本发明涉及含有重构肺表面活性物质的含水悬浮液形式的稳定药物制剂。所述制剂适用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(rds)和其它呼吸性障碍(respiratorydisorder)。
背景技术：
：人肺由大量称为肺泡的小气囊组成，其中气体在血液和肺部空气间隙之间交换。在健康个体中，这种交换通过含蛋白质的表面活性物质复合物的存在来介导，该复合物可防止肺在呼气结束时塌陷。肺表面活性物质复合物主要由脂质组成，并含有少量的各种蛋白质。缺乏足够水平的这种复合物会导致肺部功能障碍。这种综合征称为呼吸窘迫综合征(rds)，通常影响早产儿。所述综合征用从动物肺中提取的市售修饰的(modified)天然表面活性物质制备物(surfactantpreparations)有效地治疗，例如称为的金标准制备物。这些表面活性物质制备物的主要成分是磷脂和表面活性物质疏水蛋白b和c(sp-b和sp-c)。由于来自动物组织的表面活性物质制备物的缺点，例如生产过程的复杂性，以及可能的病毒污染和/或免疫反应的诱导，已经获得了合成的表面活性物质。所述合成的表面活性物质可以是合成的化合物的简单混合物，主要是磷脂和其它脂质的简单混合物，并且被称为“人造”表面活性物质；尽管它们已经在临床实践中使用多年，但它们的效力与修饰的天然表面活性物质的效力不可比。目前也在开发含有表面活性蛋白/肽的人造表面活性物质。它们被称为“重构的(reconstituted)”表面活性物质或“生物模拟的表面活性物质”。已经公开了包含类似于人表面活性蛋白的sp-b和sp-c类似物的重构表面活性物质，例如在wo00/76535、wo2008/011559和wo2008/044109中所公开的。特定的重构表面活性物质已在wo2010/139442中公开，并在文献中引用为chf5633。chf5633包含：a)1.5重量％的具有如下序列的天然表面活性蛋白sp-c的多肽类似物：ipsspvhlkrlkllllllllilllilgalllgl(seq.id:no.1)；b)0.2重量％的具有如下序列的天然表面活性蛋白sp-b的多肽类似物：cwlcralikriqalipkggrllpqlvcrlvlrcs(seq.id:no.2)；c)约49.15重量％的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)；和d)约49.15重量％的1-棕榈酰-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(popg)的钠盐；所有的量都是根据重构表面活性物质的总重量计算的。通过以下来制备chf5633：在乙醇和氯仿的混合物存在下混合多肽和磷脂，然后通过在真空下蒸发除去有机溶剂。所述方法允许在低粘度(不超过20mpas，优选小于15mpas，在25℃下)的水性介质(至多80mg/ml)中获得浓缩悬浮液，其中表面活性物质的形式为以下的高度分散的混合物：脂质体囊泡(vesicles)，即多层囊泡(mlv)，巨单层囊泡(guv)，大单层囊泡(luv)和小单层囊泡(suv)，普遍是mlv。制备小体积浓缩悬浮液的可能性确实是其临床应用特别重要的特征。上述chf5633的含水悬浮液，对于早产新生儿，以80mg/ml的总浓度单次气管内施用，变得安全有效。另一方面，除了良好的效力外，上述表面活性物质组合物还应满足适于商业销售(commercialdistribution)、储存和使用的足够的保质期的要求。因此，上述制剂将表现出至少与修饰的天然表面活性物质如相同的化学和物理稳定性，即在5℃下至少18个月的化学和物理稳定性。wo2010/139442的实施例2报道了在5℃下储存6个月后，简单含水悬浮液形式的制剂在物理化学上是稳定的。在该上下文中，表达在物理上稳定尤其意味着粘度基本上不随时间变化。然而，观察到在超过6个月的时间段，粘度趋于增加至在25℃下约50mpas的值。在该文献中，据报道，磷脂的水解在中性附近达到最小值，并且它可能受缓冲种(bufferspecies)的影响。wo92/22315和wo2010/139442一般性地公开了配制成液体悬浮液的合成肺表面活性物质可含有少量辅助物质，例如ph缓冲剂(bufferingagent)。