本发明涉及一种红曲霉素的应用，特别涉及红曲霉素用于制备治疗及延缓骨关节炎药物中的应用。
背景技术：
骨关节炎是最常见的膝关节退行性疾病，好发于50岁以上人群。临床表现关节疼痛、僵硬，特别是长时间活动后，本病不同程度的影响中老年患者的生活质量。但是目前为止，临床治疗以非甾体药物和膝关节置换手术为主。非甾体药物只能改善疾病的症状缓解疼痛，不能逆转骨关节炎进展，膝关节置换也存在费用高术后感染等风险。
骨关节炎可由多种因素引起，如异常受力、局部营养缺乏以及先天基因异常等，其中炎症是骨关节炎最重要的致病机制之一。由炎症因子介导的软骨细胞功能障碍被认为是骨关节炎退行性病变进程中重要的一环，因此针对炎症介导软骨细胞功能障碍的研究可能是治疗骨关节炎的重要途径。
红米是米经过红曲霉发酵后的产物，被作为食物和营养品已经有着1000多年的历史。红曲霉素(monascin)是红米的一种色素提取物。红曲霉素在多项药理学研究中展示出了良好的生物活性，例如抗肿瘤、免疫抑制、脓毒血症疾病等。但是其对骨关节炎疾病是否具有治疗作用尚不清楚。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种红曲霉素在制备治疗及延缓骨关节炎病变药物中的应用。相比西药较大的副作用，红曲霉素作为一种食品提取物，可以更加温和地缓解骨关节炎病变。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种红曲霉素在制备治疗及延缓骨关节炎药物中的应用，所述红曲霉素分子结构式为式(i)所示：
进一步，所述药物还包括药用载体，所述药用载体为微乳、纳米脂质体等。
进一步，所述药物为片剂、乳剂或胶囊等。
进一步，所述药物为复合制剂，包括红霉素以及选自聚己酸内酯，聚乳酸-聚乙二醇或聚乙烯醇的包载材料。
进一步，所述药物的红曲霉素用量为5-10mg/kg体重。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：红曲霉素作为一种具有良好的生物活性的食物提取物，具有用药剂量低，抗炎效果明显的特点。
附图说明
图1：红曲霉素对小鼠膝关节内侧半月板切除失稳模型(dmm)的治疗效果。sham为假手术组，dmm为骨关节炎组，dmm+ms为骨关节炎+红曲霉素组。a：x线影像学改变。b：so染色(蛋白聚糖和糖胺聚糖染色)组织学改变。c：组织学评分。
图2：红曲霉素的cck8药物毒性试验对照图。
图3：红曲霉素在缓解il-1β对软骨细胞炎性指标影响的qpcr、elisa和westernblot试验对照图；a为inos和cox-2在mrna水平的表达情况；b为tnf-α和il-6在mrna水平的表达情况；c为inos和cox-2在蛋白水平的表达情况；d为inos和cox-2灰度值比值统计图；e为pge2和nitrite在细胞外的表达水平；f为tnf-α和il-6在细胞外的表达情况。
图4：软骨细胞在il-1β刺激下，红曲霉素改善其细胞外基质合成功能的对照图；a为ii型胶原(collagenii)、蛋白聚糖(aggrecan)、mmp13、adamts-5在蛋白水平的表达情况；b为collagenii、aggrecan、mmp13、adamts-5灰度值比值统计图；c为ii型胶原(collagenii)在蛋白水平的表达荧光图；d为ii型胶原(collagenii)在蛋白水平的表达荧光值比值统计图。
图5：软骨细胞在il-1β刺激下，红曲霉素对其nf-κb通路的westernblot试验对照图；a为nf-κb信号通路在蛋白水平的表达情况；b为p65入核情况的细胞免疫荧光试验对照；c为p65和laminb灰度值比值的统计图；d为iκbα与gapdh灰度值比值的统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
1、实验步骤：
