防和/或治疗肿瘤是指抑制肿瘤细胞的生长，促进记忆性T细胞的抗肿瘤活性。

本发明中，所述免疫相关疾病包括自身免疫性疾病、慢性病毒性感染性疾病等。

本发明中，所述预防和/或治疗免疫相关疾病通过调控免疫细胞的活性、影响巨噬细胞和T细胞的活化、促进/延长 T细胞的成活、增加淋巴细胞包括记忆性T细胞数量、增加外周淋巴细胞数量、增高线粒体融合过程、促进血液干细胞的造血功能来实现。

本发明中，所述激活剂、药物用于T细胞。

本发明提出了SENP1第180位的丝氨酸(S180)发生磷酸化是SENP1转运入线粒体中激活SIRT3所必需的。本发明提出了调控线粒体代谢和功能的一种全新机制：以SENP1的S180位点磷酸化为标志，来筛选促进SENP1S180磷酸化的化合物，这些化合物可以通过SENP1调控SIRT3SUMO修饰参与的线粒体代谢活性及相关生理和病理的功能。改变SIRT3SUMO修饰与线粒体相关的生理及病理过程密切相关，筛选SENP1S180位点磷酸化的因子对SIRT3的SUMO修饰的调控和突变及其在相关疾病防治中具有广泛应用前景。

附图说明

图1为鉴定线粒体蛋白SIRT3能够发生SUMO化修饰的示意图。

图2为SIRT3SUMO修饰位点所在序列物种保守性示意图。

图3为鉴定K288是SIRT3SUMO化修饰位点示意图。

图4为鉴定SENP1是去SIRT3SUMO修饰蛋白酶示意图。

图5为SIRT3SUMO修饰位点突变对其底物去乙酰化水平的影响示意图。

图6为SIRT3SUMO修饰位点影响线粒体氧化磷酸化示意图。

图7为SIRT3SUMO修饰位点影响脂肪酸氧化示意图。

图8为SIRT3SUMO修饰位点突变小鼠构建示意图。

图9为SIRT3K223R小鼠代谢笼分析示意图。

图10为SIRT3K223R小鼠肝脏组织饥饿状况下脂肪酸氧化示意图。

图11为SIRT3K223R增强IL-4诱导巨噬细胞氧化磷酸化代谢和M2表型示意图。

图12为SIRT3K223R小鼠脾脏中CD8+记忆T细胞增多。

图13为SIRT3K223R小鼠CD8+记忆T细胞存活能力增强。

图14为SIRT3K223R对CD8+记忆T细胞代谢模式的影响

图15为SIRT3K223R增强CD8+记忆T细胞抗肿瘤的作用

图16为分离细胞组分鉴定SENP1位于线粒体内的示意图。

图17为免疫胶体金实验验证SENP1定位于线粒体基质的示意图。

图18为免疫荧光实验证明饥饿促进SENP1进入线粒体的示意图。

图19为SENP1能发生磷酸化修饰并且饥饿增强SENP1磷酸化的示意图。

图20为SENP1的180位丝氨酸突变成不能发生磷酸化修饰的丙氨酸形式后就不能进入线粒体的示意图。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1免疫沉淀鉴定SIRT3SUMO修饰方法

首先转染SIRT3-Flag和HA-SUMO1到293T细胞提取线粒体组分，然后通过M2-Flag affinity gel(Sigma，A2220)或HA magnetic beads(Thermo，88836)进行免疫沉淀实验，用Flag(Sigma，M2)和HA(Sigma，HA-7)抗体进行检测，均检测到51kDa大小的SIRT3SUMO修饰条带(图1)。内源的SIRT3SUMO化修饰通过提取肝癌细胞系SMMC7721线粒体组分，用SIRT3(Cell Signaling，5490)抗体免疫沉淀，然后用SIRT3(Cell Signaling，5490)和SUMO1(Abcam，32058)抗体进行检测，也检测到49kDa大小的SIRT3SUMO修饰条带(图1)。然后，将SIRT3-Flag、HA-SUMO1和RGS-SENP1质粒共转染到293T细胞，提取线粒体蛋白并用Flag抗体做免疫沉淀，用Flag和HA抗体检测结果表明过表达的SENP1能够去除SUMO修饰的SIRT3，同时用SENP1酶活突变型的质粒RGS-SENP1m(R630L,K631M)代替RGS-SENP1则不能去除(图4)。以上结果证明SIRT3是线粒体的SUMO修饰蛋白并且SENP1是它的去SUMO化蛋白酶。

