一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液及其制备方法和用途与流程

本发明涉及医用示踪诊断试剂领域，更具体地，涉及一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液及其制备方法和用途。

背景技术：

胃肠癌是当前世界范围内致死率最高的肿瘤之一。我国属于胃肠癌高发区，胃癌和结直肠癌分别居各类癌症死因的第三、四位，死亡率分别达17.96/10万、12.59/10万。淋巴结转移是胃肠癌主要的转移方式，其转移情况的评估是决定手术方式、精确病理分期、制定辅助治疗方案的最主要依据。术前医生多借助影像学方法对癌转移淋巴结进行评估。如B超、CT及磁共振等方法，但这些影像学方法都只能通过淋巴结的大小及形态来判断是否存在癌转移，准确率仅达到69-77%，越小的淋巴结越难以准确判断。近年来，FDG-PET已广泛应用于临床，但对胃肠癌淋巴结转移评估准确率也仅46-85%，且由于设备限制，无法进行术中实时定位及检测。另外，临床上还有一些染料如美兰、专利蓝、异硫蓝，核素如锝99，和外源性荧光剂如吲哚菁绿以及纳米炭悬浊液等淋巴结示踪剂相继运用于临床。虽然上述示踪剂实现了术中可视化淋巴结，但仍然无法实现术中辨认癌转移淋巴结。

术中为了了解区域淋巴结的转移情况，外科医生尝试通过淋巴结示踪找出可疑的前哨淋巴结，再对其进行术中冰冻病理检测，以此判断区域淋巴结的转移情况，指导区域淋巴结清扫范围。这一技术在黑色素瘤和乳腺癌等肿瘤中取得了较好的效果。但推广至胃肠癌时却因为存在检测盲区及跳跃转移等因素，使得前哨淋巴结对胃肠癌淋巴结转移状态的预测敏感性并不尽如人意。

因此，目前临床尚缺乏一种高特异性、高敏感性，且能在术中实时示踪癌转移淋巴结的示踪剂。

2、国内外研究现状

近年来研究证明，给予外源性5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）可使肿瘤细胞内原卟啉积聚而产生远高于正常细胞的自体荧光，其荧光强度差别最大可达到30余倍，自体荧光差异可用于术中区别肿瘤细胞和正常细胞。但是临床实验显示，口服或静脉注射ALA诱导卟啉荧光对人体胃肠癌转移淋巴结诊断还停留于离体标本，虽然特异性较高，但敏感性却不尽如人意，容易出现假阳性及假阴性的结果。发明人分析原因在于：（1）由于ALA诱导的自体荧光在白光下不具有可视化示踪的效果，腹腔内活体组织中运用荧光检测器检测无法做到有的放矢，为了避免淋巴结遗漏，只能选择对离体标本进行荧光检测。（2）虽然口服或静脉给予外源性ALA可使淋巴结中原卟啉蓄积，产生强度高于正常细胞10倍的自体荧光，但同时淋巴结周围脂肪或结缔组织也会因为ALA浓度增高，而原卟啉继续代谢形成血红素所必须的游离铁离子相对不足，导致原卟啉蓄积，产生自体荧光，影响肿瘤转移淋巴结中卟啉荧光的观察，出现假阳性或假阴性的结果。（3）由于口服及静脉给予外源性ALA后经全身血循环进入淋巴结中ALA浓度的限制，微小淋巴结中小于200μm的转移灶几乎不可能产出足以检测到的自体卟啉荧光，出现假阴性结果。

要解决上述口服及静脉使用外源性ALA的不足，可以通过两个途径：（1）在使用ALA诱发癌转移淋巴结自体荧光的基础上将区域淋巴结进行可视化染色，针对肉眼可见的淋巴结进行有的放矢的荧光检测，既可以最大程度上避免遗漏微小淋巴结的检测又可以缩短术中进行荧光检测的时间，使活体淋巴结的实时评估成为可能。（2）选择直径可控的纳米材料作为药物载体通过肿瘤周围粘膜下注射，将外源性ALA靶向运送至淋巴结中，既可以进一步增加淋巴结中ALA的浓度，提高癌转移淋巴结特别是微小癌转移淋巴结中自体荧光的强度，又可减少淋巴结周围组织中ALA蓄积，降低干扰自体荧光的强度，使癌转移淋巴结荧光对比度增加，提高检测的敏感性。

