靶向相变型多模态显像纳米造影剂及其制备方法与流程

本发明涉及超声影像领域，具体涉及一种靶向相变型多模态显像纳米造影剂及其制备方法。

背景技术：

传统的单一影像检查方式均具有各自的不足，应用上均存在一定的局限性，而多种影像融合成像，使得各种影像检查手段取长补短，优势互补，可提高诊断的准确性。融合了两种或多种成像模式的多功能造影剂是现代分子影像学的研究热点。多模态造影剂除了显像的功能，还能够装载药物、基因等，在影像的引导和监控下，实现可控的靶向治疗。因此，多模态多功能造影剂能够集显像与治疗于一体，为疾病的早起准确诊断和精准可控治疗打下坚实基础。

超声微泡造影剂为疾病的诊断提供了帮助，但普通的超声微泡不能满足分子影像学对分子探针的需求。微泡造影剂一般数微米大小，而肿瘤毛细血管内皮间隙约100-780nm，微泡难以穿过血管内皮达到组织间隙，限制了微泡作为超声分子探针的应用。有学者将气体微泡体积缩小，制成纳米级气泡即纳泡，但因其背向散射能力较弱，增强超声显影的能力有限。由于血管内血流的冲击，使得靶向微泡与血管内皮靶向结合的能力降低。微泡在体内的半衰期短(3-15分钟)，也限制了其进一步应用。为了克服微泡作为超声分子探针的不足，发明人设计出多种包裹液态氟碳的纳米微球。液态氟碳具备一些特殊性能，如高密度、高气体溶解度、高扩散系数、低表面张力低、低粘度、低毒性、疏水性、疏油、较好的携氧能力、热学惰性、X线不透过性等，为其在医学领域中的应用奠定了基础。Lanza团队使用磷脂材料和液态氟碳PFOB采用高压均质的方法制备液态氟碳纳米脂质微球，大小均匀，粒径小于200nm，易于穿过肿瘤毛细血管内皮间隙而达血管外，当该纳米脂质微球聚集到靶器官后可以增强灰阶超声的显影。然而液态氟碳PFOB依靠聚集效应来增强超声显像的效果不甚理想，远不如超声微泡的谐波成像。液态氟碳纳米微球体积小，能够穿过毛细血管内皮间隙而达到组织，微球较微泡性质稳定，能够在体内循环较长时间。但是因为微球核心为液体，对超声的反射作用很弱，不能够有效的增强超声显影。各种医学影像技术如超声、光声、磁共振、CT等在组织穿透力、图像分辨率、检查敏感度、成像速度及检查费用等方面各具优缺点。目前各种影像检查技术都有各自的影像增强剂。尽管增强剂对疾病的诊疗提供了帮助，但仍不能突破单一影像检查的局限性。随着医学影像学的不断发展进步，寻求多模态多功能造影剂从而实现多种影像技术的优势互补，提高影像诊疗的精准性，成为现代医学的研究重点。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种在低强度聚焦超声的作用下，发生液气相变，增强显影，并释放药物，实现对肿瘤的多模态显像及精准治疗。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：靶向相变型多模态显像纳米造影剂，包括脂质壳膜，脂质壳膜上装载有油酸氧化铁纳米颗粒和药物HCPT,且脂质壳膜上修饰有叶酸。

进一步，脂质壳膜内部包裹有液态氟碳。

进一步，其粒径为321±67nm，粒径多分散指数PDI为0.43。

进一步，其ZETA电位为-50mV。

进一步，其HCPT包封率为60.51％±2.33％，载药量为8.33％±0.57％。

采用本发明的靶向相变型多模态显像纳米造影剂，Malvern仪器测得本发明的纳米粒粒径约321±67nm，本发明的纳米粒能够穿过肿瘤毛细血管内皮间隙(100nm-780nm),所以能够满足本发明对其粒径的要求；Malvern仪测得其Zeta电位为-50mV，能够保证纳米粒的相对稳定性而不致快速沉淀。光镜、荧光显微镜及激光共聚焦显微镜等形态学检测结果显示，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒分散性好，大小均匀，成小圆球形或点状，这些特性都将有利于纳米粒顺利穿过肿瘤毛细血管内皮间隙而到达肿瘤细胞周围。原子吸收光谱法测得不同浓度的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒对应不同浓度的铁离子。

本发明FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂在4℃条件下可稳定保存48小时。众所周知，PFP沸点约29℃，常温下呈液态，生理温度下(37℃)气化呈气态。但是经由磷脂包裹成纳米级颗粒后，因为施加于纳米粒周围的Laplace压力增大，PFP气化阈值将升高。本发明发现，在40℃时，纳米粒基本不发生相变，当加热板温度逐渐升高达50℃时，纳米粒相变才最显著，显微镜下见相变后产生的气泡最多。高效液相色谱法测得HCPT包封率为60.51％±2.33％，载药量为8.33％±0.57％。药物释放试验显示，纳米粒内HCPT呈缓慢释放，避免了突释可能产生的不良反应。超声作为最有效的促进液态氟碳相变的因素之一，在本发明中用低强度聚焦超声来激发PFP相变并促进FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid释放药物。本发明所使用的磷脂成分与生物有机体的细胞膜磷脂成分相同，对生物体无任何毒副作用。液态氟碳因具有良好的携氧能力，可用作血液替代品，具备生物安全性，而且液态氟碳能弥散溶解于血液通过呼气排出体外，而不参与体内的生物化学降解。Fe₃O₄生物安全性高，在体内被红细胞代谢以后可进入正常血浆铁池，参与机体代谢过程。