然而，尽管现有技术提供了关于基于磷脂的表面活性物质的化学稳定性的一些一般性指示，但没有文献公开了获得包含与sp-c和sp-b蛋白的合成类似物组合的磷脂的肺表面活性物质组合物的特定条件，所述肺表面活性物质组合物具有对于药物应用而言足够的化学和物理稳定性，即在5℃下至少18个月的化学和物理稳定性。通过本发明解决了上述问题。技术实现要素：本发明涉及一种不含推进剂的现成可用的(ready-to-use)药物制剂，其呈含水悬浮液形式，包含：a)1.02至1.32mg/ml天然表面活性蛋白sp-c的多肽类似物，其序列为：ipsspvhlkrlkllllllllilllilgalllgl(seq.id:no.1)；b)0.136至0.176mg/ml天然表面活性蛋白sp-b的多肽类似物，其序列为：cwlcralikriqalipkggrllpqlvcrlvlrcs(seq.id:no.2)；c)33.42至43.25mg/ml的1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)；d)33.42至43.25mg/ml的1-棕榈酰-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油的钠盐(popgna)；e)0.5至3.5mg/ml的缓冲剂(bufferagent)，其选自三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐或磷酸盐缓冲液；和f)张度剂，其量足以提供约250至约400mosm/l的摩尔渗透压浓度(osmolarity)；其中ph值介于6.4和7.6之间。在第二方面，本发明涉及要求保护的药物制剂在制备用于预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(rds)和其它呼吸性障碍的药物中的用途。本发明还提供一种预防和/或治疗呼吸窘迫综合征(rds)和其它呼吸性障碍的方法，所述方法包括对有此需要的患者施用治疗有效量的所述药物制剂。本发明还涉及试剂盒，其包含：a)第一单元剂型(unitdosageform)的粉末形式的本发明组合物；b)第二单元剂型的药学上可接受的载体；c)容纳所述第一和第二剂型的容器装置(containermeans)。此外，本发明提供了一种避免在药物制剂储存期间粘度增加的方法，所述药物制剂的形式是包含与sp-c和sp-b蛋白的合成类似物组合的磷脂的重构肺表面活性物质组合物的含水悬浮液，所述方法包括用合适的缓冲剂将ph调节至6.4和7.6之间。定义表面活性物质制备物的“表面活性物质的活性(surfactantactivity)”定义为降低表面张力的能力。外源性表面活性物质制备物的体外效力通常通过以下来测试：使用合适的设备如wilhelmybalance和captivebubblesurfactometer测量其降低表面张力的能力。外源性表面活性物质制备物的体内效力通常通过测量两个参数来测试：i)作为肺顺应性指数的潮气量，和ii)肺气体体积，其是肺泡气体膨胀或呼气结束时通畅性(patency)的指标，因此也是在呼气结束时在肺泡中形成稳定的磷脂膜的能力的指标。本文所用的“治疗有效”量是指能够预防、避免、减少或消除与内源性表面活性物质的缺乏或功能障碍相关的呼吸性疾病(respiratorydisease)或障碍的重构肺表面活性物质的量。术语“药学上可接受的”或“生理学上可耐受的”是指能够对人施用而不产生不希望的生理作用的组合物、介质(medium)、溶剂、盐。“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。氨基酸序列按照单字母代码显示，其氨基酸在左端(氨基末端)带有游离氨基，而氨基酸在右端(羧基末端)带有游离羧基。本文鉴定的所有氨基酸残基都是天然l-构型。例如在wo2008/044109中报道了氨基酸的单字母代码的含义。术语“天然表面活性蛋白sp-c的多肽类似物”是指具有氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中，与天然sp-c蛋白相比，氨基酸缺失和/或已经被其它氨基酸取代，只要多肽在与磷脂的混合物中显示出肺表面活性物质的活性(如通过体外和体内效力测定所证明的)。