为此，我们在前期工作中，利用葡聚糖及其衍生物与磁性氧化铁(SPIO)共沉淀技术合成了直径为100-150nm的纳米氧化铁杂化物分散液（DIONs）（专利申请号：CN201610078979.3），实现了黑染淋巴结的可视化效果，为携载ALA特异性示踪淋巴结提供良好载体。

技术实现要素：

本发明为克服上述现有技术所述的至少一种缺陷（不足），提供一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液，并进一步提供一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的制备方法和用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：

一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液，包括葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中；所述纳米氧化铁杂化物由葡聚糖衍生物与铁盐通过共沉淀法制得；所述葡聚糖衍生物由5-氨基乙酰丙酸与氧化葡聚糖通过席夫碱反应制得。

进一步的，所述纳米氧化铁杂化物的直径为100-180nm之间。

本发明还公开一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的用途，所述用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行癌转移淋巴结示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤组织周围局部注射使用。

本发明还公开一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的制备方法，包含以下步骤：

S1、氧化葡聚糖的合成：取葡聚糖溶于去离子水中，加入高碘酸钠，于室温避光反应20-28h；滴加乙二醇或丙三醇，搅拌，透析冻干得到氧化葡聚糖；

S2、葡聚糖衍生物的合成：取氧化葡聚糖溶于pH8.0的磷酸盐缓冲液中，加入5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，避光反应20-28h后透析冻干得到葡聚糖衍生物；

S3、荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的制备：取葡聚糖衍生物与三价铁盐溶于水中形成溶液，将溶液冷却至0℃左右，低温下混合均匀待用；取二价铁盐溶于水中，过滤后与上述溶液在氮气氛围下搅拌充分后，加入一水合氨溶液，在0-4℃下充分反应1-3h；升高温度至70-100摄氏度，在氮气氛围下持续搅拌1-3h，搅拌速率为500-20000rpm；冷却至室温，超滤除去未反应的葡聚糖和氨水，透析冻干后得到纳米氧化铁杂化物分散液。

进一步的，所述三价铁盐为FeCl₃，所述二价铁盐为FeCl₂。

进一步的，二价铁盐与三价铁盐的化学计量摩尔比为1:1-2。

进一步的，所述葡聚糖分子量为30~50KDa。

进一步的，所述葡聚糖分子量为10~100KDa。

与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：

（1）本发明采用葡聚糖及其衍生物修饰，多糖上具有丰富的官能团，可与其他药物，核素，染料等分子反应，进行功能化衍生。

（2）本发明直接用葡聚糖及其衍生物修饰纳米氧化铁制备纳米杂化物分散液，实现胃肠癌转移淋巴结的特异性示踪，准确定位癌转移淋巴结，为精确手术清扫范围提供新思路，实验简单，省去了一系列繁琐操作，同时利用多糖上的羟基，分散稳定纳米杂化物分散液，提高其水溶性。

（3）本发明制备出的荧光特异性纳米杂化物分散液可用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行癌转移淋巴结示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤组织周围局部注射即可。

（4）本发明制备出的纳米杂化物分散液有望应用于胃肠癌转移淋巴结评估，并可通过葡聚糖的功能衍生，偶联抗肿瘤药物，达到诊疗一体化的目的。

附图说明

图1为本实施例1中一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液合成示意图；

图2为本实施例3中一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的粒径分布（动态光散射法测定）；

图3为本实施例3中一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的组分分析；

图4为本实施例3中局部注射60mg/mL荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液2h、6h、12h、24h、36h后区域癌淋巴结示踪情况；