以下是克隆进质粒的人Sirt3基因的序列：

001atggcgttctggggttggcgcgccgcggcagccctccggctgtggggccgggtagttgaa 060

061cgggtcgaggccgggggaggcgtggggccgtttcaggcctgcggctgtcggctggtgctt 120

121ggcggcagggacgatgtgagtgcggggctgagaggcagccatggggcccgcggtgagccc 180

181ttggacccggcgcgccccttgcagaggcctcccagacccgaggtgcccagggcattccgg 240

241aggcagccgagggcagcagctcccagtttcttcttttcgagtattaaaggtggaagaagg 300

301tccatatctttttctgtgggtgcttcaagtgttgttggaagtggaggcagcagtgacaag 360

361gggaagctttccctgcaggatgtagctgagctgattcgggccagagcctgccagagggtg 420

421gtggtcatggtgggggccggcatcagcacacccagtggcattccagacttcagatcgccg 480

481gggagtggcctgtacagcaacctccagcagtacgatctcccgtaccccgaggccattttt 540

541gaactcccattcttctttcacaaccccaagccctttttcactttggccaaggagctgtac 600

601cctggaaactacaagcccaacgtcactcactactttctccggctgcttcatgacaagggg 660

661ctgcttctgcggctctacacgcagaacatcgatgggcttgagagagtgtcgggcatccct 720

721gcctcaaagctggttgaagctcatggaacctttgcctctgccacctgcacagtctgccaa 780

781agacccttcccaggggaggacattcgggctgacgtgatggcagacagggttccccgctgc 840

841ccggtctgcaccggcgttgtgaagcccgacattgtgttctttggggagccgctgccccag 900

901aggttcttgctgcatgtggttgatttccccatggcagatctgctgctcatccttgggacc 960

961tccctggaggtggagccttttgccagcttgaccgaggccgtgcggagctcagttccccga 1020

1021ctgctcatcaaccgggacttggtggggcccttggcttggcatcctcgcagcagggacgtg 1080

1081gcccagctgggggacgtggttcacggcgtggaaagcctagtggagcttctgggctggaca 1140

1141gaagagatgcgggaccttgtgcagcgggaaactgggaagcttgatggaccagacaaatag 1200

实施例2SIRT3SUMO修饰位点鉴定方法

通过蛋白氨基酸序列比对，结果表明在人的SIRT3蛋白288位赖氨酸周围存在着一个SUMO修饰的共有序列ψ-K-χ-D(ψ是一个疏水氨基酸残基，χ是任意氨基酸残基)，而且这一序列在不同物种中是保守的(图2)。用下面一对引物通过PCR方法将SIRT3质粒上的第288位赖氨酸突变为精氨酸，然后将SIRT3K288R的质粒与SUMO1的质粒共转染进293T细胞，以SIRT3WT质粒作为阳性对照，通过M2-Flag affinity gel(Sigma，A2220)或HA magnetic beads(Thermo，88836)进行免疫沉淀实验，用Flag(Sigma，M2)和HA(Sigma，HA-7)抗体进行检测，结果表明SIRT3 288位赖氨酸突变后，SIRT3不能发生SUMO化修饰，即K288是SIRT3SUMO化修饰位点(图3)。

SIRT3K288R fwd 5’-cggcgttgtgaggcccgacattg-3’

SIRT3K288R rev 5’-caatgtcgggcctcacaacgccg-3’

实施例3证明SIRT3SUMO修饰对SIRT3的去乙酰化水平具有抑制作用

通过在内源性SIRT3基因沉默的肝癌细胞SMMC7721中稳定转染Flag-SIRT3WT或Flag-SIRT3K288R质粒，建立Flag-SIRT3WT或Flag-SIRT3K288R表达细胞系。通过Acetyl-lys(Cell Signaling,9441)抗体进行免疫沉淀，然后用已知的SIRT3的去乙酰化修饰的靶蛋白抗体诸如SOD2(Abcam,13534)、LCAD(Abcam,196655)、HMGCS2(Abcam,137043)、AceCS2(Abcam,66038)检测，结果表明SIRT3K288R比野生型有更高的去乙酰化酶活性(图5)。