液态氟碳PFP具有良好的热致相变及声致相变特性，而超顺磁性氧化铁Fe3O4具备增强光声及磁共振显像的特性，把PFP和Fe₃O₄同时装载于一个纳米载体内，可达到多模态显像的目的。再结合药物HCPT，该纳米粒将能够实现多模态及多功能的要求，成为极具潜力的分子探针。

本发明还提供另一个技术方案，靶向相变型多模态显像纳米造影剂的制备方法，采用旋转蒸发-超声法制备。

进一步，旋转蒸发-超声法的操作步骤如下：

1)、溶解：先将油酸氧化铁纳米颗粒、药物HCPT和包括有磷脂-叶酸合成原料的脂质壳膜原料用有机溶剂溶解后；

2)、旋转蒸发：于旋转蒸发仪进行减压旋转蒸发除去有机溶剂；

3)、超声清洗：再置于超声波清洗剂中清洗振荡；

4)、离心分离：离心分离后置4℃冰箱，得到样品。

进一步，步骤3)的超声清洗后，还包括有步骤3a)、加入液态氟碳，采用声振仪进行乳化后，再将乳化液体进行步骤4)的操作。

进一步，所述步骤1)中的溶解温度为50℃；

所述步骤2)中的旋转蒸发仪的转速为转速：80rpm，时间为2小时；

所述步骤3a)中声振仪乳化全程冰浴，且功率为100w，时间为6min；

所述步骤4)中离心分离的温度为4℃，转速为6000rpm，时间为5min,共离心三次。

进一步，步骤3a)中声振仪采用间断声振的方式。

本发明采用旋转蒸发-超声法，将油酸修饰的超顺磁性氧化铁颗粒(主要成分是Fe₃O₄)、液态氟碳PFP和药物HCPT包裹进由多种磷脂成分及胆固醇组成的脂质外壳内，来研制FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒。首先将脂质、Fe₃O₄颗粒及药物HCPT溶解于有机溶剂(三氯甲烷与甲醇的混合溶剂)中，溶解必须保证充足的时间，或使用加热或声振促溶的方式，使得溶质充分溶解，否则难以形成均匀稳定的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒。加入PFP液滴并声振的过程全程冰浴，否则声振过程中形成的大量热量容易促使PFP相变，采取的是间断声振的方式(on:5s,off:5s)，以便声振产生的热量能在off期及时消散。

附图说明

图1为本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂的结构示意图。

图2为本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂在透射电镜观察单个纳米粒电镜图。

图3为本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂的体外增强光声成像实验的Fe₃O₄、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid、FA/PFP/HCPT@Lipid光声图。

图4为本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂的体外增强磁共振成像实验中的Ⅰ-Ⅻ组的体外磁共振图像。

图5为本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂对卵巢癌的靶向治疗效果实验中裸鼠肿瘤生长曲线图。

具体实施方式

一、本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂(FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid)，其具体的制备方法为：

1)、溶解：将HSPC-氢化大豆卵磷脂(美国Avanti公司)、DSPE(PEG2000)Folate-磷脂PEG叶酸(重庆浦诺维生物科技有限公司)、DPPG-1,2-棕榈酰磷脂酰甘油(美国Avanti公司)、CHOL-胆固醇(生工生物工程(上海)股份有限公司)及HCPT按照质量比10:4:3:3:2共称取共22mg加入圆底烧瓶，同时加入100μL油酸氧化铁纳米颗粒OA-Fe₃O₄(25mg/mL)，量取10mL三氯甲烷和10mL甲醇加入圆底烧瓶，封闭圆底烧瓶口，置入50℃水中加热至充分溶解。

2)、旋转蒸发：溶解20min后将圆底烧瓶固定于旋转蒸发仪上(温度：50℃)进行减

压旋转蒸发以除去有机溶剂，转速：80rpm，时间：2小时，形成一层均匀的褐色薄膜。

3)、超声清洗：蒸发结束后取下圆底烧瓶，加入4mL PBS振荡、水合，然后将圆底烧瓶置于超声波清洗机中清洗振荡，直至圆底烧瓶内壁褐色薄膜脱落得到褐色混悬液，将混悬液转移至10mL EP管内。

4)、加入PFP乳化：在全程冰浴条件下，向EP管内逐滴加入200μLPFP，采用声振仪对EP管内混悬液进行乳化，乳化过程中声振仪功率：100w，时间：6min(on:5s,off:5s)。

