专利名称：一种二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应用的制作方法
一种二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应用技术领域：
本发明涉及整体电色谱柱技术领域，具体地说，是一种二氧化硅-二氧化 钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应用。
背景技术：
蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中具有重要的调控作用，因此也是目前 翻译后修饰蛋白质组研究中的热点。但大规模分析磷酸化蛋白质在技术上还 很具有挑战性，主要的技术挑战是分析灵敏度。
由于生物体内磷酸化蛋白质的含量少、化学计量值低，因此细胞内多数 蛋白质中仅有少部分被磷酸化， 一般一个发生磷酸化的蛋白质其磷酸化的部
分仅占其总量10% ，所以即使蛋白质的表达量处于相对较高的水平，该蛋白
质的磷酸化部分的分析也很困难。目前采用的分析方法远远不能达到对复杂 组织中的磷酸化蛋白质规模化检测及位点分析的要求，所以磷酸化蛋白质谱 的分析不同于一般蛋白质表达谱的分析方法，需要建立更有效的分离手段、 更特异的富集方法和更灵敏的检测技术。目前已经发展了各种各样的富集方 法和色谱填料，如抗体亲和色谱、固定化金属亲和色谱、强阳离子交换色谱 等方法以及石墨碳、二氧化钛、二氧化锆等填料。
二氧化钛是近年来发展起来的一种新型高性能材料，其表面能和表面张 力随粒径的下降急剧增大而使其具有特殊的量子尺寸效应、体积效应、表面 效应和宏观隧道效应。此外，纳米二氧化钛还具有水油两亲和性，属"超双 亲性界面材料"。二氧化钛与磷酸根之间存在路易斯酸碱作用，能够选择性地富集蛋白质酶解产物中的磷酸化多肽。毛细管电色谱整体柱主要通过通过 单体在柱内进行原位聚合反应得到，分离介质与毛细管壁之间以共价键结合 成一整体，避免了繁琐的颗粒填充过程，也免去了制备塞子所以制备过程简 单，并且毛细管电色谱整体柱在生物样品的分离、手性体的拆分等方面获得 了应用。二氧化钛电色谱柱能够选择性地富集和分析蛋白质酶解产物中的磷 酸化多肽，与电喷雾质谱联用，可高通量、自动化分析蛋白质酶解产物中的 磷酸化多肽的信息。
通常采用的溶胶-凝胶法、化学沉淀法气相法制备纳米二氧化钛的方法都 需要后期锻烧，除了极易导致粉体团聚，从而使其的性能指标大受影响以外， 纳米二氧化钛粒径也不适于直接填充毛细管电色谱填充柱。我们采用溶胶凝
胶法采用超分子模板为结构导向剂制备特定孔结构、极高比表面积、均一可 调孔径中孔分子筛。通过二氧化钛溶胶和二氧化硅溶胶的水解共聚合，既结 合传统的硅胶整体柱机械强度理想，易于孔结构控制的优势，并提供作为电 色谱推动力的电渗流，又弓l入了二氧化钛分子对磷酸化集团的特异性吸附作 用，制备具有大孔(亦称通孔)和中孔结构，机械强度高、化学稳定性好的高 选择性新型整体固定相。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种二氧化硅-二氧化钛整 体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应用。
本发明的构思为 一种可对磷酸化多肽和蛋白质选择性富集与分离的二 氧化硅-二氧化钛整体材料的毛细管电泳开管柱制备方法；二氧化钛-二氧化 硅在超分子模板作用形成中孔分子筛，机械强度好，易于根据需要控制孔径;一步法制备均匀的高比表面积毛细管电色谱柱。 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的
一种二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法，包含步骤
为，
(一) 毛细管柱的预处理
将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10 60分钟，用水洗至中性，氮气或 空气吹干后备用；
所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米 1毫米;
所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种，其中，盐酸浓度为 0. lmol/L;硫酸浓度为0. lmol/L;硝酸浓度为0. lmol/L;优选为盐酸；