实施例4线粒体氧化磷酸化水平检测方法

在XF96-well微型板(Seahorse Bioscience)的一个孔中大约铺10⁴细胞，若代谢应激处理或不处理6个小时后在37℃用XF96分析仪(Seahorse Bioscience)进行检测，其中2μM oligomycin,0.25μM FCCP和0.5μM rotenone/antimycin分别用于检测备用呼吸能力，最大呼吸值和ATP生成情况。从结果看出SIRT3SUMO修饰位点突变后，氧化磷酸化和ATP水平比野生型要高(图6)。

实施例5线粒体脂肪酸氧化分析方法

细胞的线粒体裂解物通过含有内标物的乙腈进行沉淀，通过离心得到上悬液，然后通过串联质谱(TSQ Vantage,Thermo Fisher Scientific)进行检测，通过带有一个XBridgeTM Amide保护柱(2.1×10mm,5μm；Waters)的XBridgeTM Amide column(2.1×150mm,5μm；Waters)进行层析分离。流动相由10mM乙酸铵水溶液(phase A)和乙腈(phase B)组成。L-carnitine，acylcarnitines和其它内参(Sigma-Aldrich)通过阳离子多重反应监测模式(MRM)进行分析，数据文件通过LCquan 2.7软件(Thermofisher Scientific)生成。

本发明结果表明SIRT3K288R突变细胞中长链脂肪酸中间产物的量较野生型低，说明SUMO修饰抑制了SIRT3的去乙酰化酶的活性和介导的脂肪酸氧化代谢(图7)。

实施例6构建SIRT3K223R小鼠

利用CRISPR/Cas9gene targeting技术，构建针对Sirt3基因的gRNA，体外转录为mRNA，指导Cas9蛋白在特定位点剪切DNA双链，同时99bp的donor oligo通过同源重组整合入目的位置(图8)。胚胎供体小鼠(C57BL/6)超排卵后，PMSG处理供体雌性小鼠，46小时后注射hCG，与雄性小鼠合笼交配，次日取受精卵进行显微注射。然后进行胚胎移植，胚胎移植的小鼠将在手术后19天左右出生，待小鼠出生约7天后剪尾(或脚趾)提取DNA并进行PCR鉴定，得到Founder小鼠与野生型小鼠(C57BL/6)交配得到第一代，待雄性Founder小鼠到7周龄，雌性小鼠到4周龄，可分别与野生型异性小鼠交配，小鼠出生20天后PCR鉴定。若有阳性小鼠出生，则表示转基因已经整合到生殖细胞，标志品系建立成功。该突变小鼠在正常饲养情况下与野生型没有明显的差异。

所用到的序列如下：

gRNA:CCCGATATCGTCTTTTTTGGGGA

Donor Oligo(99bp)：

GACAGGGTGCCCCGCTGCCCTGTCTGTACTGGCGTTGTGAGACCCGATATCGTCTTTTTTGGGGAGCAGCTGCCTGCAAGGTTCCTACTCCATATGGCT

SIRT3K223R小鼠鉴定前向引物：5’-GGGACCATTACAGAGTGAAGA-3’

SIRT3K223R小鼠鉴定反向引物：5’-CATACAGAGCCACAGACATACC-3’

实施例7研究SIRT3SUMO修饰位点突变小鼠的代谢

采用C57BL/6野生型和SIRT3K223R的6个月雄性小鼠进行代谢笼实验，每种小鼠分为正常饮食喂养(Research Diets,Inc.)和24小时不喂养只供水两组(n＝4)。Minispec TD-NMR Analysers(Bruker instruments)用于评估体脂含量，然后放入代谢笼(Columbus Instruments)用来评估进食、能量消耗、氧耗、二氧化碳产生和活动等情况，动物饲养和实验完全按照上海交通大学医学院实验动物伦理委员会规范操作。本发明结果表明在正常饲养条件下，SIRT3K223R小鼠的氧耗和二氧化碳产生显著高于野生型小鼠，说明SIRT3的代谢处于较高的水平(图9)。进而将小鼠的肝脏线粒体组分分离出来进行脂肪酸氧化质谱分析，结果表明SIRT3K223R小鼠肝细胞中的长链脂肪酸产物显著较野生型小鼠低，说明SIRT3K223R具有较高的活性。在饥饿时，野生型小鼠肝细胞长链脂肪酸产物显著降低，但SIRT3K223R小鼠则没有显著的改变(图10)。