图5为本实施例3中局部注射60mg/mL荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液2h、6h、12h、24h、36h、48h后血清肝肾功能检测；

图6为本实施例3中局部注射60mg/mL荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液48h后，淋巴结、肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏等组织器官内铁元素含量检测；

图7为本实施例3中局部注射60mg/mL荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液48h后，肝脏、肾脏、心脏、肺、脾脏等组织器官普鲁士及H&E染色情况；

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征更易被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围作出更为清楚的界定。

实施例1

如图1，一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液（5ALA-Dex-SPIO），包括葡聚糖衍生物、氧化铁颗粒和水，所述葡聚糖衍生物与氧化铁颗粒相结合形成纳米氧化铁杂化物，所述纳米氧化铁杂化物均匀分散在水中；所述纳米氧化铁杂化物由葡聚糖衍生物与铁盐通过共沉淀法制得；所述葡聚糖衍生物由5-氨基乙酰丙酸(5ALA)与氧化葡聚糖通过席夫碱反应制得；所述纳米氧化铁杂化物的直径为100-180nm之间。

实施例2

一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的用途，本实施例采用实施例1所述的用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液，所述用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液用于胃肠癌、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤的术前、术中局部注射进行癌转移淋巴结示踪，使用时在胃肠癌粘膜或浆膜下、乳腺癌、甲状腺癌等实体恶性肿瘤组织周围局部注射使用。

实施例3

一种用于癌转移淋巴结示踪的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的制备方法，包括以下步骤，

S1：氧化葡聚糖的合成：

称取5.0g的葡聚糖（分子量10KDa）（Dextran）溶于400 mL去离子水中，然后加入高碘酸钠(1.25g溶于100 mL去离子水中)(NaIO₄)，于室温避光反应24 h，滴加2mL乙二醇使未反应的高碘酸钠失活，继续搅拌1 h后，反应产物置于截留分子量为10000 的纤维素透析袋中，用去离子水透析3天，冻干得氧化葡聚糖。

S2：葡聚糖衍生物的合成：

称取0.1g的氧化葡聚糖溶解于pH8.0的磷酸盐缓冲液中，加入0.01g 5-氨基乙酰丙酸盐酸盐，避光反应24h后透析冻干，得到葡聚糖衍生物，通过核磁红外表征。

S3：荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液的制备

称取3.0g 葡聚糖衍生物和0.32g（1.2mmol）FeCl₃溶于10mL水中，用0.22μm的滤膜过滤，将溶液冷却至0℃，将0.13g（0.63mmol）FeCl₂溶于0.45ml 冰水中，用0.22μm的滤膜过滤后加入上述溶液中，氮气氛围下充分搅拌，逐滴加入冰的一水合氨溶液0.4ml，于0℃下充分混匀后升温至80℃，氮气氛围下持续搅拌1h，将溶液冷却至室温，用超滤除去过量的葡聚糖和氨水，反应透析后，冻干，配制75 mg/mL 的纳米氧化铁杂化物分散液。

取上述分散液3mL，利用BI-200SM型光散射仪（BrookhavenInstruments，USA）对其粒径及粒径分布进行表征，激发光源波长为532nm，散射角为90度。所有测试均在25°C下进行，并重复五次。得到粒径分布图，如图2所示，平均粒径为150nm左右。

最后，可将配制成的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液，通过 220nm过滤器过滤除菌，消毒玻璃瓶避光、密封4℃冰箱保存备用。

实验结果：

对上述荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液进行药效学，研究（大鼠淋巴结的示踪），具体如下：