所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种，氢氧化钠溶 液浓度为lmol/L;氢氧化钾溶液浓度为lmol/L;
取50 u m的毛细管柱将其充满浓度为35% 45%的氢氟酸溶液，浓度优选 为40%，在室温下蚀刻120 160分钟后，时间优选为140分钟，用水清洗， 将蚀刻成功的接口用lmol/L氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，
用水洗净后N2吹干备用；
(二) 整体柱的制备
(1) 正硅酸乙酯、异丙醇、和水按1:4:2的摩尔比混合，滴加盐酸使溶 液pH值为2，搅拌lh;
(2) 逐滴加入摩尔比为1:1的钛酸四丁酯与乙酰丙酮的混合溶液至硅与 钛的比为l:l，搅拌30分钟；
(3) 加入超分子模板聚乙二醇或CTAB或聚环氧乙烷-聚环氧丙垸-聚环 氧乙垸或聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物至与正硅酸乙酯和钛酸四丁酯摩尔数之和的比例为1:100 1:25;
(5) 将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；
(6) 再放入水浴锅加热至3(TC 4(rC，反应时间2 5小时，陈化ld;
(7) 依次用乙醇和水洗去表面活性剂、残余的反应试剂以及小分子聚合
物；
所述的超分子模板是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯 -聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物；
与一般的二氧化钛填充柱相比，二氧化钛-二氧化硅整体材料电色谱整体 柱结合硅胶整体柱机械强度理想，易于孔结构控制的优势，硅羟基提供作为 电色谱推动力的电渗流，二氧化钛与磷酸化多肽与蛋白的磷酸根能够以路易 斯酸碱的形式结合，对磷酸化集团的特异性吸附作用。整体柱具有稳定的优 点，使用寿命较长。色谱柱制备稳定性和重复性较好，并能有效的实现对复 杂生物样品体系中磷酸化多肽与蛋白的选择性分离与富集。通过改变Si-Ti比 例与超分子模板种类，得到不同表面性质的电泳柱，制备方法简单易行，重 复性与稳定性极佳。
与现有的二氧化钛填充柱相比，本发明制备的二氧化钛开管毛细管柱采 用溶胶凝胶法，在经过蚀刻处理的毛细管柱中制备了二氧化硅-二氧化钛整体 材料，用于复杂生物样品中功能化磷酸化多肽与蛋白质的选择性富集与分离。 其制备方法简单，二氧化硅与二氧化钛分子均可与毛细管内壁表面硅羟基通 过化学键结合，将整体材料固定于毛细管中。整体材料内部结构均匀，有效 减少对蛋白质等大分子样品的非特异性吸附作用。整体材料的孔结构可通过 改变溶胶混合物中致孔剂的种类和比例方便的进行控制，得到孔径、比表面 积可调的磷酸化多肽毛细管柱。本发明二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应 用的积极效果是
(1) 采用溶胶凝胶法制备二氧化硅-二氧作钛复合整体材料，制备方法 简单，所得整体材料内部结构均匀；
(2) 可通过改变致孔剂和硅-钛比例控制复合材料的孔结构和表面性质；
(3) 重复性好，溶胶凝胶法制备的整体材料稳定性好，重复使用多次数
据较重复o
图1 Si02-Ti02整体材料扫描电镜图2 Si02-Ti02整体材料红外谱图3a a-酪蛋白的酶切肽段经Si02-Ti02整体柱富集前的质谱图； 图3b a-酪蛋白的酶切肽段经Si02-Ti02整体柱富集后的质谱图。
具体实施方式
以下提供本发明一种涂敷纳米二氧化钛的开管电泳柱的制备方法及其应 用的具体实施方式
。
实施例l
整体柱的制备将正硅酸乙酯2. 08g,异丙醇2. 404g，和水0. 36g混合， 滴加盐酸使溶液pH值为2，搅拌lh;逐滴加入摩尔比为1:1的钛酸四丁酯与 乙酰丙酮的混合溶液4. 47g，搅拌30分钟；加入CTABO. 16g， 4(TC加热3小 时，陈化ld。图1为涂Si02-Ti02整体材料电镜图。实施例2
整体柱的制备将正硅酸乙酯2. 08g，异丙醇2. 404g，和水0. 36g混合， 滴加盐酸使溶液pH值为2，搅拌lh;逐滴加入摩尔比为l:l的钛酸四丁酯与 乙酰丙酮的混合溶液4. 47g，搅拌30分钟；加入CTABO. 18g， 3(TC加热5小 时，陈化ld。图2为a-酪蛋白的酶切肽段经Si02-Ti02整体柱富集前后的质 谱图。
实施例3
