一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法与流程

本发明涉及一种兼具磁共振成像和磁热疗功能以及药物治疗作用的复合外泌体。

背景技术：

纳米四氧化三铁是纳米材料的一种，具有易于合成、超顺磁性、高饱和磁化强度、生物相容性好、毒性低等优点，被认为是一种良好的磁共振成像(MRI)造影剂和磁热疗的产热材料。姜黄素是一种植物性多酚化合物，具有较强的抗肿瘤作用。体外实验发现，姜黄素对包括胶质瘤在内的多种肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，其主要机制是抑制肿瘤细胞增殖、侵袭，促进肿瘤细胞凋亡，抗肿瘤血管生成等，因此姜黄素在胶质瘤的药物治疗方面具有较广阔的前景。然而二者都有一些明显的缺点，比如：在血液循环系统中溶解性、稳定性差，容易被单核巨噬细胞吞噬，往往较多地聚集在肝脾及淋巴组织，肿瘤部位的浓度较低，影响成像与抗肿瘤的效果。用合适的载体对材料和/或药物进行包裹，提高在血循环中的溶解性、稳定性，避免/减少免疫清除，并能较特异地达到肿瘤细胞是克服上述缺点的关键，也是目前研究的热点。外泌体是细胞来源的生物微囊泡，具有较强的负载能力和较低的免疫原性，是一种引人注目的药物/材料递送载体。研究报道外泌体可以在体外进行不同目标物的负载，包括核酸分子(siRNA、miRNA等)、化学药物(阿霉素、紫杉醇等)和纳米材料(纳米金、纳米铁等)。对于肿瘤，尤其是深部的肿瘤来说，需要借助于影像学检查发现病灶，辅助诊断、评价病情变化，所以，与治疗相伴随的动态成像就显得尤为重要，为了达到对肿瘤诊断和治疗的协同性与一致性，体现诊疗的一体化，基于成熟的理论基础和优化改进的实验条件，我们发明了这种能同时用于肿瘤的成像和治疗的复合外泌体的制备方法。

技术实现要素：

技术问题：本发明的目的是提供一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体的制备方法。制得的复合外泌体可以同时发挥MRI成像、磁热疗和药物治疗的作用，为以后临床应用研究提供可靠的实验研究数据及理论基础。

技术方案：本发明的一种同时负载化学药物和纳米材料的外泌体制备方法是一种兼具成像和治疗功能的复合外泌体制备方法。

所述的外泌体内部载有可用于肿瘤示踪、成像和磁热疗的纳米四氧化三铁以及可用于肿瘤治疗的姜黄素；其中纳米四氧化三铁为水溶液，姜黄素为二甲基亚砜(DMSO)溶液，其具体制备步骤如下：

1)从小鼠巨噬细胞Raw264.7培养液中提取该细胞分泌的外泌体，采用经典的差速超速离心法，得到的外泌体重悬于含50mM海藻糖的PBS溶液中，-80℃保存备用；

2)将制备好的纳米四氧化三铁水溶液、姜黄素DMSO溶液及外泌体混悬液加入所述的海藻糖PBS溶液中，震荡混匀，得到样品；

3)按电穿孔仪要求及电穿孔皿规格加入相应体积的上述样品，放入电穿孔仪中，按照预实验摸索的最佳穿孔条件设定参数，进行穿孔；

4)穿孔后立即取样，在紫外-可见光分光光度计上检测样品在260nm处的吸光值，并与未穿孔样品对比，判断穿孔是否成功；

5)其余穿孔后样品立即放入细胞培养箱中孵育1个小时，以促进外泌体膜修复；

6)1小时后，将上述液体以10万-14万g(RCF)离心力超速离心两次，每次70-90min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载纳米四氧化三铁和姜黄素的外泌体，称之为复合外泌体；

7)上述复合外泌体加入共聚焦培养皿中，荧光显微镜下观察姜黄素自发绿色荧光证明包载姜黄素成功，上述外泌体制备铜网样品，于电镜下观察外泌体内铁颗粒，证明纳米四氧化三铁负载成功；

8)PBS重悬复合外泌体，用菲啰啉分光光度法测定铁含量，用可见光分光光度计测定姜黄素含量，用BCA法测外泌体含量(以蛋白计)；

9)取复合外泌体混悬液进行纳米颗粒跟踪分析检测NTA或动态光反射分析DLS测定其粒径大小及分布范围，并在透射电镜TEM下观察其大小及形貌特征，western blot检测外泌体膜表面特征性蛋白表达(与穿孔前外泌体对比)；

9)将上述复合外泌体混悬液分装放于-80℃冰箱中，每隔一周取样一次测定上述浓度及外泌体特征，评价复合外泌体的稳定性；

所述小鼠巨噬细胞Raw264.7培养液为含无外泌体血清或不含血清。

所述步骤2)中,1ml含50mM海藻糖的磷酸缓冲盐溶液PBS溶液中分别加入100μg-300ug外泌体、5-20μl纳米四氧化三铁水溶液和10-30μl姜黄素DMSO溶液组成混合反应体系。

