miR-106a-5p抑制骨关节炎软骨基质降解的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及miR-106a-5p抑制骨关节炎软骨基质降解，特别涉及miR-106a-5p在制备用于抑制骨关节炎软骨基质降解的产品中的应用。

背景技术：

骨关节炎以软骨基质降解为主要特征，是目前最普遍的一种关节炎。关节软骨基质降解以及其自身修复的局限性导致了关节整体性的破坏和进展性不可逆的功能变化，最终导致世界范围内的关节功能障碍。由此，各种治疗技术和药物随之研发而治疗骨关节炎。虽然骨关节炎基因组学已经取得一些成就，但是临床应用效果却未有很大改善。因此，识别骨关节炎更有效的靶标迫在眉睫，进而促进骨关节炎的临床治疗。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类大小约19-25个核苷酸(nt)的内源性非蛋白编码调控单链小分子RNA，具有高度保守性，一般来源于染色体的非编码区域，能够调节基因合成以及其他重要的生物功能。目前，研究报道，miRNAs能够在骨关节炎中发挥重要角色。miRNAs的异常表达能够影响机体的正常功能。最近，一些miRNAs，如miR-29、miR-105等已经被报道参与骨关节炎的进展和炎症过程中。

技术实现要素：

本发明的目的是提供miR-106a-5p及其相关生物材料的新用途。

第一方面，本发明要求保护如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(a)或(b)中的应用：

(1)成熟miR-106a-5p；

(2)前体miR-106a-5p；

(3)编码(1)中所述成熟miR-106a-5p或(2)中所述前体miR-106a-5p的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(a)抑制骨关节炎发生和/或发展；

(b)制备用于抑制骨关节炎发生和/或发展的产品。

第二方面，本发明要求保护如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(c)或(d)中的应用：

(1)成熟miR-106a-5p；

(2)前体miR-106a-5p；

(3)编码(1)中所述成熟miR-106a-5p或(2)中所述前体miR-106a-5p的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(c)抑制骨关节炎软骨基质降解；

(d)制备用于抑制骨关节炎软骨基质降解的产品。

第三方面，本发明要求保护如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(e)-(h)至少一种中的应用：

(1)成熟miR-106a-5p；

(2)前体miR-106a-5p；

(3)编码(1)中所述成熟miR-106a-5p或(2)中所述前体miR-106a-5p的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(e)促进关节软骨体积增大；

(f)制备用于促进关节软骨体积增大的产品；

(g)促进关节软骨表面覆盖区域增大；

(h)制备用于促进关节软骨表面覆盖区域增大的产品。

第四方面，本发明要求保护能够促进如下(1)或(2)或(3)表达的物质在如下(a)-(h)至少一种中的应用：

(1)成熟miR-106a-5p；

(2)前体miR-106a-5p；

(3)编码(1)中所述成熟miR-106a-5p或(2)中所述前体miR-106a-5p的DNA分子；

(a)抑制骨关节炎发生和/或发展；

(b)制备用于抑制骨关节炎发生和/或发展的产品；

(c)抑制骨关节炎软骨基质降解；

(d)制备用于抑制骨关节炎软骨基质降解的产品；

(e)促进关节软骨体积增大；

(f)制备用于促进关节软骨体积增大的产品；

(g)促进关节软骨表面覆盖区域增大；

(h)制备用于促进关节软骨表面覆盖区域增大的产品。

在上述四方面所述的应用中，所述成熟miR-106a-5p具体为人源成熟miR-106a-5p；所述前体miR-106a-5p具体为人源前体miR-106a-5p。

进一步地，所述成熟miR-106a-5p具体为SEQ ID No.1所示的RNA分子；所述前体miR-106a-5p具体为SEQ ID No.2所示的RNA分子。

第五方面，本发明要求保护miR-106a-5p在作为用于治疗和/或预防骨关节炎的靶标中的应用。

其中，所述miR-106a-5p具体为人源miR-106a-5p。

进一步地，所述miR-106a-5p具体为SEQ ID No.1所示的人源成熟miR-106a-5p或者为SEQ ID No.2所示人源前体miR-106a-5p。

采用骨关节炎模型小鼠，发现关节腔内注射miR-106a-5p能够显著改善骨关节炎的发生发展。并且，miR-106a-5p在骨关节炎患者软骨中发现为低表达。这表明，miR-106a-5p可以成为一种新型的抑制骨关节炎病情进展的靶标。