整体柱的制备将正硅酸乙酯2. 08g，异丙醇2. 404g，和水0. 36g混合， 滴加盐酸使溶液pH值为2，搅拌lh;逐滴加入摩尔比为1:1的钛酸四丁酯与 乙酰丙酮的混合溶液4. 47g，搅拌30分钟；加入CTABO. 2g， 4(TC加热5小时， 陈化ld。图3a与图3b为a-酪蛋白的酶切肽段经Si02-Ti02整体柱富集前后 的质谱图。
权利要求
1.一种二氧化硅-二氧化钛有机无机杂化材料的电色谱整体柱的制备方法，其特征在于，包含步骤为，(一)毛细管柱的预处理将毛细管柱依次用稀酸、稀碱冲洗10～60分钟，用水洗至中性，氮气或空气吹干后备用；所述的稀酸选自盐酸，硫酸或者硝酸中的一种；所述的稀碱选自氢氧化钠溶液或者氢氧化钾溶液中的一种；取75μm的毛细管柱将其充满浓度35％～45％的氢氟酸溶液，在室温下蚀刻120～160分钟后，用水清洗，将蚀刻成功的接口用1mol/L氢氧化钠溶液浸泡过夜，以中和掉残余的氢氟酸，用水洗净后N2吹干备用；(二)整体柱的制备(1)正硅酸乙酯、异丙醇、和水按1∶4∶2的摩尔比混合，滴加盐酸使溶液pH值为2，搅拌1h；(2)逐滴加入摩尔比为1∶1的钛酸四丁酯与乙酰丙酮的混合溶液至硅与钛的比为1∶1，搅拌30分钟；(3)加入超分子模板聚乙二醇或CTAB或聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物至与正硅酸乙酯和钛酸四丁酯摩尔数之和的比例为1∶100～1∶25；(5)将以上溶液充入毛细管柱中，并将毛细管柱两端封口；(6)再放入水浴锅加热至30℃～40℃，反应时间2～5小时，陈化1d；(7)依次用乙醇和水洗去表面活性剂、残余的反应试剂以及小分子聚合物；所述的超分子模板是聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷或者聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物。
2. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，所述的毛细管柱为石英基质，内径为1微米 1毫 米。
3. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，盐酸浓度为 0. lmol/L;硫酸浓度为0. lmol/L;硝酸浓度为0. lmol/L。
4. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，氢氧化钠溶 液浓度为lmol/L;氢氧化钾溶液浓度为lmol/L。 '
5. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，所述的稀酸 优选为盐酸。
6. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，取75um的 毛细'管柱将其充满浓度优选为40%的氢氟酸溶液。
7. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(一)毛细管柱的预处理中，在室温下蚀 刻140分钟后，用水清洗。
8. 根据权利要求1所述的二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱 的制备方法，其特征在于，在步骤(二)开管柱整体柱的制备中，再放入水 浴中加热温度优选为4(TC，反应时间优选为3小时。
9. 根据权利要求1所述的一种二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱在复杂生物样品中手性多肽与功能性磷酸化多肽的选择性富集与分离中 的应用。
全文摘要
本发明公开了一种二氧化硅-二氧化钛整体材料的电色谱整体柱的制备方法及其应用；二氧化钛-二氧化硅在超分子模板作用形成中孔分子筛，机械强度好，易于根据需要控制孔径；一步法制备均匀的高比表面积毛细管电色谱柱。本发明的优点采用超分子模板为结构导向剂制备的特定孔结构、极高比表面积、均一可调孔径中孔分子筛，具有制备方法简单，重复性好，分离效率高的优点，适宜于磷酸化多肽的分离与富集。其中二氧化钛与二氧化硅分子与毛细管内壁表面硅羟基通过化学键结合，骨架结构及纳米孔孔径可通过改变超分子模板的种类和比例方便的进行控制，调节表面性质及孔腔化学环境以提供特异分子场。
文档编号C07K1/16GK101406827SQ200810202189
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月4日 优先权日2008年11月4日
发明者张凌怡, 张维冰, 杜一平 申请人:华东理工大学