实施例8SIRT3K223R增强IL-4诱导巨噬细胞氧化磷酸化代谢和M2表型

从SIRT3WT和SIRT3K223R小鼠中分离骨髓巨噬细胞，在体外培养条件下用IL-4处理24个小时，用Seahorse分析细胞氧耗和FACS分析CD206+CD301+巨噬细胞(M2)数量，结果表明IL-4诱导SIRT3K223R巨噬细胞的氧耗和形成的M2细胞较野生型巨噬细胞显著增加(图11)，说明SIRT3K223R突变能够增强巨噬细胞的氧化磷酸化代谢和M2表型。

实施例9SIRT3K223R小鼠脾脏中CD8+记忆T细胞数量与比例增加

T细胞在胸腺中分化发育成熟，成熟的CD8+与CD4+T细胞进入脾脏与淋巴结中。本发明结果表明SIRT3K223R小鼠的胸腺与脾脏显著增大，细胞总数增多(图12-a,b)。进一步的流式FACS分析结果显示，其T细胞发育各个阶段的细胞比例无异常，但是CD4SP(single positive,SP)/CD8SP/Double Positive(DP)/Double Negative(DN)以及DN1/3/4的细胞数量显著增多。脾脏中得到了类似的结果，CD8+的记忆T细胞central memory T cells(TCM)/effector memory T cells以及 T cells的细胞数量显著增多，其中TCM占CD8+T cells的细胞比例也显著增多(图12-c)。综合以上结果，SIRT3K223R不影响T细胞的发育过程，但可导致T细胞数目，尤其CD8+TCM的数目增加。

实施例10SIRT3K223R小鼠CD8+记忆T细胞存活能力增强

为进一步探究CD8+T cells细胞数量增多的原因，本发明从两方面入手，一是通过FACS Ki67染色检测其细胞增殖潜力，结果表明SIRT3K223R小鼠CD8+T cells的增殖潜力无显著改变(图13-a)。而另一方面，通过PI(碘化丙啶)细胞活力染色结果表明CD8+TCM与TN的细胞活力KR组显著高于WT组(图13-b)。该结果提示本发明SIRT3K223R可能会提高CD8+TCM与TN的survival存活能力。因此，本发明分选了脾脏中的CD8+TN细胞( CD8+T cells isolation kit，Stem cell)并用anti-CD3/CD8+IL2体外激活3天，再用细胞因子IL15诱导3天得到T memory(IL15-TM)(Buck et al.,2016)。然后利用7AAD染色检测细胞活力的方法(van der Windt et al.,2012)，检测了CD8+TN与IL15-TM(1x10⁵)在体外无刺激条件下培养3天的存活能力，结果表明SIRT3K223R CD8+TN/IL15-TM细胞的体外存活能力显著高于WT组(图13-c,d)。同时，本发明将IL15-TM尾静脉注射至CD45.1的受体小鼠中，2天后检测其在脾脏与周围淋巴结中的存活数目，与体外存活结果一致，K223R组IL15-TM在脾脏与淋巴结中的体内存活能力同样高于WT组(图13-e,f)。

实施例11SIRT3K223R对CD8+记忆T细胞代谢模式的影响

与在肝脏中得到的结果类似，SIRT3K223R可调控CD8+T细胞的线粒体状态与代谢模式。利用mito-tracker Green标记线粒体，并用FACS检测，结果显示K223R组CD8+IL15-TM(memory)T细胞mito-tracker MFI显著高于WT组，表明线粒体mass增加，提示线粒体融合mito fusion的增加(图14-a)。免疫荧光mito-tracker Green得到了同样的结果，K223R TM中线粒体mass高于WT组，并存在mito fusion的增加(图14-b)。另外，利用JC-1染色检测线粒体膜电位MMP(Mitochondrial membrane potential)，SIRT3K223R组TE与TM的JC-1monomers均显著低于WT组，表明其MMP高于WT组，K223R更稳定的MMP有利于维持细胞的正常生理功能(图14-c)。进一步的代谢流结果显示SIRT3K223R TM氧化磷酸化OCR增加(图14-d)；同时，TM细胞利用长链脂肪酸的能力增加，并可产生更多的ATP与Acetyl-coA(图14-e)。综上所述，SIRT3-K223R CD8+IL15-TM的线粒体mass与fusion增加，膜电势MMP增高；代谢模式偏向于氧化磷酸化增加，利用长链脂肪酸的能力增强，可更有效的产生ATP供能。以上代谢模式的改变均有利于TM细胞的长期存活。