5)、离心分离：将制得的乳状液体置于高速冷冻离心机内离心分离，温度：4℃，转速：6000rpm，时间：5min,共离心三次，所得样品置4℃冰箱备用。

所制得的本发明靶向相变型多模态显像纳米造影剂如图1所示，包括脂质壳膜,脂质壳膜内部包裹有液态氟碳，脂质壳膜上装载有油酸氧化铁纳米颗粒和药物HCPT,且脂质壳膜上修饰有叶酸。

二、靶向相变型多模态显像纳米造影剂的特性及性能

1)靶向相变型多模态显像纳米造影剂的特性

(1)以PBS溶解后，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid外观呈褐色，静置无明显分层。光镜下观察，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid呈球形，分布均匀，大小均一。荧光显微镜及激光共聚焦显微镜下观察，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid呈球形或点状，分布均匀，大小较均一。

(2)如图2所示，透射电镜观察单个FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒呈黑色球形结构，形态规则。

(3)Malvern激光粒径仪检测出FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid粒径321±67nm,粒径多分散指数(PDI)为0.43,Zeta电位为-50mV。

(4)原子吸收光谱法测得不同浓度的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳(5μg mL^-1，10μg mL^-1，20μg mL^-1，40μg mL^-1，80μg mL^-1，160μg mL^-1，320μg mL^-1，640μg mL^-1，1280μg mL^-1,2560μg mL^-1)中的Fe浓度分别为(0.43±0.08μg mL^-1，0.71±0.09μg mL^-1，1.63±0.31μg mL^-1，3.52±1.21μg mL^-1，7.60±1.35μg mL^-1，15.05±3.16μg mL^-1，29.12±4.05μg mL^-1，53.32±5.25μg mL^-1，117.65±6.36μg mL^-1，236.37±11.97μg mL^-1)。

2)、靶向相变型多模态显像纳米造影剂的稳定性检测

检测结果为：在4℃条件下，纳米粒粒径在48小时内无明显增大，48小时后粒径缓慢增大。

3)、光镜下观察靶向相变型多模态显像纳米造影剂热致相变

检测结果为：40℃时纳米粒基本保持稳定，光镜下纳米粒粒径较均一，未见明显相变，45℃时部分纳米粒发生液气相变，体积增大,50℃时相变纳米粒数量明显增多，体积增大，55℃时仅存少量相变后的气泡。

4)、靶向相变型多模态显像纳米造影剂中HCPT含量的测定

检测结果为：HCPT标准曲线方程为：Y＝106.8X+1560R＝0.999，表明HCPT在20-250ng mL^-1浓度范围内与峰面积线性关系良好。HCPT包封率为60.51％±2.33％，载药量为8.33％±0.57％，对应的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid溶液中的药物浓度约为330.24±65.49μg mL-1。

5)、靶向相变型多模态显像纳米造影剂乳液药物释放

检测结果为：药物释放试验显示，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid乳液内的药物HCPT呈缓慢释放，24小时释放约25％，48小时释放约60％，60小时后药物释放趋平缓。

6)、LIFU辐照靶向相变型多模态显像纳米造影剂乳液控释药物的检测

检测结果为：随着LIFU强度的增加，药物释放量亦随着增加。0.8W/cm²、2min,1.6W/cm²、2min,2.4W/cm²、2min和3.2W/cm²、2min所对应的药物释放量分别约3.2％±、11％、27％、56％。

三、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂的靶向性实验

使用卵巢癌SKOV3细胞株，采用荷瘤裸鼠模型观察纳米粒体内靶向情况，分为叶酸靶向组(本发明)，非靶向组和拮抗组。

实验结果为：

1、纳米粒体外寻靶实验研究

经荧光染料DAPI染色后，细胞核在激光共聚焦显微镜下呈蓝色；经荧光染料DiO染色后，细胞膜在激光共聚焦显微镜下呈绿色；经荧光染料DiI染色后，纳米粒在激光共聚焦显微镜下呈红色。在叶酸受体靶向组，可见较多的代表靶向纳米粒的红色荧光聚集在细胞膜周围，而在非靶向组和拮抗组，细胞膜周围未见明显红色荧光聚集。

2、纳米粒体内寻靶实验研究

结果表明：叶酸靶向组裸鼠在注射靶向纳米乳液0.5h后，肿瘤局部可见代表靶向纳米粒的红色荧光，至1h，红色荧光范围增大，到6h和12h荧光范围逐渐缩小。而非靶向组肿瘤局部于整个观察时间内均未见明显红色荧光聚集。在靶向组和非靶向组裸鼠肝脏内显示较强的红色荧光。注射纳米粒12h后离体荧光实验显示，靶向组瘤块显示明显红色荧光而非靶向组瘤块未显示红色荧光，靶向组肿瘤的荧光强度绝对值明显高于非靶向组。注射纳米粒1h后，靶向组肿瘤区域荧光强度/非肿瘤区域荧光强度之比值明显高于非靶向组，差异有统计学意义(p＜0.05)。