(1)造模方法：取60只10周龄的c57bl/6雄性野生型(wt)小鼠。通过内侧半月板(dmm)的手术去稳定诱导小鼠骨关节炎模型。腹膜注射2％(w/v)戊巴比妥(40mg/kg)麻醉后，碘伏消毒，然后将右膝关节囊在髌腱内侧切开，用显微外科剪刀切断内侧半月板韧带。将小鼠随机分为假手术组，生理盐水组和红曲霉素治疗组。在dmm之后，红曲霉素给药组(10mg/kg/天；连续8周每天一次通过胃内施用溶于cmc中的红曲霉素)。同时，载体组中的小鼠被施用等量的cmc。所有动物在手术后八周后被处死，收集软骨组织样品用于组织学x射线分析。
(2)原代小鼠软骨细胞培养：用过量的戊巴比妥钠对十只未成熟的c57bl/6小鼠(5只雄性和5只雌性，10天)处以安乐死。通过解剖显微镜在无菌条件下仔细收集小鼠的膝盖软骨，并在37℃下用2mg/ml(0.1％)胶原酶ii处理组织4小时。将消化悬浮的软骨组织接种到组织培养液中。软骨细胞培养在含有10％胎牛血清(fbs；hyclone，thermoscientifc，logan，ut，usa)和1％青霉素/链霉素抗生素(gibco，invitrogen，grand)的dmem/f12(gibco，invitrogen，grandisland，ny)中，5％二氧化碳，37℃的培养箱。培养24小时后更换培养基。当高达80％至90％的交联度时，通过使用0.25％胰蛋白酶-edta(gibco，invitrogen)收获细胞。然后，将细胞以适当的密度重新植入10cm培养皿中。第二代软骨细胞被用于我们所有的实验，因为在传代0代到2代期间没有观察到显着变化。软骨细胞在5％co2，37℃条件的培养箱中于培养，完全培养基每隔一天更换一次。
(3)cck8法测定药物细胞毒性以及药物抗炎效果：cck8法测定药物细胞毒性：将第二代软骨细胞转移到96孔板(50000cells/cm2)中，并在不同浓度的红曲霉素(5，10，15，30μm)中孵育24小时和48小时。在指定的时间，用磷酸缓冲盐水(pbs)洗涤细胞，然后将100μl含有10μlcck-8的dmem/f12加入到平板的每个孔中，并在37℃温度下再温育2小时。然后使用分光光度计在450nm处测量孔的吸光度。
(4)步骤(2)的软骨细胞分成5组，组1，2为对照组(以100％的dmem/f12基础培养基为对照)，组3添加5μm红曲霉素+dmem/f12基础培养基，组4添加10μm红曲霉素+dmem/f12基础培养基，组4添加15μm红曲霉素+dmem/f12基础培养基，37℃培养24h后，组2、组3、组4弃培养基后再分别加入终浓度10ng/ml的il-1β+dmem/f12基础培养基，37℃作用24小时后，收集上清液用以炎症因子的elisa检测，细胞沉淀分离细胞蛋白和细胞rna分别进行westernblot和qpcr，以检测软骨细胞在炎症刺激下其细胞内功能蛋白的表达变化情况，并用elisa检测细胞分泌炎症因子的情况。
(5)westernblots：取步骤(4)作用24h后的细胞沉淀用ripa法提蛋白，并用bca法测蛋白浓度。取蛋白提取液加入loadingbuffer与水，使蛋白量定量为30μg，100℃加热5min使蛋白变性。在sds-page凝胶的每个孔内加入20μl变性后的蛋白液，sds-page凝胶电泳后转膜至pvdf膜，5％脱脂奶粉室温封闭2h，一抗(一抗∶一抗稀释液体积比＝1∶1000)4℃过夜，tbst洗涤pvdf膜5min×4次，二抗(二抗∶tbst体积比＝1∶1000)室温孵育2h，tbst洗涤5min×4次，ecl系统显影。gapdh作为内参，imagelab3.0采集条带灰度值，取目的条带吸光度与内参条带比值作为相对表达量。抗p65，iκbα一抗购置于cellsignalingtechnology，inc.(beverly，ma，usa)，抗mmp-13，adamts-5，inos，cox-2一抗购置于santacruzbiotechnology(santacruz，ca，usa)，抗collagen-ii和aggrecan一抗购置于abcam(cambridge，ma，usa)。二抗购置于santacruzbiotechnology(santacruz，ca，usa)。