附图说明

图1为各组小鼠关节软骨的μCT分析结果。A为膝关节的冠状面、矢状面的扫描图；B为膝关节软骨表面覆盖区域以及软骨体积。

图2为各组小鼠关节软骨的组织病理学检测结果。

图3为各组小鼠的关节软骨评级结果。

图4为各组小鼠的旋转实验结果。

图5为骨关节炎病人关节软骨中miR-106a-5p表达情况检测结果。

各图中，*表示P<0.05；**表示P<0.01。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，统计计算采用SPSS 17.0软件进行。所有体外实验均均重复三次以上。数据以均值±标准差(SD)表示。P<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1、miR-106a-5p抑制骨关节炎软骨基质降解

本发明所涉及的miR-106a-5p为人源miR-106a-5p。成熟miR-106a-5p的核苷酸序列具体为SEQ ID No.1；前体miR-106a-5p的核苷酸序列具体为SEQ ID No.2。

一、小鼠骨关节炎模型的制备

对8周龄的C57BL/6小鼠(雄性)采用经典的骨关节炎造模手术—前交叉韧带切除术(ACLT)制造骨关节炎模型。具体实验步骤如下：8周龄C57BL/6小鼠，采用3％异氟烷对鼠进行麻醉；取小鼠右腿，在膝关节周围1.5cm处备皮，碘伏消毒，手术刀纵向切开皮肤，使膝关节暴露；继而剥离结缔组织并暴露关节腔，手术针挑拨分离前交叉韧带后，采用小型手术剪将前交叉韧带切断；对照组仅打开关节腔，并不剪断前交叉韧带，其他操作与实验组一致；然后依次缝合膝关节韧带及表面皮肤。8周后进行观测分析(CT检测、OARSI评级、病理检测等)，确定实验组骨关节炎小鼠模型构建成功。

二、关节强注射miR-106a-5p

于步骤一建模成功2周后，采用3％异氟烷对鼠进行麻醉。对小鼠采用33号针头(Hamilton Company)和25μl CASTIGHT注射器(Hamilton Company)分别注射miRNA对照(5nmol，每只小鼠用量)和miR-106a-5p(5nmol，每只小鼠用量)。

其中，miRNA对照为SEQ ID No.3所示的RNA分子；miR-106a-5p为SEQ ID No.1所示的成熟miR-106a-5p。

三、效果检测

共三组小鼠：miR-106a-5p组、对照组和正常组。其中，miR-106a-5p组即步骤一实验组小鼠建模成功2周后关节强注射miR-106a-5p；对照组即步骤一实验组小鼠建模成功2周后关节强注射miRNA对照；正常组为未经任何处理的正常建模用小鼠。每组小鼠6只。

于步骤二关节强注射miR-106a-5p后6周对各组小鼠进行如下检测：

1、μCT分析

离体小鼠膝关节，剥离软组织。剩余的组织浸泡在70％乙醇中。CT扫描采用μCT(Skyscan 1172)进行，并进行图像重建。膝关节冠状面、矢状面被用于分析。小鼠膝关节软骨表面覆盖区域以及软骨体积同样被检测；具体方法如下：选取一个经过关节中部的具有代表性的关节冠状断面，在该冠状断面的关节外侧及内侧分别选取通过各自中点具有代表性的关节矢状断面，数值乘积即为关节软骨表面覆盖区域面积；在矢状断面上的股骨远端及胫骨近端软骨下骨部位取点，测量距离并计算，得到软骨体积数值。扫描后，每个关节软骨被标一随机号码用于后续图像分析。

2、组织病理学评估

苏木素伊红染色(H&E)：组织固定于4％多聚甲醛48小时后用EDTA脱钙缓冲(20％EDTA，pH 7.4)。组织进行石蜡包埋、切片、H&E染色。具体步骤：苏木素染色5min后流水冲洗1-3s，1％盐酸乙醇1-3s后流水冲洗10-30s，蒸馏水冲洗1-2s，0.5％伊红液进行染色1-3min后，置于蒸馏水中进行冲洗1-2s，脱水后进行封片，显微镜下观察检测。

3、关节软骨评级(采用国际通用OARSI评分标准)

OARSI评分

0正常

1表面轻微纤维化，但没有软骨损失

2关节软骨表面出现轻微裂痕

3关节软骨表面裂痕磨损<25％

4关节软骨表面裂痕磨损25％-50％

5关节软骨表面裂痕磨损50％-75％

6关节软骨表面裂痕磨损>75％

4、旋转实验

手术后的小鼠被随机分配到不同组，然后将其放置在旋转装置(Ugo Basile)。将动物置于加速杆，并且记录各个小鼠从杆上落下需要的时间。第一次时间为小鼠可以停留的时间。每次试验后，小鼠休息30分钟，然后再进行下一次实验。每组共进行三次试验，得到的时间记录计算平均值和标准差等。