3、瘤块超薄切片

光镜下观察瘤块组织超薄切片，可见靶向组切片内散布较多点状或圆球状的纳米粒，而非靶向组切片内仅可见少许纳米粒。

细胞和肿瘤模型都选用富含叶酸受体的卵巢癌SKOV3细胞。由此可见，体外靶向性实验中，靶向组SKOV3细胞周围及细胞内部可见较多纳米粒聚集，而非靶向组细胞周围基本无纳米粒聚集，充分说明了叶酸具备高效连接其受体的能力。拮抗组在加入游离叶酸后，SKOV3细胞的叶酸受体被游离叶占据，阻断了纳米粒与细胞的结合，故而细胞周围未见明显纳米粒荧光聚集，也从侧面反映了叶酸与细胞结合的特异性。体内靶向性实验中，靶向组裸鼠肿瘤局部可见代表靶向纳米粒的红色荧光区域，并且荧光强度和范围随着时间发生变化，而非靶向组裸鼠其肿瘤处始终未见明显荧光，这说明了叶酸靶向纳米粒在活体对富含叶酸的SKOV3肿瘤具有很好的靶向性。本发明制作的纳米粒粒径300nm-400nm，而肿瘤毛细血管内皮间隙约100nm-780nm,所以纳米粒可以顺利穿过毛细血管内皮间隙达到血管外，即EPR(Enhanced Permeation and Retention effect)效应。在靶向组和非靶向组，纳米粒均可通过EPR效应穿过肿瘤血管内皮间隙达到肿瘤细胞周围(被动靶向)，而在靶向组，纳米粒除了被动靶向，还可通过叶酸的靶向作用而主动结合与细胞表面并进而被吞噬，即主动靶向。该实验证明，通过主动靶向和被动靶向两种方式而沉积到肿瘤细胞周围的纳米粒数量远多于单纯经被动靶向而沉积的纳米粒。实验结果显示，0.5小时肿瘤处荧光范围较小，1小时后肿瘤处荧光的强度和范围最大，说明1小时肿瘤局部沉积的纳米粒远多于0.5小时。而到6小时，随着血液循环内的纳米粒的减少和肿瘤局部纳米粒的不断代谢消耗，致使局部荧光强度和范围不断减小。

四、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂增强超声、光声及磁共振显像研究

1)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体外热致相变及增强超声显影研究

(1)将制备的FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid纳米乳使用低温离心机离心沉淀(温度：4°C，转速：6000rpm，时间：5min)，用脱气水重悬纳米粒，制备纳米乳液。

(2)取2mL纳米乳液装入乳胶手套指端，以等量的脱气水装入乳胶手套指端作为对照。

(3)将上述乳胶手套放入装满脱气水的水浴锅内，水浴锅的温度分别设置为40℃、45℃、50℃和55℃。

(4)使用百胜超声诊断仪(探头频率：12MHz,MI:0.06)对上述手套指端的液体于加热前后进行超声显像，使用灰阶模式和造影模式进行观察，并用DFY软件对图像回声强度进行测量，比较回声强度的差别。

(5)分别取10μL经加热后的乳液置于光镜下，观察纳米粒形态大小变化。

检测结果为：

灰阶超声模式下，当水浴锅温度为40℃时，水囊内呈均匀点状低回声，与水浴加热之前相同。当温度达到45℃和50℃时，水囊内可见较多气泡强回声，到55℃时气泡强回声明显减少。谐波超声模式下，水浴锅温度为40℃时，水囊内无增强。45℃和50℃时，水囊内显影明显增强。至55℃时，水囊内回声增强相对减弱。于45℃和50℃水囊吸出的乳液在光镜下可见到较多气泡产生。实验过程中，作为对照的脱气水囊内在两种模式下始终为无回声。DFY定量分析软件测量结果显示，50℃水囊内的乳液回声强度值最高。

2)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体外声致相变及增强超声显影研究

(1)用脱气水和凝胶粉制作3％凝胶模型，内含容量约2mL的孔洞。

(2)取2mLFA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳液装入凝胶模型孔洞内，使用LIFU仪探头对凝胶模型内乳液进行辐照，模型表面涂布超声耦合剂，使LIFU焦点位于乳液内。LIFU仪设置为脉冲模式，强度分别为0.8W/cm²、1.6W/cm²、2.4W/cm²、3.2W/cm²，时间分别为1min、2min、3min、4min。LIFU辐照完毕，取少许纳米乳行光学显微镜观察纳米粒大小变化。

(3)LIFU作用完毕，使用百胜超声诊断仪(探头频率：12MHz,MI:0.06)对凝胶模型内乳液进行超声显像，使用灰阶模式和造影模式进行观察，并用DFY软件对图像回声强度进行测量，比较回声强度的差别。

