一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料及其制备方法和作为抗菌试剂的应用与流程

本发明涉及一种抑菌试剂，具体涉及一种黑磷纳米片负载纳米银复合材料，及一锅法超声辅助黑磷纳米片还原并原位负载纳米银的方法，以及黑磷纳米片负载纳米银复合材料作为抑菌试剂的应用，属于生物医药材料制备领域。

背景技术：

黑磷纳米片，作为一种新型二维纳米材料，由于其特殊的结构和性能受到广泛关注。黑磷由磷的起皱层构成的，层间范德华力较弱，故而可以通过简单的超声剥离法得到超薄的二维纳米片，由于其二维形貌的晶型结构与石墨烯相似，又被称为磷烯。黑磷的带隙与其厚度有关，大块黑磷的带隙约为0.3eV，而单层黑磷纳米片的带隙则为2.0eV。由于黑磷纳米片具有高的电子迁移率，平面各向异性以及横跨紫外和整个可见光区域的吸收带等独特性质，使其在电学、光电学、传感器及生物医药等方面得到广泛研究。黑磷纳米片在生物医药方面具有巨大潜能，已被研究可作为光动力治疗(PDT)试剂、光热治疗(PTT)试剂及抗肿瘤药物载体。

纳米银在催化、能量储存及生物医药等领域具有广泛应用。然而，单纯的纳米银容易发生聚集，性能存在一些不足，一般都通过将其负载在其他纳米材料上，能够提高纳米银的分散稳定性，得到综合性能较高的复合材料。二维材料具有高比表面积，可以很好地负载纳米银，然而，目前的大部分二维材料本身都不具有还原活性，需要额外添加还原剂和稳定剂才能实现对纳米银的均匀负载。

现有技术中有报道在二维黑鳞纳米片上负载纳米银的报道，中国专利(公开号CN106623967A)公开了一种黑鳞-金属纳米复合材料及其合成方法和应用，具体公开：(1)取黑磷BP晶体分散于N-甲基吡咯烷酮中，然后进行破碎处理，得破碎液；(2)将破碎液进行超声处理，离心，取沉淀，将沉淀重悬于N-甲基吡咯烷酮中，再次离心，收集上清，得BP纳米片悬液；(3)将BP纳米片悬液加入煮沸的水中，接着加入氯金酸溶液或硝酸银溶液继续沸腾反应，反应结束后冷却，离心，收集沉淀，得黑磷-金属纳米复合材料。该方法利用BP本身的还原性将吸附在BP表面的金属离子还原成元素金属，生成黑磷-金属纳米复合物，简便、易操作，制成的黑磷-金属纳米复合材料可以在光热效应方面应用以及作为活性基底在表面增强拉曼散射SERS中的应用。该方法需要在100℃高温条件下反应，反应条件要求高，特别是在高温条件下容易使黑鳞过度氧化，导致复合材料性能变差。

目前，报道的黑磷-金属纳米复合材料主要用于光热效应方面以及作为活性基底在表面增强拉曼散射SERS中的应用，但是在杀菌方面并未见报道。

技术实现要素：

为解决现有技术中二维黑鳞负载纳米银的方法存在的缺陷，本发明的第一个目的是在于提供一种在常温、常压下通过一锅法实现黑磷纳米片对纳米银原位还原和负载的方法。

本发明的另一个目的是在于提供一种纳米银分散均匀、负载稳定的二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料。

本发明的第三个目的是在于提供一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料的应用，将其作为抗菌试剂的应用，特别是作为抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性的试剂应用。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料(Ag@BP)的制备方法，该制备方法是在黑磷纳米片分散液中加入可溶性银盐，超声处理，即得。

优选的方案，所述黑磷纳米片分散液中黑鳞纳米片的浓度为0.05～5mg/mL。优选的方案，所述黑磷纳米片分散液中溶剂为水、甲醇和乙醇中至少一种。优选的溶剂为水。

优选的方案，所述可溶性银盐为硝酸银和/或高氯酸银。

优选的方案，所述可溶性银盐在黑磷纳米片分散液中的添加浓度为1～100mM。

优选的方案，所述超声处理的频率为20～40kHz，功率为150～300W，时间为0.25～3h。

优选的方案，所述黑磷纳米片的厚度为1～7nm，直径为200nm～250nm。

本发明还提供了一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料，由上述制备方法得到。

本发明还提供了一种二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料的应用，将其作为抗菌试剂应用。

优选的方案，在近红外光照条件下，使用二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料抑制细菌活性。

优选的方案，将二维黑磷纳米片负载纳米银复合材料作为抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性的试剂应用。