实施例12SIRT3K223R增强CD8+记忆T细胞存活能力在T细胞抗肿瘤中的作用

CD8+T细胞是免疫系统抵抗肿瘤的重要效应细胞，为研究SIRT3K223R增强CD8+TM存活能力在抗肿瘤中的能力是否增强，本发明构建了SIRT3K223R CD45.2OT1小鼠(其CD8+T细胞可被卵清白蛋白多肽OVA Peptide(257-264)，抗原特异性激活)，分离WT与K223R小鼠的CD8+TN后，利用OVA肽作为抗原体外激活TN，同样使用IL15诱导产生IL15-TM，然后将同样数目(1x10⁶)的WR与KR组IL15-TM细胞通过尾静脉注射过继转移至受体小鼠CD45.1小鼠中。在过继转移IL15-TM7天后，于受体小鼠背部接种MC-38结肠癌细胞(1x10⁶)，并连续监测肿瘤生长。结果显示：过继K223R CD8+IL15-TM组受体小鼠中肿瘤生长大小，重量均小于WT组，同时K223R组肿瘤浸润T细胞中的CD45.2+与OVA特异性抗原表位H2Kb+细胞比例高于WT组(图15)。以上结果表明，SIRT3K223R可通过代谢模式的改变增强CD8+TM的存活能力，更有利于其在抗肿瘤中的作用。

实施例13细胞饥饿方法

正常细胞培养在含10％血清的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM,4500mg/l glucose,4mM L-glutamine)中，饥饿刺激时，细胞培养在不含血清的DMEM(1000mg/l glucose,4mM L-glutamine)中，处理时间为4小时。

实施例14细胞核、细胞质和线粒体分离

收集细胞：用PBS洗一遍，用浓度为0.25％胰酶消化细胞，离心收集细胞；收集组织：动物处死后将其组织保存在冰上，不超过一个小时；洗涤细胞：用冰浴预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀，取少量细胞用于计数，剩余细胞用600g在4℃离心5分钟沉淀细胞，弃上清；洗涤组织：在1.5ml离心管内对剪取的组织进行称重，重量约为50-100mg，用PBS洗涤一次，用剪刀把组织剪切成非常细小的碎片；加入1ml线粒体分离液[210mM mannitol,70mM sucrose,5mM Tris-HCl(pH 7.5),1mM EGTA,0.5mg/ml BSA]至细胞或组织中，轻轻吹打细胞，冰上放置10-15分钟；把细胞悬液转移到Dounce匀浆器中，匀浆30下左右；匀浆效果的鉴定：不同细胞不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。通常可以在匀浆10次后取约2ul细胞匀浆，加入30-50ul台盼蓝染色液，混匀后显微镜下观察台盼蓝染色阳性(蓝色)细胞的比例。如果阳性细胞比例不足50％，增加5次匀浆。随后再同前取样进行台盼蓝染色鉴定。当阳性比例超过50％时即可停止匀浆进入下一步；细胞匀浆用600g在4℃离心10分钟，沉淀为细胞核P1；小心将上清S1转移到另一离心管中，11,000g，4℃离心10分钟，小心去除上清S2，沉淀P2即为分离得到的细胞线粒体。

线粒体的使用：如果用于完整线粒体的功能或酶活性研究，分离得到的线粒体样品中可以加入150-200ul线粒体储存液[1.5M sucrose,1mM EGTA,10mM Tris HCl(pH7.5)]，重悬线粒体；如果用于线粒体的蛋白分析，分离得到的线粒体样品中可以加入临用前添加了PMSF的线粒体裂解液裂解线粒体。裂解后的线粒体可以用于SDS-PAGE、Western blot、IP以及线粒体中的一些酶活性的测定等。

本发明检测了三个主要的去SUMO蛋白酶(SENP1-SENP3)在细胞中的定位：SENP1主要位于细胞核，但是在细胞质和线粒体组分也能检测到SENP1蛋白；SENP2绝大部分定位于细胞核；SENP3在细胞的各个组分均存在。进一步将线粒体组分进行分离，结果表明SENP3蛋白位于线粒体外膜，而SENP1蛋白则可以定位于线粒体基质中(图16)。