5、结果

8周龄的C57BL/6J小鼠进行骨关节炎造模(前交叉韧带切除术)。2周后，对小鼠关节腔内注射miR-106a-5p。关节软骨体积以及膝关节软骨表面覆盖区域采用μCT进行检测(图1中A)。数据表明，关节腔未注射mIR-106a-5p的对照组小鼠比注射miR-106a-5p的小鼠不论是关节软骨体积还是膝关节软骨表面覆盖区域都少(图1中B)。另外，组织病理学显示，接受miR-106a-5p注射的小鼠表现出较轻的骨关节炎软骨基质降解程度(图2)。关节软骨评级表明，接受miR-106a-5p注射的小鼠较对照组评分低(图3)。此外，旋转实验表明，未注射miR-106a-5p的对照组小鼠表现出旋转时间缩短，而注射mIR-106a-5p的小鼠则与正常组差别不大(图4)。综上所述，这些数据证明miR-106a-5p能够保护软骨并抑制骨关节炎发生。

实施例2、miR-106a-5p在骨关节炎患者软骨中表达含量低

一、关节软骨标本

来自40例骨关节炎关节置换的病人。骨关节炎标本包括关节软骨圈层以及软骨下骨，都被从胫骨平台上剥离。临床信息来自患者就诊记录。本项研究是由中国人民解放军总医院的机构审查委员会批准(北京，中国)和并在患者知情同意下进行。表1列出研究人口的临床和人口统计学特征。

表1人群临床相关特征数据*

*数据呈现采用均数±标准差方式。CRP，C反应蛋白；ESR，红细胞沉降率。

二、RNA的提取和定量逆转录PCR(qRT-PCR)

采用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)试剂盒，提取总RNA，并反转录成cDNA，RNA质量检查使用安捷伦2100生物分析仪根据RNA完整性评价(RIN)。RIN值的范围从1到10定义为RNA完全降解到结构完整，数值大于7被认为是可接受的完整性定量PCR基因表达检测。TaqMan miRNAqRT-PCR系统被用于检测和定量miRNA表达。用比较Ct法计算miRNA的相对表达水平。通用核小RNA U6作为内参。

用于检测miR-106a-5p的引物：

miR-106a-5p-F：5’-TCCAGCTGGGCCCAGTGTTCAGACTAC-3’；

miR-106a-5p-R：5’-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3’。

用于检测核小RNA U6的引物：

RNAU6-F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；

RNA U6-R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

qRT-PCR具体步骤：

(1)总RNA提取：关节软骨用1×PBS清洗一次后，添加1ml Trizol，混合均匀，在室温下裂解5min。按照每ml Trizol液添加0.2ml三氯甲烷，然后剧烈振荡50次，静置2-3min，12000rpm离心15min。取上层清澈透明液体至新的EP管中，并添加等体积异丙醇，放置-80℃中15min，置于4℃离心机中高速离心15min；用75％乙醇洗涤RNA白色沉淀物，4℃高速离心5min；并添加无水乙醇1ml，4℃高速离心2min；至RNA自然干燥；最后，溶解RNA沉淀，采用100μl DEPC水溶解。

(2)反转录：总RNA 2μg，加入1μl 50μM的随机引物，72℃进行解链，5min后自然冷却到室温。然后加入dNTP、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂逆转录缓冲液，加水至最终体系体积，置于42℃恒温中，反应1h，95℃恒温环境，5min灭活处理，最终得到反转录完成的cDNA。

(3)RT-qPCR：PCR反应液(20μl体系)按下列组分配制：10μl SYBR Green Mix(2×)、2μl cDNA、0.4μl上下游引物(10μM)，余下用去离子水相应补齐；将样品加入到Real-time PCR专用PCR管中后，设置ABI Prism SDS 7000的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，40个循环。完成Real-time PCR后对其熔解解曲线进行分析并结合琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物是否特异。按2^-ΔΔCt公式基因表达值进行数据计算分析。

实验同时设置来自健康人的正常关节软骨作为对照。

结果显示：在骨关节炎病人关节软骨中检测了miR-106a-5p的水平。qRT-PCR表明，相对于正常的关节软骨，骨关节炎关节软骨中miR-106a-5p表达含量显著降低(图5)。结合实施例1的结果进一步表明，miR-106a-5p对骨关节炎起抑制作用。

<110> 中国人民解放军总医院

<120> miR-106a-5p抑制骨关节炎软骨基质降解

<130> GNCLN180408

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

aaaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 2

<211> 81

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

ccuuggccau guaaaagugc uuacagugca gguagcuuuu ugagaucuac ugcaauguaa 60

gcacuucuua cauuaccaug g 81

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22