术语“天然表面活性蛋白sp-b的多肽类似物”是指具有氨基酸序列的多肽，在所述氨基酸序列中，与天然sp-b蛋白相比，氨基酸缺失和/或已被其它氨基酸取代，只要多肽在与磷脂的混合物中显示出肺表面活性物质的活性(如通过体外和体内效力测定所证明的)。当针对例如细胞、或核酸、蛋白质或载体使用“重组”时，所述“重组”表示通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质来修饰细胞、核酸、蛋白质或载体。应用于值的术语“约”表示±1％的变异性。术语“磷脂”表示其中一种脂肪酸被磷酸基团和简单的有机分子取代的脂质。可在表面活性物质制备物中发现的最常见类别的磷脂是：磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰甘油(pg)、磷脂酰肌醇(pi)和磷脂酰丝氨酸(ps)。磷脂的甘油部分主要用长链脂肪酸酯化，而长链脂肪酸又可以是饱和的(例如肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸)、单不饱和的(例如油酸)或多不饱和的(例如亚油酸和花生四烯酸)。特别是，在应用中考虑的物质是：-1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱，也称为二棕榈酰基-磷脂酰胆碱(dppc)，其为饱和衍生物，和1-棕榈酰-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油，也称为作为单不饱和衍生物的棕榈酰-油基-磷脂酰甘油(popg)。在本申请中，囊泡的粒度以体积直径表示，特别是以d(v,50)表示，其对应于50重量％的颗粒的体积。所述粒度可通过已知技术定量，例如激光衍射或单粒子光学筛分。术语“磷酸盐缓冲液”是指广泛用于生物学应用的药学上可接受的缓冲剂，其具有例如以下组成之一：na2hpo4七水合物，和nah2po4一水合物，或na2hpo4二水合物，和nah2po4二水合物，或nacl，kcl，na2hpo4和kh2po4(下文称为pbs)或nacl，na2hpo4七水合物和nah2po4一水合物。所述缓冲液在25℃下具有约7.2的pka2，并且它们的最佳缓冲容量在ph6.5-8.0的范围内。“三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐”也称为2-氨基-2-羟甲基-丙烷-1,3-二醇盐酸盐或tris，是药学上可接受的缓冲剂，广泛用于生物学应用。tris在25℃时的pka为8.06，其最佳缓冲容量在ph7.2-8.5的范围内。发明详述本发明部分基于意外的发现，即可以避免在药物制剂储存期间粘度增加，所述药物制剂的形式是包含与sp-c和sp-b蛋白的合成类似物组合的磷脂的重构肺表面活性物质组合物的含水悬浮液。虽然众所周知ph对磷脂的水解动力学有影响，但已发现控制ph对于在储存期间保持所述重构肺表面活性物质的低粘度也是必要的。还已知磷脂含水悬浮液的初始粘度取决于囊泡的粒度分布和形状，其又取决于应用于制备肺表面活性物质的方法。因此，还发现，一旦形成囊泡，为了避免在储存期间其尺寸和形状的变化，必须严格控制缓冲剂的类型和量。特别地，缓冲液的量不应太高以至于不能避免囊泡的融合或沉淀现象，也不应太低以至于降低其缓冲能力。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种不含推进剂的现成可用的药物制剂，其呈含水悬浮液形式，包含：a)1.02至1.32，优选1.2mg/ml天然表面活性蛋白sp-c的多肽类似物，其序列为：ipsspvhlkrlkllllllllilllilgalllgl(seq.id:no.1)；b)0.136至0.176mg/ml，优选0.16mg/ml天然表面活性蛋白sp-b的多肽类似物，其序列为：cwlcralikriqalipkggrllpqlvcrlvlrcs(seq.id:no.2)；c)33.42至43.25mg/ml，优选39.32mg/ml的1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dppc)；d)33.42至43.25mg/ml，优选39.32mg/ml的1-棕榈酰-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油的钠盐(popgna)；e)0.5至3.5mg/ml的缓冲剂，其选自三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐或磷酸盐缓冲液；和f)张度剂，其量足以提供约250至约400mosm/l的摩尔渗透压浓度；其中ph值介于6.4和7.6之间。