检测结果为：

LIFU强度为0.8W/cm²时，超声灰阶及造影模式下于各时间点均未见明显增强显影。当LIFU强度为1.6W/cm²时，超声灰阶及造影模式下于各时间点可见较微弱的增强效应。当LIFU强度提高到2.4W/cm²时，超声灰阶及造影模式下于各时间点均可见较明显的增强效应。DFY分析软件测值发现，2.4W/cm²、2分钟的回声强度值明显高于2.4W/cm²、1分钟，差异有统计学意义，而与2.4W/cm²、3分钟和2.4W/cm²、4分钟比较，回声强度值差别无统计学意义。当LIFU强度提高到3.2W/cm²时，不同时间点的增强强度较2.4W/cm²反而下降。不同强度和时间LIFU辐照后溶液的超声回声强度值见表1和表2。强度为0.8W/cm²时，显微镜下未见相变增大的气泡；强度为1.6W/cm²时，显微镜可见气泡产生；强度为2.4W/cm²时，显微镜下气泡增多；强度为3.2W/cm²时，显微镜见气泡增大，数量减少。

表1不同强度和时间LIFU辐照后溶液的灰阶超声回声强度值

●与2.4W/cm2、1分钟比较，p＜0.05

▲与2.4W/cm2、3分钟比较.p＞0.05

与2.4W/cm2、4分钟比较，p＞0.05

表2不同强度和时间LIFU辐照后溶液的超声造影回声强度值

·与2.4W/cm2、1分钟比较，p＜0.05

▲与2.4W/cm2、3分钟比较，p＞0.05

与2.4W/cm2、4分钟比较，p＞0.05

3)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体内声致相变及增强超声显影研究

(1)制备叶酸靶向造影剂FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid(叶酸修饰)和非靶向造影剂Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid(无叶酸修饰)。

(2)将荷瘤裸鼠(肿瘤直径约1cm)随机分为三组并进行不同处理：组Ⅰ：尾静脉注射叶酸靶向造影剂(FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid)并行LIFU辐照肿瘤；组Ⅱ：尾静脉注射非靶向造影剂(Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid)并行LIFU辐照肿瘤；组Ⅲ：尾静脉注射叶酸靶向造影剂(FA/Fe3O4/PFP/HCPT@Lipid)。

(3)用150μL戊巴比妥钠(浓度：1％)麻醉裸鼠后，三组裸鼠均经尾静脉注造影剂约200μL(1mg/mL)。组Ⅰ和组Ⅱ裸鼠于注射造影剂1小时后行LIFU辐照，涂布耦合剂确保LIFU焦点位于瘤内。LIFU仪设置为脉冲模式，强度分别为0.8W/cm2、1.6W/cm2、2.4W/cm2、3.2W/cm2，时间分别为1min、2min、3min、4min。

(4)LIFU作用完毕，使用百胜超声诊断仪(探头频率：12MHz,MI:0.06)对肿瘤进行超声显像，使用灰阶模式和造影模式进行观察，并用DFY软件对图像回声强度进行测量，比较回声强度的差别。

检测结果为：

注射造影剂之前，各组裸鼠肿瘤灰阶超声显示为均匀低回声，无明显液化坏死。组Ⅰ(靶向造影剂+LIFU组)裸鼠肿瘤在0.8W/cm²、1.6W/cm²和2.4W/cm²LIFU辐照后，超声声像图未见明显增强，DFY所测回声强度值显示，仅在2.4W/cm²、3分钟和2.4W/cm²、4分钟辐照后，回声强度值有所增加。LIFU强度提高到3.2W/cm²时，超声声像图均可出现肉眼可见的增强。DFY软件测值显示，3.2W/cm²、2分钟的回声强度值较3.2W/cm²、1分钟明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)，3.2W/cm²、2分钟的回声强度值与3.2W/cm²、3分钟和3.2W/cm²、4分钟比较，差异无统计学意义(p＞0.05)。而组Ⅱ(非靶向造影剂+LIFU组)和组Ⅲ(靶向造影剂组)裸鼠肿瘤注射造影剂前后灰阶超声及谐波超声未见明显变化，DFY软件测值分析回声强度值亦无明显改变。组Ⅰ裸鼠肿瘤经不同强度和不同时间LIFU辐照后的回声强度值见表3(灰阶超声回声强度值)和表4(超声造影回声强度值)。

表3不同强度和时间LIFU辐照后组I肿瘤后的灰阶超声回声强度值(靶向组)

●与3.2W/cm2、1分钟比较，p＜0.05

▲与3.2W/cm2、3分钟比较，p＞0.05

与3.2W/cm2、4分钟比较，p＞0.05

表4不同强度和时间LIFU辐照后组I肿瘤后的超声造影回声强度值(靶向组)