动物：无胸腺裸鼠（CAnN.Cg-Foxn1nu/Crl mice），4～6周龄、体重14～16g，购自南方医科大学实验动物中心。

细胞：胃癌HGC-27细胞株，购自Cellbio (中国上海) 。

药品：荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液（60mg/mL）。

方法：首先将胃癌细胞悬液接种到裸鼠腋周皮下，建立腋周转移淋巴结裸鼠模型。再将一定浓度的样品、在不同时间点经皮下注射于淋巴结周围，用小动物活体荧光立体显微镜成像分析裸鼠模型腋周淋巴结荧光效果，同时取血检测肝肾功能。之后离体淋巴结、肝脏、肾脏、心脏、肺脏、脾脏等组织器官，送病理做普鲁士蓝染色（Perls）和H&E染色、免疫组化分析及铁元素含量分析。

具体如下：

（1）胃癌腋周转移淋巴结裸鼠模型的建立

a、将含1×10⁷个胃癌细胞（HGC-27）的悬液随机接种到裸鼠右侧腋窝皮下，常规鼠类全价饲料喂养。饲养环境SPF级，自由饮水，饲养房温度为21±20℃，湿度30%~50%，光照时间平均每天12小时。

b、饲养6~8周后，观察成瘤情况，离体腋周淋巴结，制备冰冻切片进行免疫组化染色，明确是否有癌细胞转移。

（2）药物对胃癌裸鼠模型转移淋巴结原卟啉Ⅸ积聚的时间动力学变化

配制60mg/mL浓度的荧光特异性纳米氧化铁杂化物分散液。将成瘤裸鼠随机分成5组，每组6只。将1mL样品经皮下注射于淋巴结周围，分别饲养2、6、12、24、36h后实验。

（3）胃癌裸鼠模型样品处理

a、抽取1%戊巴比妥钠注射液注射于裸鼠腹腔麻醉，用小动物活体荧光立体显微镜成像分析裸鼠模型腋周淋巴结荧光效果。

b、取血测查肝功能（AST、ALT、TBIL、DBIL）、肾功能（BUN、Cr）；取心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、淋巴结等组织，一部分离体组织用10%福尔马林立即固定，密封避光保存，送活检做普鲁士蓝染色和H&E染色；另一部分离体组织行冰冻切片做Ki-67免疫组化分析及铁元素含量分析。

c、将活体、离体组织、病理切片的荧光分析结果进行定性定量的对比分析

结果：

对比正常裸鼠和成瘤裸鼠注射样品后，可见成瘤裸鼠淋巴结荧光强度高于正常裸鼠的淋巴结荧光强度，且在注射样品2h后，达到肉眼可见最亮荧光强度（图4-A）。对应的淋巴结内铁元素含量测定实验（Perls染色法）显示成瘤裸鼠淋巴结内的铁元素平均含量高于正常裸鼠淋巴结内的铁元素含量(图4-B)。对应的淋巴结内以Ki-67为抗体标记的免疫组化显示成瘤裸鼠淋巴结内有大量癌细胞转移(图4-C)。说明癌转移淋巴结可使样品大量聚集并留置更长时间，而大量聚集的样品又使癌细胞和正常淋巴细胞的自体荧光进一步增强，最终达到辨别转移和非转移淋巴结。

成瘤裸鼠术后48小时内肝肾功能动态监测结果显示：在样品注射2-12h后肝肾功能所测指标上升，12h之后下降至正常水平（图5）。说明样品对裸鼠的肝肾功能影响不大，具有可靠的生物安全性。

对比裸鼠注射药物48h后，肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏、淋巴结等组织内铁元素含量显示：淋巴结内铁元素含量明显多于其他脏器（图6）。说明样品经局部注射后，有高度的嗜淋巴性。

实验裸鼠注射药物48h后与正常裸鼠的肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肺脏的H&E病理结果显示：无明显病理改变（图7-A）。说明样品对裸鼠的主要脏器无病理损伤，具有可靠的生物安全性。

60h内动态监测实验裸鼠肝脏、脾脏内铁元素含量（Perls染色法）显示：从12h开始，脾脏内铁含量逐渐增多，48h达最大，之后减少；肝脏60h时才出现少量铁元素（图7-B）。说明药物经淋巴循环先进入脾脏代谢，再进入肝脏代谢，进一步明确期代谢途径。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。