结果证明上述制剂在5℃下在物理和化学上稳定至少18个月，并且出乎意料地未观察到粘度增加。此外，所述制剂在延长的时间段内保持易于再分散，并且在再分散时，不会迅速地絮凝而阻止再现给予(preventreproducingdosing)活性成分。本领域还已将seqidno：1的多肽鉴定为spc-33(leu)，而seqidno：2的多肽也已鉴定为mini-b(leu)。在一个优选的实施方案中，seqidno：2的多肽是二硫键连接分子的形式，其中分子内二硫键位于1-和33-位的两个半胱氨酸残基之间和/或4-和27-位的两个半胱氨酸残基之间。所述多肽在本领域中也被鉴定为氧化的mini-b(leu)。有利地，两种多肽可以以药学上可接受的盐的形式存在。所述盐包括，例如，盐酸、乙酸和三氟乙酸的盐。优选地，两种多肽都以乙酸盐的形式存在于组合物中。1-棕榈酰-2-油基-sn-甘油-3-磷酸甘油(popg)的钠盐可以有利地以相当的(equivalent)药学上可接受的盐的形式存在，例如钾盐。相应的相对量可以由本领域技术人员容易地确定。上述制剂的摩尔渗透压浓度应为约250至约400mosm/l，优选为280mosm/l至380mosm/l，更优选为300mosm/l至350mosm/l。有利地，张度剂选自右旋糖、甘露醇、山梨糖醇、氯化钾和氯化钠。优选地，张度剂是氯化钠，浓度为9mg/ml。制剂的ph介于6.4至7.6之间，优选6.5至7.5之间，更优选6.8至7.4之间，最优选6.9至7.2之间。可以根据熟知的方法测定ph，并且估计值应该考虑实验误差，通常为±0.2单位。有利地，缓冲剂选自三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(tris)或磷酸盐缓冲液。有利地，缓冲剂的量介于0.5mg/ml至3.5mg/ml之间，优选0.6至3.0mg/ml之间，对应于5-20mmol，优选10mmol。有利地，磷酸盐缓冲剂可以以介于0.6至2.8mg/ml之间的浓度使用。在本发明的一个实施方案中，磷酸盐缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在更优选的实施方案中，缓冲剂可以由na2hpo4七水合物和nah2po4一水合物，或na2hpo4二水合物和nah2po4二水合物制成。在磷酸盐缓冲剂的情况下，计算其量而不考虑形成所述缓冲液的盐的水合程度。缓冲剂的mg/ml与mmol浓度之间的对应关系可由本领域技术人员容易地确定。本领域技术人员还应适当调节两种磷酸盐物质的相对量，以在要求保护的间隔内达到所需的ph。有利地，本发明制剂的粘度在37℃小于10mpas(1mpas对应于1cp)，优选小于8mpas。粘度在25℃小于15mpas，优选小于10mpas。在储存期间粘度不显著变化。粘度可以用市售的普通粘度计根据已知方法测定。囊泡的粒度介于1至25微米之间，优选为8至15微米的d(v,50)，用accusizer780ad仪器(teehaichempteltd，singapore)测定。可以根据已知的合成方法或已知的重组技术制备seqidno：1和seqidno：2的多肽。可以在以下中找到可用技术的优秀总结：j.m.steward和j.d.young，“solidphasepeptidesynthesis”，w.h.freemanco.，sanfrancisco，1969，和j.meienhofer，hormonalproteinsandpeptides”，vol.2，p.46，academicpress(纽约)，1983年(针对固相肽合成)，以及e.schroder和k.kubke，“thepeptides”，第1卷，academicpress(纽约)，1965年(针对经典溶液合成)。