本发明的黑磷纳米片的制备方法：将黑磷粉末置于NMP的饱和氢氧化钠溶液中，冰浴条件下超声剥离、随后再经离心、洗涤、再水分散(或醇分散)得所述的黑磷纳米片的分散液；其中，超声的频率20～40kHz，超声功率为150～300W，超声处理时间为6～12h。

本发明的黑磷纳米片负载纳米银的制备方法：在黑磷纳米片分散液中加入可溶性银盐，超声处理，离心、洗涤、干燥，即得；所述黑磷纳米片分散液中黑鳞纳米片的浓度为0.05～5mg/mL；可溶性银盐在黑磷纳米片分散液中的添加浓度为1～100mM；所述超声处理的时间为0.25～3h，超声的频率为20～40kHz，超声功率为150～300W。

本发明的技术方案充分利用黑磷的氧化还原电位要低于银离子的氧化还原电位的特点，可以采用黑磷对银离子进行还原。利用黑磷纳米片表面对银离子进行还原，实现了银原位还原和负载，而黑磷表面由于氧化生成的少量磷氧化物或磷酸对纳米银有很好的稳定作用，可以保证纳米银在黑磷表面的均匀分散。

本发明的技术方案，超声对黑磷还原银离子的反应存在较大的影响，黑磷纳米片与银离子混合后，不需要超声，黑磷纳米片表面也能生成纳米银，但生成的纳米银尺寸较大，且不均匀，而在超声条件下得到的纳米银尺寸较小且均匀，能大大提高银的活性；超声能更好地促进银离子在黑磷纳米片表面的分散，且超声是一种均匀的能量注入方式，有利于纳米银的快速形成，减少纳米粒子的聚集，保证了纳米银在黑磷表面的均匀分散性。

本发明的技术方案将二维黑磷纳米片与纳米银复合，能大大提高两者在杀菌方面的协同作用，一方面可以利用黑磷的光热效应，使局部温度过高，导致细菌内蛋白质和脂质变性，从而抑制细菌的新陈代谢，在短时间内杀死大量细菌；另一方面，Ag@BP也会缓慢释放出银离子，破坏细菌的细胞膜并提高细菌内的ROS含量，从而抑制细菌的增殖，两者协同作用明显，杀菌效果优异。

本发明的技术方案利用纳米银/黑磷纳米片(Ag@BP)复合材料作为抗菌材料使用的方法为：将一定量的Ag@BP分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，并分别加入到育有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中，培育4h后，用808nm，2.5Wcm^-2的激光照射5min，继续培育24h后通过酶标仪测试其OD值计算细菌存活率。进一步研究Ag@BP的抗菌效果，采用平板菌落计数法进行抗菌活性试验，将上述细菌培养液稀释100倍后，取50μL涂布到固体培养基上，37℃下培育24h。

相对现有技术，本发明的技术方案的带来的有益技术效果：

(1)本发明的制备黑磷纳米片负载纳米银复合材料的制备方法简单、快速、经济，可以实现在温和条件下黑磷纳米片对纳米银一锅原位还原和负载，有效防止黑磷过度氧化，黑磷既是支撑基底，又是稳定剂，还是银离子还原剂。

(2)本发明的Ag@BP具有优异的光稳定性和光热转化性能，经其处理过的细菌，在近红外激光照射后，几乎全部死亡，具有极强的抗菌能力。

(3)本发明的Ag@BP几乎无细胞毒性，具有很好的生物安全性。

(4)本发明的Ag@BP制备方法简单，反应条件温和、成本低，应用前景大。

附图说明

【图1】为实施例与对比例1的合成示意图及对应的TEM图。由图1可以看出：超声能更好地促进银离子在黑磷纳米片表面的分散，减少纳米粒子的聚集，保证了纳米银在黑磷表面的均匀分散性。