实施例15免疫荧光实验

在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS轻轻漂洗1次；用4％的多聚甲醛室温固定爬片15分钟；PBS漂洗玻片3次，每次3分钟；用PBS配制0.1％Triton X-100，室温通透20分钟；PBS漂洗玻片3次，每次3分钟；在玻片上滴加10％山羊血清，室温封闭30分钟；吸掉封闭液，每张玻片滴加足够量的用PBS稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；PBS漂洗玻片3次，每次3分钟；吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，避光室温孵育30分钟；避光PBS漂洗玻片3次，每次3分钟；用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，在荧光显微镜下观察采集图像。

本发明结果表明随着饥饿时间的延长，SENP1与线粒体蛋白标记物的共定位显著增加(图18)，标尺为50微米。

实施例16免疫胶体金方法

4％多聚甲醛(PFA)和0.2％戊二醛(GA)室温固定1小时。细胞固定之后，离心去除固定液，PB缓冲液清洗，低速离心去掉上清，留少许缓冲液重悬细胞。离心管加热到37℃，同时将12％(w/v)明胶加热到37℃，逐滴滴加明胶并轻柔搅拌，将细胞重悬在12％的明胶中，37℃渗透10分钟左右，离心使细胞沉淀下来，然后低温固化明胶。把离心管尖端有细胞的部分用刀切成1mm³的小块若干个。切成的小块放入2.3M蔗糖中4℃旋转浸泡过夜，选择合适的旋转速度和角度以防样品块干掉或碰撞离心管壁。样品温度、刀温和冷冻箱体温度为-80℃，在进行超薄切片前先获得厚度为200nm左右的半薄切片，用甲苯胺蓝染色观察并进行定位，选取细胞较多的区域进行修块进行超薄切片。设定样品温度、刀温和冷冻箱体温度为-120℃，进行超薄切片，获得厚度为70nm左右的超薄切片，用蔗糖捞片，压在铺有Formvar膜的载网上。将载网倒扣在2％明胶板上，37℃保持20分钟以上；0.02M甘氨酸洗2次，每次2分钟；1％牛血清白蛋白BSA孵育2分钟；用1％BSA稀释抗体，4℃放在湿盒内孵育过夜；0.1％BSA漂洗4次，每次2分钟；免疫金标记，室温孵育25分钟；0.1％BSA洗2次，每次2分钟，PBS洗4次，每次2分钟；1％戊二醛，5分钟；PBS洗2次，每次5分钟，双蒸水漂洗至少6次，每次1分钟；2％醋酸双氧铀UA(pH7)，5分钟；迅速过一遍双蒸水；基纤维素-醋酸双氧铀(MC-UA)孵育包埋，于冰上操作，在前两滴MC-UA液滴快速孵育后，进入第三个MC-UA液滴，并停留5-10分钟，取出载网，吸去多余的MC-UA液滴，干燥形成薄膜，电镜观察。

本发明对MEF细胞进行冷冻超薄切片后，用免疫胶体金标记细胞中的SENP1蛋白，结果表明SENP1蛋白不仅存在于细胞核和细胞质中，也能定位在线粒体内部(图17)。Cyto表示细胞质，Mt表示线粒体，N表示细胞核，标尺为500纳米。

实施例17鉴定SENP1的磷酸化修饰

首先将Flag-SENP1转染到293T细胞中，转染后24-48h收获细胞；用PBS轻轻漂冼一遍，再加入1ml PBS，用枪或者细胞刮将细胞悬液转移至1.5ml EP管中，4℃，800g离心5分钟后弃上清；提取线粒体组分后加入适量细胞IP裂解缓冲液[50mM Tris-HCl(pH7.4),400mM NaCl,1％Triton X-100,0.1％SDS,1mM PMSF,PhosSTOP cocktail and protease inhibitors]，冰上或4℃裂解30分钟，40Hz超声3次，每次10s；裂解液超声完毕后12,000g离心10分钟，取少量裂解液作为对照，剩余裂解液加入M2-affinity gel(Sigma，A2220)在4℃缓慢摇晃孵育2h进行免疫沉淀反应；反应后在4℃以3,000g速度离心1分钟，将M2-affinity gel离心至管底，小心吸去上清，用1ml裂解缓冲液洗3-4次，最后加入2×SDS上样缓冲液，95℃煮5分钟。将制备好的样品进行Western blot，用Anti-Flag(Sigma，M2)和Anti-Phosphoserine/threonine(Abcam，ab17464)抗体进行检测。