多肽可以优选使用merrifield在以下中最初描述的固相合成技术制备：j.am.chem.soc.85：2149-2154(1963)。其它多肽合成技术可以在例如m.bodanszky等，peptidesynthesis，johnwiley&sons，2nded.，(1976)以及其它已知的参考文献中找到。用于这种合成的适当保护基团可以在上述文本以及j.f.w.mcomie，protectivegroupsinorganicchemistry，plenumpress，newyork，ny(1973)中找到。例如，两种多肽可如wo2008044109中所述制备。如下所述，用于治疗诸如rds的疾病的本发明的重构表面活性物质制剂的有效剂量根据许多不同因素而变化，包括疾病的类型、施用方式、患者的体重和生理状态、以及治疗是预防性还是治疗性的。通常，剂量包括0.01mg至10g/kg体重，优选0.1至1g/kg体重，并且施用频率可以根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。典型地，以一剂施用约50mg/kg、100mg/kg或200mg/kg的剂量。对于在新生儿中使用，一次或两次施用一般就足够了。尽管需要可以根据呼吸性疾病的严重程度和/或其它变量而变化，但是技术人员可以容易地确定有效剂量的最佳范围的确定。制剂可以以单元剂量或多剂量容器存在，例如密封的安瓿和小瓶(vial)，或者可以在冷冻或冷冻干燥(冻干)条件下储存，只需在使用前立即加入无菌液体载体。优选地，本发明的制剂作为一次性玻璃小瓶中的无菌含水悬浮液提供。多肽a)和b)以及磷脂c)和d)的总浓度典型地为20mg/ml至100mg/ml的范围内。当配制成单个小瓶时，其优选为80mg/ml。存在于本发明药物制剂中的重构肺表面活性物质可根据制药工业中的常规技术制备。这些技术包括在有机溶剂存在下混合多肽和磷脂的步骤。然后通过以下除去溶剂：透析，或在氮气下和/或暴露于真空下蒸发或通过其它已知的适当技术，例如冷冻干燥。优选地，在98：2的比例(v/v)的氯仿和乙醇的存在下混合所述重构肺表面活性物质、多肽和磷脂，然后在氮气下通过蒸发除去两种溶剂。然后将所得粉末均匀且紧密地与液体载体结合。多肽和磷脂的混合物可以在除去溶剂之前灭菌，例如通过无菌过滤。在某些其它实施方案中，最终根据已知方法对重构表面活性物质组合物进行灭菌。本发明制剂的施用以已知的方式进行，例如，通过气管内滴入(intratrachealinstallation)(输注或推注(bolus)或通过导管)。如本文所公开的，表面活性物质制剂典型地用于“推注”型施用，单独或任选地与用于治疗呼吸性疾病或障碍的其它化合物或组合物联合。例如，如果受试者正在接受由细菌感染引起的呼吸性障碍的治疗，则本发明的重构表面活性物质可以与用于治疗细菌感染的另一种化合物(例如抗生素)联合施用。另外，在某些情况下，例如为了预防诸如支气管肺发育不良的并发症，本发明的重构表面活性物质可以与皮质类固醇如布地奈德和二丙酸倍氯米松联合施用。本发明的组合物和再悬浮载体可以在合适的容器装置中同时分开地包装。在合适的容器装置中这种组分的分开包装也称为试剂盒。因此，本发明还涉及试剂盒，其包含：a)第一单元剂型的粉末形式的本发明组合物；b)第二单元剂型的药学上可接受的载体；和c)用于容纳所述第一和第二剂型的容器装置。用于施用本发明制剂的各种方法是已知的。根据疾病的类型，例如患有呼吸窘迫综合征的婴儿或成人，不同的治疗方法可能是合适的。典型地，本发明的制剂通过气管内滴注施用保持在连续或间歇正压通气(ippv)下的患者(例如早产儿)。或者，表面活性物质可以通过使用放置在气管中的薄导管(thincatheter)施用，和根据称为鼻腔持续气道正压通气(nasalcontinuouspositiveairwaypressure)(ncpap)的方法特殊设计的鼻部装置(例如面罩、尖头或管)支持患者呼吸。后一种方法只可能用具有低粘度的表面活性物质，因为高粘度会使表面活性物质通过薄导管更加困难。本发明的制剂适于预防、延迟、减轻、阻止或抑制与呼吸性疾病相关的症状或病症的发展。特别是，它可用于预防和/或治疗早产婴儿的呼吸窘迫综合征(rds)或与表面活性物质缺乏或功能障碍相关的其它疾病，包括急性肺损伤(ali)、成人rds(ards)、胎粪吸入综合征(mas)和支气管肺发育不良(bpd)。