(6)实时荧光定量pcr：取步骤(4)作用24h后的细胞沉淀用trizol法提rna，并测定浓度。用primescripttm逆转录试剂盒进行反转录，用sybr(上海生工)试剂盒进行试验，并且统计数据，进行表达差异分析。
目的基因引物序列：
cox-2(f)，seqidno.1：5’-tcctcacatccctgagaacc-3’；
cox-2(r)，seqidno.2：5’-gtcgcacactctgttgtgct-3’；
inos(f)，seqidno.3：5’-gacgagacggataggcagag-3’；
inos(r)，seqidno.4：5’-cacatgcaaggaagggaact-3’；
il-6(f)，seqidno.5：5’-ccggagaggagacttcacag-3’；
il-6(r)，seqidno.6：5’-tccacgatttcccagagaac-3’；
tnf-α(f)，seqidno.7：5’-acggcatggatctcaaagac-3’；
tnf-α(r)，seqidno.8：5’-gtgggtgaggagcacgtagt-3’。
(7)elisa检测细胞炎症因子：取步骤(4)作用24h后获得的上清液，按照试剂盒(r&dsystems，inc.，minneapolis，mn，usa)操作步骤加入试剂，并用酶标仪检测吸光度。
(8)细胞免疫荧光：将步骤(4)作用24h后的细胞沉淀播种于6孔板玻片，通过细胞免疫荧光检测各组(分组同步骤(4))胶原蛋白ii的表达情况以及p65的细胞内定位情况。用pbs洗涤5分钟×3次，再用4％多聚甲醛固定。用pbs洗涤5min×3次后加入0.5％的tritonx-100处理10min。用pbs洗涤5min×3次，再用5％的bsa封闭30min。吸干pbs，滴加p65(1∶200，cst)和ii型胶原抗体(1∶200，abcam)，4℃过夜。次日，pbs洗涤5min×3次后，用细胞用绿色荧光二抗(1∶400，bioworld)室温避光孵育1h。用pbs洗涤后，再用dapi染核。再用pbs洗涤5min×3次后，滴加抗荧光淬灭剂，封片。取玻片于荧光显微镜下观察并拍摄。
2、实验结果：
(1)单纯骨关节组(图1中dmm)的x线显示，关节间隙明显变窄，关节表面钙化。而红曲霉素治疗后(图1中dmm+ms)，关节面和关节间隙相对于dmm组有明显的改善，证明了红曲霉素能显著延缓骨关节炎的进展(图1)。
(2)通过cck8试验得出吸光度后，我们统计各组吸光度/对照组吸光度的比值，结果显示5、10、15、30μm红曲霉素作用下，24h内软骨细胞吸光值与0nn组(无红曲霉素组)无显著统计学差异，表明5、10、15、30μm红曲霉素对细胞无显著毒性；而48h后30μm红曲霉素组软骨细胞吸光值显著低于0nm组，表明30μm红曲霉素作用48h具有一定的软骨细胞毒性。通过本实验，确定了红曲霉素对软骨细胞的安全浓度，即0～15μm(图2)。
(3)通过westernblot、qpcr以及elisa试验，红曲霉素可以降低在il-1β刺激下软骨细胞细胞炎症因子的含量，证实了红曲霉素确实具有抗炎作用(图3)。
(4)通过westernblot、免疫荧光试验，表明红曲霉素可以减少细胞外基质的炎性降解(图4)。
(5)通过进一步蛋白印记试验分析，我们发现红曲霉素可以通过抑制nf-κb信号通路的激活来起到抗炎作用(图5)，这一结果也在p65的细胞免疫荧光试验中得以验证(图5)。
另外，本实施例作为已知结构的红曲霉素，可直接从市场采购或者化学合成，含红曲霉素的药物组合物可以是一些长效或者局部缓释制剂，例如，可以利用现代医学的一些生物材料，包括聚已酸内酯，聚乳酸-聚乙二醇，聚乙烯醇等等，包载红曲霉素，形成复合制剂。
sequencelisting
<110>温州医科大学附属第二医院、温州医科大学附属育英儿童医院
<120>一种红曲霉素在制备治疗及延缓骨关节炎药物中的应用
<130>2018
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