●与3.2W/cm2、1分钟比较，p＜0.05

▲与3.2W/cm2、3分钟比较，p＞0.05

与3.2W/cm2、4分钟比较，p＞0.05

在体外声致相变实验中，当强度低于2.4W/cm²时，LIFU仪无法促使PFP纳米粒相变。当LIFU参数为2.4W/cm² 2分钟时，肉眼观增强灰阶超声和增强超声造影均较明显，DFY软件也显示此时回声强度值有较显著的提高，而当时间延迟到3分钟和4分钟时，肉眼观增强的程度与2分钟时无明显区别，DFY软件测值也显示2.4W/cm²、2分钟、3分钟、4分钟的声强值无显著性差异。因此后续的体外声致相变参数就设置为2.4W/cm2、2分钟。体内声致相变实验显示，当LIFU参数到3.2W/cm²、2分钟的时候，才能出现肉眼明显的超声增强显影。DFY测值显示，3.2W/cm²、2分钟、3分钟、4分钟的声强值无显著性差异。辐照时间越短，超声能量对组织的损伤将越小，因此后续的体外声致相变参数就设置为3.2W/cm²、2分钟。对于同样制作的PFP纳米粒，体内相变需要3.2W/cm²、2分钟，而体外仅需2.4W/cm²、2分钟，原因可能是在体内通过EPR效应沉积到血管外的纳米粒粒径较小，粒径大的无法穿透毛细血管壁而只能在血池里循环。纳米粒粒径的大小与声致相变的阈值成反比，粒径约小，相变阈值越高，也就越难以相变。组II裸鼠肿瘤声像图均未见明显增强，是因为纳米粒没有叶酸修饰，因而聚集到肿瘤细胞周围的纳米粒很少，不足以产生相变而增强超声显影的效果。组III裸鼠肿瘤声像图亦未见明显增强，是因为缺少超声(LIFU)的激发。这也从侧面说明在组I中是LIFU辐照促进了相变而非裸鼠体温促进了相变。

充分说明本发明所制备的PFP纳米粒具有良好的相变特性，并在相变后能有效增强超声显影。

五、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体内外增强光声显像实验

1)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体外增强光声成像研究

①Fe₃O₄光声特性检测

如图3所示，Fe₃O₄、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid、FA/PFP/HCPT@Lipid三个样品以680nm-950nm全波段范围的近红外激光激发，Fe₃O₄、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid的光声峰值分别为2.66和1.63，两者曲线变化趋势一致，激发的峰值均在705nm处，而对照组FA/PFP/HCPT@Lipid微球光声信号峰值仅为0.37，且波形不规则，无特异的激光激发波长范围。

②不同浓度Fe₃O₄的光声信号检测

在光声仪激光激发下，凝胶模块的光声信号随着Fe₃O₄浓度的升高而逐渐增强；不含Fe₃O₄的对照组未出现明显的光声信号。各组的光声值如表5。

表5不同浓度Fe₃O₄的光声信号值

*和对照组比较，p＜0.05

③细胞光声结果

FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒被SKOV3细胞靶向结合或吞噬后，光声成像显示均匀的光声信号，随着纳米粒与SKOV3细胞孵育时间的延长，光声信号明显增加。而对照组细胞悬液肉眼观呈乳白色，未见明显的光声显像。光声值定量分析，随着纳米粒与SKOV3细胞孵育时间的延长，光声值明显增加。

2)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体内增强光声成像实验

注射造影剂之前，各组裸鼠肿瘤均未见明显光声信号。组Ⅰ裸鼠注射叶酸靶向造影剂0.5h后，肿瘤局部可见光声信号，并于1h光声信号明显增强，6h时光声信号逐渐减弱。而组II和组III裸鼠注射造影剂后，于三个时间点内均未见明显光声信号。各组的光声定量值如表6。

表6注射造影剂之前及之后0.5h，1h和6h肿瘤局部光声信号值

和注射前比较，p＜0.05

★和组II比较，p＜0.05

●和组III比较，p＜0.05

在体外增强光声成像研究中中，检测到FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂与Fe₃O₄溶液一样在705nm处有特征性的吸收峰，且波形走行一致。不含光吸收子Fe₃O₄的凝胶块光声信号极弱，而混有FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂的凝胶表现出较强的光声对比增强作用，且随着FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂浓度的增加，光声信号明显增强，光声值亦明显升高，差异有统计学意义。FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂与SKOV3细胞孵育后，细胞悬液可产生光声信号，且随着共孵育时间的延长，光声信号也明显增强，说明被细胞靶向结合和吞噬后，Fe₃O₄保持其光声增强效应。证实本发明所研制的FA/Fe304/PFP/HCPT@Lipid造影剂具有成为光声成像对比增强剂的潜能。

在体内增强光声成像研究中，经裸鼠尾静脉注射含Fe₃O₄的靶向性造影剂FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid，通过主动靶向和被动靶向聚集，肿瘤局部含有较高浓度的纳米粒FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid，提高了局部光声信号的灵敏度。实验观察了三个时间点：0.5h，1h和6h。在0.5h肿瘤局部检测到的光声信号较弱，可能是聚集到肿瘤局部的纳米粒较少。而在1h的时候，随着循环中的纳米粒不断通过EPR效应沉积到肿瘤局部，以及叶酸的主动靶向作用，肿瘤局部沉积的纳米粒逐渐增多，故检测到较强的光声信号。到第6小时，随着循环中的纳米粒的不断减少，以及肿瘤局部纳米粒的不断代谢消耗，使得肿瘤部位纳米粒浓度逐渐减少，产生的光声增强信号也渐趋减弱。