它也可用于预防和/或治疗其它呼吸性障碍，如慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、呼吸道感染(respiratoryinfection)(如肺炎、卡氏肺囊虫(pneumocystitscarinii)、囊性纤维化和呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus))以及治疗浆液性中耳炎(胶耳)。以下实施例更详细地说明了本发明。实施例1-根据本发明的制剂的制备将1：1比例的dppc：popgna、spc-33(leu)和氧化的mini-b(leu)的混合物溶解在氯仿/乙醇98：2(v/v)中。蒸发溶剂，随后在搅拌下和在10mmol磷酸盐缓冲盐水存在下，将所得粉末在0.9％w/vnacl水溶液中水合，得到80mg/ml的表面活性物质浓度。制剂1的单一组合物(unitarycomposition)列于表1中。表1-制剂1成分％浓度sp-c33(leu)1.491.2mg/ml氧化-mini-b(leu)0.20.16mg/mldppc48.739.32mg/mlpopgna48.739.32mg/mlna2hpo4七水合物0.58mg/mlnah2po4一水合物1.55mg/mlnacl9mg/ml水q.b.ph被证明为6.9±0.2。所述制剂的粘度在25℃下为约9cp，在37℃下为约7cp。通过用10mmoltrishcl或由na2hpo4二水合物和nah2po4二水合物制成的10mmol磷酸盐缓冲液替换pbs来获得类似的制剂。实施例2-对实施例1的制剂进行稳定性研究在5℃下评估填充在3ml琥珀色小瓶中的制剂的稳定性。通过hplc测定spc-33(leu)、氧化的mini-b(leu)和两种磷脂的测定。还通过hplc测定总杂质并表示为百分比。总杂质包括在储存期间形成的溶解形式的溶解-pc和溶解-pg。还测试了以下参数：囊泡的ph、粘度和粒度。为了测定粘度，将样品放置在37℃下恢复。结果报告在表2中。在5℃下，本发明的制剂被证明在物理和化学上稳定至少18个月。事实上，在可接受的实验误差(±5％)内未观察到四种组分的测定的显著变化。溶解-pc+溶解-pg的总量远低于5.0％。此外，粘度在实验误差的限度内基本保持不变，并且没有观察到显著的增加。用制剂2观察到类似的发现。实施例3-制剂1的体内活性在t＝0和在5℃下18个月后测试实施例1的制剂1的体内活性。在早产新生兔中测定制剂1，所述兔通过子宫切除术在孕龄27天获得。在不施加呼气末正压(peep)的情况下进行实验。接受的动物作为阳性对照，且未处理的同窝仔作为阴性对照。所有表面活性物质制备物以80mg/ml的浓度和2.5ml/kg的标准剂量施用。未成熟的新生兔与标准化顺序的峰值吹气压力并行通气。为了打开肺部，压力首先设定在35cmh2o，持续1分钟。在这次肺复张(recruitmentmanoeuvre)之后，压力降低到25cmh2o，持续15分钟，再进一步到20和15cmh2o。最后，压力再次增加至25cmh2o，持续5分钟，之后用氮气将肺通气另外5分钟，然后切除以进行气体体积测量。测量潮气量和肺气体体积，以ml/kg表示，并且被证明在t＝0和在5℃下18个月后相似。序列表<110>chiesifarmaceuticispa<120>包含重构肺表面活性物质组合物的稳定药物制剂<130>1721pct<160>2<170>patentin版本3.3<210>1<211>33<212>prt<213>智人<400>1ileproserserprovalhisleulysargleulysleuleuleuleu151015leuleuleuleuileleuleuleuileleuglyalaleuleuleugly202530leu<210>2<211>34<212>prt<213>智人<400>2cystrpleucysargalaleuilelysargileglnalaleuilepro151015lysglyglyargleuleuproglnleuvalcysargleuvalleuarg202530cysser当前第1页12