实验结果表明，当细胞饥饿时，SENP1蛋白的磷酸化修饰增强；如果在此基础上同时用λ-Ppase磷酸酶处理，将无法检测到SENP1蛋白的磷酸化修饰(图19)。

实施例18鉴定SENP1S180位点磷酸化方法

在QuikChange网站上设计将SENP1S180突变为A(丙氨酸)的引物，以pFLAG-SENP1质粒为模板，利用PCR反应扩增出SENP1-S180A的序列，转化后抽提质粒，经测序验证位点是否突变成功。将突变成功的SENP1-S180A质粒转染到293T细胞中，通过免疫共沉淀和western blot检测SENP1的磷酸化水平；另外对相同的细胞分离线粒体组分，通过western blot检测SENP1在线粒体的定位。

结果表明，当SENP1S180磷酸化突变之后，其在线粒体中的定位显著减少，进而线粒体内的整体SUMO化修饰增强，但是该突变并不影响其在细胞核和细胞质中的定位(图20)。

实施例19筛选改变SENP1S180磷酸化修饰的方法

将Flag-SENP1质粒转染到293T中，24小时后，在培养基中加入化合物AICAR(500μM)，A769662(500μM)，Comp.C(4μM)，乳酸(20mM)或细胞因子IL-4(20ng/ml)，4-6小时后收集细胞，通过免疫共沉淀和westernblot检测SENP1S180位的磷酸化，同时分离细胞的线粒体组分，检测SENP1在线粒体的量。

本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>上海交通大学医学院

<120>调控SENP1磷酸化修饰化合物和SIRT3 SUMO化修饰化合物及其应用

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1200

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

atggcgttct ggggttggcg cgccgcggca gccctccggc tgtggggccg ggtagttgaa 60

cgggtcgagg ccgggggagg cgtggggccg tttcaggcct gcggctgtcg gctggtgctt 120

ggcggcaggg acgatgtgag tgcggggctg agaggcagcc atggggcccg cggtgagccc 180

ttggacccgg cgcgcccctt gcagaggcct cccagacccg aggtgcccag ggcattccgg 240

aggcagccga gggcagcagc tcccagtttc ttcttttcga gtattaaagg tggaagaagg 300

tccatatctt tttctgtggg tgcttcaagt gttgttggaa gtggaggcag cagtgacaag 360

gggaagcttt ccctgcagga tgtagctgag ctgattcggg ccagagcctg ccagagggtg 420

gtggtcatgg tgggggccgg catcagcaca cccagtggca ttccagactt cagatcgccg 480

gggagtggcc tgtacagcaa cctccagcag tacgatctcc cgtaccccga ggccattttt 540

gaactcccat tcttctttca caaccccaag ccctttttca ctttggccaa ggagctgtac 600

cctggaaact acaagcccaa cgtcactcac tactttctcc ggctgcttca tgacaagggg 660

ctgcttctgc ggctctacac gcagaacatc gatgggcttg agagagtgtc gggcatccct 720

gcctcaaagc tggttgaagc tcatggaacc tttgcctctg ccacctgcac agtctgccaa 780

agacccttcc caggggagga cattcgggct gacgtgatgg cagacagggt tccccgctgc 840

ccggtctgca ccggcgttgt gaagcccgac attgtgttct ttggggagcc gctgccccag 900

aggttcttgc tgcatgtggt tgatttcccc atggcagatc tgctgctcat ccttgggacc 960

tccctggagg tggagccttt tgccagcttg accgaggccg tgcggagctc agttccccga 1020

ctgctcatca accgggactt ggtggggccc ttggcttggc atcctcgcag cagggacgtg 1080

gcccagctgg gggacgtggt tcacggcgtg gaaagcctag tggagcttct gggctggaca 1140

gaagagatgc gggaccttgt gcagcgggaa actgggaagc ttgatggacc agacaaatag 1200

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

cggcgttgtg aggcccgaca ttg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

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<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 4

cccgatatcg tcttttttgg gga 23

<210> 5

<211> 99

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 5

gacagggtgc cccgctgccc tgtctgtact ggcgttgtga gacccgatat cgtctttttt 60

ggggagcagc tgcctgcaag gttcctactc catatggct 99

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 6

gggaccatta cagagtgaag a 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 7

catacagagc cacagacata cc 22