所述外泌体以其蛋白含量计，姜黄素DMSO溶液的浓度为10-30mg/ml，纳米四氧化三铁水溶液的浓度为1-10mg/ml。

所述步骤3)中，电穿孔条件为：电压100-700v，电容125-500μF，放电时间1-5ms，放电次数：1次。

所述8)中，复合外泌体中所含铁及姜黄素的浓度均采用紫外-可见光分光光度法测定。

有益效果：与现有的单纯负载药物或单纯负载纳米材料的外泌体相比，本研究用外泌体同时纳米四氧化三铁和姜黄素，制得的复合外泌体一方面增加了负载物的溶解性、稳定性，降低了活体应用时的被免疫系统的吞噬和清除可能；另一方面，由于该复合外泌体保持了其纳米级别的粒径和良好的流动性，活体应用时，可以对肿瘤同时进行靶向成像与靶向治疗，保证疗效的及时、动态评估，实现了对肿瘤诊断和治疗的协同性和一致性，体现了诊疗一体化的先进理念。同时，该发明具有明确的理论基础，

成熟的实验方法和简便易行的操作流程。

附图说明

图1为用高温裂解法制备的纳米四氧化三铁的电镜图；

图2为电穿孔前纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量外泌体粒径大小及分布图；

图3为电穿孔后纳米颗粒跟踪分析(NTA)测量外泌体粒径大小及分布图；

图4为电穿孔前透射电镜(TEM)观察外泌体大小和形貌特征；

图5为电穿孔后透射电镜(TEM)观察外泌体大小和形貌特征；

图6为电穿孔前后外泌体特征性膜蛋白(CD63)表达情况(Western blot)。

具体实施方式

首先获得载体和负载物(外泌体、纳米四氧化三铁和姜黄素)：

1)外泌体提取、纯化：收集Raw264.7细胞上清液300ml，按如下步骤进行差速超速离心：300g×10min→2000g×10min→10000g×30min→100000g×70min→100000g×70min；终沉淀物用500μlPBS液重悬，取50μl样品BCA法测蛋白含量。本发明方法中所使用的外泌体，亦可采纳其他提取获得，外泌体在本发明方法中作为药物和材料的共同载体，其提取方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。

2)纳米四氧化三铁的制备：

采用高温热解法制备：①称取0.7g乙酰丙酮铁、20mL苄醚、2mL油酸和6mL油胺转移至100mL圆底三颈烧瓶中，将连有氩气的玻璃滴管伸入液面以下，调整气流量起到搅拌作用；②启动加热程序：从常温利用60min升温至220℃并保持60min，利用30min将体系升温至290℃并保持30min；③加热结束后继续通入氩气使之自然冷却至室温，向体系内加入30mL无水乙醇并超声分散10min；④将体系转移至小烧杯，置于强力磁铁上静置10min，利用磁力作用获得纳米级四氧化三铁沉淀，弃上清后，再次加入30mL乙醇并超声分散10min后，继续放于磁铁静置10min，该步骤重复3-4次后，弃上清，向沉淀中加入10mL正己烷，超声分散得到均匀分散的纳米四氧化三铁正己烷溶液；⑤将上述产品和20mL pH＝4的稀盐酸溶液混匀机械搅拌2h后，向体系内加入丙酮10mL超声分散均匀后，360000g离心洗涤数次后，得到水溶性的纳米四氧化三铁溶液(电镜证实粒径为5nm左右)。本发明方法中所采用的纳米四氧化三铁，亦可采纳其他制备获取，纳米四氧化三铁在本发明中具备磁共振成像功能的造影剂和磁热疗的产热剂，因此其制备方法和流程并不构成对本发明保护范围的限定。

3)姜黄素溶液配制：称取24mg姜黄素粉末，溶解于1mLDMSO中，得24mg/ml溶液：

然后再通过电穿孔将纳米铁和姜黄素载入外泌体：

4)在海藻糖PBS溶液中按一定比例加入外泌体、纳米四氧化三铁水溶液、姜黄素DMSO溶液；混匀后，加入电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照一定的反应条件进行电穿孔。

5)穿孔后外泌体经10万-14万g(RCF)离心力超速离心两次，每次70-90min，弃尽上清，沉淀物即为同时负载纳米四氧化三铁和姜黄素的外泌体，称之为复合外泌体；

下面结合具体实施方式,进一步阐明本发明,应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液10μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液5μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压100V，电容125μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

实施例2

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液10μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液5μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压400V，电容250μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

实施例3

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液10μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液5μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压700V，电容500μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

实施例4

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液30μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液20μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压100V，电容125μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

实施例5

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液30μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液20μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压400V，电容250μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

实施例6

在1mL50mM海藻糖PBS溶液中加入外泌体100μg、4mg/mL纳米四氧化三铁水溶液30μl、24mg/mL姜黄素DMSO溶液20μl；混匀后，加入4mm(容积750μl)电穿孔皿中，放入电穿孔仪，按照如下反应条件：电压700V，电容500μF，放电时间1ms，放电次数：1次。穿孔后即可将混悬液放入细胞培养箱中孵育1个小时，继之100000g超速离心两次，每次80min，小心弃尽上清，用PBS液重悬沉淀即为负载纳米四氧化三铁及姜黄素的复合外泌体，-80℃储存进行后续检测及实验；

须指出,上述实施实例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定,这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。