本发明的造影剂FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid于体内外均能够增强光声成像，为实现FA/Fe304/PFP/HCPT@Lipid多模态显像奠定实验基础。

六、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体内外增强磁共振显像实验研究

1)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体外增强磁共振成像研究

(1)实验组的制备：将FA/Fe304/PFP/HCPT@Lipid纳米乳用1％凝胶稀释成不同的浓度作为实验组：III：5μg mL^-1，IV：10μg mL^-1，V：20μg mL^-1，VI：40μg mL^-1，VII：80μg mL^-1，VIII：160μg mL^-1，IX：320μg mL^-1，X：640μg mL^-1，XI：1280μg mL^-1，XII：2560μg mL^-1。取脱气水和不含纳米粒的1％凝胶作为对照组I和对照组II。

2)结果为：如图4所示，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid在T2*WI显像中呈负性增强显影，与脱气水相比，不含Fe₃O₄的凝胶模型未见明显信号强度降低(P＞0.05)，而含不同浓度FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid的各组(III-XII)的信号强度均出现不同程度的降低(P＜0.05)，并且随着浓度的增加，MR信号强度逐渐下降。当浓度达640μg mL^-1(对应的Fe浓度为53.3μg mL^-1)时，EP管中信号强度下降最明显，几乎呈黑影，但当浓度超过640μg mL^-1，EP管内的磁共振图像发生了几何变形。表7为脱气水、凝胶及不同浓度FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid溶液所对应的Fe浓度及磁共振信号强度值。

表7不同浓度的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid溶液的铁浓度及磁共振信号强度比较

▲与组I比较.P＜0.05

*与组II比较.P＜0.05

2)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂体内增强磁共振成像研究

与注射造影剂之前相比，组Ⅰ裸鼠注射靶向造影剂之后出现负性增强，并于注射后1h较明显，注射造影剂后1h和6h后磁共振信号强度明显低于注射前(p<0.05)。组Ⅱ和组Ⅲ裸鼠注射造影剂后，均未见明显磁共振负性增强，磁共振信号强度亦无明显变化(p>0.05)。

在体外磁共振显像实验中，对照组(脱气水和不含Fe₃O₄的凝胶)呈高信号，而混有FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒的实验组呈低信号，随着的不断升高，图像逐渐变得暗淡，T2信号强度值逐渐降低，充分说明FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid壳膜里装载的磁性颗粒Fe₃O₄是其增强磁共振负性显影的原因所在。在体内磁共振显像实验中，通过尾静脉注射造影剂，评价Fe₃O₄对裸鼠肿瘤的磁共振对比增强作用。结果发现，注射靶向造影剂FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid后，裸鼠肿瘤磁共振出现不同程度的负性增强显影，而对照组(注射非靶向造影剂和不含Fe₃O₄的造影剂)在观察时间内肿瘤组织的磁共振信号强度无明显改变。另外，在注射靶向造影剂FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid后0.5h磁共振负性增强较弱，1h较强，因为在1h时，通过主动靶向(叶酸靶向)和被动靶向(EPR效应)沉积到肿瘤局部的纳米粒较多，局部Fe₃O₄浓度较高。

由此可见，本发明的靶向造影剂FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid，于体内外均能够负性增强磁共振成像。

六、FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂靶向治疗卵巢癌实验

1)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂及药物体内分布

HCPT是从我国特有植物喜树中提取的具有强烈抗肿瘤作用的药物，是DNA拓扑异构酶I抑制剂，广泛用于肝癌、胃癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗，但是HCPT水不溶脂难溶，体内循环时间短，内酯环结构不稳定，使得其临床应用受到限制，本发明将HCPT包裹到纳米粒脂质壳层中，增加其溶解性，延长循环时间。纳米粒通过主动及被动靶向作用，沉积到肿瘤细胞周围，LIFU激发后，纳米粒内液态氟碳发生液气相变并释放药物，从而显著增加肿瘤局部药物浓度。

结果为：

①FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒体内分布

于倒置荧光显微镜下，非靶向组裸鼠肿瘤超薄切片各时间点均未见明显红色荧光。而靶向组裸鼠肿瘤超薄切片，于0.5h，1h，6h，12h，24h均可见红色荧光，1h时荧光最明显。

②裸鼠血液药物浓度分布

HCPT注射液组及FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳组裸鼠的血药浓度均显示快速下降的趋势，但在每一个检测时间点，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳组裸鼠的血药浓度均高于HCPT注射液组。在注射后6小时，HCPT注射液组基本检测不到血药浓度，而FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳组在24小时后仍可检测出高达198ng mL^-1的血药浓度。

③裸鼠组织药物浓度分布

由于脂质外壳的包裹，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid内HCPT在体内的存留时间较HCPT注射液显著延长，即使在注射24小时后，各组织内仍可检出药物HCPT的存在，而在HCPT注射组，12小时已检测不到药物。特别对于肿瘤组织，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid注射组药物浓度显著高于HCPT注射组，且药物存留时间明显延长。