【图2】a)为纳米银/黑磷纳米片(Ag@BP)在近红外激光照射下的抗菌机理示意图，一方面可以利用黑磷的光热效应，使局部温度过高，在短时间内杀死大量细菌，另一方面，Ag@BP也会缓慢释放出银离子，抑制细菌的增殖；b)为Ag@BP、BP和纯水的光热效果对比图，可以看出，Ag@BP很好地保持了BP的光热转化能力；由c)可以看出，Ag@BP在808nm近红外激光下具有很好的光稳定性；图d)为不同处理条件下的细菌生长曲线，其中(1)为空白对照，(2)为只有近红外激光照射，(3)为只加黑磷纳米片(对应对比例2)，(4)为只加Ag@BP(对应对比例3)，(5)为黑磷纳米片+近红外激光照射(对应对比例4)，(6)为Ag@BP+近红外激光照射(对应实施例)；e)和f)分别为对应的琼脂平板上菌落的照片和数量分析；由d)、e)和f)可以看出，经Ag@BP处理过的细菌，在近红外激光照射后，几乎全部死亡，具有极强的抗菌能力。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，基于本发明的原理对本发明所做出的各种改动或修改同样落入本发明权利要求书所限定

实施例1

步骤(1)BP纳米片的制备：

黑磷粉末样品通过超声剥离法剥离制备超薄的BP纳米片。具体过程如下：取15mg大块黑磷粉末分散在30mL饱和NaOH的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，冰浴条件下超声8h，得棕色悬浮液，随后低速离心(3000r/min)10min，以除去未剥离的黑磷残渣，取上清液即得棕色黑磷纳米片透明液体。将所得溶液贮存于4℃冰箱中待用，使用前高速(12000r/min)离心10min，得黑磷纳米片沉淀，超声分散于所需溶液中。

步骤(2)纳米银/黑磷纳米片(Ag@BP)的制备：

在黑磷纳米片的水溶液(1mL 0.10mg/mL)中加入AgNO3(100μL 10mM)，将混合液超声30分钟，12000转离心10分钟，并用纯水洗涤数次

抗菌效果的测试：

将一定量的Ag@BP分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，并分别加入到育有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中，培育4h后，用808nm,2.5Wcm^-2的激光照射5min，继续培育24h后通过酶标仪测试其OD值计算细菌存活率。进一步研究Ag@BP的抗菌效果，采用平板菌落计数法进行抗菌活性试验，将上述细菌培养液稀释100倍后，取50μL涂布到固体培养基上，37℃下培育24h。

对比例1

步骤(1)BP纳米片的制备：

黑磷粉末样品通过超声剥离法剥离制备超薄的BP纳米片。具体过程如下：取15mg大块黑磷粉末分散在30mL饱和NaOH的N-甲基吡咯烷酮(NMP)溶液中，冰浴条件下超声8h，得棕色悬浮液，随后低速离心(3000r/min)10min，以除去未剥离的黑磷残渣，取上清液即得棕色黑磷纳米片透明液体。将所得溶液贮存于4℃冰箱中待用，使用前高速(12000r/min)离心10min，得黑磷纳米片沉淀，超声分散于所需溶液中。

步骤(2)无超声条件下纳米银/黑磷纳米片(Ag@BP)的制备：

在黑磷纳米片的水溶液(1mL 0.10mg/mL)中加入AgNO3(100μL 10mM)，将混合液放置30分钟，12000转离心10分钟，并用纯水洗涤数次

对比例2

黑磷纳米片的制备同实施例1步骤(1)

抗菌效果的测试：

将一定量的BP分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，并分别加入到育有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中，培育4h后，继续培育24h，通过酶标仪测试其OD值计算细菌存活率。进一步研究BP的抗菌效果，采用平板菌落计数法进行抗菌活性试验，将上述细菌培养液稀释100倍后，取50μL涂布到固体培养基上，37℃下培育24h。

对比例3

纳米银/黑磷纳米片(Ag@BP)的制备同实施例1

抗菌效果的测试：

将一定量的Ag@BP分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，并分别加入到育有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中，培育4h后，继续培育24h，通过酶标仪测试其OD值计算细菌存活率。进一步研究Ag@BP的抗菌效果，采用平板菌落计数法进行抗菌活性试验，将上述细菌培养液稀释100倍后，取50μL涂布到固体培养基上，37℃下培育24h。

对比例4

黑磷纳米片的制备同实施例1步骤(1)

抗菌效果的测试：

将一定量的BP分散在PBS缓冲液(pH＝7.4)中，并分别加入到育有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的培养基中，培育4h后，用808nm,2.5Wcm^-2的激光照射5min，继续培育24h后通过酶标仪测试其OD值计算细菌存活率。进一步研究BP的抗菌效果，采用平板菌落计数法进行抗菌活性试验，将上述细菌培养液稀释100倍后，取50μL涂布到固体培养基上，37℃下培育24h。