④LIFU作用后肿瘤组织药物浓度分布

FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳注射液组的肿瘤组织药物浓度显著高于HCPT注射组(P<0.05)，而FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组的肿瘤组织药物浓度显著高于FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米乳注射液组(P<0.05)。

本实验中脾脏大量吞噬FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒被认为是纳米粒具有长循环特性的证据。此外，虽然肝脏具有很高的HCPT药物浓度，但常规剂量的HCPT只会影响胃肠和骨髓造血系统，而不损伤肝脏。在每一个检测时间点，HCPT注射组的肿瘤处药物浓度均低于FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒注射组。在注射后6小时，HCPT注射组的肿瘤处已经检测不到药物浓度，而在FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid纳米粒注射组的肿瘤组织内，于注射后24小时仍能检测到50ng g^-1的药物浓度。叶酸修饰的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid能够提高肿瘤局部的组织药物浓度，并能保持较长的时间，将起到长时间持续性的杀伤肿瘤细胞的作用。另外，存留于肝脏、脾脏、肺、肾脏和心脏的纳米粒，将持续不断的向血池释放包裹的HCPT，将有利于保持较高的血药浓度水平。LIFU作用后，促进了肿瘤局部聚集的FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid相变并释放药物，从而提高局部药物浓度，增强药物杀伤效果。

2)FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid造影剂对卵巢癌的靶向治疗效果

裸鼠SKOV3肿瘤接种情况：接种肿瘤细胞后，裸鼠进食、活动以及精神状态均正常，肿瘤生长良好。选取肿瘤直径约1mm的裸鼠30只进行实验。

结果为：

①肿瘤的治疗效果

(1)生长指数如图5所示，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组裸鼠肿瘤生长指数最低。HCPT组和FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid组的生长指数无明显差别。FA/Fe₃O₄/PFP@Lipid+LIFU组和Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid组均无明显的控制肿瘤生长的作用。

(2)在治疗后的第14天，脱颈处死裸鼠，完整取出肿瘤，实验组裸鼠肿瘤小于盐水对照组，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组裸鼠的肿瘤最小。

(3)如表8所示，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组显示出最高的抑瘤率

表8治疗后第14天肿瘤质量和抑瘤率(均数±标准差，n＝5)

*P＜0.01vs control group

△P＜0.01vs FA/Fe₃O₄PFP/HCPT@Lipid group

②免疫组织化学检查结果

(1)细胞增殖及增殖指数：PCNA结果显示，六组裸鼠肿瘤于显微镜下均可见细胞核内黄色颗粒，计算阳性率从而得到增殖指数PI，结果显示FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组的增殖指数最低(#p＜0.05)，对照组(生理盐水组)增殖指数最高。

(2)细胞凋亡和凋亡指数：TUNEL结果显示，各组肿瘤于显微镜下均可见棕黄色颗粒，计算阳性率得到凋亡指数AI，结果显示FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组的凋亡指数最高(＊p＜0.05)，对照组凋亡指数最低。

本试验中，FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid+LIFU组肿瘤生长最慢，体积最小，免疫组化显示该组肿瘤细胞增殖最少而凋亡最多。FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid组因为没有LIFU的作用，纳米粒对肿瘤的抑制作用较弱。HCPT组相当于是一种全身给药，肿瘤局部的药物量少，所以治疗效果不满意。FA/Fe₃O₄/PFP@Lipid+LIFU组有LIFU作用而无药物参与，对肿瘤的抑制作用弱，从侧面说明了包裹药物的纳米粒联合LIFU对于肿瘤杀伤的重要性。Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid组缺乏叶酸额靶向作用，也缺乏LIFU的激发作用，对肿瘤基本无明显治疗作用。叶酸修饰的纳米粒FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid通过主动及被动靶向作用到达并结合于卵巢癌细胞周围，通过LIFU的激发而产生一系列物理化学作用，从而对肿瘤细胞产生治疗作用。本课题中LIFU的引入，至少有三个方面的作用。第一，LIFU诱导的PFP液气相变能够引起纳米粒FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid释放药物HCPT，直接而且明显的提升了肿瘤局部的药物浓度。很多学者也证实了超声能够促使微球或微泡释放其内包含的药物。第二，相变后形成的含气微泡，在超声的作用下，能够产生一系列物理作用，比如声辐射力(acoustic radiation forces)和空化效应(acoustic cavitation)，能够产生微射流(jets of fluid)，从而一过性的破坏肿瘤细胞壁，增加肿瘤细胞对药物的摄取。第三，微射流同时也一过性的破坏肿瘤毛细血管内皮细胞间隙，血池中的纳米粒和药物能够渗透进组织间隙，从而对肿瘤细胞产生更大的杀伤效果。

因此，本发明研制的纳米粒FA/Fe₃O₄/PFP/HCPT@Lipid配合低强度聚焦超声LIFU的作用，对裸鼠卵巢癌有良好的治疗效果。